Genöverföring till kyckling hörselorganet genom<em> I Ovo</em> Micro-elektroporering
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
Kycklingembryon är idealiska modellsystem för att studera embryonal utveckling som manipulationer av genfunktion kan genomföras relativt enkelt in ovo. Innerörat hörselsinnesorgan är avgörande för vår förmåga att höra. Det finns en mycket specialiserad sensorisk epitel som består av mekano överförande hårceller (HCS) och omgivande gliaceller liknande stödjande celler (SCS). Trots strukturella skillnader i hörselorganen är molekylära mekanismer som reglerar utvecklingen av hörselorganet evolutionärt konserverat mellan däggdjur och aves I ovo elektroporering är i stort sett begränsad till tidiga skeden vid E1 -. E3. På grund av den relativa sena utvecklingen av hörselorganet vid E5, manipulationer av hörselorganet med in ovo elektroporering tidigare E3 är svårt på grund av vidareutveckling av kycklingembryo i senare skeden. Den metod som presenteras här är en övergående genöverföringsmetod för inriktning gener av intresse vidskede E4 – E4.5 i utvecklings kyckling auditiva sinnesorgan via in ovo mikro elektroporering. Denna metod är tillämpbar för gain-och förlust-av-funktioner med konventionell plasmid DNA-baserade expressionsvektorer och kan kombineras med in ovo cellprolifereringsanalys genom tillsats edu (5-etynyl-2'-deoxiuridin) till hela embryot vid tiden för elektroporering. Användningen av grön eller röd fluorescerande protein (GFP eller RFP) expressionsplasmider låter försöksledaren att snabbt avgöra om elektroporering framgångsrikt riktade hörsel del av utvecklingsinnerörat. I denna metod papper, är representativa exempel på GFP electroporated prover illustreras; embryon skördades 18-96 h efter elektroporering och inriktningen av GFP till pro-sensoriska området i hörselorganet bekräftades genom RNA in situ hybridisering. Metoden papper ger också ett optimerat protokoll för användningen av tymidin-analog edu att analysera cell proliftion; ett exempel på en EDU baserad cellproliferationsanalys som kombinerar immuno-märkning och klicka edu kemi tillhandahålls.
Introduction
Trots skillnader i morfologi och cell mönstring mellan däggdjurs- och fågelhörselsinnesorgan, är de molekylära faktorer och vägar som ansvarar för sensorisk HC utveckling tros vara evolutionärt konserverade 1-3. Den basilar papilla, som inrymmer hörsel HC och deras omgivande SCS, utvecklas som ett KONTANT i innerörat otocyst. Tidigt en pool av HC och SC stamceller anges inom öron placode / öron cup neurala sensorisk kompetent domän (NSD). Öde-kartdata bevisa att neuronala och sensoriska linjer är länkade och uppstår från NSD ligger i antero-ventrala regionen av öron cup eller otocyst i möss och kyckling 4,5. Först, neuroblaster delaminera från NSD att ge upphov till nervceller i hörsel-vestibulära ganglion, som så småningom uppdelad i auditiv och vestibulär ganglierna. Dessa neuroner innerverar de sensoriska HC i innerörat och kärnor i hjärnstammen. Cellerna thpå kvar i NSD tros ge upphov till olika sensoriska patchar, inklusive hörselsinnesorgan, som består av de mekano överförande sensoriska HC och tillhörande kaster.
I både brud och mus, hörselorganet sensorisk stamcellstransplantation cykel exit och HC differentiering förekommer i motsatta gradienter. I chick börjar hörsel stamcellstransplantation cykel exit runt ~ E5 och utvecklas från basen till spetsen och från centrum till periferin 6. En dag senare, börjar HC differentiering i spetsen och utvecklas till basen 7. Studera utvecklingen av innerörat i kyckling ger många tekniska fördelar som funktionella mekanismer kan undersökas med relativ lätthet i ovo i motsats till att manipulera embryon i livmodern i andra modellsystem, som kräver komplexa operationer. Den här beskrivna metoden använder in ovo mikro elektroporering att rikta gener av intresse i den presumtiva Basilar papilla område anterior-ventralt i öron vesikler specifikt på E4.
