Introduction
تشكل الخلايا المناعية الفطرية نسبة أساسية من الخلايا داخل المكروية الورم وارتبطت مع خباثة الورم في المرضى والنماذج الحيوانية من السرطان 1. في الآونة الأخيرة، فقد أصبح موضع تقدير على نطاق واسع أن الاستجابات المناعية المزمنة تلعب أدوارا حاسمة في تعزيز تطور الورم، ورم خبيث ومقاومة الكيميائي 2. الضامة هي خلايا المناعة الفطرية الهامة التي ثبت لتنظيم مباشرة استجابة الخلايا السرطانية للعلاج الكيميائي 3،4. ومع ذلك، لا يعرف دور العدلات، اللاعبين الرئيسيين في نظام المناعة الفطري، في تنظيم استجابة الورم للعلاج مضاد للسرطان. أهداف هذه البروتوكولات هي استخدام طريقة سريعة وموثوق بها لفصل العدلات من عينات الدم CLL المريض وللتمييز خلايا HL60 على طول الطريق المحببات لدراسة دورها في تنظيم حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إلى وكلاء المضادة للسرطان الغدد الليمفاوية.
= "jove_content"> العدلات هي العنصر الخلوي الأكثر وفرة من نظام المناعة الفطري في الدم 5 ويكون بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة 6. العدلات دورا أساسيا في ارتفاع الاستجابات المناعية الفطرية الفعالة بالإضافة إلى وظائف المستجيب المتغيرة في العديد من الحالات المرضية 7. لذلك، وهي طريقة سريعة وموثوق بها لعزل العدلات من خلايا الدم الأخرى، مثل طريقة الفصل التدرج الكثافة، مطلوب للدراسات في المختبر. وسوف تستخدم هذه الطريقة لعزل العدلات تسهيل إجراء مزيد من البحوث على وظائف مناعية بوساطة العدلات في الجسم الحي وخارج الحي.
القدرة على الحصول على مجموعات نقية من العدلات هي خطوة أولى مهمة للتحقيق في المرضى الذين يعانون من الأمراض المناعية 8. كثافة طريقة فصل الانحدار هو أسلوب المثالية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من الخلايا. وmethoد ينطوي على إضافة حل كثافة التدرج في الجزء السفلي من أنبوب يحتوي على الدم البشري المخفف تليها الطرد المركزي في 300 غ لمدة 35 دقيقة دون انقطاع. تظهر حلقة من الخلايا وحيدة النواة في واجهة والعدلات الموجودة أدناه السابق. هذه الطريقة لها مزايا كبيرة فيما يتعلق بأساليب الأخرى المتاحة مثل مجموعات العزلة المتعادلة التي هي أكثر تكلفة بكثير 9. وبالإضافة إلى ذلك، عزل العدلات من الدم البشري من قبل مجموعات تجارية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة إلى علامة السطحية النوعية للعدلات الإنسان، تزيد من خطر تنشيط الخلايا أو تمييز. يسمح كثافة طريقة فصل التدرج عزل العدلات في غضون فترة قصيرة من الزمن. ضمن نفس الخطوة، وأيضا فصل الخلايا وحيدات النوى واستردادها. إنها تقنية الأساسية التي يتم الحصول على عائد مرتفع من خلايا نقية من أجل تحقيق السلامة الوظيفية.
من أجل تقليد microenv الورمironment، أجريت تجارب 3D. ونظرا لنصف عمر قصير العدلات في المختبر، والتجارب 3D مع العدلات الإنسان العذبة ليست نهائية. لهذا السبب، وبفعل البرولمفوسيت (HL60) الخلايا على التمايز إلى خلايا تشبه الخلايا المتعادلة باستخدام محرضات تمايز سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) وحمض الريتينويك (RA). وذلك باستخدام خلايا HL60 متباينة (HL60 فرق) منع وجود استجابات مختلفة من العدلات بسبب العزلة من مختلف الجهات المانحة.
