Introduction
Células imunitárias inatas constituem uma proporção essencial das células dentro do microambiente do tumor e têm sido associados com a malignidade de tumores em pacientes e de modelos animais de cancro 1. Recentemente, tornou-se mais amplamente apreciado que as respostas imunitárias crónicas desempenham papéis críticos na promoção da progressão do tumor, metástase e resistência às quimioterapias 2. Os macrófagos são células imunes inatos importantes que foram mostrados para regular directamente a resposta das células de tumor à quimioterapia 3,4. No entanto, o papel dos neutrófilos, os principais intervenientes no sistema imunitário inato, na regulação da resposta do tumor ao tratamento anti-cancro não é conhecido. Os objectivos destes protocolos são a utilização de um método rápido e credível para separar os neutrófilos a partir de amostras de sangue CLL do paciente e para diferenciar células HL60 ao longo da via granulocitica, a fim de estudar o seu papel na regulação da sensibilidade de células de linfoma de agentes anti-linfoma.
5 e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores 6. Os neutrófilos têm um papel essencial no aumento de respostas imunes inatas eficazes para além das funções efectoras variáveis em várias condições patológicas 7. Por conseguinte, um método rápido e credível para isolar os neutrófilos a partir de outras células sanguíneas, tais como o método de separação por gradiente de densidade, é necessário para os estudos in vitro. Usando este método para isolamento de neutrófilos irá facilitar a investigação sobre as funções imunológicas mediadas por neutrófilos in vivo e ex vivo.
A capacidade de obter populações puras de neutrófilos é um primeiro passo importante para a investigação de pacientes com doenças imunológicas 8. Densidade método de separação por gradiente é uma técnica ideal em que é obtido um elevado rendimento de células. o metod envolve a adição de uma solução de gradiente de densidade na parte inferior de um tubo contendo sangue humano diluído seguido por centrifugação a 300 g durante 35 min, sem ruptura. O anel de células mononucleares é exibida na interface e os neutrófilos residir por baixo da primeira. Este método tem vantagens significativas em relação a outros métodos disponíveis, tais como kits de isolamento de neutrófilos que são muito mais caros 9. Além disso, o isolamento de neutrófilos do sangue humano por kits comerciais utilizando anticorpos dirigidos para um marcador de superfície específico para os neutrófilos humanos, aumentam o risco de activação ou diferenciação celular. Densidade método de separação por gradiente permite o isolamento de neutrófilos dentro de um curto período de tempo. Dentro do mesmo passo, as células mononucleares são também separados e recuperados. É uma técnica fundamental em que um elevado rendimento de células puras obtém-se, a fim de alcançar a integridade funcional.
A fim de imitar o tumor microenvironment, foram realizados experimentos em 3D. Dado a curta semi-vida dos neutrófilos in vitro, as experiências 3D com neutrófilos humanos frescos não são conclusivos. Por este motivo, as células promielocíticas (HL60) são induzidas a diferenciar-se em células de neutrófilos semelhante utilizando os indutores da diferenciação sulfóxido de dimetilo (DMSO) e ácido retinóico (RA). Usando células HL60 diferenciadas (HL60 diff) vai evitar ter diferentes respostas dos neutrófilos, devido ao isolamento de diferentes doadores.
Em 3D vitro modelos de cultura representam um estágio intermediário entre modelos in vitro 2D e modelos in vivo. Na cultura 2D, as células se espalhar sobre a superfície de plástico formando anexos não naturais de células a proteínas desnaturadas que são depositados sobre essa superfície sintética. Por outro lado, as células de cultura na forma 3D anexos célula-célula naturais, uma vez que as células e a matriz extracelular que são sintetizar o material natural ao qual eles estão ligados.Por esta razão, os modelos de co- cultura 3D, especialmente entre as células cancerosas e outros tipos de células, têm sido muito útil para indicar a sua contribuição para o crescimento do tumor, angiogénese e metástases. Como resultado, as culturas 3D fazer a cultura de células de imitar as condições fisiológicas que existem in vivo 10.
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Protocol
1. neutrófilos Isolamento e Co-cultura com células leucémicas primárias
NOTA: Os procedimentos foram realizados sob a aprovação do comitê de Lyon Hospital Ética com todos os pacientes que assinaram o consentimento informado.
