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Developmental Biology

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Hühnerembryonen sind ideale Modellsysteme zur Untersuchung embryonaler Entwicklung als Manipulationen der Genfunktion kann mit relativer Leichtigkeit in ovo ausgeführt werden. Das Innenohr Gehörsinnesorgan ist für unsere Fähigkeit, kritisch zu hören. Es beherbergt eine hochspezialisierte Sinnesepithel, die von mechano-Umwandlungs-Haarzellen (HC-) und der umgebenden Glia artigen Stützzellen (SCs) besteht. Trotz struktureller Unterschiede in den Gehörorgane, sind die molekularen Mechanismen , die Entwicklung des Hörorgans Regulieren evolutionär konservierten zwischen Säugetieren und Aves In ovo Elektroporation frühen Stadien bei E1 weitgehend begrenzt ist -. E3. Aufgrund der relativ späte Entwicklung des Hörorgan bei E5, Manipulationen des Hörorgan durch in ovo Elektroporation Vergangenheit E3 sind aufgrund der fortgeschrittenen Entwicklung des Hühnerembryo schwer in späteren Phasen. Die hier vorgestellte Methode ist eine vorübergehende Gentransferverfahren für Gene von Interesse Targeting anStufe E4 - E4.5 im Hühner auditorischen Sinnesorgan über in - ovo - Mikro-Elektroporation zu entwickeln. Dieses Verfahren ist anwendbar für Verstärkungs- und loss-of-Funktionen mit herkömmlichen Plasmid - DNA-basierten Expressionsvektoren und kann durch Zugabe von EDU (5-ethinyl-2'-desoxyuridin) zu den gesamten Embryo in der mit in ovo - Zellproliferationstest kombiniert werden Zeitpunkt der Elektroporation. Die Verwendung von grün oder rot fluoreszierende Protein (GFP bzw. RFP) Expressionsplasmide ermöglicht dem Experimentator, um schnell festzustellen, ob die Elektroporation erfolgreich den auditorischen Abschnitt des Entwicklungsinnenohr abgezielt. Bei diesem Verfahren wird Papier, repräsentative Beispiele für GFP elektroporiert Proben veranschaulicht; 96 Stunden nach der Elektroporation und des Hörorgans zur pro-sensorischen Bereich der GFP - Targeting wurde von RNA in situ - Hybridisierung bestätigt - Embryonen wurden 18 geerntet. Das Verfahren Papier stellt auch ein optimiertes Protokoll für die Verwendung des EdU Thymidinanalogon Zelle prolif zu analysierenration; ein Beispiel für eine EdU basierte Zellproliferationsassays, die Immunmarkierung kombiniert und klicken Sie auf EdU Chemie vorgesehen.

Introduction

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Trotz der Unterschiede in der Morphologie und Zell Strukturierung zwischen Säugetieren und Vogel auditorischen Sinnesorgan, die molekularen Faktoren und Wege verantwortlich für die sensorische HC Entwicklung sind gedacht , um evolutionär 1-3 konserviert werden. Die basilar Papille, die den Gehör HCs und der sie umgebenden SCs beherbergt, entwickelt als Aussackung des Innenohrs otocyst. Früh auf einem Pool von HC und SC Vorläufern ist innerhalb der Ohrplakode / otic Tasse neuralen sensorische zuständigen Domain (NSD) angegeben. Fate-Mapping - Daten belegen , dass die neuronale und sensorischen Linien verbunden sind und von der NSD entstehen in der antero-ventralen Bereich des otic Tasse befindet oder otocyst bei Mäusen und Huhn 4,5. Zunächst delaminieren Neuroblasten aus der NSD Vorrücken in den Neuronen des auditorischen-vestibulären Ganglion zu geben, die schließlich in Hör- und Gleichgewichts Ganglien gespalten. Diese Neuronen innervieren die sensorischen HCs des Innenohrs und Kerne im Hirnstamm. Die Zellen thbei der NSD bleiben werden gedacht, Anlass zu verschiedenen Sinnes Patches zu geben, einschließlich Gehörsinnesorgan, der mechano-Umwandlungs-sensorischen HCs und ihre zugehörigen SCs aus.

In den beiden Küken und Maus, Hörorgan sensorischen Vorläuferzellzyklus verlassen und HC Differenzierung treten bei Steigungen entgegenwirkt. In Küken beginnt auditorischen Vorläuferzellzyklus - Ausgang um ~ E5 und schreitet von der Basis bis zur Spitze, und vom Zentrum zur Peripherie 6. Einen Tag später HC Differenzierung beginnt im Scheitel und schreitet zu der Basis 7. Das Studium der Entwicklung des Innenohres in Huhn bietet viele technische Vorteile als Funktionsmechanismen können mit relativer Leichtigkeit in ovo im Gegensatz zu manipulieren Embryonen in utero in anderen Modellsystemen untersucht werden, die komplexe Operationen erfordert. Das hier beschriebene Verfahren nutzt in ovo Mikro Elektroporation Gene von Interesse in der vermutlichen Basila Zielr Papille Bereich anterior-ventral in dem Ohrbläschen speziell bei E4.

