Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zum Ausdruck bringen und eine hohe Qualität Norovirus vorstehende (P) Domänen in E. reinigen coli für die Verwendung in der Röntgenkristallographie Studien. Dieses Verfahren kann auf andere Calicivirus P Domänen angewendet werden, sowie Nicht-Strukturproteine, dh., Virales Protein - Genom-linked (VPg), Protease und RNA - abhängige RNA - Polymerase (RdRp).
Abstract
Die Norovirus-Kapsid eines einzigen großen strukturellen Protein zusammengesetzt ist, bezeichnet VP1. VP1 in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne unterteilt. Die S-Domäne bildet eine zusammenhängende Gerüst um die virale RNA, während die P-Domäne Formen viraler Spitzen auf der S-Domäne enthält und Determinanten für die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen. Die P - Domäne bindet Kohlenhydratstrukturen, dh., Histo-Blutgruppenantigene, die für Norovirus - Infektionen wichtig sind gedacht zu sein. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode für hochwertige Norovirus P-Domänen in hohen Ausbeuten herzustellen. Diese Proteine können dann für die Röntgenkristallographie und ELISA verwendet werden, um die Antigenität und Host-Zell-Interaktionen zu studieren.
Die P-Domäne wird zuerst in einen Expressionsvektor kloniert und exprimiert dann in Bakterien. Das Protein wird gereinigt drei Schritte ausführen, die Metall-Ionen-Affinitätschromatographie und Grßenausschlußchromatographie immobilisiert beinhalten. ImGrundsätzlich ist es möglich, zu klonen, Express, zu reinigen und zu kristallisieren Proteine in weniger als vier Wochen, die in diesem Protokoll zur Analyse von neu entstehenden Norovirus-Stämme ein schnelles System macht.
Introduction
Menschliche Noroviren sind die Hauptursache der akuten Gastroenteritis weltweit 1. Diese Viren gehören zur Familie der Caliciviridae, von denen es mindestens fünf Gattungen, einschließlich Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus und Nebovirus. Trotz ihrer hohen Einfluss auf das Gesundheitssystem und die weite Verbreitung, die Untersuchung der menschlichen noroviruses wird durch das Fehlen eines stabilen Zellkultursystem behindert. Bis heute gibt es keine zugelassenen Impfstoffe oder antivirale Strategien zur Verfügung.
Das Norovirus Hauptkapsidprotein, genannt VP1, kann in eine Schale (S) -Bereich und einem vorstehenden (P) Domäne 2 geteilt werden. Die P-Domäne wird durch ein flexibles Scharnier (H) Region der S-Domäne verbunden. Die S-Domäne bildet ein Gerüst, um die Virus-RNA, während die P-Domäne den äussersten Teil des viralen Capsid bildet. Die P-Domäne versammelt in biologisch relevanten Dimere, wenn sie in Bakterien exprimiert. Die P dimer mit Kohlenhydratstrukturen in Wechselwirkung tritt, bezeichnet als histo-Blutgruppenantigene (HBGAs) , die als lösliche Antigene im Speichel vorhanden sind und auf bestimmte Wirtszellen 3 gefunden. Die P domain-HBGA Interaktion wird gedacht für Infektions 4 wichtig. Tatsächlich ergab eine kürzlich veröffentlichten Bericht die Bedeutung von synthetischen HBGAs oder Bakterien , die für die menschliche Norovirus - Infektion in vitro 5 HBGA-Ausdruck zu bringen.
Aktuelle Studien der Wirtszelle Befestigung noroviruses Bezug hauptsächlich mit virusähnlichen Partikeln (VLPs) durchgeführt , die in Insektenzellen oder die mit rekombinanten P Domänen exprimiert in Escherichia coli (E. coli) exprimiert werden kann. Um zu verstehen, können die P-Domäne-HBGA Wechselwirkungen auf atomarer Ebene, P Domain-HBGA komplexe Strukturen werden Röntgenkristallographie gelöst werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die P-Domäne Expression und Reinigung, die für Röntgen Crystall verwendet Produktion von P-Domäne in hoher Quantität und Qualität werden könnengraphie. Außerdem kann dieses Verfahren für andere Calicivirus P-Domänen und nicht-strukturelle Proteine angewendet werden.
Die P - Domäne wird Codon-optimiert für E. coli - Expression und in einem Standard - Transfer - Vektor geklont. Die P-Domäne wird dann in einen Expressionsvektor re-kloniert, das einen Polyhistidin (His) Markierung und ein Mannose-bindendes Protein (MBP), die durch eine Protease-Spaltstelle gefolgt werden codiert. Das MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein wird in E. ausgedrückt coli, durch drei Reinigungsschritten gefolgt. Das MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein wird unter Verwendung von immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). Als nächstes wird das Fusionsprotein mit humanem Rhinovirus (HRV) -3C Protease gespalten und die P-Domäne von MBP-His durch eine zusätzliche IMAC-Reinigungsschritt abgetrennt wird. Schließlich wird die P-Domäne unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt. Das gereinigte P-Domäne können dann für die Röntgenkristallographie verwendet werden. Screening von Proteinkristallisationsbedingungen ist perfoRMED mit im Handel erhältlichen Screening-Kits unterschiedliche P Domäne Proteinkonzentrationen verwendet wird. Kristallwachstum beobachtet und die vielversprechendste Bedingungen optimiert sind.
Mit den hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, vom Gen zum Protein zu gehen innerhalb von weniger als vier Wochen zu strukturieren. Deshalb ist unsere Methode der P Domain Expression, Reinigung und Kristallisation eignet Norovirus-Wirt-Interaktion auf molekularer Ebene zu untersuchen und wichtige Daten liefern zu unterstützen, up-to-date Impfstoff-Design und Wirkstoff-Screening.
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Protocol
1. P Domain Cloning
- Bestimmen Sie die P - Domäne kodierende Region durch Sequenzabgleich von Norovirus - Stämme (zB GII.10 Stamm, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Außerdem entfernen die flexible Region am C-terminalen Ende der P - Domäne (2A). Codonspezifische Optimierung der DNA für E. coli - Expression und umfassen BamHI (N-terminal) und NotI (C-terminal) Restriktionsstellen , um Sub-Klon der P - Domäne kodierende Region in den pMalc2x Expressionsvektor 6,7.
Hinweis: Der P-Domäne codierende Region wird optimiert und durch einen kommerziellen Service synthetisiert. Die P-Domäne kodierende Region (Einsatz) beträgt etwa 1 kb in der Länge und in einem Standard-Transfervektor geliefert. - Digest 2 ug des Transfervektors mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C mit einer vom Hersteller gelieferten Puffer.
- Trennen Sie die verdaute Einsatz auf einem 1% Agarosegelfür 20 min bei 135 V und reinigen die Insert-DNA aus dem Gel unter Verwendung eines kommerziellen Kits.
- Bereiten Sie die pMalc2x Expressionsvektor von 2 ug dieses Vektors Digerieren mit je 1 ul BamHI (20000 U / ml) und NotI (10.000 U / ml) Restriktionsenzyme für 1 h bei 37 ° C. Reinige den Vektor aus einem Agarosegel, wie oben beschrieben (1,3). Anmerkung: Beide Proben (1,2 und 1,4) bei -20 ° C gelagert werden.
- Ligieren des gereinigten Inserts in dem verdauten Vektor pMalc2x an den BamHI- und NotI - Restriktionsstellen mit 1 ul T4-DNA - Ligase (400.000 U / ml) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) (2B und 2C). Verwenden Sie mindestens 20 ng des pMalc2x Vektor und einem Vektor: Insert Verhältnis 1: 3 (Molekulargewicht). Die Ligationsmix ist in der Regel ~ 20 & mgr; l.
- Transformieren 2 & mgr; l der Ligationsmischung in 50 & mgr; l chemisch kompetente E. coli DH5a Bakterienzellen ein Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 Sekunden bei 42 ° C) und wachsen in 600 unter Verwendung von& mgr; l SOC-Medium für 1 Stunde bei 37 ° C. Centrifuge die transformierten Zellen für 3 min bei 1000 · g, den Überstand verwerfen und das Pellet in 30 & mgr; l SOC-Medium.
- Platte der Transformationsmischung auf LB-Agar-Platten, 100 ug / ml Ampicillin zur Selektion enthält, und wachsen über Nacht bei 37 ° C. Wählen Sie mindestens fünf Kolonien.
- Für jede der fünf Kolonien inokulieren 2-3 ml Kultur von LB-Medium, ergänzt mit 50 ug / ml Ampicillin (LB-amp) und wachsen über Nacht bei 160 rpm bei 37 ° C schüttelnd.
- Extrahieren Sie die Plasmide, die aus der über Nacht Kultur eines kommerziellen Kits verwenden. Überprüfen Sie das Vorhandensein der P-Domäne Einsatz durch Sequenzierung mit einem pMalc2x Forward-Primer (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') und Reverse-Primer (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').
2. P Domain Expression
- Transformieren 1 ul (150 ng / ul - 400 ng / & mgr; l) des pMalc2x Vektors kodierend für das MBP-His-P domainFusionsproteins in 50 ul kompetenten E. coli BL21 Zellen eine Standard - Transformationsprotokoll (10 min auf Eis, Hitzeschock 45 sec bei 42 ° C) verwendet und bei 37 ° C für 1 Stunde in 600 & mgr; l SOC - Medium wachsen. Subkultur in 120 ml LB-amp über Nacht bei 160 rpm und 37 ° C.
- Beimpfen von neun Litern (beispielsweise 6 x 5 L Kolben mit 1,5 l Medium jeweils) von LB-amp mit der Subkultur (1: 100). Wachsen die Zellen bei 160 Umdrehungen pro Minute und 37 ° C schütteln , bis die OD 600 0,4 erreicht - 0,6. Anschließend wird für ca. 1 Stunde die Temperatur auf 22 ° C abzusenken und dann mit 0,66 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 8 , um die Proteinexpression induzieren. Wachsen die Zellen über Nacht bei 22 ° C (~ 18 h).
Hinweis: Die Temperatur variiert werden kann, aber wir empfehlen 22 ° C oder weniger zu verwenden. - Ernte der Zellen durch Zentrifugation (10.543 xg, 15 min, 4 ° C). Überstand verwerfen und frieren das Zellpellet bei -20 ° C.
1. Reinigungsschritt und Protease - Spaltung
- Bereiten Puffer, die während der Proteinreinigungsschritte aus Stammlösungen verwendet werden, die Reproduzierbarkeit und die Stabilität der Experimente zu gewährleisten. Bereiten vier verschiedenen Puffern für die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC), die jeweils eine andere Konzentration an Imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM und 250 mM). Für die SEC, bereiten Sie einen Gelfiltrationsexperimente Puffer (GFB) mit einer höheren Salzkonzentration, jedoch ohne Imidazol. Verwenden deionisiertem Wasser und filtern alle Puffer vor Verwendung mit einer Porengröße von 0,45 um.
Hinweis: Für eine detaillierte Pufferherstellungsschema finden Sie in Tabelle 1. - Auftauen des Zellpellets aus der neun Liter Kultur und lösen sich bei 4 ° C in 150 ml PBS. Beschallen die Zellsuspension dreimal für 2 min (Leistung 130 W, 20% Amplitude, Impulsfrequenz 50%) der Zellen zu stören. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis während der Beschallung.
- Centrifuge Die beschallte Zellsuspension (43.667 xg, 30 min, 4 ° C) aus dem Überstand von Zelltrümmern zu trennen exprimierte Protein enthält. Sammeln Sie den Überstand und das Pellet verwerfen.
- Wash und 10 ml (= 1 Säulenvolumen [CV]) Schlamm aus Nickel (Ni) -NTA Agarose-Kügelchen mit 10 mM Imidazol-Puffer in einer Chromatographiesäule äquilibrieren. Fügen Sie die äquilibrierte Ni-Perlen zu dem Überstand aus Stufe 3.3, enthaltend exprimierten MBP-His-P-Domäne-Fusionsprotein und Inkubieren für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation.
- Nach der Inkubation gelten für eine Chromatographiesäule die gesamte Ni-bead-Proteinmischung. Die Säule wird langsam mit je 5 CVs von 10 mm, 20 mm und 50 mM Imidazol - Puffer mit 10 mM beginnen, dann 20 mM und letzten 50 mM (3A).
- Eluieren die MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein unter Verwendung von 250 mM Imidazol - Puffer (3A). Während der Elution, überprüfen Sie die OD 280nm die Elution des Fusionsproteins zu überprüfen (der Anstieg der OD 280nm). Weiterhin Elution , bis die OD 280nm zu Tropfen ~ 0,1. Waschen der Kügelchen mit übermäßiger Mengen von 250 mM Imidazol-Puffer (mindestens 10 CVs), gefolgt von mindestens 10 CVs von 10 mM Imidazol-Puffer. Speichern Sie die Perlen für die zweite Reinigungsstufe (Abschnitt 4).
- Überprüfen die Anwesenheit des MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein mit SDS-PAGE unter Verwendung eines 12% SDS-Polyacrylamidgel (10 x 8 cm) 9 (3A). Führen Sie Gel-Elektrophorese bei 45 A und 200 V für 45 min.
- Konzentrat (beispielsweise eine kommerzielle Konzentrator verwendet wird ) das eluierte MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein zu einer Endkonzentration von ~ 3 mg / ml. Spalten die MBP-His-P Domäne Fusion mit HRV-3C - Protease während der Dialyse gegen 2 l 10 mM Imidazol - Puffer (~ 1: 100) über Nacht bei 4 ° C (Abbildung 3A). Je nach Endvolumen von konzentriertem Protein, führen Dialyse in einer Dialysekassette oder Dialyseschlauch.
Anmerkung: Die Menge der HRV-3C-Protease für die ProteinSpaltung berechnet wird entsprechend der spezifischen Protease-Aktivität (2 U / & mgr; l, 1 U ist ausreichend, um 100 ug Protein abzuspalten) und der Menge des eluierten Fusionsproteins, die auf dem Expressionsniveau variiert und kann aus dem SDS-PAGE-Ergebnis (3.7 abschätzbar ).
4. 2. Reinigungsschritt
- Äquilibrieren die Ni-Perlen aus Schritt 3.6 in 10 Imidazolpuffers mM.
- Inkubieren der dialysierten Protein aus Schritt 3.7 mit den äquilibriert Ni-beads (4.1) für 30 min bei 4 ° C unter langsamer Rotation (gespalten P domain, MBP-Protein und HRV-Protease enthält).
- Tragen Sie die Ni-Perlen - Mischung auf eine Säule und sammeln Sie die Flow-Through (gespalten P - Domäne) (3B). Messen Sie die Konzentration des Proteins , wie es die Spalte , bis die OD 280 nm erreicht ~ 0.1 kommt weg.
Hinweis: Das MBP-His sollte die Ni-beads (3B) gebunden bleiben. - Prüfen Sie das Vorhandensein von gespaltenen P-Domäne unter Verwendung von SDS-PAGE mit einem 12% Gel , wie oben (3B) beschrieben. Konzentrieren der eluierten P Domäne ~ 3 mg / ml und dialysiere über Nacht bei 4 ° C gegen GFB für nachfolgende SEC Reinigung.
5. 3. Reinigungsschritt
- Waschpumpen und Leitungen der HPLC-Reinigungsanlage und Pre-äquilibrieren der SEC-Säule (siehe Materialliste) mit GFB.
- Injizieren der P-Domäne auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min eine Superloop (bis zu 12 ml) oder Schleife (bis zu 3 ml), je nach dem Volumen der konzentrierten Probe. Nach der Injektion abgeschlossen ist, erhöhen auf 2,5 ml / min Volumenstrom.
- Da die OD erhöht und die P-Domäne aus der Säule kommt, sammeln Fraktionen von 1,5 ml. Überprüfen Fraktionen mittels SDS-PAGE mit einem 12% -Gel (4A und 4B). Pool nur die reinsten Fraktionen und konzentriere auf ~ 3 mg / ml und ~ 8 mg / ml.
Hinweis: Nach ~ 110 ml (Hohlraumvolumen) die meisten Verunreinigungen aus einer SEC-Säule mit 320 ml Bettvolumen eluiert werden. DasP-Domäne wird in der Regel als ein Dimer eluiert. Elutionszeit / Volumen der P-Domäne Dimer ist abhängig von der Präparationsgüte (pg) der SEC-Säule.
6. Die Kristallisation des P-Domäne
- Verwenden, um die P-Domäne bei ~ 3 mg / ml und 8 mg / ml für die anfängliche Kristallisation Screening. Bereiten Sie mindestens 100 & mgr; l P-Domäne pro Konzentration für Einstiegsbildern mit 384 im Handel erhältlichen Screening-Bedingungen. Screening bei 18 ° C in einer 96-Well-Plattenformat, in dem der Vorratsbehälter enthält 100 & mgr; l Stammlösung und ein Tropfen besteht aus 0,2 & mgr; l Stammlösung und 0,2 & mgr; l Protein.
- Wiederholen und optimieren erfolgreiche Kristallisationsbedingungen. Daher verwenden 15-Well-Platten, die 3 Zeilen enthalten. Stellen Sie die erste Zeile mit 100% Mutterlösung auf, die zweite Reihe mit 90% Stammlösung und 10% Wasser, und die dritte Reihe mit 80% Stammlösung und 20% Wasser. Verwenden Sie eine Tropfengröße von 2 & mgr; l (1 ul Protein + 1 & mgr; l Stammlösung) und 50081; l der Mutterlösung als Behältervolumen.
- Verwenden Sie optimierte Kristall Bedingungen für die Co-Kristallisation des P-Domäne mit Liganden. Bereiten Platten wie in 6.2 beschrieben. Anstelle von 2 ul Tropfengröße eingesetzten Tropfen, die 1 & mgr; l Mutterlösung, 1 & mgr; l Protein und 1 ul-Ligand in einer Konzentration von 1 mg / ml.
- Sammeln Sie Datensätze von Einkristallen mit Synchrotronstrahlung. Führen des molekularen Ersatzes unter Verwendung veröffentlichter P Domänenstrukturen mit einer hohen Sequenzähnlichkeit als erste Suche Modell 6,10-13.
Hinweis: Die Anwesenheit eines Liganden zeigt sich als nicht modellierte blob der Elektronendichte.
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Representative Results
Die schematische Darstellung der beschriebenen Protokoll ist in 1 dargestellt. Das Protokoll 6 Hauptteile umfasst , die Klonierung des Zielgens die Expression umfassen einen dreistufigen Reinigung und Kristallisation. 2 veranschaulicht die Konstruktion des Expressionskonstrukts (EC) und Eigenschaften des pMalc2x Expressionsvektor. Die Sequenz der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des pMalc2x Vektor zeigt Restriktions und Proteasespaltstellen. Abbildung 3 zeigt repräsentative SDS-PAGE Ergebnisse von MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein und gespalten P - Domäne mit den entsprechenden Schaltplan der ersten beiden Reinigungsschritte. Der dritte Reinigungsschritt ist in Figur 4 und beinhaltet ein Reinigungsschema, das Elutionschromatogramm von gereinigtem P - Domäne und eine repräsentative SDS-PAGE Ergebnis der gesammelten Fraktionen dargestellt. Die reinsten Fraktionen (gemäß SDS-PAGE) werden gepoolt, Konzentrated, und für die Röntgenkristallographie verwendet.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Norovirus P Domain Expression und Reinigung. Das Protokoll für Norovirus P Domain Expression und Reinigung enthält sechs Hauptteile und bedecken die Klonierung und Expression (1 und 2), Reinigung (3 bis 5) und Kristallisation (6.). Rote Dreiecke stellen die P-Domäne (Gen und Protein), während blaue Rechtecke mit der MBP-His darstellen. Ni-NTA Agarose - Kügelchen , die während der IMAC (3 und 4) dargestellt sind , so groß cyan Kugeln verwendet werden. Die SEC Perlen werden als graue Kugeln dargestellt.
Abbildung 2. Konstruktion und Klonierung des Expressionskonstrukts (EC). Die P - Domäne EGDer Expressionsvektor Karte, und die multiple Klonierungsstelle (MCS) gezeigt. A) Die Ausrichtung des Norovirus - Capsid - Protein (VP1) und der P - Domäne EG über die Gestaltung der EG mit dem C-terminalen Deletion (grün) zeigt. B Schematische) Darstellung des pMalc2x Expressionsvektor für P domain Expression in E. verwendet coli mit Ampicillin-Resistenz - Kassette (AmpR), lac-Operon (lacI), Mannose-bindendes Protein (Malé, MBP) und ein MCS. C) Sequenz des MCS des pMalc2x Expressionsvektor. Hervorgehoben sind die Restriktionsenzymschnittstellen (rote Kästen) und die Erkennungssequenz LEVLFQGP für die HRV 3C Protease (Präzision, blauer Kasten).
Abbildung 3. Schematische und repräsentative Ergebnisse für die 1. und 2. Purifizierung Schritt. Die Reinigung Überblick und repräsentative SDS-PAGE Ergebnisse angezeigt. A) Die Reinigung des MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein unter Verwendung von Ni-NTA - Agarose - Kügelchen (große Cyan Kugeln). Die 12% SDS-PAGE - Gel zeigt die MBP-His-P - Domäne - Fusionsprotein. B) Trennung von MBP-His (blaues Rechteck) von gespaltenen P - Domäne (rotes Dreieck). Elution von gespaltenem P-Domäne wird durch SDS-PAGE auf einem 12% Gel analysiert.
Abbildung 4. Schematische und Repräsentative Ergebnisse für das 3. Reinigungsschritt. Chromatogramm der Elution P - Domäne unter Verwendung von SEC und SDS-PAGE - Ergebnis entspricht. Schwarze Zahlen geben die Fraktionen , die gesammelt werden. A) Schematische Darstellung der Trennung auf der SEC - Säule (SEC Perlen als graue Kugeln dargestellt sind). Die 12% SDS-PAGE zeigt das Protein vorhandenin den Fraktionen , die bei der SEC Elution und die anschließend gesammelt und verwendet für die Röntgenkristallographie. B) Die SEC - Chromatogramm zeigt die gemessene Absorption (schwarze Linie) über Elutionsvolumen gesammelt werden. Die rote Linie zeigt an, wenn der P - Domäne in der SEC-Säule. C) Vergrößern auf zweite Spitze von B injiziert wurde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Buffer Name | 1 M Tris pH 7,6 | 5 M NaCl | 3,5 M Imidazol, pH 8 |
| 250 mM Imidazolpuffer | 20 ml | 40 ml | 71 ml |
| 50 mM Imidazolpuffer | 20 ml | 40 ml | 14 ml |
| 20 mM Imidazolpuffer | 20 ml 40 ml | 5,7 ml | |
| 10 mM Imidazolpuffer | 20 ml | 40 ml | 2,8 ml |
| GFB (Gelfiltrationspuffer) | 25 ml | 60 ml | - |
Tabelle 1. Pipettierschema für die Gemeinsame Puffer verwendet während der Reinigung. Stammlösungen von Tris-HCl, Natriumchlorid (NaCl) und Imidazol werden wie in der Kopfzeile der Tabelle angegeben. Die Menge der Stammlösung zu 1 l des gewünschten Puffer in Wasser benötigt wird, dargestellt.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Expression und Reinigung von Norovirus P-Domänen in hoher Qualität und Quantität. Noroviren sind nicht gut untersucht und Strukturdaten werden kontinuierlich benötigt. Unseres Wissens P Domain Produktion mit anderen Protokollen (zB GST-tagged P - Domänen) war problematisch, so weit, und eine ausreichende strukturelle Daten auf Norovirus-Wirt - Interaktion gefehlt haben. Mit dem hier beschriebenen Verfahren haben wir in letzter Zeit wesentlich zum Verständnis der molekularen Details der Norovirus-Kohlenhydrat-bindenden beigetragen. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Proteinen angepaßt werden. Jedoch erfolgreiche Durchführung dieses Protokolls hängt von mehreren Faktoren in jedem Teil des Reinigungsverfahrens.
Design des Expressionskonstrukts ist der erste Schritt von Bedeutung. Wir führen Codon-Optimierung des P - Domäne - Expressionskonstrukt die Expression Ausbeute in E. zu verbessern coli und entfernen relevant Restriktionsstellen, die innerhalb der kodierenden Region. Außerdem entfernen wir eine flexible Region am C-Terminus, die für die Proteinfaltung während der Expression und Protein Verpackung während der Kristallisation nachteilig sein könnte. Expression als MBP-Fusionsprotein ist ein Mittel, das Protein in Lösung während der Expression zu halten.
Bezug löslichen Proteinexpression gibt es weitere Parameter berücksichtigt werden. Die E. coli BL21 Stamm wird für High - Yield - Proteinexpression optimiert und daher in diesem Protokoll verwendet. Expression wird durchgeführt über Nacht bei 22 ° C und eine reduzierte Menge von IPTG zur Induktion verwendet. Dies ist günstig für die Kinetik der Proteinexpression und als ein Ergebnis weniger Protein in Einschlußkörperchen aufgrund misfolding aggregieren werden. Daher ist es wichtig, die Kultur auf 22 ° C vor der Induktion der Proteinexpression mit IPTG abzukühlen. Wenn die Proteinausbeute nicht zufriedenstellend ist, ist es möglich, weiter die temperat verringernure und die Menge an IPTG einzustellen.
Bestimmte Sorgfalt sollte in Bezug auf die Reinigungskolonnen entnommen werden. Grundsätzlich kann Ni-Perlen mehrmals wiederverwendet werden. Jedoch werden Bindungskapazität im Laufe der Zeit reduziert. Wenn der Ni-Lösung seine Standard blaue Farbe verliert, können die Perlen entfernt werden und wieder aufgeladen die Anweisungen in der Herstelleranleitung verwendet wird. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die SEC-Säule in ordnungsgemäßem Zustand zu halten und regelmäßig zu reinigen hohe Leistung zu ermöglichen. In Abhängigkeit von der Proteingröße, die eine andere prep Grad (pg) der SEC-Säule gereinigt werden muss, gewählt werden. Die P-Domäne-Dimer ist ~ 65 kDa groß und kann gut von Verunreinigungen von ~ 100 kDa unter Verwendung einer 75 pg-Säule getrennt werden, während größere Proteine besser sein können getrennt, um eine 200 pg Spalte.
Als Kombination von optimierten Sequenzdesign, Ausdruck und Reinigungsverfahren ist es möglich, sehr reines und qualitativ hochwertigen P-Domäne unter Verwendung unserer Meth zu gewinnenod. Aufgrund der hohen Qualität des gereinigten P-Domäne, sind weitere Studien geeignet, einschließlich Immunisierung zur Antikörperproduktion, NMR-Experimente und ELISA-basierten Studien. Außerdem kann das gereinigte P - Domäne für die Komplexbildung mit Fab - Antikörper und Nanobodies 14,15 verwendet werden. Unseres Wissens ist dies das erste Protokoll , das P - Domäne Kristallisation in einem Hochdurchsatz - Art und Weise und unter Verwendung dieses Protokoll ermöglicht haben wir über 20 komplexe Strukturen verschiedener norovirus und lagovirus P - Domänen in Komplex mit HBGAs 6,16 bestimmt.
Nach unseren Erfahrungen kann das Protokoll bis zu 65 kDa auf Proteine beschränkt. Jedoch Kapsidproteine von unterschiedlichen caliciviruses 17 und nicht-strukturelle Proteine, wie virale Protein - Genom-linked (VPg), Protease und RNA - abhängige RNA - Polymerase (RdRP) wurden erfolgreich exprimiert und unter Verwendung dieses Verfahrens (nicht veröffentlichten) gereinigt. Bei Anwendung dieser Methode Proteine von anderen Viren zu Kapsid, it kann erforderlich sein , zu variieren und verschiedene Parameter zu optimieren (z. B. die Imidazol - Konzentration des Elutionspuffers) ausreichende Menge an Protein zu gewinnen. Darüber hinaus können unterschiedliche Speicherpuffer außer GFB (zB PBS oder TBS) für eine optimale Proteinstabilität geprüft werden.
Die Mehrzahl der untersuchten Konstrukte ergab in kubischen / plättchenartige Kristalle, die mit hoher Auflösung gebeugt. Daher stellt die vorliegende Protokoll ein Werkzeug reines Protein zu erhalten, die gut kristallisiert. Solange es nun robuste Zellkulturmodell verfügbar ist, stellt diese Methode ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Norovirus-Host-Zell-Interaktion beitragen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
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