- Isolamento de células leucémicas primárias e neutrófilos
- Recolhe tubos de sangue periférico em EDTA (1,8 mg de EDTA por mililitro de sangue) a partir de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crónica (CLL).
- Adicionar a cada 15 ml de sangue para um tubo estéril de 50 ml e dilui-se com 15 ml de RPMI (diluição 1: 1), em seguida, cuidadosamente e lentamente adicionar 15 ml de solução de gradiente de densidade para a parte inferior do tubo, sem misturar as fases. Certifique-se de que a solução do gradiente de densidade é à temperatura ambiente durante a preparação.
- Centrifugar a 300 xg durante 35 min à temperatura ambiente e sem travão. O sangue deve separar-se em quatro fases distintas, como mostrado na Figura 1A, de cima para baixo: plaquetas e plasma, as células mononucleares (Wanel hite), solução de gradiente de densidade, granulócitos e eritrócitos.
- Recolhe-se o anel branco que representa as células leucémicas primárias, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um novo tubo de 50 ml.
- Encher o tubo com PBS (contém cálcio e de magnésio) até 50 ml no total e centrifugar a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender o sedimento em 5 ml de PBS, em seguida, adiciona-se PBS a 50 ml, no total, e centrifugar a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender o sedimento com meio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina) para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular.
- Aspirar as fases superiores deixando a fase de granulócitos e eritrócitos e adicionar PBS até 25 ml, em seguida, adicione 3% dextrano em 0,9% NaClup a 50 ml no total. Misturar os tubos 10 vezes e mantê-los durante 30 min à temperatura ambiente sem misturar.
- Recolher o RBC-pobres uma camada de neutrófilos superiord colocá-los em um tubo limpo estéril de 50 ml e centrifugar os tubos a 300 g durante 10 min à temperatura ambiente. Ressuspender cada pellet com 5 ml de PBS, em seguida, adicionar tampão de lise dos glóbulos vermelhos até 50 ml no total.
- Manter os tubos no escuro durante 15 min à temperatura ambiente, em seguida, centrifugar a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente. Lavam-se as peletes com PBS (PBS adicionar-se até 50 ml no total), em seguida, centrifugar a 500 g durante 10 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender as peletes com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular. Manter 3 x 10 5 de cada tipo de célula em 50 ul de PBS-FBS (4%) em 5 ml de tubos de plástico para determinar a pureza do seu isolamento utilizando citometria de fluxo.
- Analisar as aparências morfológicas das Populações de células isoladas
- Para fazê-lo, ressuspender cada 3 x 10 4 neutrófilos e 3 x 10 4 células mononucleares em 150 ul de meio RPMI completo. Montar as lâminas de vidro, cartões de filtros e câmaras de amostras na centrífuga Cytospin, garantindo que tele centrifugar é bem equilibrado.
- Colocar cada tipo de célula para dentro da câmara da amostra e cito-centrifugadora a 750 xg durante 10 min à temperatura ambiente Remover as lâminas, placas de filtro, e as câmaras de amostra do centrifugador. Desmontar cuidadosamente, de modo a não danificar as células na lâmina. Descartar cartões de filtros e câmaras de amostras.
- Corar as células utilizando o kit de coloração de Giemsa e manter as lâminas durante 1 hora para secar. Examinar as células ao microscópio com uma ampliação de 100X.
- Testar a pureza de células isoladas por FACS
- Marcar as células leucémicas primárias isoladas com anticorpo CD19 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 6 células). Rotular os neutrófilos purificados com uma mistura de anticorpos anti-humanos listados na Tabela 1 (5? L / 10 6 células). Incubar as células em escuro durante 30 minutos a 4 o C.
- Lavam-se as células com 500 ul de PBS-FBS (4%) a centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min à TA.
- Ressuspender cada sedimento em 200 ul de PBS-FBS (4%).
- Analisar num citómetro de fluxo com a seguinte configuração óptica: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (BP 695/40 ), PE (BP 575/26); 633 nm do laser: APC (660/20 BP), a APC-Cy7 (780/60 BP). Garantir a compensação de cor.
