Gene Transfer inn i Chicken hørbar Organ av<em> I Ovo</em> Micro-electroporation

Summary

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Abstract

Kylling embryo er ideelle modellsystem for å studere embryonale utvikling som manipulasjoner av gen-funksjon kan utføres med relativ letthet i ovo. Det indre øret auditive sanseorgan er avgjørende for vår evne til å høre. Det huser en høyt spesialisert sensorisk epitel som består av Mekano-transducing hårcellene (HC'er) og omkringliggende glial-lignende støtte celler (SCS). Til tross for strukturelle forskjeller i hørselsorganene, blir molekylære mekanismene som regulerer utviklingen av den auditive organ evolusjonært konservert mellom pattedyr og aves In ovo elektroporasjon er i stor grad begrenset til tidlige stadier ved E1 -. E3. På grunn av den relative sent utviklingen av hørselsorganet på E5, manipulasjoner av hørselsorganet ved i ovo electroporation siste E3 er vanskelig på grunn av avansert utvikling av kylling embryo på senere stadier. Metoden som presenteres her er en forbigående genoverføring metode for målretting gener av interesse påstadium E4 – E4.5 i utviklings kylling auditive sanseorgan via in ovo mikro electroporation. Denne fremgangsmåte er anvendelig for gevinst-og tap-av-funksjoner med konvensjonelt plasmid DNA-baserte ekspresjonsvektorer og kan kombineres med i ovo assay celleformering ved tilsetning EDU (5-etynyl-2'-deoksyuridin) til hele embryoet i tidspunktet electroporation. Bruk av grønn eller rød fluorescerende protein (GFP eller RFP) ekspresjonsplasmider gjør at eksperimentator raskt avgjøre om elektroporeringsmetoden vellykket målrettet auditive delen av å utvikle indre øret. I denne fremgangsmåte papiret, er representative eksempler på GFP elektroporert prøvene illustrert; embryoene ble høstet 18-96 timer etter electroporation og målretting av GFP til pro-sensorisk område av hørselsorganet ble bekreftet av RNA in situ hybridisering. Fremgangsmåten papir tilveiebringer også en optimal protokoll for anvendelse av tymidinanalog EDU for å analysere celle formeringenbeid; et eksempel på en Edu basert celleproliferasjon analyse som kombinerer immuno-merking og klikk Edu kjemi er gitt.

Introduction

Til tross for forskjeller i morfologi og cellulære mønster mellom pattedyr og avian auditive sanseorgan, er de molekylære faktorer og stier som er ansvarlige for sanse HC utvikling antas å være evolusjonært konservert ^1-3. Basilaris papilla, som huser de auditive HC'er og deres omkringliggende SC'er, utvikler seg som en outpocketing i det indre øret otocyst. Tidlig på en pool av HC og SC stamfedre er spesifisert i otic placode / otic cup nevrale sensorisk kompetent domene (NSD). Fate-kartdata dokumentere at nevronale og sensoriske linjene er koblet og oppstår fra NSD ligger i Antero-ventral regionen otic kopp eller otocyst i mus og kylling ^4,5. Først neuroblasts delaminere fra NSD til å gi opphav til nervecellene i hørsels-vestibular ganglion, som til slutt delt i auditiv og vestibular ganglier. Disse nervecellene innerverer de sensoriske HC'er i det indre øret og kjerner i hjernestammen. Cellene thved forbli i NSD er tenkt å gi opphav til ulike sensoriske patcher, inkludert det auditive sanseorgan, bestående av Mechano førende sensoriske HC'er og deres tilknyttede SC'er.

I både dama og muse, auditiv organ sansestamcellesyklus exit og HC differensiering skje i motsatte stigninger. I chick, starter auditiv stamcellesyklus exit rundt ~ E5 og utvikler seg fra bunnen til toppen, og fra sentrum til periferien ^6. En dag senere, starter HC differensiering i apex og utvikler seg til bunnen ^7. Å studere utviklingen av det indre øret hos kylling gir mange tekniske fordeler som funksjonelle mekanismer kan bli undersøkt med relativ letthet i ovo i motsetning til å manipulere embryo in utero i andre modellsystemer, som krever komplekse operasjoner. Metoden som beskrives her bruker i ovo mikro electroporation å målrette gener av interesse i presumptive Basilar papilla området anterior-ventralt i otic vesikkel spesielt på E4.

