Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Производство человека Norovirus выступающую Домены в Published: April 19, 2016 doi: 10.3791/53845
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Schaller Research Group, University of Heidelberg and the German Cancer Research Center, 2Department of Infectious Diseases, Virology, University of Heidelberg

Summary

Здесь мы опишем метод , чтобы выразить и очистить высокое качество Norovirus выступающие (P) доменов в E. палочки для использования в исследованиях рентгеновской кристаллографии. Этот метод может быть применен к другим кальцивируса P доменов, а также неструктурные белки, то есть., Вирусный белок геном-сшитый (ВПГ), протеазы и РНК зависимой РНК - полимеразы (RdRp).

Abstract

Норовирусная капсид состоит из одного основного структурного белка, названного VP1. VP1 подразделяется на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена. Домен S образует непрерывную леску вокруг вирусной РНК, в то время как P доменных форм вирусные шипы на домене S и содержит детерминанты для антигенности и хост-клеточных взаимодействий. Домен P связывает углеводные структуры, то есть., Групповые антигены гисто-крови, которые считаются важными для норовируса инфекций. В этом протоколе, мы описываем способ получения высококачественных норовирус P домены с высокими выходами. Эти белки могут быть использованы для рентгеновской кристаллографии и ELISA с целью изучения антигенных свойств и хост-клеточных взаимодействий.

Домен Р сначала клонирован в вектор экспрессии и экспрессии в клетках бактерий. Белок очищают с помощью трех шагов, которые включают иммобилизованных металл-ионную аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии. Впринцип, можно клонировать, экспресс, очищают, и кристаллизуются белки менее чем за четыре недели, что делает этот протокол система быстрого анализа вновь возникающих штаммов Norovirus.

Introduction

Человеческие Noroviruses являются основной причиной острого гастроэнтерита во всем мире 1. Эти вирусы принадлежат к семейству Caliciviridae, из которых по крайней мере пять родов, в том числе норовирус, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus и Nebovirus. Несмотря на их высокую воздействие на систему здравоохранения и широкое распространение, изучение человеческих норовирусами затруднено из-за отсутствия надежной системы клеточной культуры. На сегодняшний день нет никаких утвержденных вакцин или противовирусных стратегий, доступных.

Норовирусная основной белок капсида, названный VP1, можно разделить на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена 2. Домен Р подключен к домену S областью гибкого шарнира (H). Домен S образует леску вокруг вирусной РНК, в то время как домен Р образует дальний от центра часть вирусного капсида. Домен P компонует в биологически соответствующих димеров при экспрессии в бактериях. P dИМЕР взаимодействует с углеводными структурами, называемые антигены групп гисто-крови (HBGAs), которые присутствуют в виде растворимых антигенов в слюне и обнаружили на некоторых клетках - хозяевах 3. Взаимодействие домена HBGA Р считается важным для инфекции 4. В самом деле, недавний доклад показал важность синтетических HBGAs или HBGA экспрессирующих бактерии для инфекции норовирусной человека в пробирке 5.

Современные исследования , касающиеся вложения клетки - хозяина норовирусами в основном осуществляется с вирусоподобных частиц (VLPs) , которые могут быть выражены в клетках насекомых или рекомбинантных P доменов , выраженных в Escherichia coli (E.coli). Для того, чтобы понять P предметно-HBGA взаимодействия с атомным разрешением, P предметно-HBGA сложные структуры могут быть решены с помощью рентгеновской кристаллографии. Здесь мы опишем протокол для выражения Р домена и очистки, что позволяет производить области Р в высоком количестве и качестве, которые будут использоваться для рентгеновской Crystallграфия. Кроме того, этот метод может быть применен для других кальцивируса P доменов и неструктурных белков.

Домен P является кодон-оптимизированной для Е. палочка экспрессии и клонируют в стандартный вектор переноса. Домен Р затем повторно клонирована в вектор экспрессии, который кодирует полигистидиновая (His) тэг и маннозы-связывающий белок (МВР), которые, за которым следует сайт расщепления протеазы. -His-P МВР слитый домен белок экспрессируется в E. палочки, а затем три стадии очистки. Гибридный домен белка ОБМ-His-P очищают с помощью иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии (IMAC). Затем слитый белок расщепляют с человеческим риновирусной (ВРС) -3C протеазы и домен Р отделяется от MBP-His, с помощью дополнительной стадии очистки IMAC. И, наконец, домен Р очищают с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенный домен P может затем использоваться для рентгеновской кристаллографии. Скрининг условий кристаллизации белков является Перфоrmed с коммерчески доступными наборами скрининга с использованием различных концентраций белка P домена. Рост кристаллов наблюдается и наиболее перспективные условия оптимизированы.

