Introduction
Células inmunes innatas constituyen una proporción esencial de las células dentro del microambiente del tumor y se han asociado con la malignidad del tumor en pacientes y modelos animales de cáncer 1. Recientemente, se ha vuelto más ampliamente apreciado que las respuestas inmunes crónicas desempeñan papeles críticos en la promoción de la progresión tumoral, metástasis y resistencia a quimioterapias 2. Los macrófagos son importantes células inmunitarias innatas que se han demostrado para regular directamente la respuesta de las células tumorales a la quimioterapia 3,4. Sin embargo, el papel de los neutrófilos, los actores clave en el sistema inmunitario innato, en la regulación de la respuesta del tumor al tratamiento contra el cáncer no se conoce. Los objetivos de estos protocolos son el uso de un método rápido y fiable para separar los neutrófilos de muestras de sangre CLL del paciente y para diferenciar las células HL60 a lo largo de la vía granulocítica con el fin de estudiar su papel en la regulación de la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes anti-linfoma.
5 y actuar como una primera línea de defensa contra los microorganismos invasores 6. Los neutrófilos tienen un papel esencial en el aumento de la respuesta inmune innata eficaces, además de las funciones efectoras variables en varias condiciones patológicas 7. Por lo tanto, un método rápido y fiable para aislar los neutrófilos de otras células sanguíneas, tales como método de separación en gradiente de densidad, se requiere para los estudios in vitro. El uso de este método para el aislamiento de neutrófilos facilitará aún más la investigación sobre las funciones inmunológicas mediada por neutrófilos in vivo y ex vivo.
La capacidad de obtener poblaciones puras de los neutrófilos es un primer paso importante para la investigación de los pacientes con enfermedades inmunológicas 8. método de separación en gradiente de densidad es una técnica ideal en el que se obtiene un alto rendimiento de las células. el method implica la adición de la solución de gradiente de densidad en la parte inferior de un tubo que contiene la sangre humana diluido seguido de centrifugación a 300 g durante 35 min sin descanso. El anillo de las células mononucleares aparece en la interfase y los neutrófilos residen por debajo de la primera. Este método tiene ventajas significativas con respecto a otros métodos disponibles, tales como kits de aislamiento de neutrófilos, que son mucho más caros 9. Además, el aislamiento de los neutrófilos de sangre humana por kits comerciales que utilizan anticuerpos dirigidos a un marcador de superficie específico para los neutrófilos humanos, aumentar el riesgo de activación o diferenciación celular. método de separación en gradiente de densidad permite el aislamiento de neutrófilos dentro de un corto período de tiempo. Dentro del mismo paso, también se separan y se recuperan las células mononucleares. Es una técnica fundamental en la que se obtiene un alto rendimiento de células puras a fin de lograr la integridad funcional.
Con el fin de imitar la microenv tumorironment, se realizaron experimentos en 3D. Dada la corta vida media de los neutrófilos in vitro, los experimentos en 3D con los neutrófilos humanos frescos no son concluyentes. Por esta razón, se inducen las células HL60 promielocítica () para diferenciarse en células de neutrófilos como el uso de los inductores de la diferenciación dimetilsulfóxido (DMSO) y el ácido retinoico (RA). El uso de células HL60 diferenciadas (HL60) diff evitará tener diferentes respuestas de los neutrófilos debido al aislamiento de diferentes donantes.
En 3D vitro modelos de cultivo representan una etapa intermedia entre modelos 2D in vitro y en modelos in vivo. En la cultura 2D, las células se extienden sobre una superficie de plástico que forma los archivos adjuntos de células no naturales a las proteínas depositadas que se desnaturalizan en esta superficie sintética. Por el contrario, las células en forma de cultivo 3D adjuntos célula-célula natural, ya que las células y la matriz extracelular que sintetizan son el material natural a los que están unidos.Por esta razón, los modelos 3D de co-cultivo, especialmente entre las células cancerosas y otros tipos de células, han sido muy útiles para indicar su contribución al crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis. Como resultado, los cultivos 3D hacen que el cultivo de células de imitar las condiciones fisiológicas que existen in vivo 10.
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Protocol
1. Aislamiento de neutrófilos y co-cultivo con células leucémicas primarias
NOTA: Los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Lyon con todos los pacientes que firman el consentimiento informado.
- El aislamiento de las células leucémicas primarias y neutrófilos
- Recoger tubos de sangre periférica en EDTA (1,8 mg EDTA por mililitro de sangre) de los pacientes diagnosticados con leucemia linfocítica crónica (CLL).
- Añadir cada 15 ml de sangre a un tubo estéril de 50 ml y se diluye con 15 ml de RPMI (dilución 1: 1), luego, con cuidado y se añade lentamente 15 ml de una solución de gradiente de densidad para la parte inferior del tubo sin mezclar las fases. Asegúrese de que la solución de gradiente de densidad es a TA durante la preparación.
- Centrifugar a 300 xg durante 35 min a TA y sin freno. La sangre se debe separar en cuatro fases distintas, como se muestra en la Figura 1A, de arriba abajo: las plaquetas y el plasma, las células mononucleares (wanillo hite), solución de gradiente de densidad, los granulocitos y eritrocitos.
- Recuperar el anillo blanco que representa las células leucémicas primarias con una pipeta de plástico Pasteur y traslado a un nuevo tubo de 50 ml.
- Llenar el tubo con PBS (contiene calcio y magnesio) hasta 50 ml en total y se centrifuga a 300 g durante 10 min a TA.
- Resuspender el precipitado con 5 ml de PBS y luego añadir PBS hasta 50 ml en total y se centrifuga a 300 g durante 10 min a TA.
- Resuspender el precipitado con medio completo RPMI (RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), glutamina 2 mM, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) para contar usando un contador de la viabilidad celular.
- Aspirar las fases superiores que salen de la fase de granulocitos y eritrocitos y añadir PBS hasta 25 ml, añadir 3% de dextrano en el 0,9% NaClup a 50 ml en total. Mezclar los tubos 10 veces y conservar durante 30 min a TA sin mezclar.
- Recoger el RBC-pobres una capa superior de neutrófilosd colocarlos en un tubo estéril de 50 ml limpio y centrifugar los tubos a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Resuspender cada sedimento con 5 ml de PBS a continuación, añadir tampón de lisis de glóbulos rojos de hasta 50 ml en total.
- Mantener los tubos en la oscuridad durante 15 min a RT y centrifugar a 500 g durante 10 min a TA. Lavar los pellets con PBS (PBS añadir hasta 50 ml en total) y centrifugar a 500 g durante 10 min a TA.
- Resuspender los pellets con medio RPMI completo para el recuento usando un contador de la viabilidad celular. Mantenga 3 x 10 5 de cada tipo de células en 50 l de PBS-FBS (4%) en 5 ml de tubos de plástico para determinar la pureza de su aislamiento mediante citometría de flujo.
- Analizar las apariencias morfológicas de las poblaciones de células aisladas
- Para ello, resuspender cada 3 x 10 4 neutrófilos y 3 x 10 4 células mononucleares en 150 l de medio completo RPMI. Montar las placas de vidrio, tarjetas de filtros y cámaras de muestra en la centrífuga cytospin, asegurando que tque centrifugar está bien equilibrado.
- Colocar cada tipo de células en la cámara de muestra y cito-centrifugar a 750 xg durante 10 min a TA Eliminar las diapositivas, tarjetas de filtro, y cámaras de muestra de la centrífuga. Desmontar con cuidado, para no dañar las células en el portaobjetos. Descartar cartas de filtro y cámaras de muestra.
- Teñir las células utilizando kit de tinción de Giemsa y mantener las diapositivas durante 1 hora para secar. Se examinan las células al microscopio con un aumento de 100X.
- Prueba de la pureza de las células aisladas por FACS
- Identificar a las células leucémicas primarias aisladas con el anticuerpo CD19 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 6 células). Etiquetar los neutrófilos purificados con una mezcla de anticuerpos anti-humanos que se enumeran en la Tabla 1 (5 l / 10 6 células). Se incuban las células en la oscuridad durante 30 min a 4 ° C
- Se lavan las células con 500 l de PBS-FBS (4%) de la centrífuga los tubos a 300 g durante 5 min a TA.
- Resuspender cada sedimento en 200 l de PBS-FBS (4%).
- El análisis en un citómetro de flujo utilizando la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (BP 695/40 ), PE (BP 575/26); 633 nm láser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Garantizar la compensación de color.
- Co-cultivo de las células leucémicas primarias con autólogo de neutrófilos
- Seed 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primarias solo o con neutrófilos autólogas en relación 1:10 en medio completo RPMI. Para ello, puede ajustar el número de células por dilución de las suspensiones de células y añadir 2 x 10 5 células / ml de células leucémicas primarias de 2 x 10 6 células / ml neutrófilos. Mezclar con cuidado.
- Añadir 25 M de inhibidor de tirosina quinasa de Bruton (Btk) (ibrutinib) a las células. Incubar durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO2.
- Cell Cosecha y Análisis FACS
- Collect las células en tubos de plástico de 5 ml para análisis FACS y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA. Lavar los pellets con 1 ml de PBS-FBS (4%) y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA.
- pellets de resuspender en Anexina V y PI utilizando kit comercial e incubar las células en oscuridad durante 10 min a TA. El análisis en un citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 2A y la siguiente configuración óptica: láser de 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Garantizar la compensación de color.
2. La diferenciación de células HL60 a lo largo del Camino granulocítica y su Coculture con RL linfoma de células B en modelo 3D
- La diferenciación de promielocítica humana (HL60) células en células similares a los neutrófilos
- Ajustar el número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml a continuación, añadir 1 M de ácido retinoico (AR) y 1,25% de DMSO para inducir su diferenciación. Semillas cada 3 x 10 5 CO2.
- Más tarde, recoger las células y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender las células con medio RPMI completo para el recuento usando un contador de la viabilidad celular.
- A continuación diluir la suspensión de células en medio RPMI completo para ajustar el número de células HL60 a 3 x 10 5 células / ml y de nuevo inducir su diferenciación mediante la adición de 1 M de ácido retinoico (AR) y 1,25% de DMSO. Semillas cada 3 x 10 5 HL60 células por pocillo en placa de 48 pocillos y se incuba durante otras 48 horas a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Análisis de la diferenciación de HL60 (HL60 diff)
- Recoger las células y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender el precipitado con medio completo RPMI para el recuento usando un contador de la viabilidad celular.
- Para analizar los cambios en la expresión de marcadores de la superficie celular por citometría de flujo. Coloque cada 3 x 10 5 5 células HL60 diff en tubos de plástico de 5 ml para análisis FACS y centrifugar los tubos a 300 g durante 5 min a TA.
- Resuspender los sedimentos en 50 l de PBS-FBS (4%). Marcar las células con CD11b anti-humano conjugado con AF700 o CD38 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 6 células). Se incuban las células en la oscuridad durante 30 min a 4 ° C
- Lavar con 500 l de PBS-FBS (4%) y centrifugar a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender los sedimentos en 200 l de PBS-FBS (4%).
- Analizar el citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 3A y la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm láser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
- Para probar los cambios morfológicos en diff HL60, inmovilizar las células en portaobjetos de vidrio para el examen microscópico.
- Para ello, resuspender cada 3 x 10
- Colocar cada tipo de células en la cámara de muestra y cito-centrifugar a 1500 rpm durante 10 min a TA. Retire las transparencias, tarjetas de filtros y cámaras de muestras de la centrífuga. Desmontar con cuidado, para no dañar las células en el portaobjetos. Descartar cartas de filtro y cámaras de muestra.
- Teñir las células utilizando kit de tinción de Giemsa y mantener las diapositivas durante 1 hora para secar. Se examinan las células al microscopio con un aumento de 100X.
- Para ello, resuspender cada 3 x 10
- 3 dimensiones (3D) Cultura
NOTA: Asegúrese de que los materiales utilizados en este experimento son fríos y el experimento se está llevando a cabo en el hielo.- Resuspender cada 5 x 10 4 células RL, ya sea solo o mezclado con diff HL60 diff 01:10, con 300 l de la matriz de la membrana basal usando punta de la pipeta 1 ml cortar con una tijera estéril con el fin de ensanchar la abertura a aproximadamente 2 a 3 mm. Evitar las burbujas durante este paso.
- Sembrar cada 300 l de suspensión de células / pocillo en placas de 24 pocillos. Evitar las burbujas durante este paso. Incubar la placa durante 30 min a 37 ° C con 5% de CO 2 a continuación, añadir 1 ml de medio completo RPMI para cada pocillo e incubar durante 7 días a 37 ° C con 5% de CO 2. Cambiar el medio cada dos días. Añadir 10 nM vincristina en el día 5.
- Análisis FACS
- Después de 7 días de cultivo, se aspira el medio y lavar cada pocillo con 1 ml de PBS enfriado con hielo dos veces. Añadir 3 ml / pocillo de PBS enfriado en hielo-EDTA (5 mM). Separar el gel de la parte inferior del pozo por raspado utilizando la parte inferior de la punta de pipeta 200 l. Agitar suavemente la placa sobre hielo durante 30 min.
- Transferir la suspensión celular en un tubo estéril de 15 ml y agitar los tubos suavemente sobre ice durante otros 30 min. Comprobar la aparición de suspensión celular homogénea. (Si no es el caso, entonces agitar las células durante más tiempo o añadir más PBS-EDTA).
- Centrifugar los tubos a 300 xg durante 10 min a TA. Se lavan los gránulos con PBS y centrifugar a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Resuspender con PBS-FBS (4%) y la etiqueta con el anticuerpo CD19 anti-humano conjugado con PE-Cy7 y el anticuerpo CD38 anti-humano conjugado con APC (5 l / 10 6 células). Incubar en oscuridad durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar con 500 l de PBS-FBS (4%), entonces los tubos de centrífuga a 300 g durante 5 min a TA. Resuspender las células con anexina V y PI utilizando el kit comercial.
- Analizar el citómetro de flujo utilizando la estrategia de compuerta de la figura 4A y la siguiente configuración óptica: 488 nm láser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (BP 780/60); 633 nm láser: APC (660/20 BP). Garantizar la compensación de color.
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Representative Results
Método de separación en gradiente de densidad descrito aquí proporciona células leucémicas primarias y neutrófilos no estimulados aisladas de la sangre de pacientes con LLC Figura 1A representa las diferentes capas de la sangre obtenidos después de centrifugación en gradiente de densidad (de arriba a abajo:. Plaquetas y plasma, anillo blanco representa las células mononucleares, gradiente de densidad de la solución, granulocitos y eritrocitos). Figura 1B y 1C muestran las diferencias en las apariencias morfológicas entre los neutrófilos (células polilobulados núcleos) y células mononucleares respectivamente.
Resultados en la Figura 1D representan la dispersión frontal (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) parcela de células leucémicas primarias (células mononucleares). Etiquetado de esta población con CD19 anti-humano conjugado con APC muestra un cambio completo derecho del histograma (Figura 1E) con una solapico que indica que esta población es positiva para CD19 y puro. Los neutrófilos también son ≥90% de pureza como se verifica mediante citometría de flujo después de etiquetado de los neutrófilos aislados con una mezcla de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo listados en la Tabla 1. Figura 1F representa FSC frente a SSC parcela de dispersión de los neutrófilos aislados que son positivas para CD45 (figura 1G), positivo para CD15 y negativas para CD14 (Figura 1H), positiva tanto para CD15 y CD16 (Figura 1I), positivos para CD16 y negativas para CD56 (Figura 1J).
Figura 1. Análisis de las apariencias morfológicas y pureza de las células leucémicas primarias y neutrófilos aislados de sangre de los pacientes. (A) Vista esquemática representa diferentes capas de sangre después de densidad Gradient centrifugación. (BC) Giemsa tinción representa las diferencias morfológicas entre los neutrófilos (B) y (C) células leucémicas (células mononucleares) primarios. Las fotografías fueron tomadas con un microscopio con un aumento de 100X. (D) de la dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) gráfico representa la población de células leucémicas primarias aisladas. (E) células leucémicas primarias aisladas fueron etiquetados con anti-CD19-APC y analizadas para la expresión de CD19. La línea roja indica las células no marcadas y la línea azul indica células marcadas con anti-CD19-APC. (F) FSC frente a parcela SSC dispersión representa la población aislada de neutrófilos. (GJ) neutrófilos aislados fueron marcadas con una mezcla de anticuerpos que figuran en la tabla 1 y se analizaron para la expresión de (G) CD45, (H) CD14 y CD15, (I) CD15 y CD16, (J) un CD16d CD56. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| antígenos | fluorocromo | Clon |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | EDUCACIÓN FÍSICA | AF12-7H3 |
Tabla 1. conjugados con fluorocromo anticuerpos monoclonales purificados utiliza para probar la pureza de los neutrófilos aislados. Todos los anticuerpos se obtuvieron de Miltenyi Biotech.
figura 2A representa las puertas de los neutrófilos y las células leucémicas primarias. Los neutrófilos son mucho más granular que las células leucémicas primarias por lo que aparecen con mayor SSC. De apertura de puerta en las células leucémicas primarias co-cultivadas con neutrófilos en presencia de ibrutinib, los resultados muestran mayor porcentaje de células vivas (Figura 2C, 84,8%) en comparación con las células cultivadas solas (Figura 2B, 53,1%). El gráfico de la caja en la Figura 2D muestra que la decrease de la viabilidad celular inducida por ibrutinib fue significativamente inhibida por la presencia de neutrófilos (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p <0,001, 19 pacientes).
Figura 2. Los neutrófilos autólogo proteger a las células leucémicas primarias contra Ibrutinib. Se recogió sangre de los pacientes diagnosticados con leucemia linfocítica crónica (CLL). Se aislaron células leucémicas primarias y se cultivaron solo o junto con los neutrófilos autólogas (N) en las células leucémicas primarias: nratio 01:10 durante 24 horas, en presencia o ausencia de 25 ibrutinib M. El porcentaje de células leucémicas primarias en vivo (ANEXO IV V negativo / PI negativo) se midió por doble tinción con anexina V-FITC y PI, seguido por análisis de citometría de flujo. (A) de la dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) gráfico representa las puertas de los neutrófilos y las células leucémicas primarias. (B) bidimensional dot-blot se muestran los porcentajes de células leucémicas primarias vivos y apoptóticas cultivadas solas y tratados con ibrutinib 25 M. (C) bidimensional dot-blot se muestran los porcentajes de células leucémicas primarias vivos y apoptóticas CO- cultivadas con neutrófilos y se trató con ibrutinib 25 mM. parcela (D) Box representa el porcentaje de células leucémicas primarias vivos de 19 pacientes. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. *** p <0,001 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La corta vida media de los neutrófilos in vitro hace que su uso en cultivo 3D ineficaz. La diferenciación de las células HL60 a lo largo de la vía granulocítica fue inducida por inductores de la diferenciación. Dos parámetros diferentes (expresión de marcadores de la superficie celular y morfológica changES) se utilizaron para medir la diferenciación de HL60. FSC frente a SSC parcela de dispersión en la Figura 3A muestran que las células HL60 son más grandes en tamaño en comparación con las células HL60 diff con mayor FSC. Etiquetado de las células (HL60 o HL60 diff) con anticuerpo CD11b anti-humano conjugado con AF700 y CD38antibody anti-humano conjugado con APC muestra un aumento de CD11b y la expresión CD38 (Figura 3B) a la diferenciación que es un indicativo de la diferenciación granulocítica. Células HL60 diff también muestran cambios morfológicos detectados por la aparición de núcleos de múltiples lóbulos (Figura 3C).
Figura 3. Los parámetros estructurales de las células HL60 diferenciadas. (A) de la dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) parcelas representan HL60 y HL60 células diferenciadas (esta HL60). (B) y H HL60Células diff L60 se marcaron con anti-CD11b-AF700 o anti-CD38-APC seguido por citometría de flujo análisis. Después se active en cada población celular en el FSC frente a SSC-A-Un gráfico de dispersión (A), se analizaron las células para la expresión de CD11b o CD38. Células (C) HL60 muestran cambios morfológicos consistentes con la diferenciación hacia granulocitos. Las fotografías fueron tomadas con un microscopio con un aumento de 100X. Negrita negro flecha apunta al núcleo multilobular. Los gráficos son representativos de cinco experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para probar el efecto de las células HL60 diff en la regulación de la respuesta de células RL a la vincristina en el modelo 3D, las células RL se cultivaron solo o con diff HL60 en la matriz de la membrana basal en presencia o ausencia de la vincristina en 10 nM. El uso de la estrategia de compuerta se muestra en la Figura 4A, ambas poblaciones se discrimina en base a la expresión de CD19 y CD38; Células RL positivos para las células CD19 diff y HL60 positivas para CD38. De apertura de puerta en las células RL co-cultivadas con células HL60 diff en presencia de vincristina, los resultados muestran mayor porcentaje de células vivas (Figura 4C, 35,9%) en comparación con células cultivadas solas RL (Figura 4B, 19,7%). El gráfico de barras en la figura 4D muestra un aumento significativo en el porcentaje de células vivas RL (CD19 positivo Anexina V negativo / negativo PI) en presencia de células HL60 diff (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1,0, p <0,001).
Figura 4. Las células HL60 diff neutrófilos como proteger a las células contra el linfoma RL vincristina en Cultura 3D. Células RL se cultivaron solas o junto con células HL60 diff en RL: HL60 relación diff 01:10 durante 7 días en la matriz de la membrana basal. En el día 5, se añadió vincristina (VCR) a una concentración de 10 nM. Los esferoides se disociaron en días 7 y las células se marcaron con anti-CD19-PECy7 y anti-CD38-APC después se resuspendieron con anexina V-FITC y PI seguido por análisis de citometría de flujo. (A) de la dispersión frontal (FSC) y dispersión lateral (SSC) gráfico representa las puertas de las células RL y células HL60 diff. (B) bidimensional dot-blot se muestran los porcentajes de células apoptóticas RL vivos y cultivadas solas y tratados con vincristina 10 nM. (C) punto- bidimensional blot muestra los porcentajes de células apoptóticas y RL vivos co-cultivadas con diff HL60 y tratados con 10 vincristina nM. (D) el gráfico de barras representa el porcentaje de células RL vivos. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se describe aquí, un protocolo eficaz, sencillo, rápido y de bajo costo para el aislamiento de los neutrófilos de la sangre humana con alta pureza utilizando el enfoque de la centrifugación en gradiente de densidad y dentro de las mismas células mononucleares de paso también se separan y se recupera. Las poblaciones de células aisladas son ≥90% de pureza.
Hay varios métodos disponibles para el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana. Estos incluyen métodos similares utilizando gradientes discontinuos 11,12, o el uso de kits comerciales para el aislamiento de neutrófilos por la selección positiva inmuno-magnética en la que los neutrófilos son inmuno-magnética marcado con un anticuerpo específico tal como CD16 anti-humano entonces neutrófilos enriquecido por la unión de la CD16 células positivas en una columna magnética 13. kits comerciales con selección negativa inmuno-magnética también están disponibles durante el cual la sangre entera o suspensión de granulocitos se etiquetan con un cóctel de anticuerpos que se unen en las células otra than neutrófilos 9 (es decir, los complejos de anticuerpos que etiquetan los glóbulos rojos, las plaquetas y las células no deseadas, tales como CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glicoforina A y partículas magnéticas revestido con dextrano), a continuación, los neutrófilos se enriquecen por elución como el anticuerpo fracción negativa de las células que no se une en la columna magnética. Además, los neutrófilos se pueden aislar por fluorescencia de células activadas de clasificación 14.
Algunas técnicas se han demostrado para proporcionar altos rendimientos de los neutrófilos puros, tales como la selección positiva de inmuno-magnética. Sin embargo, este método tiene desventajas en comparación con métodos de centrifugación en gradiente de densidad debido a los agentes de marcaje que se unen en la superficie de los neutrófilos y esto podría potencialmente alterar su función mediante la inducción de su activación o diferenciación. También utilizando el método de selección de inmuno-magnética positiva, el anticuerpo marcado con neutrófilos se unen en una columna magnética para la separación y esto también puede afectar a su función.La fluorescencia de células activadas clasificación tiene otra limitación en la medida en que este método requiere un tiempo más largo para recoger las células que pueden afectar negativamente a la supervivencia de neutrófilos debido a su corta vida media.
método de centrifugación en gradiente de densidad son muy comparable y la pureza de los neutrófilos puede ser superior a 90% usando ambos procedimientos, pero el primero es un gradiente de dos capas que es técnicamente menos exigente en comparación con solución de gradiente de capas que consisten en 40%, 60% y 80% vol / volumen en PBS. Se mencionó por Swamydas et al. 15 que el entremezclado de las interfaces de solución de gradiente a menudo tiene lugar debido a las pequeñas diferencias de densidad entre las tres capas. Con respecto a los criterios de selección inmuno-magnético negativo, sino que también se han reportado para ser eficaz para el aislamiento de neutrófilos con una alta pureza y viabilidad 9. Su ventaja sobre la selección de inmuno-magnética positiva y clasificación de células activadas por fluorescencia es que los neutrófilosno están etiquetados con cualquier agente de etiquetado y no se unen a la columna magnética, evitando así la activación de células, pero este método es mucho más caro y consume más tiempo en comparación con el método de gradiente de densidad.
Los neutrófilos normalmente experimentan una rápida apoptosis espontánea tanto in vitro como in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells conservan muchas de las características de los progenitores de leucocitos humanos, tales como el potencial de sufrir diferenciación en neutrófilos 18. A diferencia de los neutrófilos, células HL60 diff no lo hacen rápidamente se someten a la apoptosis y el uso de estas células resuelve el problema de tener diferentes respuestas de los neutrófilos, debido a su aislamiento de los diferentes donantes.
Recientemente, 3D culturas se vuelven más maduros y pertinente a la fisiología humana y animal, y un modelo atractivo para diferentes investigaciones biológicas sobre todo en el campo del cáncer. El cambio de patrón de 2D a 3D la cultura está progresando rápidamente portofinona vez que el último es más visible durante el estudio de diversos estados patológicos como el cáncer 19. Hay una conciencia cada vez mayor de los inconvenientes de la cultura 2D, donde la adición de una tercera dimensión al entorno de una célula es importante con el fin de echar un vistazo más de cerca a la importancia de las interacciones celulares 20 y estudiar las diferencias en el comportamiento celular y características. Cultura 3D crea un entorno similar a las condiciones en un organismo vivo (por ejemplo., Un ser humano) que conduce a una investigación más relevante. Sin embargo, la cultura 3D implica la compleja interacción entre los diferentes socios, tales como células, matrices extracelulares y los fluidos intersticiales que no lo hacen presente en la cultura 2D. Por lo tanto, es necesario hacer esfuerzos con el fin de establecer la calibración método y contar con buenas prácticas de laboratorio, así como suministros eficaces especialmente las marcas comerciales que son ampliamente probado y monitoreado.
El microambiente tumoralse compone de múltiples tipos de células, incluyendo muchas poblaciones de células inmunes que participan en y regulan la tumorigénesis, la metástasis y la respuesta a los agentes contra el cáncer 21,22. Varios estudios han demostrado que un aumento de la infiltración de neutrófilos en los tumores se correlaciona significativamente con la resistencia adquirida a varios agentes anti-cáncer, tales como la terapia anti-VEGF 23,24. Además, la elevación en el recuento de neutrófilos pretratamiento cuenta en pacientes con carcinoma metastásico de células renales 25, así como la presencia de un alto nivel de neutrófilos intra-tumorales en pacientes con tumores sólidos diferentes, 26 se han propuesto como factores pronósticos de la supervivencia pobre. Nuestro estudio sugiere que los neutrófilos pueden jugar un papel en la protección de células de linfoma B de cáncer apoptosis inducida por agente.
En resumen, el método fiable y reproducible descrito aquí puede emplearse por cualquier laboratorio para recoger neutrófilos y células mononucleares de humun sangre. Además, la diferenciación de las células HL60 a lo largo de la vía granulocítica se presenta con el fin de evitar algunos problemas neuropilo tales como la apoptosis espontánea rápida. Estos enfoques se utilizaron para estudiar el papel de los neutrófilos en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes anti-linfoma donde neutrófilos muestran un efecto protector sobre las células de linfoma contra estos agentes utilizando sistemas de cultivo 2D y 3D. Estos enfoques se pueden utilizar para una variedad de estudios funcionales de neutrófilos que se deben profundizar nuestra comprensión de la función de los neutrófilos en la biología del cáncer. En particular este método se puede utilizar para comprender mejor la diafonía entre los neutrófilos y las células tumorales o entre los neutrófilos y otros componentes del microambiente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
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