- Co-cultura de células leucêmicas preliminares com autólogo de neutrófilos
- Semente de 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primárias, sozinho ou com neutrófilos autólogos na proporção de 1:10 em meio RPMI completo. Para fazer isso, ajustar o número de células por diluição de suspensões de células e adicionar 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primárias para 2 X 10 6 células / ml neutrófilos. Misture com cuidado.
- Adicionar 25 uM de inibidor de tirosina quinase de Bruton (Btk) (Ibrutinib) para as células. Incubar durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Celular de colheita e análise de FACS
- Collect as células em 5 ml de tubos de plástico para análise FACS e os tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA. Lavam-se as peletes com 1 ml de PBS-FBS (4%), em seguida, centrifugar a 300 g durante 5 min à TA.
- Ressuspender em peletes Anexina V e PI utilizando o kit comercial e incubar as células na obscuridade durante 10 min a RT. Analisar num citómetro de fluxo usando a estratégia de propagação da Figura 2A e a configuração óptica seguinte: laser de 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Garantir a compensação de cor.
2. Diferenciação de Células HL60 ao longo do Granulocítica Caminho e Sua Coculture com células RL linfoma B em modelo 3D
- Diferenciação de promielocítica humana (HL60) Células em Células de neutrófilos semelhante
- Ajustar o número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml, em seguida adicionar 1 uM de ácido retinóico (RA) e 1,25% de DMSO para induzir a diferenciação. Semente cada 3 x 10 5 2.
- Mais tarde, recolher as células e centrifugar a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender as células com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular.
- Depois dilui-se a suspensão de células em meio RPMI completo para ajustar o número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml e induzir novamente a sua diferenciação pela adição de 1 ^ M de ácido retinóico (RA) e 1,25% de DMSO. Sementes em cada 3 x 10 5 células HL60 por poço em placas de 48 poços e incuba-se durante mais 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Análise de diferenciação de HL60 (células HL60 diff)
- Recolher as células e centrifugar os tubos a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender o sedimento com meio RPMI completo para a contagem utilizando um contador de viabilidade celular.
- Para analisar as mudanças na expressão de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo. Coloque cada 3 x 10 5 5 células HL60 diff em 5 mL de tubos de plástico para análise FACS e os tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA.
- Ressuspender as pelotas em 50 ul de PBS-FBS (4%). Rotular as células com anti-CD11b humano conjugados com AF700 ou CD38 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 6 células). Incubar as células em escuro durante 30 minutos a 4 o C.
- Lava-se com 500 ul de PBS-FBS (4%), em seguida, centrifugar a 300 g durante 5 min à TA. Ressuspender as pelotas em 200 ul de PBS-FBS (4%).
- Analise no citómetro de fluxo usando a estratégia de propagação da Figura 3A e a configuração óptica seguinte: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb); 633 nm do laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- Para testar as alterações morfológicas no diff HL60, imobilizar as células em lâminas de vidro para exame microscópico.
- Para fazê-lo, ressuspender cada 3 x 10
- Colocar cada tipo de célula para dentro da câmara da amostra e cito-centrífuga a 1500 rpm durante 10 min à temperatura ambiente. Remova os slides, cartões de filtros e câmaras de amostras da centrifugadora. Desmontar cuidadosamente, de modo a não danificar as células na lâmina. Descartar cartões de filtros e câmaras de amostras.
- Corar as células utilizando o kit de coloração de Giemsa e manter as lâminas durante 1 hora para secar. Examinar as células ao microscópio com uma ampliação de 100X.
- Para fazê-lo, ressuspender cada 3 x 10
- 3-dimensional Cultura (3D)
NOTA: Certifique-se de que os materiais utilizados nesta experiência são frios e o experimento está ocorrendo no gelo.- Ressuspender cada 5 x 10 4 células RL, quer sozinhos ou misturados com Diff HL60 dif 1:10, com a matriz da membrana basal de 300 ul utilizando uma ponta de pipeta ml cortado com uma tesoura estéril, de modo a alargar a abertura de cerca de 2 a 3 mm. Evitar bolhas durante este passo.