С методами, описанными здесь, можно перейти от гена к белку структурировать в течение менее четырех недель. Таким образом, наш метод выражения P домена, очистки и кристаллизации подходит для изучения взаимодействия норовирус-хозяина на молекулярном уровне и обеспечивают важные данные для оказания помощи в последнюю дату разработкой вакцин и наркотиков скрининг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. P Домен Клонирование

  1. Определение кодирующей области P домена путем выравнивания последовательностей штаммов норовируса (например, штамм GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Кроме того, удалите гибкую область на С-конце домена P (фиг.2А). Кодон-оптимизируют ДНК для E. палочки экспрессии и включают BamHI (N-терминал) и NotI (C-терминал) сайтов рестрикции для того , чтобы суб-клона области Р кодирующей области в вектор экспрессии pMalc2x 6,7.
    Примечание: Область кодирования Р домен оптимизировано и синтезируются коммерческой службы. Домен P кодирования области (вставка) составляет примерно 1 кб в длину и поставляется в стандартном векторе переноса.
  2. Дайджест 2 мкг вектора переноса с каждого 1 мкл BamHI (20000 ед / мл) и NotI (10000 ед / мл), ферменты рестрикции в течение 1 ч при 37 ° С с производителем поставляется буферов.
  3. Отделить переваренной вставку на агарозном геле 1%в течение 20 мин при 135 В и очищают ДНК-вставки из геля с использованием коммерческого набора.
  4. Готовят вектор экспрессии pMalc2x расщеплением 2 мкг этого вектора с каждым 1 мкл BamHI (20000 ед / мл) и NotI (10000 ед / мл) ферментов рестрикции в течение 1 ч при 37 ° С. Очищают вектор из агарозного геля, как было описано выше (1.3). Примечание: Оба образца (1.2 и 1.4) можно хранить при -20 ° С.
  5. Лигирования Очищенную вставку в расщепленного вектора pMalc2x на сайтах рестрикции BamHI и NotI с 1 мкл лигазы Т4-ДНК (400000 ед / мл) в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) (рис 2В и 2С). Использование по меньшей мере 20 нг вектора pMalc2x и вектор: вставка соотношение 1: 3 (молекулярный вес). Смесь Лигирование обычно ~ 20 мкл.
  6. Transform 2 мкл сшитой смеси на 50 мкл химически компетентную E. палочки DH5 & бактериальные клетки с использованием стандартного протокола преобразования (10 мин на льду, теплового шока 45 сек при 42 ° С) и растут в 600мкл SOC среда в течение 1 ч при 37 ° С. Центрифуга трансформированные клетки в течение 3 мин при 1000 об XG, отбросить супернатант, и ресуспендируют осадок в 30 мкл SOC среды.
    1. Пластинчатый смесь преобразования на LB-чашки с агаром, содержащей 100 мкг / мл ампициллина для селекции, и расти в течение ночи при 37 ° С. Выберите по крайней мере пять колоний.
  7. Для каждого из пяти колоний, прививают 2-3 мл культуры LB-среде, дополненной 50 мкг / мл ампициллина (LB-Amp) и растут при встряхивании в течение ночи при 160 оборотах в минуту при 37 ° С.
  8. Извлечение Плазмиды из ночной культуры с использованием коммерческого набора. Проверьте наличие P домена вставки путем секвенирования с прямого праймера pMalc2x (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') и обратного праймера (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').

Выражение 2. P Домен

  1. Transform 1 мкл (150 нг / мкл - 400 нг / мкл) векторного кодирования pMalc2x для MBP-His-P доменслитый белок в 50 мкл компетентную E. Клетки палочки BL21 с использованием стандартного протокола преобразования (10 мин на льду, теплового шока 45 сек при 42 ° С) и растут в 600 мкл SOC среды в течение 1 ч при 37 ° С. Субкультура в 120 мл LB-амп в течение ночи при 160 оборотах в минуту и ​​37 ° С.
  2. Привить девять литров (например, 6 х 5 л колб с 1,5 л среды каждая) LB-усилителя с субкультуры (1: 100). Grow клетки качалке при 160 оборотах в минуту и 37 ° С до тех пор , OD 600 не достигнет 0,4 - 0,6. Затем снижают температуру до 22 ° С в течение ~ 1 ч и затем индуцируют экспрессию белка с 0,66 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG) 8. Grow клеток в течение ночи при 22 ° С (~ 18 ч).
    Примечание: температура может быть разнообразным, но мы рекомендуем использовать 22 ° C или ниже.
  3. Урожай клеток путем центрифугирования (10,543 XG, 15 мин, 4 ° С). Жидкость над осадком сливают и замораживают осадок клеток при -20 ° С.

