Introduction
선천성 면역 세포는 종양 미세 환경 내에서 세포의 중요한 비율을 구성하는 환자, 암 (1)의 동물 모델에서 종양의 암과 연관되어왔다. 최근에,보다 널리 만성 면역 반응은 화학 요법에 대한 종양이 진행, 전이 저항 증진에 중요한 역할을하는 것으로 인식되고있다. 식세포 직접 화학 요법에 3,4- 종양 세포 반응을 조절하는 것으로 나타났다 중요한 선천성 면역 세포이다. 그러나 항암 치료에 대한 종양 반응을 조절하는 호중구의 선천 면역 키 선수의 역할은 알려져 있지 않다. 이러한 프로토콜의 목적은 CLL 환자의 혈액 샘플로부터의 호중구를 분리하는 빠르고 신뢰할만한 방법을 사용하여 안티 림프종 에이전트 림프종 세포의 민감도를 조절하는 역할을 연구하기 위하여 과립 통로 따라 HL60 세포를 구별한다.
6 침입에 대한 방어의 첫 번째 줄 혈액 (5) 행동의 선천성 면역 시스템의 가장 풍부한 세포의 구성 요소입니다. 호중구 여러 병리 적 상태 (7)에 가변 이펙터 기능 이외에 유효 선천성 면역 반응을 상승에 필수적인 역할을한다. 따라서, 이러한 농도 구배 분리법과 같은 다른 혈액 세포에서 호중구를 분리하는 빠르고 신뢰할만한 방법은 시험 관내 연구에 필요하다. 호중구 격리를 위해이 방법을 사용하면 생체 내 및 생체에서 호중구 매개 면역 기능에 대한 추가 연구를 촉진 할 것이다.
호중구 순수한 집단을 수득하는 능력은 면역 학적 질환 환자의 팔 조사 중요한 첫 단계이다. 밀도 구배 분리 방법은 세포의 높은 수율을 수득하는 이상적인 방법이다. 운전 방식D는 쉬지 않고 35 분 동안 300g으로 원심 분리 한 다음 희석 된 인간 혈액을 함유하는 튜브의 바닥에서 밀도 구배 용액의 첨가를 포함한다. 단핵 세포의 링 인터페이스에 표시하고, 호중구 전 이하 상주. 이 방법은 훨씬 더 9 비싼 호중구 분리 키트로 사용 가능한 다른 방법에 대한 상당한 이점이있다. 또한, 인간의 호중구에 대한 특정 표면 마커에 관한 항체를 사용하여 상업용 키트에 의해 인간 혈액으로부터 분리 호중구 세포 활성화 또는 분화의 위험을 증가시킨다. 밀도 구배 분리 방법은 단시간 호중구의 분리를 허용한다. 동일 단계 내에서 단핵 세포는 분리 회수된다. 순수한 세포의 높은 수율 무결성 기능을 달성하기 위해 수득되는 기본 기술이다.
종양 microenv을 모방하기 위해ironment, 3 차원 실험을 수행 하였다. 체외에서 호중구의 짧은 반감기를 고려할 때, 신선한 인간의 호중구와 3D 실험은 결정적인 없습니다. 이런 이유로, 전 골수성 (HL60) 세포 분화 유도제 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 및 레티노 산 (RA)를 사용하여 호중구와 같은 세포로 분화 유도된다. 차별화 된 HL60 세포 (HL60은 diff)를 사용하여 인해 다른 기증자로부터 격리에 호중구의 다른 응답을 갖는 것을 방지 할 수 있습니다.
체외 차원에서 문화 모델은 체외 2D 모델 사이의 생체 내 모델에서 중간 단계를 나타냅니다. 2D 문화에서, 세포는이 합성 표면에 변성되어 퇴적 단백질에 자연스러운 세포의 첨부 파일을 형성하는 플라스틱 표면에 확산. 반대로, 세포가 세포 외 기질의 합성 보낸 3D 배양 형태 천연 세포 - 세포 부착에 세포는 이들이 결합되어있는 천연 물질이다.이러한 이유로, 특히 암 세포 및 다른 세포 유형 간의 3D 공동 배양 모델은 종양 성장, 혈관 신생 및 전이에 대한 기여를 나타내는 매우 유용한왔다. 결과적으로, 3 차원 배양은 세포 배양 물이 생체 내 (10)에 존재하는 생리적 조건을 모방 할.