- Sementes em cada 300 ul de suspensão de células / poço em placas de 24 poços. Evitar bolhas durante este passo. Incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C com 5% de CO 2, em seguida, adicionar 1 ml de meio completo RPMI a cada poço e incubar durante 7 dias a 37 ° C com 5% de CO 2. Mudar o meio de dois em dois dias. Adicionar 10 nM vincristina no dia 5.
- Análise FACS
- Após 7 dias de cultura, Aspirar o meio e lava-se cada cavidade com 1 mL de PBS arrefecido em gelo, duas vezes. Adicionar 3 ml / poço de PBS gelado-EDTA (5 mM). Retire o gel a partir do fundo da cavidade por raspagem usando a parte inferior da ponta da pipeta de 200 uL. Agitar ligeiramente a placa em gelo durante 30 min.
- Transferir suspensão de células em estéril tubo de 15 ml e agitar os tubos suavemente sobre ice durante mais 30 min. Verifique se o aparecimento de suspensão celular homogênea. (Se não for o caso, em seguida, agitar as células durante mais tempo ou adicionar mais PBS-EDTA).
- Centrifugar os tubos a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Lavam-se as peletes com PBS, depois, centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender com PBS-FBS (4%) e rotular com anticorpo CD19 anti-humano conjugado com PE-Cy7 e anticorpo CD38 anti-humano conjugado com APC (5? L / 10 6 células). Incubar no escuro durante 30 minutos a 4 o C.
- Lava-se com 500 ul de PBS-FBS (4%), em seguida, tubos de centrifugação a 300 g durante 5 min à TA. Volte a suspender as células com anexina V e PI usando kit comercial.
- Analisar em citômetro de fluxo usando a estratégia de selecção de Figura 4A e a seguinte configuração óptica: 488 nm do laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488/10 pb), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm do laser: APC (660/20 BP). Garantir a compensação de cor.
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Representative Results
Densidade método de separação por gradiente descrito aqui fornece as células leucémicas primárias e neutrófilos não estimulados isolados a partir do sangue de pacientes com LLC Figura 1A representa as diferentes camadas de sangue obtidas após centrifugação em gradiente de densidade (de cima para baixo:. Plaquetas e plasma, anel branco representam as células mononucleares, solução de gradiente de densidade, granulócitos e eritrócitos). Figura 1B e 1C mostram as diferenças nas aparências morfológicas entre os neutrófilos (células de multi-lóbulos núcleos) e células mononucleares, respectivamente.
Os resultados na Figura 1D representam a frente-de dispersão (FSC) vs lado de dispersão (SSC) lote de células leucémicas primárias (células mononucleares). Rotular esta população com CD19 anti-humano conjugado com APC mostra um deslocamento para a direita completa do histograma (Figura 1E), com apenas umapico, que indica que essa população é positivo para CD19 e puro. Os neutrófilos também são ≥90% puro conforme verificado por citometria de fluxo após a marcação dos neutrófilos isolados com uma mistura de anticorpos monoclonais conjugados de fluorocromo-listados na Tabela 1. A Figura 1F representa FSC vs SSC trama de dispersão dos neutrófilos isolados que são positivas para CD45 (Figura 1G), positivo para CD15 e negativo para CD14 (Figura 1H), positivo tanto para CD15 e CD16 (Figura 1I), positivo para CD16 e negativo para CD56 (Figura 1J).
Figura 1. Análise das aparências morfológicas e Pureza de células leucêmicas primários e neutrófilos isolados do sangue dos pacientes. (A) Representação esquemática representa diferentes camadas de sangue após gradi densidadeent centrifugação. (BC) de Giemsa coloração representa as diferenças morfológicas entre os neutrófilos (B) e (C) células leucémicas (células mononucleares) primários. Fotos foram tiradas por microscópio com ampliação de 100X. (D) Forward-dispersão (FSC) e lateral-dispersão (SSC) gráfico representa a população de células leucêmicas primária isolada. (E) células leucémicas primárias isolados foram marcadas com anti-CD19-APC e analisada para a expressão de CD19. A linha vermelha indica as células não marcadas e a linha azul indica células marcadas com anti-CD19-APC. (F) do FSC vs lote SSC dispersão representa a população de neutrófilos isolado. (GJ) Isolado neutrófilos foram marcados com uma mistura de anticorpos listados na Tabela 1 e analisados para a expressão de (L) CD45, (H) CD14 e CD15, (I), CD15 e CD16, (J) de um CD16d CD56. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| antígenos | fluorocromo | Clone |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tabela 1. conjugado com fluorocromo purificados anticorpos monoclonais utilizados para testar a pureza do isolado neutrófilos. Todos os anticorpos foram obtidos a partir de Miltenyi Biotech.