й Стадия очистки и протеаз Расщепление

  1. Подготовка буферов, которые используются во время стадий очистки белка из маточных растворов, чтобы гарантировать воспроизводимость и стабильность экспериментов. Подготовьте четыре различных буферов для ионно-аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC), каждая из которых содержит различную концентрацию имидазола (10 мм, 20 мм, 50 мм и 250 мм). Для SEC, подготовить гель-фильтрационной буфер (CFB) с более высокой концентрацией соли, но без имидазола. С помощью деионизованной воды и фильтровать все буферы перед использованием с размером пор 0,45 мкм.
    Примечание: Для получения детальной схемы подготовки буфера, обратитесь к таблице 1.
  2. Растаяйте осадок клеток из литровой культуры девяти и растворяют в 150 мл PBS при 4 ° С. Разрушать ультразвуком суспензии клеток три раза в течение 2 мин (мощность 130 Вт, амплитуда 20%, частота следования импульсов 50%) для разрушения клеток. Держите клеточной суспензии на льду во время озвучивания.
  3. CentrifuGE Озвученную суспензии клеток (43667 XG, 30 мин, 4 ° С), чтобы отделить клеточные остатки от супернатанта, содержащего экспрессируемый белок. Соберите супернатант и отбросить осадок.
  4. Мытье и уравновешивают 10 мл (= 1 объем колонки [CV]) суспензии никеля (Ni) -NTA агарозных шариков с 10 мМ имидазола буфера в хроматографическую колонку. Добавить уравновешенную Ni бусинки к надосадочной жидкости с этапа 3.3, содержащего выраженный MBP-His-P домен слитого белка и инкубировать в течение 30 мин при температуре 4 ° С при медленном вращении.
  5. После инкубации применить всю смесь Ni-бусинка-белка в хроматографическую колонку. Промывают колонку медленно с каждые 5 колоночными объемами 10 мМ, 20 мМ и 50 мМ имидазола буферы, начиная с 10 мм, затем 20 мМ , и последние 50 мМ (фиг.3А).
  6. Элюции ОБМ-His-P слитый домен белка с использованием 250 мМ имидазола буфера (фиг.3А). Во время элюирования, проверьте OD 280 нм , чтобы проверить , вымывание слитого белка (рост OD 280nm). Продолжайте элюирование до OD 280 нм не упадет до ~ 0,1. Промыть шарики с чрезмерным количеством 250 мМ имидазола буфера (по крайней мере, 10 ППО), а затем по крайней мере, 10 колоночными объемами 10 мМ имидазола буфера. Сохраните шарики для второй стадии очистки (раздел 4).
  7. Проверьте наличие ОБМ-His-P домен белка , слитого с SDS-PAGE с использованием 12% SDS-полиакриламидном геле в присутствии (10 х 8 см) 9 (рисунок 3А). Выполните гель-электрофореза на 45 А и 200 В в течение 45 мин.
  8. Концентрат (например, с использованием коммерческого концентраторы) элюированного ОБМ-His-P домен слитого белка до конечной концентрации ~ 3 мг / мл. Сколите домен слияния МВР-His-P с ВСР-3С протеазы во время диализа против 2 л 10 мМ имидазола буфера (~ 1: 100) в течение ночи при 4 ° С (фиг.3А). В зависимости от конечного объема концентрированного белка, выполняют диализ в диализный кассете или диализной трубке.
    Примечание: количество HRV-3C протеазы для белкаРасщепление рассчитывается по удельной активности протеазы (2 ед / мкл, 1 U достаточно, чтобы расщепить 100 мкг белка), и количество вымываемого слитого белка, который изменяется от уровня экспрессии и могут быть оценены из результата SDS-PAGE (3.7 ).