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Protocol
기본 백혈병 세포 1. 호중구의 분리 및 공동 문화
참고 : 절차는 동의서에 서명 모든 환자와 리옹 병원 윤리위원회의 승인하에 실시 하였다.
- 기본 백혈병 세포 및 호중구의 분리
- 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)으로 진단 된 환자에서 EDTA (혈액의 밀리리터 당 1.8 mg을 EDTA)에 말초 혈액의 튜브를 수집합니다.
- 멸균 50 ㎖ 튜브에 혈액을 각각 15 ㎖에 첨가하고 15 ml의 RPMI로 희석 하였다 (희석 1 : 1)로 조심스럽게 천천히 위상 혼합없이 상기 튜브의 하단에 밀도 구배 용액의 15 mL로 추가한다. 밀도 구배 용액을 제조 RT에있을 수 있도록한다.
- RT에서 브레이크없이 35 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 그림 1A, 위에서 아래와 같이 피가 네 가지 단계로 구분한다 : 혈소판과 혈장, 단핵 세포 (w하이트 링) 밀도 구배 용액 과립구 및 적혈구.
- 새로운 50 ML 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전송에 기본 백혈병 세포를 나타내는 흰색 반지를 수집합니다.
- PBS로 튜브를 실온에서 10 분 동안 300g에 총과 원심 분리기에 50 ㎖까지 (칼슘과 마그네슘을 포함)를 입력합니다.
- 5 PBS 후 RT에서 10 분 동안 300g로 원심 분리하고 총 50 ㎖의 PBS까지 추가 ml로 펠렛을 재현 탁.
- 완전한 RPMI 배지로 펠렛을 재현 탁 (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 글루타민, 100 U 보충 / ㎖ 페니실린 및 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신) 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트.
- 대기음는 상위 단계 과립구와 적혈구 위상을 떠나 25 ml의 최대 PBS를 추가는 총 50ml로 0.9 % NaClup에 3 % 덱스 트란을 추가합니다. 튜브 10 번을 혼합하고 혼합하지 않고 실온에서 30 분 동안 보관하십시오.
- 상단 RBC 부족한 호중구 층를 수집깨끗한 멸균 50 ㎖ 튜브로 배치하고 RT에서 10 분 동안 300g로 원심 분리 튜브 거라고. PBS 후 총 50 ㎖까지 적혈구 용해 완충액을 추가 5 ㎖ 각 펠렛을 재현 탁.
- RT 후 RT에서 10 분 동안 500g으로 원심 분리기에서 15 분 동안 어두운 데에서 튜브를 유지한다. PBS로 알약을 (총 50 ㎖까지 PBS를 추가) 다음 실온에서 10 분간 500 g에서 원심 분리 세척 할 것.
- 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지 펠렛을 재현 탁. 유세포 사용하여 분리의 순도를 결정하기 위해 5 ㎖ 플라스틱 튜브에 50 ㎕의 PBS-FBS (4 %)에서 각 세포 유형의 3 × 105을 유지한다.
- 분리 된 세포 집단의 형태 학적 출연 분석
- 이를 위해, 각각 3 × 104 호중구 150 μL 완전 RPMI 배지에서 3 × 104 단핵 세포를 재현 탁. 즉 t을 보장 cytospin 원심 분리기에서 유리 슬라이드 필터 카드 및 샘플 챔버를 조립그는 원심 분리기는 균형이다.
- 원심 분리기에서 슬라이드, 필터 카드 및 샘플 실을 제거 실온에서 10 분 동안 750 XG에서 샘플 챔버 및 사이토 원심 분리기로 각 셀 유형을 놓습니다. 슬라이드의 세포를 손상시키지 않도록 신중하게 분해한다. 필터 카드 및 샘플 챔버를 폐기하십시오.
- 김사 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하고 1 시간 건조 할 슬라이드를 유지합니다. 100X 배율 현미경으로 세포를 검사합니다.