Figura 2A representa os portões de neutrófilos e células leucémicas primárias. Os neutrófilos são muito mais granular do que as células leucémicas primárias para que eles apareçam com maior SSC. Gating nas células leucémicas primárias co-cultivadas com neutrófilos na presença de Ibrutinib, os resultados mostram maior percentagem de células vivas (Figura 2C, 84,8%) em comparação com as células cultivadas isoladamente (Figura 2B, 53,1%). O gráfico a caixa na Figura 2D mostra que o decrease de viabilidade celular induzida por Ibrutinib foi significativamente inibida pela presença de neutrófilos (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 pacientes).
Figura 2. autólogo neutrófilos Proteger células leucêmicas primária contra Ibrutinib. O sangue foi coletado de pacientes diagnosticados com leucemia linfocítica crónica (LLC). células leucémicas primárias foram isolados e cultivados sozinhos ou em conjunto com neutrófilos autólogas (N), células leucémicas primárias Nratio 1:10 durante 24 h, na presença ou na ausência de 25 uM Ibrutinib. A percentagem de células leucémicas primárias vivo (AnexoIV negativo V / PI negativo) foi medida por coloração dupla com anexina V-FITC e PI, seguidos pela análise por citometria de fluxo. (A) para a frente-dispersão (FSC) e lateral-dispersão (SSC) gráfico representa os portões de neutrófilos e células leucémicas primárias. (B) bi-dimensional dot-blot mostra as percentagens de células leucémicas primárias vivos e apoptóticos cultivadas isoladamente e tratados com Ibrutinib 25 uM. (C) bi-dimensional dot-blot mostra as percentagens de células leucémicas primárias vivos e apoptóticos CO- cultivadas com neutrófilos e tratada com Ibrutinib 25? M. plot (D) Box representa a porcentagem de células leucémicas primárias vivas de 19 pacientes. Os dados são expressos como média ± DP. *** p <0,001 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A meia-vida curta de neutrófilos in vitro, torna a sua utilização em cultura 3D ineficaz. A diferenciação de células HL60 ao longo da via granulocitica foi induzida por indutores de diferenciação. Dois parâmetros diferentes (expressão de marcadores de superfície celular e chang morfológicaES) foram usadas para medir a diferenciação de células HL60. FSC vs SSC trama de dispersão na Figura 3A mostra que as células HL60 são maiores em tamanho em comparação com as células HL60 diff com maior FSC. Marcação das células HL60 (diff ou HL60) com anticorpo anti-CD11b humano conjugado com AF700 e CD38antibody anti-humana conjugada com APC mostra um aumento na expressão de CD38 e CD11b (Figura 3B) na diferenciação que é um indicativo da diferenciação granulocítica. Células HL60 diff também mostram alterações morfológicas detectadas pelo aparecimento de núcleos de multi-lóbulos (Figura 3C).