4. 2 - й Стадия очистки

  1. Уравновешивания Ni-бусинки со стадии 3.6 в 10 мМ имидазола буфере.
  2. Выдержите Диализованный белок из шага 3.7 (содержащий расщепляется домен P, белок MBP и HRV-протеазы) с уравновешенной Ni бусинок (4.1) в течение 30 мин при температуре 4 ° С при медленном вращении.
  3. Нанесите Ni-шарик смеси в колонну и собирать проточные (расщепляется P домена) (Рисунок 3B). Измерение концентрации белка , как это происходит с колонки до OD 280 нм не достигает ~ 0,1.
    Примечание: MBP-His должен оставаться связанным с Ni-шариков (рис 3б).
  4. Проверьте наличие домена расщепляют P с помощью SDS-PAGE с 12% гель , как описано выше (фиг.3В). Концентрат элюированного домен Р до ~ 3 мг / мл и диализ в течение ночи при 4 ° C против GFB для последующей очистки SEC.

5. 3 - я стадия очистки

  1. Мытье насосы и трубопроводы системы очистки ВЭЖХ и предварительно уравновешивают SEC-колонку (см список материалов) с GFB.
  2. Вводят области Р на колонку при скорости потока 1 мл / мин с использованием superloop (до 12 мл) или цикл (до 3 мл), в зависимости от объема концентрированного образца. После инъекции закончено, увеличить расход до 2,5 мл / мин.
  3. По мере того как OD увеличивается и область P отрывается колонку, собирают фракции 1,5 мл. Проверка фракций с помощью SDS-PAGE с 12% геле (рис 4А и 4Б). Бассейн только чистые фракции и концентрируют до ~ 3 мг / мл и ~ 8 мг / мл.
    Примечание: После ~ 110 мл (объем пустот) большинство примесей элюируют из колонки SEC с объемом 320 мл слоем.домен Р обычно элюируют в виде димера. Элюирование время / объем димера Р домена зависит от степени преп (Pg) колонны SEC.

6. Кристаллизация P домена

  1. Используйте домен P на ~ 3 мг / мл и 8 мг / мл для первичного скрининга кристаллизации. Подготовьте по крайней мере, 100 мкл области P в концентрации для начальных экранов с 384 коммерчески доступных условий скрининга. Провести скрининг при 18 ° С в 96-луночного формата пластины, где резервуар содержит 100 мкл маточного раствора и каплю состоит из 0,2 мкл раствора маточного и 0,2 мкл белка.
  2. Повторить и оптимизировать успешных условий кристаллизации. Таким образом, использовать 15-луночные планшеты, которые содержат 3 ряда. Установите первую строку с 100% -ным раствором матери, во втором ряду с 90% -ным раствором матери и 10% воды, а в третьем ряду с 80% -ным раствором матери и 20% воды. Используйте размер капли 2 мкл (1 мкл белка + 1 мкл маточного раствора) и 50081; л маточного раствора в объеме резервуара.
  3. Используйте оптимизированные условия для кристаллических сокристаллизующееся домен P с лигандами. Подготовка пластин, как это описано в пункте 6.2. Вместо 2 мкл размера капель, установить капли, содержащие 1 мкл раствора маточного 1 мкл белка, и 1 мкл лиганда при концентрации 1 мг / мл.
  4. Соберите наборы данных монокристаллов с использованием синхротронного излучения. Выполните молекулярную замену с использованием опубликованных структур P доменов с высоким сходством последовательности в качестве исходной модели поиска 6,10-13.
    Примечание: Наличие лиганда показывает, как ООН смоделированный сгустка электронной плотности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Схема описанного протокола изображен на рисунке 1. Протокол охватывает 6 основных частей , которые включают клонирование гена - мишени, экспрессия, очистка трехступенчатую и кристаллизацию. Рисунок 2 иллюстрирует конструкцию экспрессионной конструкции (ЕС) и характеристики вектора экспрессии pMalc2x. Последовательность сайта множественного клонирования (MCS) вектора pMalc2x показывает рестрикции и протеазы сайтов расщепления. Рисунок 3 показывает репрезентативные результаты SDS-PAGE ОБМ-His-P слитого домен белка и расщепленные домен P с соответствующими схемами из первых двух стадии очистки. Стадию третьей очистки изображен на рисунке 4 , и включает в себя схему очистки, Вымывание хроматограмма очищенного домена P и репрезентативный результат SDS-PAGE собранных фракций. Самые чистые фракции (по SDS-PAGE), объединяли, Концентрате изд, и используется для рентгеновской кристаллографии.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема экспрессии Норовирусная P домена и очистки. Протокол для экспрессии домена норовирус P и очистки состоит из шести основных частей, охватывающих клонирование и выражение (1 и 2), очистки ( от 3 ​​до 5) и кристаллизации (6.). Красные треугольники представляют домен P (ген и белок), в то время как синие столбики MBP-His. Агарозные гранулы Ni-NTA, которые используются во время IMAC (3 и 4) показаны в виде больших голубых сфер. Шарики SEC изображены в виде серых сфер.