- FACS에 의해 고립 된 세포의 순도 테스트
- APC에 접합 된 항 - 인간 CD19 항체 (5 μL / 10 6 세포)와 격리 된 차 백혈병 세포를 레이블. 표 1 (5 μL / 10 6 세포)에 나열된 항 인간 항체의 혼합물로 정제 된 호중구 레이블. 4 O ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 세포를 부화
- 500 ㎕의 PBS-FBS (4 %) RT에서 5 분 동안 300g의 튜브를 원심 분리기로 세포를 씻으십시오.
- 200 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 각 펠렛을 재현 탁.
- , SSC-A (488 /이 10bp), FITC (BP 530/30)를 PerCP-Cy5.5 (40분의 695 BP FSC-A (488 nm의) : 488 nm의 레이저 : 다음 광학 구성을 사용하여 사이토 흐름 분석 ), PE (BP를 575/26); 633 nm의 레이저 : APC (BP를 660/20), APC-Cy7 (BP를 780/60). 색 보정을 확인합니다.
- 자가 호중구와 차 백혈병 세포의 공 배양
- 시드 차 백혈병 세포 단독으로 또는 완전 RPMI 배지에서 비 1:10자가 호중구로 2 × 105 세포 / ml. 이렇게 희석하여 세포 현탁액을 세포 수를 조절하고 2 × 106 세포 / ml로 호중구 주 백혈병 세포를 2 × 105 세포 / ㎖를 추가한다. 조심스럽게 섞는다.
- 세포에의 Bruton의 티로신 키나제 (BTK) 억제제 (ibrutinib)의 25 μM을 추가합니다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 24 시간 동안 품어.
- 세포 수확 및 FACS 분석
- 콜요법 FACS 분석 및 원심 분리기 RT에서 5 분 동안 300g의 튜브 5 ML의 플라스틱 튜브에 세포. 다음 실온에서 5 분간 300 g에서 원심 분리기 1 ml의 PBS-FBS (4 %)와 펠렛을 씻으십시오.
- 상업 키트를 사용하여 실온에서 10 분 동안 어둠 속에서 세포를 배양 재현 탁의 넥신 V의 펠렛 및 PI. (FSC-A (488 ㎚), SSC-A (488 /이 10bp), FITC는 (BP 530/30), PI 610 : 488 nm의 레이저 :도 2A의 게이트 전략을 사용하여 유세포과 같은 광학 구성에 분석 / 20 BP). 색 보정을 확인합니다.
과립 통로 및 3D 모델에서 RL 림프종 B 세포와의 공동 배양을 따라 HL60 세포의 분화 (2)
- 호중구와 같은 세포로 인간 전 골수성 (HL60) 세포의 분화
- / ㎖가 그들의 분화를 유도하기 위해 1 μm의 레티노 산 (RA) 및 1.25 %의 DMSO를 추가 3 × 10 5 세포에 HL60 세포 수를 조정합니다. 각 3 × 10 5 종자 2, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양한다.
- 그 후, 실온에서 5 분 300g에 세포와 원심 분리기를 수집합니다. 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지로 세포를 재현 탁.
- 이어서 용액 3 × 105 세포 /으로 HL60 세포의 수를 조정하고 1 μM 레티노 산 (RA) 및 1.25 % DMSO를 첨가하여 다시 분화를 유도하는 완전 RPMI 배지에서 세포 현탁액을 희석. 당 잘 48 웰 플레이트에 각 3 × 10 5 HL60 세포를 종자와 5 % CO 2와 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 배양한다.
- HL60 분화 분석 (HL60의 차이)
- 세포를 수집하고 RT에서 5 분 동안 300g로 원심 분리 튜브. 세포 생존 카운터를 이용하여 카운트 완전한 RPMI 배지 펠렛을 재현 탁.
- 유동 세포 계측법에 의한 세포 표면 마커의 발현에서의 변화를 분석. 각 3 × 10 (5)를 배치 5 HL60은 diff 세포.
- 50 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 펠렛을 재현 탁. AF700 또는 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38 (5 μL / 10 6 세포)에 접합 된 항 - 인간 CD11b를 가진 세포를 레이블. 4 O ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 세포를 부화
- 다음 실온에서 5 분 300g에 원심 분리기 500 μl의 PBS-FBS (4 %)로 세척. 200 ㎕의 PBS-FBS (4 %)의 펠렛을 재현 탁.