في 3D المختبر تمثل نماذج ثقافة مرحلة وسيطة بين في المختبر نماذج 2D و في النماذج الحية. في ثقافة 2D، والخلايا المنتشرة على سطح البلاستيك تشكيل إرفاق ملفات خلية غير طبيعية للبروتينات المودعة التي التشويه والتحريف على هذا السطح الاصطناعية. على العكس من ذلك، فإن الخلايا في شكل ثقافة 3D إرفاق ملفات الطبيعية خلية خلية منذ الخلايا والمصفوفة خارج الخلية التي توليف هي المواد الطبيعية التي ترد فيها.لهذا السبب، ونماذج 3D شارك في ثقافة، خصوصا بين الخلايا السرطانية وأنواع الخلايا الأخرى، كانت مفيدة جدا للإشارة إلى مساهمتها في نمو الورم، الأوعية الدموية، والانبثاث. ونتيجة لذلك، والثقافات 3D جعل ثقافة خلية محاكاة الظروف الفسيولوجية التي توجد في الجسم الحي 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. العدلات عزل والمشارك الثقافة مع خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية
أجريت إجراءات بموجب موافقة لجنة ليون الأخلاق مستشفى مع جميع المرضى توقيع الموافقة المسبقة عن: ملاحظة.
- عزل خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية والعدلات
- جمع أنابيب من الدم المحيطي على EDTA (EDTA 1.8 ملغ لكل مليلتر من الدم) من المرضى الذين شخصت إصابتهم بسرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL).
- إضافة كل 15 مل من الدم إلى أنبوب 50 مل العقيمة وتمييع مع 15 مل RPMI (تخفيف 1: 1)، ثم بعناية وببطء إضافة 15 مل من كثافة حل الانحدار إلى أسفل الأنبوب دون خلط المراحل. ضمان أن الحل كثافة التدرج في RT لإعداد.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 35 دقيقة في RT ودون فرامل. يجب فصل الدم إلى أربع مراحل متميزة كما هو مبين في الشكل 1A، من أعلى إلى أسفل: الصفائح الدموية والبلازما وخلايا وحيدات النوى (ثحلقة هيت)، حل التدرج الكثافة، المحببة وكريات الدم الحمراء.
- جمع عصابة البيضاء التي تمثل خلايا اللوكيميا الأولية مع ماصة باستير البلاستيك ونقل إلى أنبوب 50 مل الجديد.
- ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني (يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم) تصل إلى 50 مل في مجموعه وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
- Resuspend وبيليه مع 5 مل برنامج تلفزيوني ثم إضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 مل في مجموعه وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
- Resuspend وبيليه مع المتوسطة RPMI كاملة (RPMI 1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ملغ / مل الستربتومايسين) لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
- نضح المراحل العليا وترك مرحلة المحببة وكريات الدم الحمراء وإضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 25 مل ثم يضاف 3٪ ديكستران في 0.9٪ NaClup إلى 50 مل في المجموع. خلط الأنابيب 10 مرات والاحتفاظ بها لمدة 30 دقيقة في RT دون خلط.
- جمع العلوي RBC الفقراء طبقة العدلة لد وضعها في أنبوب مل العقيمة 50 نظيفة وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 10 دقيقة في RT. resuspend كل بيليه مع 5 مل برنامج تلفزيوني ثم إضافة عازلة خلية تحلل الأحمر إلى 50 مل في المجموع.
- إبقاء الأنابيب في الظلام لمدة 15 دقيقة في RT ثم الطرد المركزي في 500 غ لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الكريات مع برنامج تلفزيوني (إضافة برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 مل في المجموع) ثم الطرد المركزي في 500 غ لمدة 10 دقيقة في RT.
- Resuspend والكريات مع المتوسط RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد. الحفاظ 3 × 10 5 من كل نوع من الخلايا في 50 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) في 5 أنابيب مل من البلاستيك لتحديد نقاء عزلتهم باستخدام التدفق الخلوي.
- تحليل عدد المورفولوجية من بالسكان خلية معزولة
- للقيام بذلك، resuspend كل 3 × 10 4 عدلات و 3 × 10 4 خلايا وحيدة النواة في 150 ميكرولتر كامل المتوسطة RPMI. تجميع الشرائح الزجاجية، وبطاقات الترشيح، وغرف العينة في جهاز الطرد المركزي cytospin، وضمان أن رانه الطرد المركزي غير متوازن.
- وضع كل نوع من الخلايا في حجرة العينة وخلوي الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 10 دقيقة في RT إزالة الشرائح وبطاقات الترشيح، وغرف عينة من أجهزة الطرد المركزي. تفكيك بعناية، حتى لا تتلف الخلايا على الشريحة. تجاهل بطاقات الترشيح وغرف عينة.
- وصمة عار على الخلايا باستخدام بالغيمزا عدة تلطيخ والحفاظ على الشرائح لمدة 1 ساعة حتى يجف. دراسة الخلايا عن طريق مجهر مع التكبير 100X.
- اختبار نقاء خلايا معزولة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية
- تسمية الخلايا اللوكيميا الأولية المعزولة مع الأجسام المضادة CD19 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). تسمية العدلات النقاء مع خليط من أضداد الإنسان المدرجة في الجدول 1 (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) من أنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
- resuspend كل بيليه في 200 ميكرولتر PBS-FBS (4٪).
- تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PerCP-Cy5.5 (695/40 BP )، PE (575/26 BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP)، APC-Cy7 (780/60 BP). ضمان تعويض اللون.
- Coculture من خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية مع ذاتي العدلات
- البذور 2 × 10 5 خلية / مل من خلايا اللوكيميا الأولية وحدها أو مع العدلات ذاتي في 1:10 النسبة في المتوسط RPMI كاملة. للقيام بذلك، وضبط أعداد الخلايا عن طريق تمييع تعليق خلية وإضافة 2 × 10 5 خلية / مل من خلايا اللوكيميا الأولية إلى 2 × 10 6 خلية / مل العدلات. مزيج بعناية.
- إضافة 25 ميكرومتر مثبط التيروزين كيناز بروتون (BTK) (ibrutinib) إلى الخلايا. احتضان لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- خلية الحصاد وتحليل FACS
- كولإلخ الخلايا في أنابيب بلاستيكية 5 مل لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. غسل الكريات مع 1 مل PBS-FBS (4٪) ثم الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
- الكريات Resuspend في Annexin V و PI باستخدام طقم التجارية واحتضان الخلايا في الظلام لمدة 10 دقيقة في RT. تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة في الشكل 2A و التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PI (610 / 20 BP). ضمان تعويض اللون.
2. تمايز الخلايا HL60 على طول المحببات المسار وCoculture مع خلايا RL سرطان الغدد الليمفاوية B في 3D النموذجي
- تمايز البرولمفوسيت الإنسان (HL60) الخلايا إلى خلايا تشبه العدلات
- ضبط HL60 عدد الخلايا إلى 3 × 10 5 خلية / مل ثم يضاف 1 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA)، و 1.25٪ DMSO للحث على تمايز بهم. البذور كل 3 × 10 5 2.
- وفي وقت لاحق، وجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الخلايا مع المتوسط RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
- ثم تمييع تعليق خلية في المتوسط RPMI كاملة لضبط عدد الخلايا HL60 إلى 3 × 10 5 خلية / مل وحمل مرة أخرى التمايز من خلال إضافة 1 ميكرومتر حمض الريتينويك (RA)، و 1.25٪ DMSO. البذور كل 3 × 10 5 HL60 الخلايا لكل بئر في لوحة 48-جيدا واحتضان لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
- تحليل التمايز HL60 (HL60 فرق)
- جمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي أنابيب في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الكرية مع المتوسط RPMI الكامل لحساب باستخدام بقاء الخلية العداد.
- لتحليل التغيرات في التعبير علامات سطح الخلية التدفق الخلوي. ضع كل 3 × 10 5 5 HL60 الخلايا المختلفة في أنابيب بلاستيكية 5 مل لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية وأنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT.
- Resuspend والكريات في 50 ميكرولتر PBS-FBS (4٪). تسمية الخلايا مع CD11b مكافحة الإنسان مترافق إلى AF700 أو CD38 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- يغسل مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪) ثم الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. Resuspend والكريات في 200 ميكرولتر PBS-FBS (4٪).
- تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة من 3A الشكل والتكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP)، اليكسا فلور 700 (730/45 BP).
- لاختبار التغيرات الشكلية في فرق HL60، لشل حركة الخلايا على الشرائح الزجاجية للفحص المجهري.
- للقيام بذلك، resuspend كل 3 × 10
- وضع كل نوع من الخلايا في حجرة العينة وخلوي الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة الشرائح وبطاقات الترشيح، وغرف عينة من أجهزة الطرد المركزي. تفكيك بعناية، حتى لا تتلف الخلايا على الشريحة. تجاهل بطاقات الترشيح وغرف عينة.
- وصمة عار على الخلايا باستخدام بالغيمزا عدة تلطيخ والحفاظ على الشرائح لمدة 1 ساعة حتى يجف. دراسة الخلايا عن طريق مجهر مع التكبير 100X.
- للقيام بذلك، resuspend كل 3 × 10
- 3-الأبعاد (3D) الثقافة
ملاحظة: تأكد من أن المواد المستخدمة في هذه التجربة باردة والتجربة تجري على الجليد.- resuspend كل 5 × 10 4 خلايا RL، إما وحدها أو مختلطة مع فرق HL60 فرق 01:10، مع 300 ميكرولتر الغشاء القاعدي مصفوفة باستخدام 1 مل ماصة قطع مع مقص معقم من أجل توسيع الانفتاح على حوالي 2 إلى 3 مم. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة.
- البذور لكل 300 ميكرولتر من تعليق خلية / جيد في 24 لوحة جيدا. تجنب فقاعات خلال هذه الخطوة. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 ثم يضاف 1 مل إكمال RPMI المتوسطة لكل بئر واحتضان لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تغيير المتوسطة كل يومين. إضافة 10 نانومتر الفينكريستين في يوم 5.
- تحليل FACS
- بعد 7 أيام من الثقافة، نضح المتوسطة ويغسل كل جيدا مع 1 مل PBS الجليد الباردة مرتين. إضافة 3 مل / جيد من الجليد الباردة PBS-EDTA (5 ملم). فصل جل من قاع البئر عن طريق كشط استخدام الجزء السفلي من 200 رأس ماصة ميكرولتر. يهز لوحة بلطف على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- نقل تعليق خلية في أنبوب معقم 15 مل ويهز أنابيب بلطف على جيمه لمدة 30 دقيقة أخرى. تحقق من ظهور التعليق الخلية متجانسة. (إذا لم يكن كذلك، ثم يهز الخلايا لوقت أطول أو إضافة المزيد من PBS-EDTA).
- أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. غسل الكريات مع برنامج تلفزيوني ثم الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
- و resuspend مع برنامج تلفزيوني-FBS (4٪) وعلامة مع الأجسام المضادة CD19 مكافحة الإنسان مترافق PE-Cy7 والأجسام المضادة CD38 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC (5 ميكرولتر / 10 6 خلايا). احتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- يغسل مع 500 ميكرولتر PBS-FBS (4٪)، ثم أنابيب الطرد المركزي في 300 غ لمدة 5 دقائق على RT. resuspend الخلايا مع Annexin V و PI باستخدام طقم التجارية.
- تحليل على قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية المحاصرة في الشكل 4A و التكوين البصري التالية: 488 نانومتر ليزر: FSC-A (488 نانومتر)، SSC-A (488 / 10BP)، FITC (530/30 BP)، PI (610 / 20 BP)، PE-Cy7 (780/60 BP)؛ 633 نانومتر ليزر: APC (660/20 BP). ضمان تعويض اللون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كثافة طريقة فصل التدرج الموصوفة هنا يوفر خلايا اللوكيميا الأولية والعدلات unstimulated عزل من دم المرضى CLL يمثل الشكل 1A طبقات الدم المختلفة التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي التدرج الكثافة (من أعلى إلى أسفل: الصفائح الدموية والبلازما، حلقة بيضاء تمثل الخلايا وحيدة النواة، التدرج الكثافة حل، المحببة وكريات الدم الحمراء). 1B الشكل و1C تظهر الاختلافات في مباراة شكلية بين العدلات (خلايا نوى متعددة الفصوص) والخلايا وحيدة النواة على التوالي.
النتائج في الشكل 1D تمثل مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة خلايا اللوكيميا الأولية (خلايا وحيدة النواة). وسم هذه الفئة من السكان مع CD19 مكافحة الإنسان مترافق إلى APC يظهر تحولا الصحيح الكامل من الرسم البياني (الشكل 1E) مع واحد فقطالذروة مما يدل على أن هذه الفئة من السكان هو إيجابي للCD19 ونقية. العدلات هي أيضا ≥90٪ نقية كما تم التحقق منها عن طريق التدفق الخلوي بعد وصفها العدلات معزولة مع خليط من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ملون تألقي مترافق المدرجة في الجدول 1. ويمثل الشكل 1F FSC مقابل مؤامرة محكمة أمن الدولة مبعثر من العدلات المعزولة التي هي ايجابية للCD45 (الشكل 1G)، إيجابية لCD15 والسلبية لCD14 (الشكل 1H)، إيجابية لكلا CD15 و CD16 (الشكل 1I)، إيجابية لCD16 والسلبية لCD56 (الشكل 1J).
الشكل 1. تحليل عدد المورفولوجية والطهارة من خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية والعدلات المعزولة من الدم المرضى. (أ) يمثل عرض تخطيطي طبقات الدم المختلفة بعد غرادي الكثافةوالأنف والحنجرة الطرد المركزي. (قبل الميلاد) تلطيخ بالغيمزا يمثل الاختلافات الشكلية بين (ب) العدلات و (ج) خلايا اللوكيميا (خلايا وحيدة النواة) الأساسية. تم التقاط الصور بواسطة المجهر مع 100X التكبير. (D) إلى الأمام مبعثر (FSC)، ويمثل الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة المعزول السكان خلية ابيضاض الدم الرئيسي. وصفت (E) خلايا اللوكيميا الأولية المعزولة مع anti-CD19-APC و تحليل للتعبير عن CD19. الخط الأحمر يشير إلى خلايا غير المسماة والخط الأزرق يشير الخلايا المسمى مع anti-CD19-APC. (F) FSC مقابل مؤامرة محكمة أمن الدولة مبعثر يمثل سكان العدلة معزولة. (GJ) وصفت العدلات المعزولة مع خليط من الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1 وتحليلها للتعبير عن (G) CD45، (H) CD14 و CD15، (I) CD15 و CD16، (J) CD16 ل د CD56. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مستضدات | تألقي | استنساخ |
| CD14 | APC-Vio770 (قبرصي-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
الجدول 1. تألقي مترافق تنقية حيدة النسيلة الأجسام المضادة المستخدمة لاختبار نقاء المعزولة العدلات. وقد تم الحصول على جميع الأجسام المضادة من Miltenyi التكنولوجيا الحيوية.
FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> لدراسة تأثير العدلات على حساسية خلايا اللوكيميا الأولية (CLL) إلى ibrutinib، ومثقف هذا الأخير وحده أو مع العدلات ذاتي (N) لمدة 24 ساعة على نسبة N : CLL 10: 1، في وجود أو عدم وجود ibrutinib في 25 ميكرومتر. وقد تم قياس النسبة المئوية للخلايا اللوكيميا الأولية على قيد الحياة (Annexin V سلبي / PI سلبي) من خلال تلطيخ مزدوج مع annexin V-FITC و PI، تليها تحليل تدفق cytometric. FSC مقابل مخطط التشتت SSC في الشكل 2A يمثل أبواب العدلات وخلايا اللوكيميا الأولية. العدلات هي أكثر الحبيبية الكثير من خلايا اللوكيميا الأولية بحيث تظهر مع أعلى محكمة أمن الدولة. تبوب على خلايا اللوكيميا الأولية شارك في تربيتها مع العدلات في وجود ibrutinib، وأظهرت النتائج ارتفاع نسبة الخلايا على قيد الحياة (الشكل 2C، 84.8٪) مقارنة مع الخلايا مثقف وحدها (الشكل 2B، 53.1٪). الرسم البياني مربع في الشكل 2D يدل على أن النقصانكان مستعمل (ه) من بقاء الخلية الناجمة عن ibrutinib بشكل كبير بسبب وجود العدلات (40.1 ± 3.1 مقابل 60.1 ± 3.5، ف <0.001، 19 مريضا).
وقد تم جمع الشكل 2. ذاتي العدلات حماية خلايا اللوكيميا السرطانية الأولية ضد Ibrutinib. الدم من المرضى الذين شخصت إصابتهم بسرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL). تم عزل خلايا اللوكيميا الأولية ومثقف وحدها أو مع العدلات ذاتي (N) في خلايا اللوكيميا الأولية: Nratio 01:10 لمدة 24 ساعة، في وجود أو غياب 25 ميكرومتر ibrutinib. النسبة المئوية للخلايا اللوكيميا الأولية الحية (Annexiv V سلبي / PI سلبي) ويقاس تلطيخ مزدوج مع annexin V-FITC و PI، تليها تحليل تدفق cytometric. (A) إلى الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) وتمثل مؤامرة أبواب العدلات وخلايا اللوكيميا الأولية(ب) ثنائي الأبعاد نقطة وصمة عار يظهر النسب من خلايا اللوكيميا الأولية على قيد الحياة وأفكارك مثقف وحده، وتعامل مع ibrutinib 25 ميكرومتر (C) تظهر ثنائية الأبعاد نقطة وصمة عار النسب المئوية للخلايا اللوكيميا الأولية على قيد الحياة وأفكارك المشارك مثقف مع العدلات وتعامل مع ibrutinib 25 ميكرومتر (D) صندوق مؤامرة تمثل النسبة المئوية للخلايا اللوكيميا الأولية على قيد الحياة من 19 مريضا. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD. *** ع <0.001 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
على المدى القصير نصف عمر العدلات في المختبر يجعل استخدامها في الثقافة 3D غير فعالة. وكان المستحث تمايز الخلايا HL60 على طول الطريق المحببات من المحرضات التمايز. معلمتين مختلفة (التعبير علامات على سطح الخلية والصرفي تشانغوفاق) كانت تستخدم لقياس التفريق بين HL60. FSC مقابل مؤامرة محكمة أمن الدولة مبعثر في الشكل 3A تبين أن HL60 الخلايا هي أكبر في الحجم مقارنة مع خلايا HL60 فرق مع ارتفاع FSC. وضع العلامات الخلايا (HL60 أو فرق HL60) مع الأجسام المضادة CD11b مكافحة الإنسان مترافق إلى AF700 وCD38antibody مكافحة البشرية مترافق إلى APC يظهر زيادة في CD11b والتعبير CD38 (الشكل 3B) على التمايز وهو يدل على التمايز المحببات. تظهر خلايا HL60 فرق أيضا تغيرات شكلية الكشف عنها من قبل ظهور نوى متعددة الفصوص (الشكل 3C).
الشكل 3. معلمات الهيكلية للخلايا متباينة HL60. (A) إلى الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) المؤامرات تمثل HL60 والخلايا HL60 متباينة (HL60 فرق). (ب) HL60 وHوصفت خلايا فرق L60 مع anti-CD11b-AF700 أو مكافحة CD38-APC تليها تحليل التدفق الخلوي. بعد تبوب على كل سكان الخلية في FSC-A مقابل SSC-A مؤامرة مبعثر (A)، وقد تم تحليل الخلايا للتعبير عن CD11b أو CD38 الخلايا (C) HL60 تظهر تغيرات شكلية تتفق مع التمايز نحو المحببة. تم التقاط الصور بواسطة المجهر مع 100X التكبير. بولد السهم الأسود يشير الفصوص متعددة النواة. الرسوم البيانية هي تمثيلية من خمس تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لاختبار تأثير الخلايا HL60 فرق على تنظيم استجابة الخلية RL إلى الفينكريستين في نموذج 3D، كان المثقف خلايا RL وحدها أو مع فرق HL60 في الطابق السفلي مصفوفة الغشاء في وجود أو عدم وجود الفينكريستين في 10 نم عن طريق استراتيجية النابضة هو مبين في الشكل 4A، يتعرضون للتمييز كلا الشعبين على أساس CD19 CD38 والتعبير. خلايا RL إيجابية لCD19 وHL60 الخلايا فرق إيجابية للCD38. تبوب على خلايا RL شارك في تربيتها مع الخلايا HL60 فرق في وجود الفينكريستين، وأظهرت النتائج ارتفاع نسبة الخلايا على قيد الحياة (الشكل 4C، 35.9٪) مقارنة مع الخلايا RL مثقف وحدها (الشكل 4B، 19.7٪). الرسم البياني شريط في الشكل 4D يظهر زيادة كبيرة في نسبة الخلايا RL على قيد الحياة (CD19 Annexin إيجابي V سلبي / PI سلبي) في وجود خلايا HL60 فرق (19.5 ± 0.2 مقابل 33.1 ± 1.0، P <0.001).
الشكل 4. خلايا فرق HL60 مثل العدلات حماية خلايا الغدد اللمفاوية RL ضد الفينكريستين في الثقافة 3D الخلايا RL تم تربيتها بمفرده أو بالاشتراك مع خلايا HL60 فرق في RL: HL60 نسبة فرق 1:10 لمدة 7 أيام في مصفوفة الغشاء القاعدي. في يوم 5، وأضيف الفينكريستين (VCR) بتركيز 10 نانومتر. تم فصلها الكروية في يوم 7 و وصفت الخلايا مع مكافحة CD19-PECy7 ومكافحة CD38-APC ثم معلق مع annexin V-FITC و PI تليها تحليل تدفق cytometric. (A) إلى الأمام مبعثر (FSC) والجانب مبعثر (SSC) تمثل مؤامرة بوابات الخلايا RL والخلايا فرق HL60. (ب) ثنائي الأبعاد نقطة وصمة عار يظهر النسب الخلايا RL على قيد الحياة وأفكارك مثقف وحده، وتعامل مع 10 نانومتر الفينكريستين. (C) ثنائي الأبعاد dot- يظهر صمة عار النسب المئوية للخلايا RL على قيد الحياة وأفكارك شارك في تربيتها مع فرق HL60 وتعامل مع 10 نانومتر الفينكريستين. (D) ويمثل الرسم البياني شريط النسبة المئوية للخلايا RL على قيد الحياة. يتم التعبير عن البيانات كما يعني ± SD. *** ع ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الموصوفة هنا، بروتوكول فعالة وبسيطة وسريعة وغير مكلفة لعزل العدلات من الدم البشري مع نقاء عالية باستخدام نهج الطرد المركزي التدرج الكثافة والواقعة في نفس الخلايا وحيدة النواة خطوة فهي أيضا مفصولة واستردادها. السكان خلية معزولة و≥90٪ نقية.
تتوفر لعزل العدلات من الدم البشري عدة طرق. وتشمل هذه الأساليب مماثلة باستخدام التدرجات متقطعة 11،12، أو باستخدام مجموعات تجارية لعزل العدلات عن طريق الانتقاء المناعية المغناطيسي إيجابية خلالها العدلات هي المناعية المغناطيسية المسمى مع الأجسام المضادة المحددة مثل CD16 مكافحة الإنسان ثم العدلات أثرى ملزم للCD16- خلايا إيجابية على عمود المغناطيسي 13. مجموعات تجارية مع اختيار السلبية المناعية المغناطيسية وتتوفر أيضا خلالها وصفت الدم كله أو تعليق محببة مع مزيج من الأجسام المضادة التي تربط على خلايا ثا آخرينن العدلات 9 (أي مجمعات الأجسام المضادة التي تسمية كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية والخلايا غير المرغوب فيها مثل CD2، CD3، CD9، CD19، CD36، CD56، glycophorin ألف والجزيئات المغناطيسية المغلفة ديكستران)، ثم يتم إثراء العدلات من قبل شطف مثل الأضداد جزء سلبي من الخلايا التي لا تربطه على العمود المغناطيسي. وبالإضافة إلى ذلك، العدلات يمكن عزله من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط 14.
وقد ثبت أن بعض التقنيات لتوفير عوائد عالية من العدلات نقية، مثل اختيار إيجابية المناعية المغناطيسية. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له عيوب مقارنة مع الكثافة أساليب الطرد المركزي التدرج بسبب وكلاء العلامات التي تربط على سطح العدلات وهذا يحتمل أن تغير وظيفتها عن طريق حفز تفعيلها أو تمييز. أيضا باستخدام طريقة اختيار المناعية المغناطيسية إيجابي، والمسمى الأجسام المضادة العدلات ربط على عمود المغناطيسي للانفصال، وهذا قد يؤثر أيضا على وظيفتها.مضان الفرز الخلية المنشط لديها قيود أخرى بقدر ما يتطلب هذا الأسلوب قتا أطول لجمع الخلايا التي قد تؤثر سلبا على البقاء على قيد الحياة العدلات بسبب من نصف عمر قصير.
التدرج الكثافة طريقة الطرد المركزي قابلة للمقارنة جدا ونقاء العدلات يمكن أن يتجاوز 90٪ باستخدام كل الإجراءات، ولكن الأول هو التدرج من طبقتين وهي من الناحية الفنية أقل تحديا مقارنة طبقات حل الانحدار التي تتكون من 40٪، 60٪ و 80٪ حجما / المجلد في برنامج تلفزيوني. وذكره Swamydas وآخرون. 15 أن اختلاط واجهات حل التدرج في كثير من الأحيان يحدث بسبب الخلافات كثافة صغيرة بين الطبقات الثلاث. فيما يتعلق نهج اختيار المناعية المغناطيسية السلبية، كما تم الإبلاغ عنها لتكون فعالة لعزل العدلات مع نقاء عالية وقابلية 9. صالحها على اختيار المناعية المغناطيسية الإيجابية والإسفار المنشط الفرز الخلية هي أن العدلاتلا وصفت مع أي وكلاء العلامات ولا ربط العمود المغناطيسي، وبالتالي تجنب تنشيط الخلايا ولكن هذه الطريقة هي أكثر تكلفة بكثير وأكثر تستغرق وقتا طويلا مقارنة مع الكثافة طريقة التدرج.
