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Immunology and Infection

न्युट्रोफिल अलगाव और विश्लेषण करने के लिए चिकित्सीय एजेंट लिंफोमा सेल संवेदनशीलता में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के लिए

Published: March 25, 2016 doi: 10.3791/53846
Automatic Translation
1, 1
1Immunity, Microenvironment, Virus, Cancer Research Center in Lyon

Introduction

सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं ट्यूमर microenvironment के भीतर कोशिकाओं का एक अनिवार्य अनुपात का गठन और रोगियों और कैंसर 1 के पशु मॉडल में ट्यूमर द्रोह के साथ संबद्ध किया गया है। हाल ही में, यह अधिक व्यापक रूप से सराहना की है कि पुरानी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ट्यूमर प्रगति, मेटास्टेसिस और chemotherapies 2 के लिए प्रतिरोध को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं बन गया है। मैक्रोफेज महत्वपूर्ण सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि सीधे कीमोथेरेपी 3,4 ट्यूमर सेल प्रतिक्रिया को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, विरोधी कैंसर के इलाज के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के विनियमन में न्यूट्रोफिल, सहज प्रतिरक्षा प्रणाली में प्रमुख खिलाड़ियों की भूमिका, ज्ञात नहीं है। इन प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक तेज और विश्वसनीय विधि का उपयोग करने के लिए CLL रोगी के रक्त के नमूनों से न्यूट्रोफिल अलग करने के लिए और विरोधी लिंफोमा एजेंटों को लिंफोमा कोशिकाओं की संवेदनशीलता को विनियमित करने में उनकी भूमिका का अध्ययन करने के क्रम में granulocytic मार्ग के साथ HL60 कोशिकाओं को अलग करने के लिए कर रहे हैं।

6 पर हमले के खिलाफ खून 5 और रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का सबसे प्रचुर मात्रा में सेलुलर घटक हैं। न्यूट्रोफिल कई रोग की स्थिति में 7 चर प्रेरक कार्यों के अलावा प्रभावी सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ती में एक आवश्यक भूमिका है। इसलिए, एक तेज और विश्वसनीय इस तरह के घनत्व ढाल जुदाई विधि के रूप में अन्य रक्त कोशिकाओं, से न्यूट्रोफिल को अलग करने की विधि, इन विट्रो अध्ययन के लिए आवश्यक है। न्युट्रोफिल अलगाव के लिए इस विधि का उपयोग vivo और पूर्व vivo में न्युट्रोफिल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा कार्यों पर और अधिक अनुसंधान की सुविधा होगी।

न्यूट्रोफिल का शुद्ध आबादी प्राप्त करने की क्षमता प्रतिरक्षा रोगों 8 के साथ रोगियों की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। घनत्व ढाल जुदाई विधि एक आदर्श तकनीक है जिसमें कोशिकाओं का एक उच्च उपज प्राप्त की है। methoडी ट्यूब एक पतला मानव रक्त को तोड़ने के बिना 35 मिनट के लिए 300 ग्राम पर centrifugation द्वारा पीछा किया युक्त के तल में घनत्व ढाल समाधान के अलावा शामिल है। mononuclear कोशिकाओं की अंगूठी इंटरफेस में प्रकट होता है और न्यूट्रोफिल पूर्व के नीचे रहते हैं। इस विधि में इस तरह के न्युट्रोफिल अलगाव किट जो बहुत अधिक महंगा 9 रहे हैं के रूप में अन्य उपलब्ध तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण लाभ है। इसके अलावा, एक सतह मार्कर मानव न्यूट्रोफिल के लिए विशिष्ट करने के लिए निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग वाणिज्यिक किट द्वारा मानव रक्त से न्यूट्रोफिल को अलग-थलग, सेल सक्रियण या भेदभाव के जोखिम को बढ़ा सकते हैं। घनत्व ढाल जुदाई विधि समय की एक छोटी अवधि के भीतर neutrophils के अलगाव की अनुमति देता है। एक ही कदम के भीतर, mononuclear कोशिकाओं को भी अलग कर दिया और बरामद कर रहे हैं। यह एक मौलिक तकनीक है जिसमें शुद्ध कोशिकाओं के एक उच्च उपज आदेश कार्यात्मक अखंडता को प्राप्त करने में प्राप्त किया जाता है।

आदेश ट्यूमर microenv की नकल करने मेंironment, 3 डी प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया। इन विट्रो में न्यूट्रोफिल की कम आधा जीवन को देखते हुए, ताजा मानव न्यूट्रोफिल के साथ 3 डी प्रयोगों निर्णायक नहीं हैं। इस कारण से, प्रोमाईलोसाईटिक (HL60) कोशिकाओं न्यूट्रोफिल की तरह भेदभाव inducers डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) और retinoic एसिड (आरए) का उपयोग कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं। भेदभाव HL60 कोशिकाओं (HL60 अन्तर) का उपयोग कर विभिन्न दानदाताओं से अलगाव के कारण न्यूट्रोफिल के विभिन्न प्रतिक्रियाएं होने पाएगा।

इन विट्रो 3 डी में संस्कृति मॉडल में इन विट्रो 2 डी मॉडल के बीच और vivo मॉडल में एक मध्यवर्ती चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। 2 डी संस्कृति में, कोशिकाओं को जमा प्रोटीन है कि इस कृत्रिम सतह पर विकृत कर रहे हैं करने के लिए अप्राकृतिक सेल अनुलग्नकों के गठन प्लास्टिक की सतह पर फैल गया। इसके विपरीत, सेल और बाह्य मैट्रिक्स वे synthesize के बाद से 3 डी संस्कृति प्रपत्र प्राकृतिक सेल सेल संलग्नक में कोशिकाओं प्राकृतिक सामग्री के लिए जो वे जुड़े होते हैं।इस कारण से, 3 डी सह संस्कृति मॉडल, विशेष रूप से कैंसर की कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के बीच, ट्यूमर के विकास, angiogenesis, और मेटास्टेसिस के लिए उनके योगदान का संकेत के लिए बहुत उपयोगी है। नतीजतन, 3 डी संस्कृतियों सेल संस्कृति शारीरिक स्थिति है कि इन विवो 10 में मौजूद नकल करते हैं।