Figura 3. parâmetros estruturais de células diferenciadas HL60. (A) Forward-dispersão (FSC) e lateral-dispersão (SSC) parcelas representam HL60 e células HL60 diferenciadas (diff HL60). (B) HL60 e HDiff células L60 foram marcadas com anti-CD11b-AF700 ou anti-CD38-APC, seguido por análise de citometria de fluxo. Após gating em cada população de células no FSC vs SSC-A-Um gráfico de dispersão (A), as células foram analisadas para a expressão de CD38 ou CD11b. Células (C) HL60 mostrar alterações morfológicas consistentes com diferenciação para granulócitos. Fotos foram tiradas por microscópio com ampliação de 100X. seta preta corajosa apontar o núcleo multi-lobed. Os gráficos são representativos de cinco experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para testar o efeito de células HL60 em diff regulação da resposta de células RL a vincristina no modelo 3D, RL células foram cultivadas isoladamente ou com Diff HL60 na matriz da membrana basal, na presença ou ausência de vincristina a 10 NM. Usando a estratégia de gating mostrado na Figura 4A, as duas populações são discriminados com base na expressão de CD19 e CD38; Células RL positivas para CD19 e células HL60 diff positivas para CD38. Gating em células RL co-cultivadas com células HL60 diff na presença de vincristina, os resultados mostram uma maior percentagem de células vivas (Figura 4C, 35,9%) em comparação com células cultivadas RL sozinho (Figura 4B, 19,7%). O gráfico de barras na Figura 4D mostra um aumento significativo na percentagem de células vivas RL (CD19 positivo negativo Anexina V / PI negativo) na presença de células HL60 diff (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Figura 4. células HL60 diff neutrófilos-como proteger células RL linfoma contra Vincristina em Cultura 3D. Células RL foram cultivadas isoladamente ou em conjunto com as células HL60 em diff RL: HL60 relação dif 01:10 durante 7 dias na matriz de membrana basal. No dia 5, a vincristina (VCR) foi adicionado a uma concentração de 10 nM. Os esferóides foram dissociadas no dia 7 e as células foram marcadas com anti-CD19-PECy7 e anti-CD38-APC, em seguida, ressuspensas com anexina V-FITC e PI, seguido de análise de citometria de fluxo. (A) para a frente-dispersão (FSC) e lateral-dispersão (SSC) gráfico representa os portões de células RL e células diff HL60. (B) Bi-dimensional dot-blot mostra as percentagens de células RL vivos e apoptóticos cultivadas sozinho e tratadas com 10 nM a vincristina. (C) DOT- Bi-dimensional blot mostra as percentagens de células vivas e RL apoptóticas co-cultivadas com diff e HL60 tratadas com 10 nM de vincristina. (D) o gráfico de barras que representa a percentagem de células vivas RL. Os dados são expressos como média ± DP. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrito aqui, um protocolo eficaz, simples, rápido e barato para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano com elevada pureza utilizando a abordagem de centrifugação em gradiente de densidade e nas mesmas células mononucleares passo também são separados e recuperados. As populações de células isoladas são ≥90% puro.
Vários métodos estão disponíveis para o isolamento dos neutrófilos a partir de sangue humano. Estes incluem métodos semelhantes utilizando gradientes descontínuos 11,12, ou utilizando kits comerciais para isolamento de neutrófilos através da selecção positiva imuno-magnética durante a qual os neutrófilos são imuno-magnéticas marcadas com um anticorpo específico, como CD16 anti-humano, em seguida, os neutrófilos enriquecidos por ligação da CD16- células positivas sobre uma coluna magnética 13. kits comerciais com selecção negativa imuno-magnética também estão disponíveis durante o qual o sangue total ou suspensão de granulócitos são rotulados com um cocktail de anticorpos que se ligam a células de outros thaN neutrófilos 9 (isto é, complexos de anticorpo que rotulam GVs, plaquetas e células indesejáveis, tais como CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glicoforina A e partículas magnéticas revestidas com dextrano), em seguida, os neutrófilos são enriquecidas por eluição como o anticorpo- fracção negativa de células que não se ligam à coluna magnética. Além disso, os neutrófilos podem ser isolados por meio de fluorescência de células activadas Triagem 14.
Algumas técnicas têm sido mostrados para fornecer elevados rendimentos de neutrófilos puros, tais como selecção positiva imuno-magnética. No entanto, este método tem desvantagens em comparação com métodos de centrifugação em gradiente de densidade devido aos agentes de marcação que se ligam à superfície de neutrófilos e isto poderia potencialmente alterar a sua função por induzir a sua activação ou a diferenciação. Também utilizando o método de selecção positiva de imuno-magnética, a ligação de neutrófilos marcados com anticorpo sobre uma coluna magnética para a separação e este pode também afectar a sua função.Activadas por fluorescência triagem celular tem outra limitação na medida em que este método requer um tempo mais longo para recolher as células que podem afectar negativamente a sobrevivência de neutrófilos devido à sua semi-vida curta.