العدلات يخضع عادة موت الخلايا المبرمج العفوية السريعة على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 16،17. HL60promyelocyticcells الاحتفاظ العديد من الخصائص من الأسلاف الكريات البيض البشرية، مثل القدرة على الخضوع التمايز في العدلات 18. على عكس العدلات، والخلايا فرق HL60 لا تخضع بسرعة موت الخلايا المبرمج واستخدام هذه الخلايا يحل مشكلة وجود استجابات مختلفة من العدلات بسبب انعزالها عن مختلف الجهات المانحة.
في الآونة الأخيرة، والثقافات 3D تصبح أكثر نضجا وذات الصلة لعلم وظائف الأعضاء البشرية والحيوانية، ونموذجا جذابا للبحوث البيولوجية المختلفة وخاصة في مجال السرطان. تحول نمط من 2D إلى 3D الثقافة يسير بسرعة الاشتراكيةالامتحانات التنافسية الوطنية وهذا الأخير هو أكثر وضوحا خلال دراسة مختلف الحالات المرضية مثل السرطان 19. هناك وعي متزايد من عيوب الثقافة 2D حيث إضافة البعد الثالث للبيئة الخلية مهم من أجل إلقاء نظرة فاحصة على أهمية التفاعلات الخلوية 20 ولدراسة الاختلافات في سلوك الخلوية والخصائص. ثقافة 3D يخلق بيئة مشابهة لظروف في الكائن الحي (على سبيل المثال، إنسان) مما يؤدي إلى المزيد من البحوث ذات الصلة. ومع ذلك، والثقافة 3D ينطوي على تفاعل معقد بين مختلف الشركاء مثل الخلايا، مصفوفات خارج الخلية والسوائل الخلالية التي لا موجودة في ثقافة 2D. وبالتالي، سوف تكون هناك حاجة الجهود من أجل إقامة طريقة المعايرة والاعتماد على الممارسات المخبرية الجيدة فضلا عن إمدادات فعالة وخاصة الماركات التجارية التي يتم اختبارها على نطاق واسع ورصدها.
المكروية الورميتكون من أنواع الخلايا متعددة، بما في ذلك العديد من السكان الخلايا المناعية التي تشارك في تنظيم وتكون الأورام، ورم خبيث وردا على وكلاء المضادة للسرطان 21،22. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن زيادة تسلل العدلات في الأورام وترتبط بشكل كبير مع المقاومة المكتسبة لعدد من وكلاء المضادة للسرطان مثل العلاج المضاد للعامل نمو بطانة الاوعية 23،24. وعلاوة على ذلك، والارتفاع في العدلات المعالجة الاعتماد في المرضى الذين يعانون من النقيلي الكلوي خلية سرطان 25 عاما، فضلا عن وجود مستوى عال من العدلات داخل ورمي في المرضى الذين يعانون من الأورام الصلبة المختلفة، 26 وقد اقترحت عن العوامل النذير للفقراء البقاء على قيد الحياة. وتقترح دراستنا أن العدلات قد تلعب دورا في حماية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية B من سرطان الخلايا التي يسببها عامل.
وباختصار، فإن طريقة موثوق بها وقابلة للتكرار وصفها هنا يمكن استخدام من قبل أي مختبر لجمع العدلات وخلايا وحيدات النوى من همهمةوالدم. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم التفريق بين HL60 الخلايا على طول الطريق المحببات لتفادي بعض المشاكل إسفنجة العصبونات مثل موت الخلايا المبرمج العفوية السريعة. واستخدمت هذه الأساليب لدراسة دور العدلات على حساسية خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إلى وكلاء المضادة للسرطان الغدد الليمفاوية حيث تظهر العدلات تأثير وقائي على خلايا سرطان الغدد الليمفاوية ضد هذه العوامل باستخدام 2D و 3D نظم الاستزراع. هذه الطرق يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الدراسات الفنية المتعادلة التي ينبغي تعميق فهمنا لدور العدلات في بيولوجيا السرطان. على وجه الخصوص يمكن استخدام هذه الطريقة لفهم الحديث المتبادل بين العدلات وخلايا الورم أو بين العدلات وغيرها من عناصر المكروية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