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Protocol

1. न्युट्रोफिल अलगाव और प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति

नोट: प्रक्रिया सूचित सहमति पर हस्ताक्षर करने से सभी रोगियों के साथ ल्यों अस्पताल आचार समिति के अनुमोदन के तहत आयोजित की गई।

  1. प्राथमिक leukemic कोशिकाओं और न्यूट्रोफिल का अलगाव
    1. पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) के साथ का निदान रोगियों से EDTA (खून की मिली लीटर प्रति 1.8 मिलीग्राम EDTA) पर परिधीय रक्त की नलियों लीजिए।
    2. एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब को रक्त की प्रत्येक 15 मिलीलीटर जोड़ें और 15 मिलीलीटर RPMI के साथ पतला (कमजोर पड़ने 1: 1), तो ध्यान से और धीरे धीरे ट्यूब के नीचे घनत्व ढाल समाधान के 15 मिलीलीटर चरणों मिश्रण के बिना जोड़ें। सुनिश्चित करें कि घनत्व ढाल समाधान तैयारी के लिए आरटी पर है।
    3. आरटी पर और ब्रेक के बिना 35 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र। के रूप में चित्रा 1 ए, नीचे से ऊपर में दिखाया गया रक्त चार अलग चरणों में अलग होना चाहिए: प्लेटलेट और प्लाज्मा, mononuclear कोशिकाओं (डब्ल्यूHite अंगूठी), घनत्व ढाल समाधान, granulocytes और एरिथ्रोसाइट्स।
    4. सफेद अंगूठी जो एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक और एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण के साथ प्राथमिक leukemic कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व लीजिए।
      1. भरें पीबीएस के साथ ट्यूब आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर कुल और अपकेंद्रित्र में 50 मिलीलीटर तक (कैल्शियम और मैग्नीशियम शामिल हैं)।
      2. गोली के साथ 5 मिलीलीटर पीबीएस तो पीबीएस 50 एमएल के लिए कुल और सेंट्रीफ्यूज में 300 ग्राम पर आरटी पर 10 मिनट के लिए जोड़ने Resuspend।
      3. पूरा RPMI माध्यम के साथ गोली Resuspend (RPMI 1640 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी glutamine, 100 यू के साथ पूरक / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग गिनती के लिए।
    5. महाप्राण ऊपरी चरणों granulocytes और एरिथ्रोसाइट्स चरण छोड़ने और पीबीएस 25 मिलीलीटर को जोड़ें तो 3% dextran 0.9% NaClup में 50 एमएल के लिए कुल में जोड़ें। नलियों 10 बार मिलाएं और मिश्रण के बिना आरटी पर 30 मिनट के लिए उन्हें रखने के लिए।
    6. ऊपरी आरबीसी गरीब न्युट्रोफिल परत एक लीजिएघ उन्हें एक साफ बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया है और आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। 5 के साथ प्रत्येक गोली Resuspend एमएल पीबीएस तो लाल सेल बफर 50 एमएल के लिए कुल में जोड़ें।
    7. 15 मिनट के लिए अंधेरे में ट्यूबों रखें आरटी तो आरटी पर 10 मिनट के लिए 500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र पर। पीबीएस के साथ छर्रों (पीबीएस में कुल 50 मिलीलीटर को जोड़ें) तो आरटी पर 10 मिनट के लिए 500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र धो लें।
    8. सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग गिनती के लिए पूरा RPMI मध्यम के साथ छर्रों Resuspend। 3 एक्स 10 प्रत्येक कोशिका प्रकार के 5 5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में 50 μl पीबीएस FBS (4%) में रखें उनके अलगाव प्रवाह cytometry का उपयोग की शुद्धता निर्धारित करने के लिए।
  2. विश्लेषण पृथक सेल आबादी के रूपात्मक छपने
    1. ऐसा करने के लिए, प्रत्येक 3 एक्स 10 4 न्यूट्रोफिल और 150 μl पूरा RPMI मध्यम में 3 एक्स 10 4 mononuclear कोशिकाओं resuspend। गिलास स्लाइड, फिल्टर कार्ड, और cytospin सेंट्रीफ्यूज में नमूना कक्षों इकट्ठा, कि टी सुनिश्चितवह अपकेंद्रित्र अच्छी तरह से संतुलित है।
    2. नमूना कक्ष और cyto-सेंट्रीफ्यूज में प्रत्येक कोशिका प्रकार आरटी पर 10 मिनट के लिए 750 XG पर जगह सेंट्रीफ्यूज से स्लाइड, फिल्टर कार्ड, और नमूना कक्षों निकालें। , ध्यान से जुदा इतनी के रूप में स्लाइड पर कोशिकाओं को नुकसान नहीं। फिल्टर कार्ड और नमूना कक्षों त्यागें।
    3. Giemsa धुंधला किट का उपयोग कोशिकाओं दाग और 1 घंटा सुखाने के लिए रख लिए स्लाइड। 100X बढ़ाई साथ माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं की जांच।
  3. FACS द्वारा अलग कक्षों की शुद्धता का परीक्षण
    1. विरोधी मानव CD19 एंटीबॉडी एपीसी संयुग्मित (5 μl / 10 6 कोशिकाओं) के साथ पृथक प्राथमिक leukemic कोशिकाओं लेबल। तालिका 1 (5 μl / 10 6 कोशिकाओं) में सूचीबद्ध विरोधी मानव एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ शुद्ध न्यूट्रोफिल लेबल। 4 ओ सी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को सेते
    2. 500 μl पीबीएस FBS (4%) सेंट्रीफ्यूज आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूबों के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    3. 200 μl पीबीएस FBS (4%) में प्रत्येक गोली Resuspend।
    4. 488 एनएम लेजर: एफएससी-ए (488 एनएम), एसएससी-ए (488 / 10BP), FITC (बीपी 530/30), PerCP-Cy5.5 (695/40 बीपी निम्नलिखित ऑप्टिकल विन्यास का उपयोग कर एक प्रवाह cytometer पर विश्लेषण ), पीई (बीपी 575/26); 633 एनएम लेजर: एपीसी (बीपी 660/20), एपीसी-Cy7 (बीपी 780/60)। रंग मुआवजा सुनिश्चित करें।
  4. ऑटोलॉगस न्यूट्रोफिल के साथ प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के coculture
    1. बीज 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं / प्राथमिक leukemic कोशिकाओं अकेले या पूरा RPMI माध्यम में अनुपात 1:10 पर ऑटोलॉगस न्यूट्रोफिल साथ मिलीलीटर। ऐसा करते हैं, गिराए सेल निलंबन से सेल नंबर को समायोजित करने और 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल न्यूट्रोफिल के लिए प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल जोड़ने के लिए। ध्यान से मिलाएं।
    2. ब्रूटन के tyrosine kinase (BTK) अवरोध (ibrutinib) के 25 माइक्रोन के कोशिकाओं को जोड़ने। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. सेल हार्वेस्ट और FACS विश्लेषण
    1. collect FACS विश्लेषण और सेंट्रीफ्यूज आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूबों के लिए 5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूबों में कोशिकाओं। तो आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र 1 मिलीलीटर पीबीएस FBS (4%) के साथ छर्रों धो लें।
    2. Annexin वी में Resuspend छर्रों और पीआई वाणिज्यिक किट का उपयोग और आरटी पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को सेते हैं। 488 एनएम लेजर: चित्रा 2A के gating रणनीति का प्रयोग कोशिकामापी एक प्रवाह है और निम्नलिखित ऑप्टिकल विन्यास पर विश्लेषण एफएससी-ए (488 एनएम), एसएससी-ए (488 / 10BP), FITC (बीपी 530/30), पीआई (610 / 20 बीपी)। रंग मुआवजा सुनिश्चित करें।