método de centrifugação em gradiente de densidade são muito comparáveis e a pureza dos neutrófilos pode ser superior a 90%, utilizando ambos os procedimentos, mas o primeiro é um gradiente de duas camadas que é tecnicamente menos exigente em relação à solução de gradiente de camadas que consistem em 40%, 60% e 80% vol / vol em PBS. Ele foi mencionado por Swamydas et al. 15, que miscigenação das interfaces de solução de gradiente, muitas vezes ocorre devido às pequenas diferenças de densidade entre as três camadas. No que diz respeito às abordagens de selecção negativa imuno-magnética, eles também têm sido referidos como sendo eficazes para o isolamento dos neutrófilos com elevada pureza e viabilidade 9. Sua vantagem sobre a seleção imuno-magnético positivo e fluorescência Activated Sorting celular é que os neutrófilosnão são rotulados com quaisquer agentes de marcação e não se ligam à coluna magnética, evitando assim a activação das células, mas este método é muito mais dispendiosa e mais demorada em comparação com o método de gradiente de densidade.
Os neutrófilos normalmente sofrem apoptose espontânea rápida tanto in vitro como in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells retêm muitas das características dos progenitores de leucócitos humanos, tais como o potencial para sofrer diferenciação em neutrófilos 18. Ao contrário dos neutrófilos, células diff HL60 não rapidamente sofrem apoptose e usando estas células resolve o problema de ter diferentes respostas dos neutrófilos, devido ao seu isolamento a partir de diferentes doadores.
Recentemente, culturas 3D se tornam mais maduros e pertinentes a fisiologia humana e animal, e um modelo atrativo para a pesquisa biológica diferente, especialmente no domínio do cancro. A mudança padrão de 2D para 3D cultura está progredindo rapidamente itselfdno o último é mais visível durante o estudo de várias condições patológicas, como o cancro 19. Há uma crescente consciência das desvantagens da cultura 2D, onde a adição de uma terceira dimensão ao ambiente de uma célula é importante, a fim de dar uma olhada mais de perto a importância das interações celulares 20 e estudar as diferenças no comportamento celular e características. Cultura 3D cria um ambiente semelhante às condições em um organismo vivo (por exemplo., Ser humano) que conduz a investigação mais relevante. No entanto, a cultura 3D envolve a interação complexa entre os diferentes parceiros, tais como células, matrizes extracelulares e fluidos intersticiais que não fazer presente na cultura 2D. Assim, os esforços serão necessários para estabelecer a calibração método e contar com as boas práticas laboratoriais, bem como suprimentos eficazes especialmente as marcas comerciais que são amplamente testados e monitorados.
O microambiente do tumorconsiste em vários tipos de células, incluindo muitas populações de células imunitárias que participem na tumorigénese e regulam, metástase e resposta a agentes antineoplásicos 21,22. Vários estudos têm mostrado que um aumento da infiltração dos neutrófilos nos tumores é significativamente correlacionada com a resistência adquirida a vários agentes anti-cancro tais como a terapia anti-VEGF 23,24. Além disso, a elevação de neutrófilos no pré-tratamento de contagem em pacientes com carcinoma de células renais metastático 25, bem como a presença de um elevado nível de neutrófilos intra-tumoral em pacientes com tumores sólidos diferentes, 26 foram propostos como factores de prognóstico para a sobrevivência pobre. O nosso estudo sugere que os neutrófilos podem desempenhar um papel na protecção de células de linfoma B de anticancerígeno apoptose induzida por agente.
Em resumo, o método de confiança e reprodutível descrito aqui pode ser empregue em qualquer laboratório para recolher os neutrófilos e as células mononucleares de Humum sangue. Além disso, a diferenciação de células HL60 ao longo da via granulocitica é apresentada, a fim de evitar alguns problemas neurophil tais como a apoptose espontânea rápida. Estas abordagens foram usadas para estudar o papel dos neutrófilos sobre a sensibilidade de células de linfoma de agentes anti-linfoma em que os neutrófilos mostram um efeito protector nas células de linfoma contra estes agentes usando sistemas de cultura de 2D e 3D. Estas abordagens podem ser utilizadas para uma variedade de estudos funcionais de neutrófilos que deve aprofundar a compreensão do papel dos neutrófilos na biologia do cancro. Em particular, este método pode ser usado para melhor compreender a conversa cruzada entre os neutrófilos e as células tumorais ou entre os neutrófilos e outros componentes do microambiente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
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