Elektroporering i ovo er en teknikk som er godt etablert, og som vanligvis brukes ^{til 8-14.} Prinsippet for elektroporering teknikken er basert på det faktum at nukleotider (for eksempel plasmid-DNA, syntetisk DNA, RNA eller oligonukleotider) er negativt ladet. DNA ble injisert inn i vevet av interesse. Når en elektrisk strøm legges på tvers av vev, åpner den nåværende opp forbigående porer i celleveggene og muliggjør opptak av DNA, som negativt ladet DNA strømmer mot den positive elektrode (anode). For forsterkning-av-funksjon eksperimenter, er gener som er av interesse vanligvis subklonet inn i ekspresjonsplasmider som inneholder hensiktsmessige ekspresjonskassetter for grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP). For tap-av-funksjon eksperimenter plasmid-baserte dominerende negative repressor konstruksjoner eller RNAi, eller morfolino konstruksjoner er commonly brukte ^15,16. For å hindre mikroRNA (miRNA) funksjons mirnas svamp konstruksjoner, som er typisk plasmid basert, kan brukes ^17. Den her beskrevne metoden gjør for å undersøke de molekylære mekanismene som styrer spredning og differensiering i hørselsorganet, som i ovo mikro elektroporeringsmetoden kan enkelt kombineres med i ovo analysen celleproliferasjon ved å legge Edu til hele embryo.

Elektroporeringsmetoden og tillegg av Edu er utført på E4 i otic vesikkel, som er en dag før utbruddet av cellesyklus exit i hørselsorganet. Analyse av auditiv organ er vanligvis utført 18-96 timer etter electroporation på E5 (utbruddet av sensorisk stamcellesyklus exit), E6 (utbruddet av HC differensiering), og E7 (under HC differensiering); og senere opp til ~ E9 (slutten av HC differensiering). Denne elektroporering fremgangsmåte for genoverføring er forbigående varer omkring ~ 4 dager, because genene av interesse ikke å integrere i genomet, men metoden er anvendelig for bruk med passende plasmid DNA-baserte ekspresjonsvektorer, som har evnen til å integrere i genomet, slik som Tol2-mediert genoverføring ^11. Med denne metoden robust GFP eller RFP uttrykk varer ~ 4 dager i sneglehuset, etter som peker signalene svekkes, men gir en god tidsvindu til å studere den intrikate utvikling av auditiv organ. Dette i ovo genoverføring metoden er ny og lar spesifikt mot den presumptive auditive organ ved E4, som er optimal for undersøkelser som fokuserer på HC utvikling i hørselsorganet. Det er et godt tillegg til alternative metoder, som electroporate på mye yngre utviklingsstadier ^11,12 eller i forhold til bruk av in vitro basilaris papiller eksplantering kulturer ^18.

Protocol

Egg og unhatched embryoer blir tatt vare på og behandlet etisk og humant. Alle protokoller for unhatched embryo bruk ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland. 1. Egg og klargjøring av Expression konstruerer egg: Inkuber 3-4 dusin befruktet kylling egg (Gallus gallus) ligger flatt på sine sider ved 37 ° C. Etter 24 timers inkubasjon trekke tre cc av eggehvitestoff med en spr…

Representative Results

Ved denne fremgangsmåte papiret plasmid DNA som består av grønt fluorescerende protein (GFP) ekspresjonskassetter ble rettet inn mot å utvikle kylling basilær papilla (BP) med optimale parametre for 12 V og 4 pulser med 100 msek pulsvarighet og intervaller på 200 millisekunder, noe som ga en ~ 50% embryo overlevelsesrate og effektivitet av plasmid-DNA målretting til BP. Fluoriserende avbildning av nativt GFP-ekspresjon i utviklingen av embryoer viste denne metoden for elektroporer…

Discussion

Den her beskrevne fremgangsmåte for in ovo mikro elektroporering er optimalisert for genoverføring inn i det fremkallende auditive organ. Det er kompatibelt med plasmid DNA-baserte ekspresjonsvektorer som typisk benyttes for å manipulere genfunksjon / ekspresjon. Tidspunktet for electroporation ved E4 er optimal for undersøkelser som fokuserer på HC utvikling i hørselsorganet. De mest kritiske trinn er mikro-injeksjon av DNA inn i otiske vesikkel hulrommet uten å gå for dypt med nålen og skade på otic…

Materials

Sterile 1x PBS pH 7.4	gibco	10010-023
Fast Green FCF Powder	Sigma	F7252-5G
EdU Powder	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit	Invitrogen	C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)	Qiagen	12643
ECM 830 ElectroSquarePorator	BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit	BTX Harvard Apparatus	45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators	World Precision Instruments Inc.	M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts	World Precision Instruments Inc.	M10
Metal Steel Base Plate 12×24 inch	World Precision Instruments Inc.	5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors	World Precision Instruments Inc.	14120
Micropippette Puller for pulling needles	Sutter Instrument Co.	P-97
2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament	Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm	FHC	27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl	Hamilton	80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe	Fisher Scientific	O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic	Becton Dickinson and Company (BD)	427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes	Becton Dickinson and Company (BD)	309657
Disposable 21 Gauge Needles	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
Electrode Holder	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5	Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs	Office Depot	520-928
Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	23-400-101
Sterile filter tips