Introduction
תאים חיסוניים מולדים מהווים שיעור מהותי של תאים במיקרו-סביבה של הגידול קושרו עם ממאירות הגידול בחולים ומודלים של בעלי חיים של סרטן 1. לאחרונה, זה הפך להיות יותר מוערך נרחב שתגובות חיסוניות כרוניות תפקיד קריטי בקידום התקדמות גידול, גרורות והתנגדות לכימותרפיה 2. המקרופאגים חשובים תאים חיסוניים מולדים אשר הוכחו להסדיר ישירות בתגובה תאים סרטניים לכימותרפיה 3,4. עם זאת, את התפקיד של נויטרופילים, שחקני מפתח במערכת החיסון המולדת, בוויסות תגובת הגידול לטיפול נגד סרטן אינו ידוע. מטרות הפרוטוקולים הללו הן להשתמש בשיטה מהירה ואמינה להפריד נויטרופילים מדגימים הדם של מטופל CLL וכדי להבדיל תאי HL60 לאורך מסלול granulocytic כדי ללמוד את תפקידם בויסות הרגישות של תאי לימפומה לסוכנים נגד לימפומה.
= "jove_content"> נויטרופילים הם מרכיב הסלולר הנפוץ ביותר של מערכת החיסון המולדת בדם 5 ולפעול כקו ההגנה הראשון נגד פולשים מיקרואורגניזמים 6. יש נויטרופילים תפקיד חיוני עולה תגובות חיסון מולדות יעילות בנוסף לפונקציות מפעיל משתנות במצבים פתולוגיים מספר 7. לכן, שיטה מהירה ואמינה כדי לבודד נויטרופילים מתאי דם אחרים, כגון שיטת הפרדת שיפוע צפיפות, נדרשה לבדיקות במבחנה. באמצעות שיטה זו לבידוד נויטרופילים יקל על המשך מחקר פונקציות חיסוניות בתיווך נויטרופילים in vivo לשעבר vivo.
היכולת להשיג אוכלוסיות טהורות של נויטרופילים היא צעד ראשון חשוב לחקירת חולים עם מחלות אימונולוגיות 8. שיטת צפיפות הפרדת שיפוע היא טכניקה אידיאלית שבו תשואה גבוהה של תאים מתקבלת. methoד יהיה כרוך בתוספת פתרון שיפוע צפיפות בתחתית צינור המכיל דם אדם מדולל ואחריו צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 35 דקות ללא הפסקה. הטבעת של תאי mononuclear מופיעה על הממשק ואת נויטרופילים מתגוררים מתחת לשעבר. יש שיטה זו יתרונות משמעותיים ביחס משיטות אחרות כגון ערכות בידוד נויטרופילים שהן הרבה יותר 9 יקרים. בנוסף, בידוד נויטרופילים מדם אנושי על ידי ערכות מסחריות באמצעות נוגדנים המכוונים סמן משטח ספציפי עבור נויטרופילים אדם, להגביר את הסיכון של הפעלה או התמיינות תאים. שיטת ההפרדה צפיפות שיפוע מאפשר בידוד של נויטרופילים בתוך פרק זמן קצר. בתוך אותו שלב, תאים mononuclear גם מופרדים והחלים. זוהי טכניקה בסיסית שבה תשואה גבוהה של תאים טהורים מתקבלת על מנת להשיג שלמות תפקודית.
על מנת לחקות את הגידול microenvironment, ניסויי 3D בוצעו. בהינתן זמן מחצית החיים הקצר של נויטרופילים במבחנה, ניסויי 3D עם נויטרופילים אדם טריים אינם חד משמעיים. מסיבה זו, פרומיילוציטית (HL60) תאים מושרים להתמיין לתאי נויטרופילים דמוי באמצעות מעוררי הבידול sulfoxide דימתיל (DMSO) ו חומצה רטינואית (RA). שימוש בתאי HL60 בדיל (הבדל HL60) ימנע שיש תגובות שונות של נויטרופילים בשל בידוד מתורמים שונים.