фигура 2
Рисунок 2. Конструкция и Клонирование конструкции экспрессии (ЕС). Р домен EC, Вектор экспрессии , карта, и сайт множественного клонирования (MCS) , показаны. A) соотнесение белка Норовирусная капсида (VP1) и домен P EC , иллюстрирующее конструкцию ЕС с С-концевой делецией (зеленый). Б ) Схематическое изображение вектора экспрессии pMalc2x используется для выражения Р домена в E. палочка с устойчивости к ампициллину кассетой (AmpR), LAC-оперона (Лачи), манноза-связывающий белок (MALE, МВР) , и. С) Последовательность MCS из MCS вектора экспрессии pMalc2x. Выделено являются сайты ферментов рестрикции расщепления (красные коробки) и последовательность LEVLFQGP распознавания для протеазы HRV 3C (точность, синяя коробка).

Рисунок 3
Рисунок 3. Схема и Представитель Результаты за 1 - й и 2 - й Purфикация Шаг. Обзор Очистка и показательные результаты SDS-PAGE показаны. A) Очистка домена слитого МВР-His-P белка с использованием Ni-NTA агарозном бисером (большие голубые сферы). 12% гель SDS-PAGE показывает B) Разделение MBP-His-P домен слитого белка. ОБМ-His (синий прямоугольник) из расщепленного области P (красный треугольник). Вымывание скола области Р анализируют с помощью SDS-PAGE на 12% геле.

Рисунок 4
Рисунок 4. Схема и Представитель Результаты за 3 - й стадии очистки. Хроматограмма P домена элюции с использованием SEC и соответствующий результат SDS-PAGE. Черные цифры указывают на фракции, которые собирают.) Схема разделения на колонке SEC (SEC шарики изображены в виде серых сфер). 12% SDS-PAGE показывает белок, присутствующийво фракциях, которые собираются во время SEC элюирования и которые впоследствии объединяются и используются для рентгеновской кристаллографии. B) Хроматограмма SEC показывает измеренное абсорбцию (черная линия) по объему элюирования. Красная линия указывает на то, когда область P впрыскивали в SEC-колонке. C) Увеличение ко второму пику B. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

имя буфера 1 М Трис рН 7,6 5 М NaCl 3,5 М имидазола, рН 8
буфер 250 мМ имидазола 20 мл 40 мл 71 мл
буфер 50 мМ имидазола 20 мл 40 мл 14 мл
буфер 20 мМ имидазола 20 мл 40 мл 5,7 мл
буфер 10 мМ имидазола 20 мл 40 мл 2,8 мл
GFB (гель-фильтрация буфера) 25 мл 60 мл -

Таблица 1. Схема Раскапывание Common буферов , используемых в процессе очистки. Маточные растворы Tris-HCl, хлорид натрия (NaCl), и имидазола получают , как указано в заголовке таблицы. Количество раствора, необходимое для приготовления 1 л нужного буфера в воде представлена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы опишем протокол для экспрессии и очистки норовируса P доменов в высоком качестве и количестве. Норовирусы недостаточно хорошо изучены и постоянно необходимы структурные данные. Насколько нам известно, производство домен P с использованием других протоколов (например, GST-меченый P домены) было проблематичным, до сих пор, и достаточные структурные данные о взаимодействии норовирус-хост пропали без вести. С метод, описанный здесь, недавно мы внесли значительный вклад в понимание молекулярных деталей норовируса углеводного связывания. Настоящий протокол может быть адаптирован к различным белкам. Тем не менее, успешная реализация этого протокола зависит от нескольких факторов, в пределах каждой части способа очистки.

Дизайн конструкции экспрессии, является первым шагом важности. Проводим кодонов оптимизации экспрессии Р домена конструкта для повышения выхода экспрессии в E. палочки и удалить ReleВАНТ сайты рестрикции, присутствующие в кодирующей области. Кроме того, мы убираем гибкую область на С-конце, который может быть невыгодным для сворачивания белка во время экспрессии и упаковки белка в процессе кристаллизации. Выражение, как MBP слитого белка представляет собой среднее значение для поддержания белка в растворе в процессе экспрессии.