2. Granulocytic मार्ग और 3 डी मॉडल में आरएल लिंफोमा बी कोशिकाओं के साथ उनके coculture साथ HL60 कोशिकाओं के भेदभाव

  1. न्युट्रोफिल-तरह की कोशिकाओं में मानव प्रोमाईलोसाईटिक (HL60) कोशिकाओं के भेदभाव
    1. 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं को / एमएल तो उनके भेदभाव प्रेरित करने के लिए 1 माइक्रोन retinoic एसिड (आरए) और 1.25% DMSO जोड़ने HL60 सेल नंबर समायोजित करें। बीज प्रत्येक 3 एक्स 10 5 2 के साथ सेते हैं।
    2. बाद में, आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज इकट्ठा। सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग गिनती के लिए पूरा RPMI मध्यम के साथ कोशिकाओं Resuspend।
    3. फिर 3 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल HL60 सेल नंबर को समायोजित करने और 1 माइक्रोन retinoic एसिड (आरए) और 1.25% DMSO जोड़कर फिर से उनके भेदभाव प्रेरित करने के लिए पूरा RPMI मध्यम में सेल निलंबन पतला। प्रति 48 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रत्येक 3 एक्स 10 5 HL60 कोशिकाओं बीज और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 48 घंटे के लिए सेते हैं।
  2. HL60 भेदभाव का विश्लेषण (HL60 रचनाकार)
    1. कोशिकाओं को इकट्ठा और आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग गिनती के लिए पूरा RPMI माध्यम के साथ गोली Resuspend।
    2. प्रवाह cytometry द्वारा सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए। जगह प्रत्येक 3 एक्स 10 5 5 HL60 FACS विश्लेषण और सेंट्रीफ्यूज आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर ट्यूबों के लिए 5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूबों में अन्तर कोशिकाओं।
    3. 50 μl पीबीएस FBS (4%) में छर्रों Resuspend। AF700 या विरोधी मानव CD38 एपीसी संयुग्मित (5 μl / 10 6 कोशिकाओं) संयुग्मित विरोधी मानव CD11b के साथ कोशिकाओं लेबल। 4 ओ सी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को सेते
    4. 500 μl पीबीएस FBS (4%) के साथ धो तो आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर अपकेंद्रित्र। 200 μl पीबीएस FBS (4%) में छर्रों Resuspend।
    5. 488 एनएम लेजर: चित्रा 3 ए के gating रणनीति और निम्न ऑप्टिकल विन्यास का उपयोग प्रवाह पर विश्लेषण एफएससी-ए (488 एनएम), एसएससी-ए (488 / 10BP); 633 एनएम लेजर: एपीसी (660/20 बीपी), एलेक्सा स्त्राव 700 (बीपी 730/45)।
    6. HL60 रचनाकार में रूपात्मक परिवर्तनों का परीक्षण करने के लिए, सूक्ष्म परीक्षण के लिए कांच की स्लाइड्स पर कोशिकाओं को स्थिर।
      1. ऐसा करने के लिए, resuspend प्रत्येक 3 एक्स 10 4 HL60 रचनाकार। cytospin सेंट्रीफ्यूज में कांच स्लाइड, फिल्टर कार्ड, और नमूना कक्षों इकट्ठा, यह सुनिश्चित करना है कि सेंट्रीफ्यूज संतुलित है।
      2. आरटी पर 10 मिनट के लिए 1500 rpm पर नमूना कक्ष और cyto-सेंट्रीफ्यूज में प्रत्येक कोशिका प्रकार रखें। स्लाइड, फिल्टर कार्ड, और सेंट्रीफ्यूज से नमूना कक्षों निकालें। , ध्यान से जुदा इतनी के रूप में स्लाइड पर कोशिकाओं को नुकसान नहीं। फिल्टर कार्ड और नमूना कक्षों त्यागें।
      3. Giemsa धुंधला किट का उपयोग कोशिकाओं दाग और 1 घंटा सुखाने के लिए रख लिए स्लाइड। 100X बढ़ाई साथ माइक्रोस्कोप से कोशिकाओं की जांच।
  3. 3-आयामी (3 डी) संस्कृति
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि सामग्री इस प्रयोग में इस्तेमाल किया ठंडा कर रहे हैं और प्रयोग बर्फ पर जगह ले जा रहा है।
    1. प्रत्येक 5 एक्स 10 4 आर एल कोशिकाओं resuspend, या तो अकेले या HL60 रचनाकार के साथ मिलाया रचनाकार 1:10, 300 μl तहखाने झिल्ली 1 मिलीलीटर विंदुक टिप आदेश के बारे में 2 से 3 मिमी के लिए खोलने को चौड़ा करने में एक बाँझ कैंची के साथ कटौती का उपयोग कर मैट्रिक्स के साथ। इस कदम के दौरान बुलबुले से बचें।
    2. 24 अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन के प्रत्येक 300 μl बीज / अच्छी तरह से। इस कदम के दौरान बुलबुले से बचें। 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं तो 1 मिलीलीटर जोड़ने अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए RPMI माध्यम को पूरा करने और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए सेते हैं। मध्यम बदलें हर दो दिन। 5 दिन में 10 एनएम vincristine जोड़ें।
  4. FACS विश्लेषण
    1. संस्कृति के 7 दिनों के बाद, मध्यम aspirate और दो बार 1 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धो लें। 3 मिलीग्राम / ठंडा पीबीएस EDTA (5 मिमी) की अच्छी तरह से जोड़ें। 200 μl विंदुक टिप के नीचे का उपयोग scraping द्वारा अच्छी तरह से नीचे से जेल को अलग करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर धीरे थाली हिला।
    2. बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण और आईसी पर धीरे ट्यूबों हिलाएक और 30 मिनट के लिए ई। सजातीय सेल निलंबन की उपस्थिति के लिए जाँच करें। (यदि यह मामला नहीं है, तो लंबे समय के लिए कोशिकाओं को हिला या अधिक पीबीएस EDTA जोड़)।
    3. आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र। धो पीबीएस के साथ छर्रों तो आरटी पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र।
    4. पीबीएस FBS (4%) के साथ Resuspend और विरोधी मानव CD19 एंटीबॉडी पीई Cy7 और विरोधी मानव CD38 एंटीबॉडी एपीसी संयुग्मित (5 μl / 10 6 कोशिकाओं) संयुग्मित के साथ लेबल। 4 ओ सी पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में सेते
    5. आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम से कम 500 μl पीबीएस FBS (4%) तो अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ धोएं। Annexin वी और पीआई वाणिज्यिक किट का उपयोग कर के साथ कोशिकाओं Resuspend।
    6. चित्रा -4 ए के gating रणनीति का प्रयोग प्रवाह पर विश्लेषण और निम्न ऑप्टिकल विन्यास: 488 एनएम लेजर: एफएससी-ए (488 एनएम), एसएससी-ए (488 / 10BP), FITC (बीपी 530/30), पीआई (610 / 20 बीपी), पीई Cy7 (780/60 बीपी); 633 एनएम लेजर: एपीसी (बीपी 660/20)। रंग मुआवजा सुनिश्चित करें।

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Representative Results

, सफेद अंगूठी mononuclear कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व प्लेटलेट्स और प्लाज्मा,:। घनत्व ढाल जुदाई विधि यहाँ वर्णित प्राथमिक leukemic कोशिकाओं और unstimulated न्यूट्रोफिल CLL रोगियों के रक्त से अलग चित्रा 1 ए ऊपर से नीचे तक (विभिन्न रक्त परतों घनत्व ढाल centrifugation के बाद प्राप्त प्रतिनिधित्व प्रदान करता है घनत्व ढाल समाधान, granulocytes और एरिथ्रोसाइट्स)। चित्रा 1 बी और 1 सी क्रमशः न्यूट्रोफिल (बहु-lobed नाभिक कोशिकाओं) और mononuclear कोशिकाओं के बीच रूपात्मक दिखावे में मतभेद दिखा।

चित्रा -1 में परिणाम आगे-तितर बितर (एफएससी) बनाम पक्ष तितर बितर (एसएससी) प्राथमिक leukemic कोशिकाओं (mononuclear कोशिकाओं) की साजिश का प्रतिनिधित्व करते हैं। एपीसी संयुग्मित विरोधी मानव CD19 के साथ इस आबादी लेबल केवल एक ही साथ हिस्टोग्राम (चित्रा 1E) का एक पूरा अधिकार पारी से पता चलताचोटी जो इंगित करता है कि इस आबादी CD19 और शुद्ध के लिए सकारात्मक है। न्यूट्रोफिल भी ≥90% शुद्ध रूप cytometry fluorochrome संयुग्मित मोनोक्लोनल 1 टेबल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी के एक मिश्रण के साथ पृथक न्यूट्रोफिल लेबलिंग के बाद प्रवाह द्वारा सत्यापित कर रहे हैं। चित्रा 1F एफएससी बनाम पृथक न्यूट्रोफिल जो CD45 के लिए सकारात्मक रहे हैं की एसएससी तितर बितर साजिश (चित्रा का प्रतिनिधित्व करता है 1G), CD15 के लिए सकारात्मक और CD14 (चित्रा 1 के लिए नकारात्मक), दोनों CD15 और CD16 (चित्रा 1 मैं) के लिए सकारात्मक सकारात्मक CD16 के लिए और CD56 (चित्रा 1J के लिए नकारात्मक)।

आकृति 1
चित्रा 1. रूपात्मक छपने और प्राथमिक leukemic कोशिकाओं की पवित्रता और न्यूट्रोफिल पृथक मरीजों के खून से का विश्लेषण। (ए) योजनाबद्ध दृश्य घनत्व gradi के बाद अलग-अलग रक्त परतों का प्रतिनिधित्व करता हैईएनटी centrifuging। (BC) Giemsa धुंधला के बीच (बी) न्यूट्रोफिल और (सी) प्राथमिक leukemic कोशिकाओं (mononuclear कोशिकाओं) रूपात्मक मतभेद का प्रतिनिधित्व करता है। Photos 100X बढ़ाई साथ माइक्रोस्कोप द्वारा उठाए गए थे। (डी) आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) की साजिश पृथक प्राथमिक लयूकेमिक सेल की आबादी का प्रतिनिधित्व करता है। (ई) पृथक प्राथमिक leukemic कोशिकाओं विरोधी CD19 एपीसी और साथ लेबल रहे थे CD19 की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया। लाल रेखा लेबल हटाया गया कोशिकाओं को इंगित करता है और ब्लू लाइन विरोधी CD19 एपीसी के साथ लेबल कोशिकाओं को इंगित करता है। (एफ) एफएससी बनाम एसएससी तितर बितर साजिश पृथक न्यूट्रोफिल आबादी का प्रतिनिधित्व करता है। (जीजे) पृथक न्यूट्रोफिल तालिका में सूचीबद्ध एंटीबॉडी का एक मिश्रण के साथ लेबल रहे थे 1 और (छ) CD45, (एच) CD14 और CD15, (मैं) CD15 और CD16, (जे) CD16 एक की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषणडी CD56। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एंटीजन fluorochrome क्लोन
CD14 एपीसी-Vio770 (सीवाई-7) TÜK4
CD15 एपीसी VIMC6
CD16 FITC VEP13
CD45 PerCP-Vio700 (Cy5.5) 5B1
CD56 पीई AF12-7H3

तालिका 1 Fluorochrome संयुग्मित शुद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पृथक न्यूट्रोफिल की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया। सभी एंटीबॉडी Miltenyi बायोटेक से प्राप्त किया गया।

चित्रा 2A में एसएससी scatterplot न्यूट्रोफिल और प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के द्वार का प्रतिनिधित्व करता है। न्यूट्रोफिल बहुत अधिक बारीक से प्राथमिक leukemic कोशिकाओं ताकि वे उच्च एसएससी के साथ दिखाई देते हैं। प्राथमिक leukemic कोशिकाओं ibrutinib की उपस्थिति में न्यूट्रोफिल के साथ सह-सुसंस्कृत पर gating, परिणाम जीवित कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत (चित्रा -2 सी, 84.8%) अकेले संवर्धित कोशिकाओं की तुलना में (चित्रा 2 बी, 53.1%) दिखा। चित्रा 2 डी में बॉक्स ग्राफ कि decreas चलताibrutinib से प्रेरित सेल व्यवहार्यता के ई काफी न्यूट्रोफिल की उपस्थिति (40.1 ± 3.1 बनाम 60.1 ± 3.5, पी <0.001, 19 रोगियों) से हिचकते था।

चित्र 2
चित्रा 2. ऑटोलॉगस न्यूट्रोफिल Ibrutinib। रक्त के खिलाफ प्राथमिक leukemic कोशिकाओं की रक्षा पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) के साथ का निदान रोगियों से एकत्र किया गया था। प्राथमिक leukemic कोशिकाओं को अलग और अकेले या एक साथ सुसंस्कृत ऑटोलॉगस न्यूट्रोफिल (एन) प्राथमिक leukemic कोशिकाओं पर साथ गया: 24 घंटे के लिए Nratio 1:10, उपस्थिति या 25 माइक्रोन के ibrutinib के अभाव में। लाइव प्राथमिक leukemic कोशिकाओं का प्रतिशत (Annexiv वी नकारात्मक / पीआई नकारात्मक) Annexin वी FITC और पीआई के साथ डबल धुंधला, प्रवाह cytometric विश्लेषण के बाद से मापा गया था। (ए) आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) साजिश न्यूट्रोफिल और प्राथमिक leukemic कोशिकाओं के द्वार का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) द्वि-आयामी डॉट धब्बा जिंदा और apoptotic प्राथमिक leukemic कोशिकाओं अकेले सुसंस्कृत और 25 माइक्रोन के ibrutinib के साथ इलाज के प्रतिशत से पता चलता है। (सी) द्वि-आयामी डॉट धब्बा जिंदा और apoptotic प्राथमिक leukemic कोशिकाओं का प्रतिशत सह चलता न्यूट्रोफिल साथ सुसंस्कृत और 25 माइक्रोन के ibrutinib साथ इलाज किया। (डी) बॉक्स साजिश 19 रोगियों के जीवित प्राथमिक leukemic कोशिकाओं का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा के रूप में मतलब ± एसडी व्यक्त कर रहे हैं। *** पी <0.001 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इन विट्रो में न्यूट्रोफिल की कम आधा जीवन 3 डी संस्कृति में उनके उपयोग निष्प्रभावी बना देता है। granulocytic मार्ग के साथ HL60 कोशिकाओं के भेदभाव भेदभाव inducers द्वारा प्रेरित किया गया था। दो अलग अलग मानकों (सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति और रूपात्मक चांगते) HL60 के भेदभाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया। एफएससी बनाम चित्रा 3 ए में एसएससी तितर बितर साजिश बताते हैं कि HL60 कोशिकाओं उच्च एफएससी साथ HL60 रचनाकार कोशिकाओं की तुलना में आकार में बड़े होते हैं। विरोधी मानव CD11b एंटीबॉडी AF700 और विरोधी मानव CD38antibody एपीसी संयुग्मित संयुग्मित के साथ कोशिकाओं (HL60 या HL60 रचनाकार) से पता चलता लेबल भेदभाव पर CD11b में वृद्धि हुई है और CD38 अभिव्यक्ति (चित्रा 3 बी) जो granulocytic भेदभाव का एक संकेत है। HL60 रचनाकार कोशिकाओं को भी बहु-lobed नाभिक (चित्रा -3 सी) की उपस्थिति से पता लगाया रूपात्मक बदलाव दिखा।

चित्र तीन
चित्रा 3. विभेदित HL60 कोशिकाओं के संरचनात्मक पैरामीटर। (ए) आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) भूखंडों HL60 और विभेदित HL60 कोशिकाओं (HL60 अन्तर) का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) और एच HL60L60 रचनाकार कोशिकाओं विरोधी CD11b-AF700 या विरोधी CD38 एपीसी प्रवाह cytometry विश्लेषण के द्वारा पीछा के साथ लेबल रहे थे। एफएससी-ए बनाम एसएससी-एक तितर बितर साजिश (ए) में प्रत्येक सेल की आबादी पर gating के बाद, कोशिकाओं CD11b या CD38 की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया। (सी) HL60 कोशिकाओं granulocytes की ओर भेदभाव के साथ लगातार रूपात्मक बदलाव दिखा। Photos 100X बढ़ाई साथ माइक्रोस्कोप द्वारा उठाए गए थे। बोल्ड काला तीर बहु-lobed नाभिक इशारा करते हैं। रेखांकन पांच स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3 डी मॉडल में vincristine को आरएल सेल प्रतिक्रिया के विनियमन पर HL60 रचनाकार कोशिकाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, आर एल कोशिकाओं अकेले या 10 एन पर उपस्थिति या vincristine के अभाव में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में HL60 रचनाकार के साथ सुसंस्कृत थेएम gating रणनीति चित्रा -4 ए में दिखाया गया है का उपयोग करना, दोनों आबादी CD19 और CD38 अभिव्यक्ति के आधार पर भेदभाव कर रहे हैं; आरएल कोशिकाओं CD19 और HL60 रचनाकार CD38 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं के लिए सकारात्मक। आरएल कोशिकाओं vincristine की उपस्थिति में HL60 रचनाकार कोशिकाओं के साथ सह-सुसंस्कृत पर gating, परिणाम जीवित कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत (चित्रा 4C, 35.9%) अकेले सुसंस्कृत आरएल कोशिकाओं की तुलना में (चित्रा 4 बी, 19.7%) दिखा। चित्रा 4D में बार ग्राफ HL60 रचनाकार कोशिकाओं (19.5 ± 0.2 बनाम 33.1 ± 1.0, पी <0.001) की उपस्थिति में जिंदा आरएल कोशिकाओं का प्रतिशत में उल्लेखनीय वृद्धि (CD19 सकारात्मक Annexin वी नकारात्मक / पीआई नकारात्मक) से पता चलता है।

चित्रा 4
चित्रा 4. न्युट्रोफिल की तरह HL60 रचनाकार प्रकोष्ठों 3D संस्कृति में Vincristine के खिलाफ आर एल लिंफोमा कोशिकाओं की रक्षा। आरएल कोशिकाओं तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में 7 दिनों के लिए HL60 रचनाकार अनुपात 1:10: आर एल पर HL60 रचनाकार कोशिकाओं के साथ अकेले या एक साथ सुसंस्कृत थे। 5 दिन, विन्क्रिस्टाईन (वीसीआर) 10 एनएम के एक एकाग्रता में जोड़ा गया है। Spheroids 7 दिन पर अलग थे और कोशिकाओं विरोधी CD19-PECy7 और विरोधी CD38 एपीसी तो Annexin वी FITC और पीआई प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा पीछा के साथ resuspended साथ लेबल रहे थे। (ए) आगे तितर बितर (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) की साजिश आरएल कोशिकाओं और HL60 रचनाकार कोशिकाओं के द्वार का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) द्वि-आयामी डॉट धब्बा जिंदा और apoptotic आरएल अकेले सुसंस्कृत और 10 एनएम vincristine साथ इलाज किया कोशिकाओं के प्रतिशत से पता चलता है। (सी) द्वि-आयामी डॉट धब्बा जिंदा और apoptotic आरएल कोशिकाओं HL60 रचनाकार के साथ सह-सुसंस्कृत और 10 एनएम vincristine के साथ इलाज के प्रतिशत (डी) से पता चलता है। बार ग्राफ जिंदा आरएल कोशिकाओं का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है। डेटा के रूप में मतलब ± एसडी व्यक्त कर रहे हैं। *** पी ≤0.001।jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां उच्च शुद्धता घनत्व ढाल centrifugation दृष्टिकोण का उपयोग कर के साथ मानव रक्त से neutrophils के अलगाव के लिए और एक ही कदम mononuclear कोशिकाओं के भीतर वर्णित है, एक प्रभावी, सरल, तेज और सस्ती प्रोटोकॉल भी अलग कर दिया और बरामद कर रहे हैं। पृथक सेल आबादी ≥90% शुद्ध कर रहे हैं।

कई तरीकों मानव रक्त से न्युट्रोफिल अलगाव के लिए उपलब्ध हैं। ये असंतत ढ़ाल 11,12 का उपयोग कर, या सकारात्मक इम्युनो-चुंबकीय चयन के दौरान जो न्यूट्रोफिल इम्युनो-चुंबकीय इस तरह के विरोधी मानव CD16 तो CD16- के बंधन से समृद्ध न्यूट्रोफिल के रूप में विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे द्वारा न्युट्रोफिल अलगाव के लिए वाणिज्यिक किट का उपयोग इसी तरह के तरीकों में शामिल एक चुंबकीय स्तंभ 13 पर सकारात्मक कोशिकाओं। नकारात्मक इम्युनो-चुंबकीय चयन के साथ वाणिज्यिक किट के दौरान जो पूरे रक्त या granulocyte निलंबन एंटीबॉडी के एक कॉकटेल है कि कोशिकाओं अन्य Tha पर बाँध के साथ चिह्नित कर रहे हैं भी उपलब्ध हैंn न्यूट्रोफिल 9 (यानी, एंटीबॉडी परिसरों कि लाल रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और ऐसे CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glycophorin ए और dextran लेपित चुंबकीय कणों के रूप में अवांछित कोशिकाओं लेबल), तो न्यूट्रोफिल antibody- के रूप में क्षालन से समृद्ध कर रहे हैं कोशिकाओं है कि चुंबकीय स्तंभ पर नहीं बाँध के नकारात्मक अंश। इसके अलावा, न्यूट्रोफिल प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई 14 से अलग किया जा सकता है।

कुछ तकनीकों में इस तरह के सकारात्मक इम्युनो-चुंबकीय चयन के रूप में शुद्ध न्यूट्रोफिल, की उच्च पैदावार प्रदान करने के लिए दिखाया गया है। हालांकि, इस विधि घनत्व ढाल centrifugation लेबलिंग एजेंटों कि न्यूट्रोफिल की सतह पर बाँध और यह संभवतः अपने सक्रियण या भेदभाव उत्प्रेरण द्वारा उनके कार्य को बदल सकता है के कारण तरीकों की तुलना में नुकसान है। इसके अलावा सकारात्मक इम्युनो-चुंबकीय चयन विधि, अलग होने के लिए एक चुंबकीय स्तंभ पर एंटीबॉडी लेबल न्यूट्रोफिल बाँध का उपयोग करते हुए और यह भी उनके कार्य को प्रभावित कर सकता है।प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई उनकी कम आधा जीवन के कारण के रूप में इस विधि लंबे समय कोशिकाओं जो नकारात्मक न्युट्रोफिल अस्तित्व को प्रभावित कर सकते हैं इकट्ठा करने के लिए की आवश्यकता है insofar के एक और सीमा है।

घनत्व ढाल centrifugation विधि बहुत तुलना कर रहे हैं और न्युट्रोफिल पवित्रता दोनों प्रक्रियाओं का उपयोग 90% से अधिक कर सकते हैं, लेकिन पूर्व एक दो परत ढाल जो लेयरिंग ढाल समाधान है जो 40%, 60% और 80% वॉल से मिलकर की तुलना में तकनीकी रूप से कम चुनौतीपूर्ण है / पीबीएस में वॉल्यूम। यह तीन परतों के बीच छोटे घनत्व मतभेद के कारण। Swamydas एट अल 15 कि ढाल समाधान इंटरफेस की intermixing अक्सर जगह लेता द्वारा उल्लेख किया गया था। नकारात्मक इम्युनो-चुंबकीय चयन दृष्टिकोण के लिए सम्मान के साथ, वे भी उच्च शुद्धता और व्यवहार्यता 9 के साथ न्युट्रोफिल अलगाव के लिए प्रभावी होने के लिए सूचित किया गया है। सकारात्मक इम्युनो-चुंबकीय चयन और प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई पर उनके लाभ यह है कि न्यूट्रोफिल हैकिसी भी लेबलिंग एजेंटों के साथ चिह्नित कर रहे हैं नहीं और चुंबकीय स्तंभ के लिए बाध्य नहीं है, इस प्रकार सेल सक्रियण परहेज लेकिन इस विधि बहुत अधिक महंगा है और अधिक समय लेने घनत्व ढाल विधि की तुलना में है।

न्यूट्रोफिल सामान्य रूप से दोनों इन विट्रो और इन विवो 16,17 में तेजी से सहज apoptosis से गुजरना। HL60promyelocyticcells इस तरह के संभावित न्यूट्रोफिल 18 में भेदभाव से गुजरना करने के लिए के रूप में मानव ल्युकोसैट progenitors के कई विशेषताओं, बरकरार रहती है। न्यूट्रोफिल के विपरीत, HL60 रचनाकार कोशिकाओं के तेजी से नहीं कर apoptosis से गुजरना और इन कोशिकाओं का उपयोग कर विभिन्न दानदाताओं से उनके अलगाव के कारण न्यूट्रोफिल के विभिन्न प्रतिक्रियाएं होने की परेशानी को हल करती है।

हाल ही में, 3 डी संस्कृतियों और अधिक परिपक्व और मानव और पशु शरीर क्रिया विज्ञान, और विभिन्न जैविक अनुसंधान के लिए एक आकर्षक मॉडल विशेष रूप से कैंसर के क्षेत्र में करने के लिए प्रासंगिक हो गया है। 3 डी संस्कृति के लिए 2 डी से पैटर्न पारी से चल रहा है तेजी से सीउत्तरार्द्ध nce कैंसर 19 के रूप में इस तरह के विभिन्न रोग की स्थिति का अध्ययन करने के दौरान और अधिक स्पष्ट है। वहाँ 2 डी संस्कृति की खामियों के एक बढ़ती हुई जागरूकता जहां एक सेल के पर्यावरण के लिए एक तीसरा आयाम जोड़ने के क्रम में सेलुलर बातचीत 20 के महत्व पर एक करीब देखो लेने के लिए और सेलुलर व्यवहार और विशेषताओं में मतभेद का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण है। 3 डी संस्कृति एक वातावरण में एक जीवित जीव में शर्तों के समान (जैसे।, इंसान) अधिक प्रासंगिक अनुसंधान के लिए अग्रणी बनाता है। हालांकि, 3 डी संस्कृति ऐसी कोशिकाओं, बाह्य matrices और मध्य तरल पदार्थ जो 2D संस्कृति में मौजूद नहीं है के रूप में विभिन्न भागीदारों के बीच जटिल परस्पर क्रिया शामिल है। इस प्रकार, प्रयासों के क्रम में विधि अंशांकन स्थापित करने के लिए और विशेष रूप से अच्छा प्रयोगशाला प्रथाओं के रूप में अच्छी तरह से प्रभावी आपूर्ति वाणिज्यिक ब्रांड है कि बड़े पैमाने पर परीक्षण किया और निगरानी कर रहे हैं पर भरोसा करने के लिए आवश्यक हो जाएगा।

ट्यूमर microenvironmentकई प्रतिरक्षा सेल आबादी है कि में भाग लेते हैं और कैंसर विरोधी एजेंटों 21,22 को विनियमित tumorigenesis, मेटास्टेसिस और प्रतिक्रिया सहित अनेक प्रकार की कोशिकाओं, के होते हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि ट्यूमर में न्यूट्रोफिल घुसपैठ की वृद्धि हुई है काफी ऐसे विरोधी वीईजीएफ़ चिकित्सा 23,24 के रूप में कई विरोधी कैंसर एजेंटों के लिए अधिग्रहण कर लिया प्रतिरोध के साथ जोड़ा जाता है। इसके अलावा, pretreatment न्यूट्रोफिल में ऊंचाई मेटास्टेटिक गुर्दे सेल कार्सिनोमा 25, साथ ही विभिन्न ठोस ट्यूमर के साथ रोगियों में इंट्रा-tumoral न्यूट्रोफिल के एक उच्च स्तर की उपस्थिति के साथ रोगियों में गिनती, 26 गरीब अस्तित्व के लिए शकुन कारकों के रूप में प्रस्तावित किया गया है। हमारे अध्ययन से पता चलता न्यूट्रोफिल कैंसर विरोधी एजेंट प्रेरित apoptosis से लिंफोमा बी कोशिकाओं की रक्षा करने में एक भूमिका निभा सकते हैं।

सारांश में, विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि यहाँ वर्णित गुंजन से न्यूट्रोफिल और mononuclear कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला द्वारा नियोजित किया जा सकताएक खून। इसके अलावा, granulocytic मार्ग के साथ HL60 कोशिकाओं के भेदभाव ऐसे तेजी से सहज apoptosis के रूप में आदेश कुछ neurophil समस्याओं से बचने के लिए प्रस्तुत किया है। इन तरीकों जहां न्यूट्रोफिल इन 2 डी और 3 डी संस्कृति सिस्टम का उपयोग कर एजेंटों के खिलाफ लिंफोमा कोशिकाओं पर एक सुरक्षात्मक प्रभाव दिखाने के विरोधी लिंफोमा एजेंटों को लिम्फोमा की कोशिकाओं की संवेदनशीलता पर न्यूट्रोफिल की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इन तरीकों न्यूट्रोफिल कार्यात्मक अध्ययन है कि कैंसर जीव विज्ञान में न्यूट्रोफिल भूमिका के बारे में हमारी समझ को गहरा करना चाहिए की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशेष रूप से इस विधि बेहतर न्यूट्रोफिल और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच या न्यूट्रोफिल और microenvironment के अन्य घटकों के बीच परस्पर बात को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640  Gibco Invitrogen 21875-034
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10270-106
Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) Gibco Invitrogen 14040-091
N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) Life technologies 25030-024
Penicillin streptomycin (Pen Strep) Life technologies 15140-122
Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)  CliniSciences A3001
Vincristine  EG labo
BD Matrigel basement membrane matrix  BD Biosciences 354234 Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment
Red cell lysis buffer  BD Biosciences 555899
Ficoll (Pancoll) PAN Biotech P04-60500
Dextran  Sigma-Aldrich D8906
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Sodium chloride (NaCl) Euromedex S3014
Annexing V-FLOUS staining kit  Roche 11 988 549 001
Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit Cosmos Biomedical CB361550-0000
LSRII flow cytometry BD Biosciences
Cytocentrifuge Thermo Scientific
Leica DMR-XA microscope Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter Nexcelom  Bioscience

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References

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न्युट्रोफिल अलगाव और विश्लेषण करने के लिए चिकित्सीय एजेंट लिंफोमा सेल संवेदनशीलता में उनकी भूमिका का निर्धारण करने के लिए
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Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil… More

Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. J. Vis. Exp. (109), e53846, doi:10.3791/53846 (2016).

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