- 488 nm의 레이저 :도 3A의 게이팅 전략과 같은 광학 구성을 이용하여 유동 세포 계측기에 분석 FSC-A (488 나노 미터), SSC-A (488 /이 10bp); 633 nm의 레이저 : APC (660/20 BP), 알렉사 플 루어 700 (BP를 730/45).
- HL60은 diff의 형태 학적 변화를 테스트하려면, 현미경 검사 용 유리 슬라이드에 세포를 고정.
- 이렇게하려면 각 3 × 10을 재현 탁
- 실온에서 10 분 동안 1,500 rpm으로 샘플 챔버 및 사이토 원심 분리기로 각 셀 유형을 놓습니다. 원심 분리기에서 슬라이드, 필터 카드 및 샘플 실을 제거합니다. 슬라이드의 세포를 손상시키지 않도록 신중하게 분해한다. 필터 카드 및 샘플 챔버를 폐기하십시오.
- 김사 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하고 1 시간 건조 할 슬라이드를 유지합니다. 100X 배율 현미경으로 세포를 검사합니다.
- 이렇게하려면 각 3 × 10을 재현 탁
- 3 차원 (3D) 문화
주 :이 실험에 사용 된 물질은 저온이며 실험 얼음 일어나고 있는지 확인.- 단독으로 또는 HL60은 diff와 혼합하거나, 각 5 × 10 4 RL 세포를 재현 탁 DIFF 1:10 약 2 내지 3 mm의 개구부를 넓게하기 위해 멸균 가위로 절단 한 ml의 피펫 팁을 사용하여 300 ㎕의 기저막 매트릭스. 이 단계에서 거품을 피하십시오.
- 24 웰 플레이트에 잘 / 세포 현탁액 각각 300 μl를 시드. 이 단계에서 거품을 피하십시오. 그 다음 각 웰에 대해 RPMI 배지를 완료하고, 5 % CO 2, 37 ℃에서 7 일간 배양한다 ㎖로 1을 추가 5 % CO 2, 37 ℃에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다. 매 2 일 매체를 변경합니다. 하루 5에서 10 나노 빈 크리스틴을 추가합니다.
- FACS 분석
- 문화 7 일 후, 매체를 대기음 두 번 1 ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 각 웰을 씻는다. 3 ㎖ / 얼음처럼 차가운 PBS-EDTA (5 mM)을 잘을 추가합니다. 200 μL 피펫 팁의 바닥을 이용하여 긁어 웰의 바닥에서 겔을 분리. 30 분 동안 얼음에 부드럽게 판을 흔들어.
- 멸균 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 IC에 부드럽게 튜브를 흔들또 다른 30 분 동안 전자. 균일 한 세포 현탁액의 모양을 확인합니다. (이 경우가 아니라면, 다음 긴 시간 동안 세포를 흔들 이상의 PBS-EDTA 추가).
- RT에서 10 분 동안 300 XG에서 튜브를 원심 분리기. PBS로 펠릿 후 RT에서 10 분 동안 300 × g으로 원심 분리로 세척 하였다.
- PBS-FBS (4 %)으로 재현 탁 및 PE Cy7하고 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38 항체 (5 μL / 10 106 세포)를 접합 항 - 인간 CD19 항체 레이블. 4 오 ℃에서 30 분 동안 어둠 속에서 품어
- 실온에서 5 분 동안 300g에 500 ㎕의 PBS-FBS (4 %) 원심 분리기 튜브로 씻으십시오. 상업용 키트를 사용하여 아 넥신 V 및 PI로 세포를 재현 탁.
- 도 4a의 게이팅 전략을 사용 사이토 흐름을 분석하고 다음 광학 구성 : 488 nm의 레이저 : FSC-A (488 ㎚), SSC-A (488 /이 10bp), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm의 레이저 : APC (BP를 660/20). 색 보정을 확인합니다.