Elektroporering in ovo är en teknik som är väl etablerade och används vanligen 8-14. Principen för elektroporation teknik är baserad på det faktum att nukleotider (t.ex. plasmid-DNA, syntetiskt DNA, eller RNA-oligonukleotider) är negativt laddade. DNA injiceras in i vävnaden av intresse. När en elektrisk ström är placerad tvärs över vävnaden, öppnas det aktuella upp transienta porer i cellväggarna och möjliggör upptag av DNA: t, som den negativt laddade DNA strömmar mot den positiva elektroden (anoden). För förstärknings-of-funktion experiment, är gener av intresse som vanligen subklonades i expressionsplasmider som innehåller lämpliga expressionskassetter för grönt fluorescerande protein (GFP) eller röd fluorescerande protein (RFP). För förlust-of-funktion experiment plasmid-baserad dominanta negativa repressor konstruktioner, eller RNAi, eller morfolino konstruktioner är commonly används 15,16. För att inhibera mikro-RNA (miRNA) funktions miRNA svamp-konstruktioner, vilka typiskt plasmid baserad, kan användas 17. Den här beskrivna metoden gör det möjligt att undersöka de molekylära mekanismer som styr proliferation och differentiering i hörselorganet, som i ovo mikroelektro metoden kan lätt kombineras med in ovo cellprolifereringsanalys genom att tillsätta edu till hela embryot.
Elektroporation och tillsats av edu utförs vid E4 i öron vesikler, som är en dag före inträdet av cellcykelutgång vid hörselorganet. Analys av hörselorganet är typiskt 18-96 timmar efter elektroporering vid E5 (uppkomsten av sensoriska stamcellstransplantation cykel exit), E6 (uppkomsten av HC differentiering), och E7 (under HC differentiering); och senare upp till ~ E9 (slutet av HC differentiering). Denna elektro metod för genöverföring är övergående varar ungefär ~ 4 dagar becauSE generna av intresse inte integreras i genomet, men metoden är tillämpbar för användning med lämplig plasmid DNA-baserade expressionsvektorer, som har förmåga att integrera i genomet, såsom Tol2 genöverföring 11. Med denna metod robusta GFP eller RFP uttryck varar ~ 4 dagar i snäckan, varefter pekar signalerna bleknar, men ger en god tid att studera den invecklade utveckling av hörselorganet. Detta in ovo genöverföring metod är ny och gör det möjligt att specifikt rikta in sig på presumtiva hörselorganet vid E4, vilket är optimalt för undersökningar som fokuserar på HC utveckling i hörselorganet. Det är ett bra komplement till alternativa metoder, som electroporate vid mycket yngre utvecklingsstadier 11,12 eller jämfört med användning av in vitro-basilar papiller Explantation kulturer 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här beskrivna metoden för in ovo mikro elektroporering är optimerad för genöverföring i utvecklingshörselorganet. Den är kompatibel med plasmiden DNA-baserade expressionsvektorer som typiskt används för att manipulera genfunktion / uttryck. Tidpunkten för elektroporering vid E4 är optimal för undersökningar som fokuserar på HC utveckling i hörselorganet. De mest kritiska stegen är mikro-injicering av DNA i öron vesikler lumen utan att gå alltför djupt med nålen och skadar öron vesikler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Doris K. Wu för expressionsplasmider och in situ-sonder, Johns Hopkins University Center for Sensory Biology imaging anläggning och Centrum för hörsel- och balans. Detta arbete stöddes av NIDCD Grant T32 DC000023 LE
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
- Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
- Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
- Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
- Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
- Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
- Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
- Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
- Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
- Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
- Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
- Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
- Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
- Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
- Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
- Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