Что касается растворимого экспрессии белка есть дополнительные параметры, которые необходимо учитывать. E. BL21 палочка штамм оптимизированными для экспрессии белка с высоким выходом и , следовательно , используемые в настоящем протоколе. Выражение проводят в течение ночи при 22 ° С и уменьшенное количество IPTG используется для индукции. Это благоприятно для кинетики экспрессии белка и, как результат, меньше белка будет агрегировать в тельцах включения из-за неправильного сворачивания. Поэтому, важно, чтобы охладить культуру до 22 ° C до индукции экспрессии белка с помощью IPTG. Если выход белка не является удовлетворительным, можно дополнительно уменьшить TEMPERATЮр и регулировать количество IPTG.

Некоторые следует проявлять осторожность в отношении колонн очистки. В принципе, Ni-гранулы могут быть повторно использованы несколько раз. Тем не менее, способность связывания будет уменьшаться с течением времени. Если Ni-решение теряет стандартный синий цвет, шарики могут быть зачищены и заряжаться с помощью инструкции, приведенные в руководстве изготовителя. Кроме того, важно поддерживать колонку SEC в надлежащем состоянии и регулярно чистить, чтобы обеспечить высокую производительность. В зависимости от размера белка, который должен быть очищен в разные Prep класса (PG) из колонки SEC должна быть выбрана. Димер P домена составляет ~ 65 кДа по размеру и могут быть хорошо отделены друг от примесей ~ 100 кДа, используя колонку 75 пг, в то время как более крупные белки могут быть лучше разделены с использованием колонки 200 пг.

В сочетании оптимизированной конструкции последовательности, выражения и процедуры очистки можно получить очень чистый и высокого качества домен P с помощью нашего денатуратобмундирование оливково-серого цвета Благодаря высокому качеству очищенной области P, дополнительные исследования пригодны, включая иммунизацию для производства антител, ЯМР-экспериментов и исследований ELISA на основе. Кроме того, очищенный домен Р может быть использован для образования комплекса с Fab - фрагментов антител и нанотел 14,15. Насколько нам известно, это первый протокол , который позволяет P домен кристаллизации в высокой пропускной способности и способом, используя этот протокол, мы определили более 20 сложных структур различных норовируса и lagovirus P доменов в комплексе с HBGAs 6,16.

По нашему опыту, протокол может быть ограничен с белками до 65 кДа. Тем не менее, были успешно экспрессируют и очищают с помощью этого метода (неопубликованное) белки капсида различных калицивирусов 17 и неструктурных белков, таких как вирусный белок , геном-сшитый (VPg), протеазы и РНК - зависимой РНК - полимеразы (RdRp). При применении этого метода для белков капсида других вирусов, ят может быть необходимо варьировать и оптимизировать различные параметры (например, концентрация имидазола буфера для элюции) , чтобы получить достаточное количество белка. Кроме того, кроме GFB (например, PBS или TBS) различных буферов для хранения могут быть проверены для оптимальной стабильности белка.

Большинство анализируемых конструкций, дали в кубических / пластинчатых кристаллов, которые дифрагированного на высоких разрешениях. Таким образом, настоящий протокол предоставляет средство для получения чистого белка, который кристаллизуется хорошо. До тех пор, пока существует в настоящее время модель надежной культуры клеток доступны, эта методология представляет собой значительный шаг, чтобы способствовать пониманию взаимодействия норовирус-клетки-хозяина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
P domain DNA Life Technologies GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector On request
BamHI New England Biolabs R0136L
NotI New England Biolabs R0189L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104
S.O.C. Medium Life Technologies 15544-034
Econo-Column Chromatography Column Bio-Rad 7372512 2.5 x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
Vivaspin 20 GE Healthcare various cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Life Technologies 18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli Life Technologies C6000-03
HRV 3C Protease Merck Millipore 71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG GE Healthcare 28-9893-34 SEC column
JCSG Core suites Qiagen various 4 screens with each 96 wells
Carbohydrates Dextra Laboratories, UK various Blood group products

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
  2. Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
  3. Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
  4. Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
  6. Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
  7. Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
  8. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  10. Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
  11. Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
  12. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
  13. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
  14. Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
  15. Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
  16. Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
  17. Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).

Tags

Молекулярная биология выпуск 110 Клонирование норовирус P домен экспрессия белка очистки белка кристаллизация
Производство человека Norovirus выступающую Домены в<em&gt; E. палочки</em&gt; Для рентгеновской кристаллографии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leuthold, M. M., Koromyslova, A. D., … More

Leuthold, M. M., Koromyslova, A. D., Singh, B. K., Hansman, G. S. Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (110), e53845, doi:10.3791/53845 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter