Introduction
Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, tümör mikro içindeki hücrelerin önemli bir kısmını oluşturmaktadır ve hastalar ve kanser 1 hayvan modellerinde tümör kanser ile ilişkilidir. Son zamanlarda, daha yaygın kronik immün yanıtları kemoterapiler 2 tümör ilerlemesi, metastaz ve direnç teşvik kritik bir rol oynayan takdir haline gelmiştir. Makrofajlar ile doğrudan kemoterapi 3,4 tümör hücresi yanıtı düzenleyen gösterilmiştir önemli doğuştan gelen bağışıklık hücrelerdir. Bununla birlikte, anti-kanser tedavisine, tümör yanıtı düzenleyen nötrofillerin, doğuştan gelen bağışıklık sisteminde anahtar oyuncular rolü bilinmemektedir. Bu protokollerin amacı KLL hastanın kan örneklerinden nötrofil ayırmak için hızlı ve güvenilir bir yöntem kullanmak ve anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığını düzenleyen rollerini araştırmak için granülositik yol boyunca HL60 hücreleri ayırt etmek vardır.
6 işgalci karşı ilk savunma hattı olarak kan 5 ve hareket doğuştan gelen bağışıklık sisteminin en bol hücresel bileşenidir. Nötrofiller, çeşitli patolojik şartlarda 7 değişken efektör fonksiyonlara ek olarak etkili bir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları artan önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, yoğunluk gradyan ayırma yöntemi gibi diğer kan hücreleri, nötrofillerin izole etmek için, hızlı ve güvenilir bir yöntem olup, in vitro çalışmalar için gereklidir. Nötrofil izolasyonu için, bu yöntem kullanılarak, in vivo ve ex vivo nötrofil aracılığıyla oluşturulan imünolojik fonksiyonları üzerinde daha fazla araştırma kolaylaştıracaktır.
Nötrofillerin saf popülasyonlarının elde etme yeteneği immünolojik hastalıkların 8 hastaların araştırılması için önemli bir ilk adımdır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi hücrelerin yüksek verim elde edildiği bir yere bir tekniktir. methoD ara vermeden 35 dakika boyunca 300 g'de santrifüje edilerek ve ardından seyreltilmiş insan kanı ihtiva eden bir tüpün alt yoğunluk gradyan çözeltisi ilave edilmesini kapsar. mononükleer hücrelerin halka arayüzü görünür ve nötrofiller eski aşağıda bulunur. Bu yöntem, çok daha 9 pahalı nötrofil izolasyon kiti gibi diğer mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahip. Buna ek olarak, insan nötrofillerinden için spesifik bir yüzey işaretleyici yönelik antikorlar kullanılarak ticari kitler insan kanından nötrofilleri izole hücre aktivasyonunun veya farklılaşmasının riskini arttırır. Yoğunluk gradyan ayırma yöntemi kısa bir süre içinde, nötrofillerin izolasyonu sağlar. Aynı aşamada içinde, tek çekirdekli hücreler, ayrılmış ve geri kazanılır. Saf hücrelerin yüksek verimi fonksiyonel bütünlüğü elde etmek için elde edildiği bir temel teknik.
Tümör microenv taklit etmek içinironment 3D deneyler gerçekleştirilmiştir. In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü göz önüne alındığında, yeni insan nötrofil 3D deneyler kesin değildir. Bu nedenle, promiyelositik (HL60) hücreleri farklılaşma uyarıcılar dimetil sülfoksit (DMSO) ve retinoik asit (RA) kullanılarak, nötrofil benzeri hücrelere farklılaşmaları için indüklenir. Farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) kullanarak, farklı donörlerden izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip önleyecektir.
In vitro 3D kültür modelleri, in vitro 2D modelleri arasında ve in vivo modellerde bir ara evresini temsil eder. 2B kültüründe hücreler bu sentetik yüzey üzerinde denatüre edilir biriken proteinlere doğal olmayan hücre ekleri oluşturan plastik yüzeye yayılır. Bunun aksine, hücre ve hücre dışı matrisin sentezlenmesi için 3D kültürü da doğal hücre-hücre ek hücreler, bağlı oldukları doğal malzeme vardır.Bu nedenle, özellikle de, kanser hücreleri ve diğer hücre tipleri arasında 3D ko-kültür modelleri, tümör büyümesi, anjiyogenez ve metastazın katkıları gösteren için yararlı olmuştur. Bunun bir sonucu olarak, 3D kültürleri, hücre kültürü, in vivo 10 mevcut fizyolojik koşulları taklit etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Primer lösemik hücreler ile 1. Nötrofil İzolasyon ve Co-kültür
NOT: Prosedürler bilgilendirilmiş onam imzalanması tüm hastalarda Lyon Hastane Etik kurul onayı altında gerçekleştirilmiştir.
- Birincil lösemik hücreler ve nötrofillerin izolasyonu
- Kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı hastaların EDTA (kan mililitrede 1.8 mg EDTA) periferik kan tüpleri toplamak.
- Bir steril 50 ml tüp kan her biri 15 ml ilave edilir ve 15 ml RPMI seyreltin (seyreltme 1: 1), daha sonra dikkatli bir şekilde yavaş yavaş fazlar karıştırılmadan tüpün dibine yoğunluk gradyan çözeltisi 15 ml ilave ediniz. yoğunluk gradyan çözeltisi hazırlanması için oda sıcaklığında olduğundan emin olun.
- Oda sıcaklığında ve frensiz 35 dakika boyunca 300 xg'de santrifüj. Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru gösterildiği gibi kan dört farklı aşamadan ayırmak gerekir: trombosit ve plazma, mononükleer hücreleri (white halkası), yoğunluk gradyan çözümü, granülositler ve eritrositler.
- Yeni 50 ml tüp plastik Pasteur pipeti ve transferi ile birincil lösemik hücreleri temsil beyaz halka toplayın.
- PBS ile tüp içinde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml'ye kadar (kalsiyum ve magnezyum içerir) doldurun.
- 5 PBS daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g toplam ve santrifüj 50 ml'ye kadar PBS ilave mL pelletini.
- tam RPMI ortamı ile pelletini (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM glutamin, 100 U ile takviye / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin), hücre canlılığı sayacını kullanarak sayım için.
- Aspire Üst fazlar granülosit eritrosit faz ayrılıp 25 ml'ye kadar PBS ekleyin toplam 50 ml% 0.9 NaClup içinde% 3 dekstran ekleyin. boruları 10 kez karıştırın ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 30 dakika boyunca muhafaza edin.
- Üst RBC-fakir nötrofil katman toplayıntemiz ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri d. PBS sonra toplam 50 ml kadar kırmızı hücre parçalama tampon ekleyin ml 5 ile her pelletini.
- RT daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüj 15 dakika süreyle karanlıkta tüpler tutun. PBS ile pelet (toplam 50 ml'ye kadar PBS ekleyin), daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüj yıkayın.
- hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi kullanılarak izolasyon saflığını belirlemek için 5 ml'lik plastik tüplere 50 ul PBS-FBS (% 4), her hücre türü için 3 x 10 5 tutun.
- İzole hücre popülasyonlarının Morfolojik Görüntüle'ye analiz
- Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 4 Nötrofiller ve 150 ul tam RPMI ortamında 3 x 10 4 mononükleer hücreleri yeniden süspanse edin. Bu t sağlanması, sitospin santrifüj cam slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları birleştirinO santrifüj iyi dengelenmiş.
- santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odalarında çıkarın oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 750 x g'de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın.
- Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin.
- FACS İzole Hücrelerin Saflık test
- APC konjüge anti-insan CD19 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) ile izole edilmiş, birincil lösemi hücreleri etiketlemek. Tablo 1 (5 ul / 10 6 hücre) listelenen anti-insan antikorlarının karışımı ile saflaştırılmış nötrofilleri etiketleyin. 4 O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri
- 500 ul PBS-FBS (% 4), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri hücreleri yıkayın.
- 200 ul PBS-FBS (% 4), her pelletini.
- , SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP FSC-A (488 nM): 488 nm lazer: Aşağıdaki optik yapılandırmayı kullanarak bir akış sitometresinde analiz ), PE (BP 575/26); 633 nm lazer: APC (BP 660/20), APC-Cy7 (BP 780/60). Renk karşılanmasını sağlamak.
- Otolog Nötrofiller ile İlköğretim lösemik hücrelerinin Coculture
- Tohum, birincil lösemi hücrelerinin tek başına ya da tam RPMI ortamı içinde oranı 1:10 otolog nötrofiller 2 x 10 5 hücre / ml olmuştur. Bunu yapmak için, seyreltilmesi hücre süspansiyonları, hücre sayıları ayarlayın ve 2 x 10 6 hücre / mL nötrofil birincil lösemi hücre 2 x 10 5 hücre / ml ekleyin. dikkatlice karıştırın.
- hücrelere Bruton tirozin kinaz (Btk) inhibitörü (İbrutinib) 25 uM ekleyin. % 5 CO2 ile 37 ° C 'de 24 saat süreyle inkübe edilir.
- Hücre Hasat ve FACS analizi
- collECT, FACS analizi ve santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'da tüpler 5 ml'lik plastik tüplere hücreleri. daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj 1 ml PBS-FBS (% 4) ile granül yıkayın.
- ticari kit kullanılarak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlıkta inkübe hücreleri süspanse Annexin V ve PI peletler. (FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (BP 530/30), PI 610: 488 nm lazer: Şekil 2A yolluk stratejisi kullanarak bir akış sitometresinde ve aşağıdaki optik yapılandırmasına analiz / 20 BP). Renk karşılanmasını sağlamak.
Granulositik Pathway ve 3D Model RL Lenfoma B Hücreleri ile Bunların kokültürü boyunca HL60 Hücre 2. Farklılaşma
- Nötrofil benzeri Hücreleri içine insan promiyelositik (HL60) Hücre Farklılaşma
- / Ml daha sonra değişimi etkilemek için 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave 3 x 10 5 hücre HL60 hücre sayısını ayarlar. Her 3 x 10 5 Tohum CO2 ile 37 ° C 'de 48 saat süre ile inkübe edilir.
- Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g hücreleri ve santrifüj toplar. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri.
- Sonra bu çözeltiye, 3 x 10 5 hücre / HL60 hücre sayısını ayarlamak ve 1 uM retinoik asit (RA) ve% 1.25 DMSO ilave edilerek kendi değişimini etkileme tam RPMI ortamı içinde hücre süspansiyonu seyreltin. Oyuk başına 48 oyuklu plaka içerisinde her biri 3 x 10 5 HL60 hücreleri, tohum ve% 5 CO2 ile 37 ° C sıcaklıkta bir 48 saat daha inkübe edilir.
- HL60 farklılaşma Analizi (HL60 fark)
- hücreleri toplamak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj tüpleri. hücre canlılığı, sayılmadan için tam RPMI ortamı ile pelet yeniden süspanse edin.
- flow sitometri ile hücre-yüzey belirteçleri ifade değişikliklerini analiz etmek. Her 3 x 10 5 koyun 5 HL60 fark hücreleri.
- 50 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin. AF700 veya APC konjüge anti-insan CD38 (5 ul / 10 6 hücre) konjüge edilmiş bir anti-insan CD11b hücreleri etiketleyin. 4 O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe hücreleri
- daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'de santrifüj 500 ul PBS-FBS (% 4) ile yıkayınız. 200 ul PBS-FBS (% 4) pelet yeniden süspanse edin.
- 488 nm lazer: Şekil 3A yolluk stratejisi ve aşağıdaki optik yapılandırma kullanarak akış sitometresinde analiz FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm lazer: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (BP 730/45).
- HL60 fark morfolojik değişiklikleri test etmek için, mikroskobik inceleme için cam slaytlar üzerine hücreleri hareketsiz.
- Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 tekrar süspansiyon
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 rpm'de numune odasına ve hücre-santrifüje her bir hücre türü yer. santrifüj slaytlar, filtre kartları ve örnek odaları çıkarın. slaytta hücrelere zarar vermemek için dikkatli sökün. Filtre kartları ve örnek odaları atın.
- Giemsa boyama kiti kullanılarak hücreleri leke ve 1 saat kuruması için slaytlar tutun. 100X büyütme ile mikroskop hücreleri tarafından inceleyin.
- Bunu yapmak için, her biri 3 x 10 tekrar süspansiyon
- 3 boyutlu (3D) Kültür
NOT: Bu deneyde kullanılan malzemeler soğuk ve deney buz üzerinde gerçekleşiyor emin olun.- Tek başına veya HL60 fark ile karıştırılır ya her 5 x 10 4 RL hücreleri tekrar süspansiyon fark 1:10 yaklaşık 2 ila 3 mm açıklığı genişletmek amacıyla steril makasla kesme, 1 ml bir pipet kullanarak 300 ul bazal membran matris ile karıştırılması. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının.
- 24 oyuklu bir plaka içerisinde de / hücre süspansiyonu her biri 300 ul tohumu. Bu adım sırasında kabarcıkları kaçının. Daha sonra her bir RPMI ortamı doldurun ve% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 7 gün süre ile inkübe ml 1 ekleyin% 5 CO2 ile 37 ° C' de 30 dakika boyunca inkübasyona bırakılır. iki günde orta değiştirin. günde 5 10 nM vinkristin ekleyin.
- FACS analizi
- 7 günlük bir kültürden sonra ortam aspire ve iki kez 1 ml buz gibi soğuk PBS ile her bir yıkama. 3 ml / buz gibi soğuk PBS-EDTA (5 mM) da ekleyin. 200 ul pipet ucu alt kullanılarak kazıyarak Kuyunun dibinden jel ayırın. 30 dakika boyunca buz üzerinde hafifçe plakayı sallayın.
- steril 15 ml tüp içine hücre süspansiyonu aktarın ve ic yavaşça tüpler sallayın30 dakika daha örn. homojen hücre süspansiyonu görünüm için kontrol edin. (Bu durumda değilse, o zaman daha uzun süre hücreleri sallamak ya da daha fazla PBS-EDTA ekleyin).
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin tüpler. PBS ile peletler daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yıkayın.
- PBS-FBS (% 4) ile yeniden süspanse edin ve PE-Cy7 ve APC konjüge anti-insan CD38 antikoru (5 ul / 10 6 hücre) bağlı anti-insan CD19 antikoru ile etiket. 4 O ° C'de 30 dakika süreyle karanlıkta inkübe
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g sonra 500 ul PBS-FBS (% 4) santrifüj tüplerine ile yıkayınız. ticari kit kullanılarak Annexin V ve PI ile hücreleri tekrar süspansiyon.
- Şekil 4A yolluk strateji kullanarak akış sitometresinde analiz ve aşağıdaki optik yapılandırma: 488 nm lazer: FSC-A (488 nM), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm lazer: APC (BP 660/20). Renk karşılanmasını sağlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
, Beyaz bir halka tek-çekirdekli hücreleri temsil eder, trombositler ve plazma. Burada tarif edilen yoğunluk gradyan ayırma yöntemi CLL hasta kanından izole primer lösemik hücreler ve uyarılmamış nötrofiller Şekil 1A, yukarıdan aşağıya doğru (yoğunluk gradyanlı santrifüj işlemi sonrasında elde edilen farklı kan katmanları temsil içerir yoğunluk gradyan çözeltisi, granülositler ve eritrositler). Şekil 1B ve 1C, sırasıyla nötrofil (çok loblu çekirdek hücreleri) ve mononükleer hücreler arasında morfolojik görünümlere bakımından farklılıklar gösterir.
Şekil 1 D'deki sonuçlar, birincil lösemi hücrelerinde (mononükleer) yan dağılım (SSC) arsa vs ileri dağılım (FSC) temsil eder. Tek olan histogram (Şekil 1E) tam bir sağ shift APC konjuge anti-insan CD19 ile bu nüfusu gösterir EtiketlemeBu nüfus CD19 ve saf pozitif olduğunu gösterir zirve. Sitometrisi Tablo 1'de listelenen florokrom-eşlenik monoklonal antikorların bir karışımı ile izole edilmiş nötrofiller etiketleme sonra akış tarafından doğrulanan şekilde nötrofiller de ≥90% saflıktadır. Şekil 1F CD45 için pozitif Yalıtılmış nötrofiller SSC dağılım çizim vs. FSC (Şekil temsil 1G), CD14 (Şekil 1H için CD15 için pozitif ve negatif), CD56 (Şekil 1J için, CD15 ve CD16 (Şekil 1I) hem de pozitif pozitif CD16 ve negatif).
Hasta Kan İzole Morfolojik golcüler ve İlköğretim lösemik Hücre Saflık ve Nötrofiller Şekil 1. analizi. (A) şematik görünümü yoğunluğu Gradi sonra farklı kan katmanları temsilent santrifüj. (BC) Giemsa lekeleme (B) nötrofillerin ve (C) birinci lösemi hücrelerinde (mononükleer) arasındaki morfolojik farklılıklar gösterir. Fotoğraflar. 100X büyütme ile mikroskop tarafından alınan (D) İleri-saçılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) arsa izole primer lösemi hücre popülasyonunu temsil edildi. (E) İzole primer lösemi hücreleri, anti-CD19-APC ile etiketlendi CD19 ekspresyonu için analiz edildi. Kırmızı çizgi etiketlenmemiş hücreleri belirtir ve mavi çizgi anti-CD19-APC ile etiketlenmiş hücreler olduğunu gösterir. (E) FSC SSC dağılım çizim vs. izole nötrofil popülasyonu temsil etmektedir. (GJ) Yalıtılmış nötrofiller Tablo l'de listelenen antikorların bir karışımı ile etiketlenmiş 1 ve (G), CD45 (H) CD14 ve CD15, (I) 'CD15 ve CD16, (J) CD16 bir ifadesi için analizd CD56. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| antijenler | florokrom | Klon |
| CD14 | APC-Vio770 (Cy-7) | TÜK4 |
| CD15 | APC | VIMC6 |
| CD16 | FITC | VEP13 |
| CD45 | PerCP-Vio700 (Cy5.5) | 5B1 |
| CD56 | PE | AF12-7H3 |
Tablo 1. florokrom-eşlenik Saflastırılmıs Monoklonal antikorlar izole nötrofillerin saflık testi için kullanılır. Tüm antikorlar Miltenyi Biotech elde edilmiştir.
Şekil 2A SSC ScatterPlot vs FSC nötrofiller ve primer lösemi hücrelerinin kapılarını temsil eder. Nötrofiller daha ayrıntılı birincil lösemik hücreler, böylece daha yüksek SSC ile görünür daha vardır. İbrutinib mevcudiyetinde nötrofil ile birlikte kültürlenmiş primer lösemik hücreler üzerinde geçiş sağlandıktan sonuçlar canlı hücrelerin daha yüksek oranda, tek başına kültürlenen hücreler ile karşılaştırıldığında (Şekil 2C,% 84.8) (Şekil 2B,% 53.1) göstermektedir. Şekil 2B kutu grafiği olduğunu azaltmaktadır gösteriyorİbrutinib tarafından uyarılan hücre canlılığı e anlamlı nötrofillerin varlığı (40.1 ± 3.1 vs 60.1 ± 3.5, p <0.001, 19 hasta) tarafından engellenmiştir.
2. Otolog Nötrofiller İbrutinib. Kan karşı primer lösemik hücreler koruyun Şekil kronik lenfositik lösemi (KLL) tanısı almış hastalarda toplanmıştır. Birincil lösemik hücreler izole ve primer lösemi hücreleri otolog nötrofiller (N) tek başına veya birlikte kültüre edildi: 24 saat Nratio 1:10 varlığında ya da 25 uM İbrutinib yokluğunda. Canlı birincil lösemi hücrelerinin yüzdesi (Annexiv V negatif / PI negatif) akım sitometri analizi takiben anneksin V-FITC ve PI ile çift boyanması ile ölçüldü. (A) İleri-saçılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) arsa nötrofiller ve birincil lösemi hücrelerinin kapılarını temsil. (B) Bi-boyutlu nokta-leke canlı ve apoptotik birincil lösemik hücrelerin tek başına kültüre ve 25 mcM İbrutinib ile tedavi yüzdelerini gösterir. (C) Bi-boyutlu nokta-leke canlı ve apoptotik birincil lösemik hücrelerin yüzdelerini ko-göstermektedir nötrofiller ile kültüre ve 25 mcM İbrutinib ile işlendi. (D) Kutu arsa 19 hastanın hayatta birincil lösemik hücrelerin yüzdesini temsil eder. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir. *** p <0.001 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
In vitro nötrofil kısa yarı ömürlü 3D kültür kullanımı etkisiz hale getirir. granülositik yolu boyunca HL60 hücrelerinin farklılaşma farklılaşma indükleyicileri ile oluşturuldu. İki farklı parametreler (hücre yüzey belirteçleri ifade ve morfolojik changes) HL60 farklılaşmasını ölçmek için kullanılmıştır. Şekil 3A'da SSC dağılım çizim vs FSC HL60 hücrelerinin daha yüksek FSC ile HL60 fark hücreleri ile karşılaştırıldığında boyutu daha büyük olduğunu göstermektedir. Granülositik diferansiyasyon bir göstergesidir farklılaşması üzerine bir CD11b artış ve CD38 ekspresyonu (Şekil 3B) AF700 APC konjüge anti-insan CD38antibody konjüge anti-insan CD11b antikoru ile hücrelerin (HL60 ve HL60 fark) gösterir etiketleme. HL60 fark hücreleri, çok-loblu çekirdekleri (Şekil 3C) ortaya çıkması ile tespit morfolojik değişiklikler gösterir.
Şekil 3. Farklılaştırılmış HL60 Hücrelerinin Yapısal Parametreleri. (A) İleri-saçılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) araziler HL60 ve farklılaşmış HL60 hücreleri (HL60 fark) temsil etmektedir. (B) HL60 ve HL60 fark hücreleri akış sitometri analizi ve ardından bir anti-CD11b-AF700 ya da anti-CD38-APC ile etiketlenmiştir. SSC-A dağılım çizim (A) vs FSC-A her hücre popülasyonu üzerinde yolluk sonra, hücreler CD11b veya CD38 ifadeleri analiz edildi. (C) HL60 hücrelerinin granülosit doğru farklılaşma ile tutarlı morfolojik değişiklikleri gösterir. Resimler 100X büyütme ile mikroskop ile alınmıştır. Kalın siyah ok çok loblu çekirdeği etmektedir. Grafikler beş bağımsız deneyler temsilcisi vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3D modeli vinkristin RL hücresi tepkisi düzenleyen HL60 fark hücrelerinin etkisini test etmek için, RL hücreleri tek başına ya da 10 n, en vinkristin varlığında veya yokluğunda bazal membran matrisi içinde HL60 fark ile kültürlenmiştirŞekil 4A'da gösterilen Ayırıcı stratejisi kullanılarak M., her iki popülasyonu, CD19 ve CD38 ekspresyonu göre ayırt edilir; CD38 pozitif CD19 ve HL60 fark hücre bulunan RL hücreleri. Vinkristin mevcudiyetinde HL60 fark hücreleri ile birlikte-kültür RL hücreler üzerinde geçiş sağlandıktan sonuçlar canlı hücrelerin daha yüksek oranda, tek başına kültür RL hücreleri ile karşılaştırıldığında (Şekil 4C,% 35.9) (Şekil 4B,% 19.7) göstermektedir. Şekil 4D çubuk grafiği HL60 fark hücreleri (19.5 ± 0.2 vs 33.1 ± 1.0, p <0.001) varlığında hayatta RL hücrelerin yüzdesinde önemli bir artış (negatif CD19 pozitif Annexin V / PI negatif) gösterir.
Şekil 4. Nötrofil benzeri HL60 fark Hücreler 3D Kültür Vinkristin karşı RL Lenfoma Hücreleri koruyun. RL hücreleri bazal membran matris içinde 7 gün HL60 fark oranı 1:10: RL HL60 fark hücreleri ile tek başına veya birlikte kültürlenmiştir. 5. günde, vinkristin (VCR), 10 nM lik bir konsantrasyonda ilave edilmiştir. Sferoidler 7. günde ayrıştırılmış ve hücreler daha sonra akış sitometrik analizi ile takip anneksin V-FITC ve PI ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş bir anti-CD 19-PECy7 ve anti-CD38-APC ile etiketlenmiştir. (A) ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) arsa RL hücreleri ve HL60 fark hücrelerin kapıları temsil eder. (B) Bi-boyutlu nokta-leke yalnız kültüre ve 10 nM vinkristin ile tedavi canlı ve apoptotik RL hücrelerinin yüzdelerini göstermektedir. (C) Bi-boyutlu nokta- blot HL60 fark ile birlikte kültür ve 10 nM vinkristin ile tedavi canlı ve apoptotik RL hücrelerin yüzdelerini göstermektedir. (D) çubuk grafiği canlı RL hücrelerinin yüzdesini temsil eder. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
yoğunluk gradyanlı santrifüj yaklaşımı kullanarak yüksek saflıkta insan kanından nötrofıller izolasyonu için ve aynı kademe tek çekirdekli hücreler içinde, burada etkili, basit, hızlı ve ucuz bir protokol açıklanan, aynı zamanda ayrılmakta ve geri kazanılmaktadır. izole edilmiş hücre popülasyonları ≥90% saftır.
Çeşitli yöntemler insan kanından nötrofil izolasyonu için kullanılabilir. Bu süreksiz gradyanlar 11,12 kullanarak veya nötrofiller immüno-manyetik bu daha sonra CD16- bağlanması ile zenginleştirilmiş nötrofiller insan karşıtı CD16 gibi belirli bir antikor ile işaretlenmişlerdir olan sırasında pozitif immüno-manyetik seçim nötrofil izolasyonu için, ticari kitler kullanılarak benzer yöntemler bulunmaktadır manyetik bir sütun 13 pozitif hücreleri. Negatif immüno-manyetik seçim ile ticari kitler tam kan ya da granülosit süspansiyon hücreleri Tha üzerine bağlanan antikorun bir kokteyli ile etiketlenir sırasında da mevcutturn, nötrofiller 9 (yani, eritrosit, trombosit ve CD2, CD3, CD9, CD 19, CD36, CD56, glikoforin A ve dekstran-kaplı manyetik parçacıklar gibi istenmeyen hücreleri etiketlemek antikor komplekslerinin), daha sonra nötrofiller antibodinin olarak elüsyon ile zenginleştirilmiş manyetik kolonu üzerinde bağlanmayan hücreleri negatif fraksiyon. Buna ek olarak, nötrofiller flöresanla aktive edilen hücre 14 sıralama ile izole edilebilir.
Bazı teknikler pozitif immüno-manyetik seçim olarak saf nötrofil, yüksek verimler sağladığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, nötrofillerin yüzeyi üzerinde bağlanan ve bu potansiyel olarak, bunların aktivasyonunu veya farklılaşmasını indükleyerek işlevini değiştirebilir markalama maddeleri nedeniyle yoğunluk gradyan santrifüj yöntemlerine göre dezavantajları vardır. Ayrıca pozitif immuno-manyetik seçim yöntemi, ayrılması için bir manyetik sütun üzerinde antikor etiketli nötrofil bağlama kullanarak ve bu da onların fonksiyonlarını etkileyebilir.Bu yöntem olumsuz nötrofil yaşamını etkileyebileceğini göstermiştir hücreleri toplamak için uzun zaman gerektirir Floresan Aktif Hücre Sıralama nedeniyle kısa yarı ömrü ölçüde başka sınırlama vardır.
Yoğunluk gradyanı santrifüjü yöntem çok karşılaştırılabilir ve nötrofil saflığı hem prosedürler kullanılarak% 90'ından fazla, ancak önceki 40,% 60 ve% 80,% hacim oluşur katman gradyan çözeltisi ile karşılaştırıldığında teknik olarak daha az zor olan bir iki tabakalı bir gradyanı / PBS Vol. Nedeniyle üç tabakadan arasındaki küçük yoğunluk farklılıkları Swamydas ve ark. Gradyan çözüm arayüzleri karışması sık yer aldığını 15 tarafından dile getirilmiştir. Negatif immüno-manyetik seçim yaklaşımlar ile ilgili olarak, aynı zamanda, yüksek saflık ve canlılığı 9 nötrofil izolasyonu için etkili olduğu bildirilmiştir. Pozitif bağışıklık manyetik seçimi ve Floresan Aktif Hücre Sorting üzerindeki avantajı nötrofiller olduğunuHerhangi bir markalama maddeleri ile etiketlenmemiş ve böylece hücre aktivasyonunun önlenmesi, manyetik kolona bağlanmaz ancak bu yöntem çok daha pahalı ve daha fazla zaman, yoğunluk gradyanı yöntemi ile karşılaştırıldığında alıcıdır.
Nötrofiller, normal olarak in vitro ve in vivo 16,17 hem de hızlı bir kendiliğinden bile apoptoza uğrarlar. HL60promyelocyticcells nötrofiller 18 içine farklılaşma geçmesi potansiyel olarak insan lökosit atalarıdır birçok özelliklerini korurlar. Nötrofil aksine, HL60 fark hücreler hızla yok apoptoz geçmesi ve bu hücreleri kullanarak, farklı donörlerden kendi izolasyon nötrofillerin farklı tepkiler sahip sorun çözer.
Son zamanlarda, 3D kültürleri, insan ve hayvan fizyolojisi ve özellikle kanser alanında farklı biyolojik araştırmaları için bir modele daha olgun ve uygun hale gelir. 3D kültür 2D desen kayması hızla si ilerliyorİkincisi nce kanser 19 gibi çeşitli patolojik durumların inceleyerek sırasında daha göze çarpıyor. Bir hücrenin ortamına üçüncü bir boyut ekleyerek hücresel etkileşimleri 20 önemine yakından bakmak ve hücresel davranış ve özellikleri farklılıkları araştırmak için önemli olan 2B kültür sakıncaları artan bir farkındalık var. 3D kültür daha ilgili araştırma yol açan canlı bir organizmada koşullarına benzer bir ortam (örneğin., Insan) oluşturur. Ancak, 3D kültür gibi hücreler, hücre dışı matrisler ve 2D kültüründe mevcut değil interstisyel sıvılar gibi farklı iş ortakları arasındaki karmaşık etkileşimi içerir. Böylece, çabalar sipariş yöntemi kalibrasyonu kurmak ve özellikle iyi laboratuar uygulamaları yanı sıra etkili malzemeleri kapsamlı test ve izlenmektedir ticari markalar saymak gerekecektir.
tümör mikrokatılmak ve antikanser ajanları 21,22 için tümör oluşumu, metastaz ve tepki düzenleyen birçok immün hücre popülasyonlarının da dahil olmak üzere çok sayıda hücre türleri oluşur. Çeşitli çalışmalar, tümör nötrofil infiltrasyonu artış önemli ölçüde anti-VEGF tedavisinin 23,24 gibi çeşitli anti-kanser ajanlarına karşı direnç kazanmış olan korelasyon göstermiştir. Ayrıca, ön-muamele nötrofil yükselme metastatik renal hücre karsinomu 25, hem de farklı katı tümörleri olan hastalarda intra-tümöral nötrofil yüksek düzeyde mevcudiyetinde hastalarda sayısı, 26 düşük hayatta kalma prognostik faktör olarak önerilmiştir. Çalışmamız nötrofiller antikanser ajan apoptosisden lenfoma B hücreleri korumada rol oynayabileceğini düşündürmektedir.
Özetle, burada açıklanan güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem hum gelen nötrofillerin ve mononükleer hücreleri toplamak için herhangi bir laboratuar tarafından istihdam edilebilirBir kan. Buna ek olarak, granülositik yolu boyunca HL60 hücrelerinin farklılaşma bu hızlı kendiliğinden apoptoz gibi neurophil sorunları önlemek amacıyla sunulmuştur. nötrofiller 2D ve 3D kültür sistemleri kullanılarak bu ajanlara karşı lenfoma hücreleri üzerinde koruyucu bir etki gösteren burada Bu yaklaşımlar bir anti-lenfoma ajanlara lenfoma hücrelerinin duyarlılığına nötrofillerin rolünü araştırmak için kullanıldı. Bu yaklaşımlar, kanser biyolojisinde nötrofil rolü anlayışımızı derinleştirmek gerektiğini nötrofil fonksiyonel çalışmalar çeşitli için kullanılabilir. Özellikle, bu yöntem, daha nötrofiller ve tümör hücreleri arasında veya nötrofil ve mikro diğer bileşenleri arasında çapraz-anlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium) | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine) | Life technologies | 25030-024 | |
| Penicillin streptomycin (Pen Strep) | Life technologies | 15140-122 | |
| Bruton's tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib) | CliniSciences | A3001 | |
| Vincristine | EG labo | ||
| BD Matrigel basement membrane matrix | BD Biosciences | 354234 | Put at 4 oC overnight (O/N) before the day of the experiment |
| Red cell lysis buffer | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll (Pancoll) | PAN Biotech | P04-60500 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Euromedex | S3014 | |
| Annexing V-FLOUS staining kit | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII flow cytometry | BD Biosciences | ||
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA microscope | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter | Nexcelom Bioscience |
References
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606 (2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586 (2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D.
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940 (2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).