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Representative Results
흰색 환 단핵 세포이고, 혈소판 혈장 :. 여기에 설명 된 농도 구배 분리법은 CLL 환자의 혈액에서 분리 된 일차 백혈병 세포 및 자극되지 호중구도 1a는 위에서 아래로 (밀도 구배 원심 분리 후의 다른 혈액 층을 나타낸다 제공 밀도 구배 용액, 과립구 및 적혈구).도 1b 및 1c는 각각 호중구 (멀티 로브 핵 세포)와 단핵 세포의 형태 학적 외관의 차이를 나타낸다.
그림 1D의 결과는 기본 백혈병 세포 (단핵 세포)의 측면 산란 (SSC) 플롯 대 전방 산란 (FSC)을 나타냅니다. 하나와 히스토그램 (그림 1E)의 전체 오른쪽 시프트는 APC에 접합 된 항 - 인간 CD19이 인구를 보여줍니다 라벨 붙이기이 인구는 CD19과 순수에 대한 긍정적 인 것을 나타냅니다 피크. 세포 계측법 표 1에, 형광 접합 된 단일 클론 항체의 혼합물로 분리 된 호중구 라벨 후 흐름에 의해 확인으로 호중구는 ≥90 % 순수하다. 그림 1 층은 CD45에 대한 긍정적 고립 된 호중구의 SSC의 산점도 대 FSC (그림을 나타냅니다 1G), CD14 (그림 1H에 대한 CD15 양성 및 음성), CD56 (그림 1J를 들어, CD15 및 CD16 (그림 1I) 모두 긍정적 인 긍정적 인 CD16 및 음수).
환자들의 혈액에서 고립 된 형태 학적 외관 및 기본 백혈병 세포의 순도 및 호중구의 그림 1. 분석. (A) 개략도 밀도 GRADI 후 다른 혈액 층을 나타낸다엔트 원심이. (BC) 김사 염색 (B) 및 호중구 (C) 주요 백혈병 세포 (단핵구)의 형태의 차이를 나타낸다. 사진은. 100X 배율 현미경으로 촬영 (D) 앞으로 산란 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 플롯은 고립 된 차 백혈병 세포 인구를 나타냅니다 하였다. (E) 절연 차 백혈병 세포는 항 CD19-APC와 함께 표시 하였다 CD19의 발현을 분석 하였다. 빨간색 선은 레이블이없는 세포를 나타내고 파란색 선은 항 CD19-APC로 표지 세포를 나타냅니다. (F) FSC는 SSC의 산점도 대 고립 된 호중구 인구를 나타냅니다. (GJ)에 격리 된 호중구 표에 나와있는 항체의 혼합물로 표지 된 (1) 및 (G) CD45 (H) CD14 및 CD15, (I) CD15과 CD16, (J) CD16의의 발현 분석D CD56입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항원 | 형광 색소 | 복제 |
| CD14 | APC-Vio770 (CY-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | 를 PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | 체육 | AF12-7H3 |
표 1. 형광 색소 - 복합 정제 된 단일 클론 항체는 고립 된 호중구의 순도를 테스트하는 데 사용됩니다. 모든 항체가있는 Miltenyi 생명 공학에서 얻어졌다.
도 2a에서 SSC의 산점도 대 FSC는 호중구 및 기본 백혈병 세포의 문을 나타냅니다. 호중구는 훨씬 더 세분화 된 기본 백혈병 세포가 그래서 그들은 더 높은 SSC와 함께 표시보다 있습니다. ibrutinib의 존재 호중구와 공 배양 차 백혈병 세포상의 게이팅 결과는 살아있는 세포의 높은 비율 단독 배양 된 세포와 비교하여 (도 2C, 84.8 %) (도 2B, 53.1 %)을 나타낸다. 그림 2D의 상자 그래프는 그 decreas를 보여줍니다ibrutinib에 의해 유도 된 세포 생존의 전자는 크게 호중구의 존재 (40.1 ± 3.1 대 60.1 ± 3.5, P <0.001, 19 명)에 의해 억제되었다.
2.자가 호중구가 Ibrutinib. 혈액에 대한 기본 백혈병 세포를 보호 그림은 만성 림프 구성 백혈병 (CLL)으로 진단 된 환자에서 수집되었다. 기본 백혈병 세포는 격리 및 기본 백혈병 세포에서자가 호중구 (N)와 단독 또는 함께 배양 하였다 : 24 시간 동안 Nratio 1:10 존재 또는 25 μM의 ibrutinib의 부재이다. 라이브 차 백혈병 세포의 비율 (Annexiv V 음 / PI 부정적인)는 유세포 분석에 의해 다음 넥신 V-FITC와 PI 이중 염색에 의해 측정 하였다. (A) 앞으로 산란 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 줄거리는 호중구 및 기본 백혈병 세포의 문을 나타냅니다. (B) 양성 차원 도트 오 살아과 세포 사멸 차 백혈병 세포 만 배양 및 25 μM의 ibrutinib 처리의 비율을 보여줍니다. (C) 양성 차원 도트 오 살아과 세포 사멸 차 백혈병 세포의 비율이 공동 -를 보여줍니다 호중구 배양 및 25 μM의 ibrutinib 처리 하였다. (D) 박스 플롯은 19 명의 살아 기본 백혈병 세포의 비율을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. *** p <0.001 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
체외에서 호중구의 짧은 반감기는 3D 문화에서의 사용은 비효율적합니다. 과립 경로를 따라 HL60 세포의 분화는 분화 유도 물질에 의해 유도했다. 두 개의 다른 매개 변수 (세포 표면 마커의 발현 및 형태학 창ES) HL60의 분화를 측정하는 데 사용 하였다. 도 3a에서 SSC 분산 플롯 대 FSC는 HL60 세포가 더 높은 FSC와 HL60은 diff 세포에 비해 크기가 더 큰 것으로 나타났다. 과립 분화의 나타내는 분화시 CD11b를 증가 및 CD38 발현 (그림 3b는) AF700 및 APC에 접합 된 항 - 인간 CD38antibody에 접합 된 항 - 인간 CD11b를 항체와 세포 (HL60 또는 HL60은 diff)를 보여줍니다에 레이블. HL60은 diff 세포는 또한 멀티 잎 모양 핵 (그림 3C)의 모양에 의해 검출 된 형태 학적 변화를 보여줍니다.
그림 3. 차별화 된 HL60 세포의 구조 매개 변수. (A) 앞으로 산란 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 플롯 HL60 차별화 된 HL60 세포 (HL60은 diff)를 나타냅니다. (B) HL60 및 H를L60은 diff 세포 유동 세포 계측법 분석 하였다 항 -CD11b-AF700 또는 항 CD38-APC으로 표시 하였다. SSC-A 산점도 (A) 대 FSC-A의 각 세포 집단 게이팅 후, 세포는 CD11b 또는 CD38의 발현에 대해 분석 하였다. (C) HL60 세포는 과립구쪽으로 분화와 일치하는 형태 변화를 나타낸다. 사진은 100X의 배율 현미경으로 촬영되었다. 굵은 검은 색 화살표는 다중 잎 모양 핵을 가리 킵니다. 그래프 다섯 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3D 모델에서 빈 크리스틴에 RL 세포 반응을 조절하기에 HL60의 DIFF 세포의 효과를 시험하기 위해, RL 세포는 단독으로 또는 10 N에서 빈 크리스틴의 유무에 기저막 매트릭스 HL60의 DIFF 배양 하였다도 4a에 도시 된 게이팅 전략을 사용 M.은 두 집단은 CD19 및 CD38 발현에 기초하여 판별된다; CD38 양성 CD19 및 HL60은 diff 셀에 대한 긍정적 인 RL 세포. 빈 크리스틴의 존재하에 HL60 diff의 세포와 공동 배양 된 RL 세포상의 게이팅 결과는 살아있는 세포의 높은 비율 단독 배양 RL 세포에 비하여 (도 4C, 35.9 %) (도 4b, 19.7 %)을 나타낸다. 도 4d에 막대 그래프는 HL60의 DIFF 세포 (19.5 ± 0.2 대 33.1 ± 1.0, p <0.001)의 존재 하에서 살아있는 RL 세포의 비율이 크게 증가 (음 CD19 양성 아 넥신 V / PI 음극)을 나타낸다.
그림 4. 호중구와 같은 HL60은 diff 세포는 3D 문화에 빈 크리스틴에 대한 RL 림프종 세포를 보호합니다. RL 세포를 기저막 매트릭스에서 7 일간 HL60 DIFF 비 1시 10분 : RL에서의 DIFF HL60 세포를 단독으로 또는 함께 배양 하였다. 5 일째에, 빈 크리스틴 (VCR)는 10 nM의 농도로 첨가 하였다. 구 상체는 7 일째에 분해하고, 세포를 유세포 분석 하였다 넥신 V-FITC와 PI로 재현 탁 항 CD19-PECy7 및 항 CD38-APC로 표지 하였다. (A) 앞으로 산란 (FSC) 및 측면 산란 (SSC)의 플롯 RL 세포와 HL60은 diff 세포의 문을 나타냅니다. (B) 양성 차원 도트 오 혼자 배양 및 10 나노 빈 크리스틴으로 치료 살아있는 세포 사멸 RL 세포의 비율을 보여줍니다. (C) 양성 차원 도트 형, 얼룩은 HL60은 diff와 공동 배양 및 10 나노 빈 크리스틴으로 치료 살아있는 세포 사멸 RL 세포의 비율을 보여줍니다. (D) 막대 그래프가 살아 RL 세포의 비율을 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현된다. *** 페이지 ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
밀도 구배 원심 분리 방법을 이용하여 고순도의 인간 혈액 호중구의 분리를 위해 동일한 단계 단핵 세포 내에서, 여기에 효과적인 간단한 빠르고 저렴 프로토콜 설명도 분리 회수된다. 분리 된 세포 집단은 ≥90 % 순수 있습니다.
여러 가지 방법 인간의 혈액에서 호중구의 분리에 사용할 수 있습니다. 이러한 불연속 그라디언트 (11, 12)를 사용하거나 호중구는 면역 자기와 같은 후 CD16-의 결합에 의해 농축 호중구 항 - 인간 CD16으로 특정 항체로 표지되는 동안 긍정적 인 면역 자기 선택에 의해 호중구 격리를위한 상업 키트를 사용하여 유사한 방법을 포함 자기 열 (13)에 양성 세포. 음의 면역 자기 선택과 상업 키트는 전혈 또는 과립구 정지 세포의 다른 그쪽에 결합하는 항체의 칵테일로 표지하는 동안도 사용할 수 있습니다n은 호중구 9 (즉, 적혈구, 혈소판 등 CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, 글리코 포린 A와 덱스 트란 코팅 된 자성 입자와 같은 원치 않는 세포를 라벨 항체 복합체), 다음 호중구는 항체로 용출에 의해 강화된다 자기 컬럼에 결합하지 않는 세포의 부정적인 부분. 또한, 호중구 형광 활성 세포 분류 (14)에 의해 분리 될 수있다.
일부 기술은 같은 양의 면역 자기 선택과 같은 순수한 호중구의 높은 수익률을 제공하는 것으로 나타났다. 그러나,이 방법은 호중구의 표면에 결합하고 이러한 잠재적으로 활성화 또는 분화를 유도함으로써 기능을 변경할 수있는 라벨 제제로 인한 밀도 구배 원심 분리 방법에 비해 단점이있다. 또한 포지티브 면역 자기의 선택에있어서, 분리를위한 자기 열에 항체 표지 호중구 바인딩을 사용하고 또한이 그 기능에 영향을 미칠 수있다.이 방법은 부정적으로 호중구의 생존에 영향을 미칠 수있는 세포를 수집하기 위해 긴 시간을 필요로 형광 활성화 된 셀 정렬은 그들의 짧은 반감기로 한, 다른 제한이 있습니다.
밀도 구배 원심 분리 방법은 매우 비슷하며 호중구 순도 양쪽 방법을 사용하여 90 %를 초과 할 수 있지만, 전자는 40 %, 60 %, 80 부피 %로 구성 레이어 구배 용액에 비해 기술적으로 덜 도전 이중층 구배 / PBS에서 권. 그것은 세 의한 층간 작은 밀도 차이 Swamydas 외. 구배 용액 인터페이스 상호 혼합은 종종 일어나는 것을 15으로 언급 하였다. 음의 자기 면역 선택 방법과 관련하여, 이들은 또한 고순도 생존 9 호중구의 분리를위한 효과적인 것으로보고되었다. 긍정적 인 면역 자기 선택과 형광 활성 세포 정렬을 통해 그들의 장점은 호중구입니다임의의 표지 제와 표지되지 않으며, 따라서 세포의 활성화를 방지 자기 컬럼에 결합하지 않지만,이 방법은 많은 비용과 많은 시간 밀도 구배 법에 비해 소비이다.
호중구는 일반적으로 시험관 내 및 생체 내 모두에서 급속한 16,17 자연 세포 사멸을 겪는다. HL60promyelocyticcells 18은 호중구로의 분화를 겪게 할 가능성 인간 백혈구 전구 세포의 여러 특성을 유지한다. 호중구는 달리, HL60은 diff 세포는 빠르게하지 않는 세포 사멸을 받아야하고 이러한 세포를 사용하기 때문에 다른 기증자로부터 자신의 고립에 호중구의 다른 응답을 갖는 문제를 해결합니다.
최근, 3D 문화는 인간과 동물 생리학, 특히 암 분야에서 다른 생물학적 연구를위한 매력적인 모델에 더 성숙하고 해당된다. 3D 문화의 차원에서 패턴 변화는 빠르게 SI 진행후자의 NCE 암 (19)과 같은 다양한 병리 적 상태로 공부하는 동안 더 눈에 띄는 것입니다. 셀의 환경에 세 번째 차원을 추가하면 세포의 상호 작용 (20)의 중요성에 대해 자세히 살펴하고 세포의 행동과 특성의 차이를 연구하기 위해 중요 2D 문화의 단점의 인식이 증가하고있다. 3D 문화의 관련성 연구에 선도적 인 살아있는 유기체의 조건과 유사한 환경 (예., 인간)을 만듭니다. 그러나, 3 차원 배양은 세포 외 기질 및 2D 문화에 존재하지 않는 간질 성 유체와 같은 다른 파트너들 사이의 복잡한 상호 작용을 포함한다. 따라서, 노력이 주문 방법 교정을 수립하고 특히 좋은 실험실 관행뿐만 아니라 효과적인 공급 광범위하게 테스트 및 모니터링 상업 브랜드에 계산에 필요합니다.
종양 미세 환경에 참여하고 항암제 (21, 22)에 종양, 전이 및 응답을 조절하는 많은 면역 세포 인구를 포함한 여러 종류의 세포로 구성되어 있습니다. 몇몇 연구는 종양에서 호중구 침윤의 증가가 현저 안티 VEGF 치료 23,24 여러 항암제를 획득 내성과 상관되는 것을 보여 주었다. 또한, 전처리 호중구에서 상승 전이성 신장 세포 암 (25)뿐만 아니라, 다양한 고형 종양 환자 내 종양 호중구의 높은 수준의 존재하에 환자 카운트 (26)가 불량한 생존 예후 인자로서 제시되어왔다. 본 연구에서 호중구 항암제 - 유도 아폽토시스로부터 B 림프종 세포를 보호하는 역할을 할 수 있음을 시사한다.
요약하면, 여기에 설명 된 신뢰성 및 재현성이 방법은 잡음으로부터 호중구 및 단핵 세포를 수집 할 수있는 기관에 의해 사용될 수있다혈액. 또한, 과립 통로 따라 HL60 세포의 분화는 이러한 급속한 자발 아폽토시스 일부 neurophil 문제를 회피하기 위해 제공된다. 호중구는 2D 및 3D 배양 시스템을 사용하여 이들 제제에 대해 림프종 세포에 대한 보호 효과를 보여 여기서 이러한 방식은 안티 림프종 에이전트 림프종 세포의 민감도 호중구의 역할을 연구하기 위해 사용되었다. 이러한 접근 방법은 암 생물학에서 호중구의 역할에 대한 우리의 이해를 깊게한다 호중구의 기능 연구의 다양한 사용할 수 있습니다. 특히이 방법은 더 호중구 및 종양 세포 간 또는 호중구 및 미세 환경의 다른 컴포넌트들 사이의 크로스 토크를 이해하기 위해 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
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