ב 3D במבחנה מודלים תרבות מייצגים שלב ביניים בין מודלים 2D במבחנה במודלים vivo. בתרבות 2D, התאים להתפשט על פני פלסטיק ויוצרים מצורפים התא טבעי לחלבונים שהופקדו כי הם מפוגל על משטח סינתטי זה. לעומת זאת, התאים מצורפים תאים תאים טבעי טופס תרבות 3D מאז התאים ואת תאי מטריקס הם לסנתז הם חומר טבעי אשר הם מחוברים.מסיבה זו, מודלי שיתוף תרבות 3D, במיוחד בין תאים סרטניים סוגי תאים אחרים, היו מאוד שימושיים המציין תרומתם צמיחת גידול, אנגיוגנזה, וגרורות. כתוצאה מכך, תרבויות 3D להפוך את תרבית תאים לחקות את התנאים הפיזיולוגיים הקיימים vivo 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד נויטרופילים ושיתוף תרבות עם תאים leukemic ראשוניים
הערה: פרוצדורות נערכו בכפוף לאישור של ועדת האתיקה ליון החולים עם כל החולים חתימת הסכמה מדעת.
- בידוד של תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים
- אסוף צינורות דם היקפי על EDTA (1.8 מ"ג EDTA למיליליטר דם) מן החולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL).
- הוסף כל 15 מ"ל של דם אל צינור 50 מ"ל סטרילי לדלל עם 15 מ"ל RPMI (דילול 1: 1), אז בזהירות ולאט לאט להוסיף 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתחתית הצינור ללא ערבוב בשלבים. ודא כי פתרון שיפוע הצפיפות הוא ב RT לעריכה.
- צנטריפוגה XG ב 300 במשך 35 דקות ב RT וללא בלמים. הדם צריך להפריד לארבעה שלבים ברורים כפי שמוצג באיור 1 א ', מלמעלה למטה: טסיות ופלסמה, תאים mononuclear (wהייט טבעת), פתרון שיפוע צפיפות, גרנולוציטים ו אריתרוציטים.
- אסוף את הטבעת לבן המייצג את התאים leukemic ראשוניים עם טפטפת פלסטיק פסטר והעברת צינור חדש 50 מ"ל.
- מלאו את הצינור עם PBS (מכיל סידן ומגנזיום) עד 50 מ"ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT.
- Resuspend גלולה עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להוסיף PBS עד 50 מ"ל בסך הכל צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT.
- Resuspend גלולה עם המדיום RPMI שלם (RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ גלוטמין, 100 U / פניצילין מ"ל ו 100 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין) לספירת באמצעות הדלפק כדאיות התא.
- לשאוב את השלבים העליונים עוזב את השלב גרנולוציטים ו אריתרוציטים ולהוסיף PBS עד 25 מ"ל ולאחר מכן להוסיף dextran 3% ב 0.9% NaClup 50 מיליליטר בסך הכל. מערבבים את צינורות 10 פעמים ולשמור אותם במשך 30 דקות ב RT ללא ערבוב.
- אסוף את שכבת נויטרופילים RBC-עניים העליוןd ולהכניס אותם לתוך צינור נקי סטרילי 50 מ"ל ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 10 דקות ב RT. Resuspend כל גלולה עם 5 מ"ל PBS ולאחר מכן להוסיף למאגר תמוגה התא אדום עד 50 מ"ל בסך הכל.
- שמור את הצינורות בחושך במשך 15 דקות ב RT אז צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS (להוסיף PBS עד 50 מיליליטר בסך הכל) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 10 דקות ב RT.
- Resuspend את הכדורים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא. שמור 3 x 10 5 של כל סוג תא ב 50 μl PBS-FBS (4%) צינורות פלסטיק 5 מ"ל כדי לקבוע את טוהר הבידוד שלהם באמצעות cytometry הזרימה.
- ניתוח ההופעות מורפולוגי של אוכלוסיות תאים המבודדות
- לשם כך, resuspend כל 3 x 10 4 נויטרופילים 3 x 10 4 תאים mononuclear ב 150 μl שלם בינוני RPMI. הרכיבו את שקופיות זכוכית, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם בצנטריפוגה cytospin, להבטיח כי לאהוא צנטריפוגות מאוזן היטב.
- מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 750 XG במשך 10 דקות ב RT הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם.
- כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x.
- בדוק את הטוהר של תאים מבודדים על ידי FACS
- התווית תאי leukemic ראשוני המבודדים עם נוגדני CD19 אנטי אנושיים מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). לייבל נויטרופילים מטוהרים עם תערובת של נוגדנים אנטי אנושי המפורטים בטבלה 1 (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
- שוטפים את התאים עם 500 μl PBS-FBS (4%) בצנטריפוגה צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
- Resuspend כל גלולה ב 200 μl PBS-FBS (4%).
- לנתח על cytometer זרימה באמצעות התצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). ודא פיצוי הצבע.
- Coculture של תאים leukemic ראשוניים עם נויטרופילים עצמיים
- Seed 2 x 10 5 תאים / מ"ל של תאים leukemic ראשוניים לבד או עם נויטרופילים עצמיים בשעה 1:10 יחס במדיום RPMI להשלים. לשם כך, להתאים מספרים סלולריים על ידי המתלים תא דילול ולהוסיף 2 x 10 5 תאים / מ"ל של תאים leukemic ראשוניים עד 2 x 10 6 תאים / מ"ל נויטרופילים. מערבבים בזהירות.
- הוסף 25 מיקרומטר של טירוזין קינאז של ברוטון (BTK) מעכב (ibrutinib) אל התאים. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- קציר תא ניתוח FACS
- collect התאים צינורות פלסטיק 5 מ"ל לניתוח צנטריפוגות FACS צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשטוף את כדורי עם 1 מ"ל PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
- כדורי Resuspend ב Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית ו דגירת התאים בחושך במשך 10 דקות ב RT. לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 2 א ו בתצורה האופטית הבאה: ליזר 488 ננומטר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). ודא פיצוי הצבע.
בידול 2. של תאים HL60 לאורך נתיב granulocytic ו Coculture שלהם עם תאים RL לימפומה B ב 3D דגם
- דיפרנציאציה של פרומיילוציטית האדם (HL60) תאים לתוך תאים נויטרופילים דמוי
- התאם מספר הסלולרי HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ"ל ולאחר מכן להוסיף 1 מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO להשרות התמיינות שלהם. כל זרע 3 x 10 5 2.
- מאוחר יותר, לאסוף את התאים צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא.
- ואז לדלל ההשעיה תא בינוני RPMI מלאה, ומשנה את מספר הנייד HL60 עד 3 x 10 5 תאים / מ"ל ולגרום שוב הבידול שלהם על ידי הוספת 1 מיקרומטר החומצה הרטינואית (RA) ו -1.25% DMSO. כל זרע 3 x 10 5 HL60 תאים לכל היטב צלחת 48-היטב דגירה במשך 48 אחר שעה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- ניתוח של בידול HL60 (הבדל HL60)
- אוספים את התאים צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלול עם מדיום RPMI מלא ל לספור באמצעות דלפק כדאי תא.
- כדי לנתח את השינויים בביטוי סמנים על פני קרום התא על ידי cytometry הזרימה. מניחים כל 3 x 10 5 5 HL60 תאים diff צינורות פלסטיק 5 מ"ל לניתוח FACS ו צנטריפוגות צינורות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT.
- Resuspend את הכדורים ב 50 μl PBS-FBS (4%). לייבל את התאים עם אנטי אנושי CD11b מצומדות כדי AF700 או CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירת התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
- לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend את הכדורים ב 200 μl PBS-FBS (4%).
- לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגיה gating של איור 3A ואת התצורה האופטית הבאים: 488 ננומטר לייזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP); לייזר ננומטר 633: APC (660/20 BP), Alexa פלואוריד 700 (730/45 BP).
- כדי לבדוק את השינויים מורפולוגיים diff HL60, לשתק את התאים על גבי שקופיות זכוכית לבדיקה מיקרוסקופית.
- לשם כך, resuspend כל 3 x 10
- מניחים כל סוג תא אל תא מדגם צנטריפוגות ציטומגלווירוס ב 1500 סל"ד במשך 10 דקות ב RT. הסר את השקופיות, כרטיסי מסנן, ותאי מדגם מתוך צנטריפוגה. לפרק בזהירות, כדי לא לגרום נזק לתאים בשקופית. בטל כרטיסי מסנן ותא מדגם.
- כתם התאים באמצעות ערכת מכתים Giemsa ולשמור את השקופיות עבור השעה 1 לייבוש. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x.
- לשם כך, resuspend כל 3 x 10
- 3-ממדי (3D) תרבות
הערה: ודא כי החומרים המשמשים בניסוי זה הם קרים הניסוי מתקיים על קרח.- Resuspend כל 5 x 10 4 תאים RL, לבד או מעורבב עם הבדל HL60 diff HL60 1:10, עם 300 μl מטריצה קרום המרתף באמצעות 1 מ"ל קצה פיפטה לחתוך עם מספריים סטרילי כדי להרחיב את הפתח לכ 2 עד 3 מ"מ. הימנע בועות במהלך שלב זה.
- כל זרע 300 μl של השעית תא / גם בצלחת 24 גם. הימנע בועות במהלך שלב זה. דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל להשלים בינוני RPMI לכל היטב דגירה במשך 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. שנה את בינונית כל יומיים. הוסף 10 ננומטר vincristine ביום 5.
- ניתוח FACS
- לאחר 7 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום ולשטוף היטב עם כל 1 מ"ל קר כקרח PBS פעמיים. הוסף 3 מ"ל / היטב קר כקרח PBS-EDTA (5 מ"מ). לנתק את ג'ל מתחתית הבאר על ידי גירוד באמצעות בתחתית 200 קצה פיפטה μl. לנער את הצלחת בעדינות על קרח למשך 30 דקות.
- להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ"ל סטרילי ולנער את צינורות בעדינות על icדואר למשך 30 דקות אחרות. בדקו את המראה של השעית תא הומוגנית. (אם זה לא המקרה, אז לנער את התאים במשך זמן ארוך יותר או להוסיף עוד PBS-EDTA).
- בצנטריפוגה צינורות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את הכדורים עם PBS אז צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב RT.
- Resuspend עם PBS-FBS (4%) ו תווית עם נוגדנים CD19 אנטי אנושי מצומדות כדי PE-Cy7 ו נוגדן CD38 אנטי אנושי מצומדות כדי APC (5 μl / 10 6 תאים). דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
- לשטוף עם 500 μl PBS-FBS (4%) ולאחר מכן צינורות צנטריפוגות ב 300 גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend תאים עם Annexin V ו- PI באמצעות ערכה מסחרית.
- לנתח על cytometer זרימה באמצעות אסטרטגית gating של איור 4 א ו בתצורה האופטית הבאה: 488 ננומטר ליזר: FSC-A (488 ננומטר), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 ננומטר לייזר: APC (660/20 BP). ודא פיצוי הצבע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת צפיפות ההפרדה שיפוע המתואר כאן מספק תאים leukemic ראשוניים נויטרופילים unstimulated מבודדים מהדם של חולי CLL איור 1A מייצג את שכבות הדם השונות שהתקבלו לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות (מלמעלה למטה:. טסיות ופלסמה, טבעת לבן מייצג את התאים mononuclear, צפיפות שיפוע פתרון, גרנולוציטים ו אריתרוציטים). איור 1B ו 1C להראות את הבדלי ההופעות מורפולוגיים בין נויטרופילים (תאי גרעינים רבים-אונות) ותאי mononuclear בהתאמה.
תוצאות באיור 1D לייצג את פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) העלילה של תאים leukemic ראשוניים (תאים mononuclear). תיוג אוכלוסייה זו עם CD19 אנטי אנושי מצומדות כדי APC מציגה משמרת זאת זכותם המלאה של ההיסטוגרמה (1E איור) עם רק אחדשיא אשר מציין כי אוכלוסייה זו היא חיובית עבור CD19 וטהור. נויטרופילים הם גם ≥90% טהורים כמו מאומתים על ידי זרימת cytometry לאחר תיוג נויטרופילים המבודד בתערובת של נוגדנים חד שבטיים מצומדות fluorochrome המפורטים בטבלת 1. איור 1F מייצג FSC לעומת עלילת פיזור SSC של נויטרופילים המבודדים אשר הם חיוביים עבור CD45 (איור 1G), חיובי עבור CD15 ושלילי עבור CD14 (1H איור), חיובי לשני CD15 ו CD16 (איור 1 ט), חיובי עבור CD16 ושלילי עבור CD56 (איור 1J).
ניתוח איור 1. מורפולוגי הופעות וטוהרים של תאי leukemic ראשוניים נויטרופילים מבודדות מן הדם של החולים. (א) להציג סכמטי מייצג שכבות דם שונות לאחר gradi הצפיפותצנטריפוגה אף אוזן גרון. (בי סי) Giemsa מכתים מייצג את הבדלים מורפולוגיים בין (B) נויטרופילים (ג) תאים leukemic ראשוניים (תאים mononuclear). תמונות צולמו על ידי מיקרוסקופ עם גדלת 100x. (ד) צופה פני פיזור (FSC) וצד פיזור (SSC) עלילה מייצגת את אוכלוסיית תאי leukemic ראשונית המבודדת. (ה) תאי leukemic ראשוניים מבודדים תויגו עם אנטי CD19-APC ו ניתח עבור ביטוי CD19. הקו האדום מציין את התאים ללא תווית והקו הכחול מציין תאים שכותרתו עם אנטי CD19-APC. (F) FSC לעומת עלילת פיזור SSC מייצג את האוכלוסייה נויטרופילים המבודדת. (GJ) נויטרופילים מבודדים תויגו בתערובת של נוגדנים המפורטים בטבלה 1 ונותחו על מנת לתת ביטוי (G) CD45, (H) CD14 ו CD15, (אני) CD15 ו CD16, CD16 (J) ד CD56. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| אנטיגנים | fluorochrome | Clone |
| CD14 | APC-Vio770 (סיי-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | פ | AF12-7H3 |
טבלת 1. Fluorochrome מצומדות נוגדנים חד-שבטיים מטוהר משמשים כדי לבחון את הטוהר של נויטרופילים מבודדים. כל הנוגדנים התקבלו ביוטכנולוגיה Miltenyi.
FO: keep-together.within-page = "1"> כדי לחקור את ההשפעה של נויטרופילים על הרגישות של תאים leukemic ראשוניים (CLL) כדי ibrutinib, האחרון היו בתרבית לבד או עם נויטרופילים עצמיים (N) למשך 24 שעות ב יחס N : CLL 10: 1, בנוכחות או בהעדר ibrutinib ב 25 מיקרומטר. אחוז התאים leukemic בחיים העיקרי (Annexin V שלילי / PI שלילית) נמדדה על ידי צביעה כפולה עם Annexin V-FITC ו PI, ואחריו ניתוח תזרים cytometric. FSC לעומת scatterplot SSC באיור 2A מייצג את השערים של נויטרופילים ותאי leukemic ראשוניים. נויטרופילים הם הרבה יותר פרטנית מאשר תאים leukemic ראשוניים כדי שיופיעו עם גבוה SSC. Gating על תאים leukemic ראשוניים שיתוף תרבותי עם נויטרופילים בנוכחות ibrutinib, התוצאות מראות אחוז גבוה של תאים חיים (איור 2 ג, 84.8%) לעומת תאים בתרבית לבד (תרשים 2B, 53.1%). גרף התיבה באיור 2D מראה כי decreasדואר של כדאיות התא הנגרמת על ידי ibrutinib חל עיכוב משמעותי על ידי נוכחות של נויטרופילים (40.1 ± 3.1 לעומת 60.1 ± 3.5, p <0.001, 19 חולים).
איור 2. עצמיים נויטרופילים להגן על התאים leukemic ראשיים נגד Ibrutinib. דם נאסף חולים שאובחנו עם לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). תאים leukemic ראשוניים בודדו בתרבית לבד או יחד עם נויטרופילים עצמיים (N) ב תאים leukemic ראשוניים: 01:10 Nratio למשך 24 שעות, בנוכחות או בהעדר 25 ibrutinib מיקרומטר. אחוז התאים leukemic העיקרי חי (Annexiv V שלילי / PI שלילית) נמדדה על ידי צביעה כפולה עם Annexin V-FITC ו PI, ואחריו ניתוח תזרים cytometric. (א) קדימה-פיזור (FSC) וצד פיזור (SSC) העלילה מייצגת את השערים של נויטרופילים ותאי leukemic ראשוניים. (ב) דו-ממדי כתם נקודה מראה את האחוזים של תאי leukemic עיקריים בחיים אפופטוטיים תורבת לבד ומטופל עם 25 מיקרומטר ibrutinib. (C) כתם הנקודה Bi-ממדי מציג את אחוזי תאי leukemic העיקריים בחי אפופטוטיים שיתוף תיבה תרבותית עם נויטרופילים שטופלו 25 מיקרומטר ibrutinib. (ד) עלילה מייצגת את אחוז תאי leukemic העיקריים בחיים של 19 חולים. הנתונים באים לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן. *** p <0.001 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הקצר זמן מחצית החיים של נויטרופילים במבחנה עושה שימוש שלהם בתרבות 3D יעיל. דיפרנציאציה של תאי HL60 לאורך מסלול granulocytic הושרה על ידי מעוררי בידול. שני פרמטרים שונים (סמנים על פני קרום התא ביטוי וצ'אנג מורפולוגייםes) שימשו למדידת הבידול של HL60. FSC לעומת עלילת פיזור SSC באיור 3A מראה כי HL60 תאים הנם גדולים בהשוואה לתאי diff HL60 עם FSC הגבוהה. סימון תאים (HL60 או הבדל HL60) עם נוגדן אנטי אנושי CD11b מצומדות כדי AF700 ו CD38antibody אנטי אנושי מצומדות כדי APC מציגה גידול CD11b וביטוי CD38 (איור 3B) על בידול וייחוד הוא מעיד על בידול granulocytic. תאי HL60 הבדל גם להראות שינויי מורפולוגיים זוהו על ידי הופעתו של גרעינים רבים-אונות (איור 3 ג).
איור 3. מבנית פרמטרים של תאים מובחנים HL60. (א) קדימה-פיזור (FSC) ו-פיזור בצד (SSC) מגרשים מייצגים HL60 ותאי HL60 הבדיל (הבדל HL60). (ב) ו- H HL60תאים diff L60 תויגו עם-AF700 אנטי CD11b או אנטי CD38-APC ואחריו ניתוח תזרים cytometry. לאחר gating על כל האוכלוסייה תא-A FSC לעומת SSC-A פיזור העלילה (א), התאים נותחו עבור ביטויי CD11b או CD38. (C) תאים HL60 להראות מורפולוגיים שינויים בקנה אחד עם בידול כלפי גרנולוציטים. התמונות צולמו על ידי מיקרוסקופ עם הגדלה 100x. חץ שחור מודגש להצביע הגרעין רב-אונות. גרפים מייצגים חמישה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
כדי לבחון את ההשפעה של תאי HL60 diff על ויסות תגובת תא RL כדי vincristine במודל 3D, תאי RL היו בתרבית לבד או עם הבדל HL60 במטריצת קרום במרתף בנוכחות או בהעדר vincristine ב -10 nמ באמצעות אסטרטגית gating שמוצגת באיור 4 א, שתי האוכלוסיות מופלות מבוססת על ביטוי CD19 ו CD38; תאי RL חיוביים עבור תאי diff CD19 ו HL60 חיוביים CD38. Gating על תאים RL שיתוף תרבותי עם תאים diff HL60 בנוכחות vincristine, התוצאות מראות אחוז גבוה של תאים חיים (איור 4C, 35.9%) לעומת תאים RL מתורבת לבד (איור 4 ב, 19.7%). גרף העמודות באיור 4D מציג עלייה משמעותית באחוז תאי RL בחיים (Annexin החיובית CD19 V השלילי / PI השלילית) בנוכחות של תאי diff HL60 (19.5 ± 0.2 לעומת 33.1 ± 1.0, p <0.001).
איור 4. תאי diff HL60 דמויי נויטרופילים גן תאי לימפומה RL נגד וינקריסטין ב 3D תרבות. תאי RL היו בתרבית לבד או יחד עם תאים diff HL60 ב RL: 01:10 יחס diff HL60 למשך 7 ימים מטריצה קרום במרתף. ביום 5, vincristine (VCR) נוסף בריכוז של 10 ננומטר. Spheroids היו מנותקים ביום 7 ותאי תויגו עם ניתוח cytometric אנטי CD19-PECy7 ואנטי-CD38-APC אז resuspended עם Annexin V-FITC ו PI ואחריו הזרימה. (א) קדימה-פיזור (FSC) ואת הצד פיזור (SSC) העלילה מייצגת את השערים של תאים RL ותאי diff HL60. (ב) דו-ממדי כתם נקודה מראה את האחוזים של תאים RL חי אפופטוטיים מתורבת לבד ומטופל עם 10 ננומטר vincristine. (C) Bi-ממדי דוטי כתם מראה את האחוזים של תאים RL חי אפופטוטיים שיתוף תרבותי עם הבדל HL60 ומטופל עם 10 ננומטר vincristine. (ד) גרף העמודות מייצג את אחוז התאים RL בחיים. הנתונים באים לידי ביטוי ממוצע ± סטיית תקן. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המתוארת כאן, פרוטוקול יעיל, פשוט, מהיר וזול עבור הבידוד של נויטרופילים מדם אנושי עם טוהר גבוה שימוש בגישת צנטריפוגה שיפוע צפיפות ובתוך אותם תאי mononuclear הצעד מופרדים גם וחלים. אוכלוסיות התאים הבודדות הן ≥90% טהורות.
שיטות קיימות מספר לבידוד נויטרופילים מדם אנושי. אלה כוללים שיטות דומות באמצעות 11,12 הדרגתיים רציף, או באמצעות ערכות מסחריות לבידוד נויטרופילים ידי בחירה חיסונית מגנטית חיובית במהלכו נויטרופילים הם חיסוניות מגנטי שכותרתו עם נוגדנים ספציפיים כגון CD16 אנטי אנושי אז נויטרופילים מועשר באמצעות קשירה של CD16- תאים חיוביים על עמודה מגנטית 13. ערכות מסחריות עם מבחר חיסוני מגנטית שלילי זמינות גם במהלכו הדם המלא או ההשעיה גרנולוציט מסומנות עם קוקטייל של נוגדנים הנקשרים על תאי tha האחרn נויטרופילים 9 (כלומר, מתחמי נוגדן כי תווית RBCs, טסיות ותאי רצויות כגון CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, A glycophorin וחלקיקים מגנטיים מצופה dextran), אז נויטרופילים מועשרים ידי elution כמו antibody- חלק יחסי של תאים שליליים כי אינה מחייבים על העמודה המגנטית. בנוסף, נויטרופילים יכול להיות מבודד על ידי תא הופעל קרינת מיון 14.
כמה טכניקות הוכחו לספק תשואות גבוהות של נויטרופילים טהור, כגון בחירה חיסונית מגנטית חיובית. יש עם זאת, שיטה זו חסרונות לעומת שיטות צנטריפוגה שיפוע צפיפות בשל סוכני התיוג אשר נקלטים על פני השטח של נויטרופילים וזה עלול לשנות את התפקוד שלהם על ידי גרימת ההפעלה או הבידול שלהם. גם בשימוש בשיטת המיון החיסוני מגנטית החיובית, לאגד נויטרופילים-נוגדן הנקרא על עמודה מגנטית להפרדה והדבר עלול להשפיע גם על תפקידם.יש תא הקרינה מיון מופעל אחר הגבלה ככל שיטה זו דורשת זמן רב יותר כדי לאסוף את התאים אשר עשויים להשפיע הישרדות נויטרופילים לרעה בשל מחצית החיים הקצר שלהם.
שיטת צנטריפוגה שיפוע צפיפות מאוד דומה ועל טוהר נויטרופילים יכול יעלה על 90% באמצעות בשני ההליכים, אלא לשעבר הוא שיפוע דו שכבתי המהווה פחות מאתגר מבחינה טכנית לעומת פתרון שיפוע שכבות אשר מורכב של 40%, 60% ו -80% בנפח / כרך ב PBS. זה הוזכר על ידי Swamydas et al. 15 כי וערבוב של ממשקי שיפוע הפתרון מתרחש לעתים קרובות בשל הבדלי צפיפות הקטנים בין השלוש השכבות. עם כל כבוד גישות מבחר החיסוני מגנטית השליליות, הם גם דווחו כיעילים לבידוד נויטרופילים עם טוהר גבוה כדאי 9. היתרון שלהם על מבחר חיסוני מגנטית חיובי ומיון Cell הופעל קרינה הוא נויטרופיליםלא מסומן עם כל סוכני תיוג ואינו נקשר טור מגנטי, ובכך למנוע הפעלת תא אך שיטה זו היא הרבה יותר יקרה ויותר זמן רב לעומת שיטת שיפוע צפיפות.
נויטרופילים בדרך כלל עוברים אפופטוזיס מהירה ספונטנית הן במבחנה in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells לשמור מאפיינים רבים של אבות לויקוציטים אנושיים, כגון פוטנציאל לעבור התמיינות לתוך נויטרופילים 18. בניגוד נויטרופילים, תאי diff HL60 לא במהירות לעבור אפופטוזיס באמצעות תאים אלה פותרים את הטרחה של תגובות שונות של נויטרופילים בשל בידודם מתורמים שונים.
לאחרונה, תרבויות 3D להיות יותר בוגרת רלוונטית פיזיולוגיה אנושית ובעלי חיים, מודל אטרקטיבי מחקר ביולוגי שונה בעיקר בתחום של הסרטן. מעבר הדפוס מ 2D ל 3D התרבות מתקדם במהירות siNCE האחרון הוא יותר בולט במהלך לומד במצבים פתולוגיים שונים כגון סרטן 19. יש מודעות הולכת וגוברת של החסרונות של תרבות 2D שבו הוספת מימד שלישי בסביבה של התא חשוב כדי להעיף מבט מקרוב על החשיבות של אינטראקציות הסלולר 20 ו ללמוד את ההבדלים בהתנהגות ומאפיינים הסלולר. תרבות 3D יוצרת סביבה דומה תנאי אורגניזם חי (למשל., אדם) מוביל מחקר רלוונטי יותר. עם זאת, תרבות 3D כרוכה הגומלין המורכב בין שותפים שונים כגון תאים, מטריצות תאיות ונוזלי ביניים אשר לא נוכח תרבות 2D. לכן, מאמצים יידרשו כדי להקים כיול שיטה לסמוך על שיטות מעבדה טובות, כמו גם אספקה יעילה במיוחד המותגים המסחריים אשר נבחנו בהרחבת פיקוח.
במיקרו-סביבה של הגידולמורכב של סוגי תאים מרובים, כולל אוכלוסיות תאים רבים החיסונית להשתתף ולהסדיר tumorigenesis, גרורות ותגובה לסוכנים נגד סרטן 21,22. מספר מחקרים הראו כי עלייה של חדירת נויטרופילים בגידולים היא בקורלציה משמעותית עם התנגדות רכשה לכמה תרופות אנטי-סרטניות כגון 23,24 טיפול אנטי VEGF. יתר על כן, העלאת נויטרופילים המקדים לספור בחולים עם קרצינומה של תאי כליה גרורתי 25, כמו גם הנוכחות של רמה גבוהה של נויטרופילים תוך tumoral בחולים עם גידולים מוצקים שונים, 26 הוצעו כגורמים פרוגנוסטיים להישרדות עניה. מהמחקר עולה כי נויטרופילים עשוי לשחק תפקיד בהגנה תא B לימפומה בגלל אפופטוזיס הסוכן נגרם נגד הסרטן.
לסיכום, שיטה אמינה לשחזור המתואר כאן יכול להיות מועסק על ידי כל מעבדה לאסוף נויטרופילים ותאי mononuclear מן זמזוםדם. בנוסף, את הבידול של HL60 תאים לאורך מסלול granulocytic מוצג על מנת למנוע כמה בעיות neurophil כגון אפופטוזיס ספונטנית מהירה. גישות אלה שימשו כדי ללמוד את התפקיד של נויטרופילים על הרגישות של תאי לימפומה לסוכנים נגד לימפומה שבו נויטרופילים להראות השפעה מגנה על תאי לימפומה נגד סוכנים אלה באמצעות 2D ומערכות תרבות 3D. גישות אלה יכולים לשמש עבור מגוון רחב של מחקרים פונקציונלי נויטרופילים שאמורים להעמיק את ההבנה שלנו של התפקיד נויטרופילים בביולוגיה סרטן. בפרט בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר את ההצטלבות בין נויטרופילים תאים סרטניים או בין נויטרופילים ורכיבים אחרים של microenvironment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