Elektroporation in ovo ist eine Technik , die gut etabliert ist und häufig verwendet 8-14. Das Prinzip der Elektroporation Technik basiert auf der Tatsache , dass Nukleotiden (zB Plasmid - DNA, synthetische DNA oder RNA - Oligonucleotide) sind negativ geladen. Die DNA wird in das interessierende Gewebe injiziert. Wenn ein elektrischer Strom über das Gewebe gelegt wird, öffnet sich der Strom transiente Poren in den Zellwänden und ermöglicht die Aufnahme der DNA, da die negativ geladenen DNA der positiven Elektrode fließt in Richtung (Anode). Für gain-of-function Experimente werden Gene von Interesse in Expressionsplasmide gewöhnlich subkloniert, die geeigneten Expressionskassetten für das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder rot fluoreszierendes Protein (RFP) enthalten. Für loss-of-function Experimente plasmid-basierten dominant negative Repressor-Konstrukten oder RNAi oder Morpholino Konstrukte commonly verwendet 15,16. Zur Hemmung microRNA (miRNA) Funktion miRNAs Schwamm Konstrukte, die typischerweise Plasmid basiert, 17 verwendet werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die Proliferation und Differenzierung in Hörorgans steuern, wie die in ovo Mikro Elektroporationsverfahren kann leicht durch Zugabe von mit in ovo - Zellproliferationstest kombiniert werden EdU auf den gesamten Embryo.

Die Elektroporation und die Zugabe von EdU bei E4 in der Ohrbläschen durchgeführt, die einen Tag vor dem Beginn der Zellzyklus-Ausgang in dem Hörorgan ist. Die Analyse des Hörorgan ist in der Regel durchgeführt, 18-96 Stunden nach der Elektroporation bei E5 (Beginn der sensorischen Vorläuferzellzyklus-Ausgang), E6 (Beginn der HC Differenzierung) und E7 (bei HC Differenzierung); und später bis ~ E9 (Ende HC Differenzierung). Dieses Elektroporation Verfahren des Gentransfers ist vergänglich etwa ~ 4 Tage dauert, because die Gene von Interesse nicht integrieren in das Genom, aber das Verfahren ist anwendbar für die Verwendung mit geeigneten Plasmid - DNA-basierten Expressionsvektoren, die die Fähigkeit tun haben , in das Genom, beispielsweise Tol2 vermittelten Gentransfer 11 zu integrieren. Mit dieser Methode robust GFP oder RFP Ausdruck dauert ~ 4 Tage in der Cochlea, nach welchem ​​Punkt die Signale verblassen, noch bieten eine reichliche Zeitfenster die komplizierte Entwicklung des Hörorgan zu studieren. Diese in - ovo - Gentransferverfahren ist neu und ermöglicht, speziell auf die vermutliche Hörorgan bei E4 Ziel, die für die Untersuchungen optimal ist, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Es ist eine gute Ergänzung zu alternative Verfahren, die bei viel jüngeren Entwicklungsstadien 11,12 oder im Vergleich zur Verwendung von in vitro basilar Papillen Explantatkulturen 18 elektroporieren.

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Protocol

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Die Eier und unhatched Embryonen werden gepflegt und ethisch und menschlich behandelt. Alle Protokolle für unhatched Embryo Verwendung durch das Animal Care und Use Committee an der Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland genehmigt.

1. Eier und Herstellung von Expressionskonstrukten

  1. Eier:
    1. Inkubieren 3-4 Dutzend befruchtete Hühnereier (Gallus gallus) bei 37 ° C flach auf der Seite liegen.
      1. Nach 24 Stunden Inkubation ziehen 3 ccm Eiweiss mit einer Spritze aus dem runden hinteren Ende des Eis und das Loch mit durchsichtigem Klebeband abzudichten. Dies schafft eine Luftkammer zwischen dem Embryo und der Eierschale, so dass für einen leichten Zugang zu dem Embryo , ohne den Embryo an der Schale haftet , wenn für den Zugriff auf die Oberseite des Eies 19 das Fenster zu schneiden.
      2. Bei 117 h Inkubationszeit, inszenieren die Embryonen nach Hamburger und Hamilton 20 Entwicklungsstadienbei E4 (HH24-25) (siehe Figur 1D).
  2. Expressionskonstrukten:
    1. Bereiten Sie die Plasmid-DNA unter Verwendung von Reagenzien und das Protokoll vom Hersteller eines handelsüblichen Vorbereitung Kit zur Verfügung gestellt. Im letzten Schritt der Herstellung, eluieren die DNA in 500 ul TE (Tris-EDTA) -Puffer in dem Kit in ein 1,5-ml-Röhrchen bereitgestellt.
    2. Ethanol ausfällen die DNA sie zu konzentrieren durch Zugabe von 50 ul 3 M Natriumacetat und 1 ml 100% Ethanol zu dem Rohr. Das Röhrchen wird bei -20 ° CO / N.
    3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 min bei 14.000 rpm bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und an der Luft trocknen das Pellet für 10 min bei RT. Auflösen des Pellets in 15 ul TE-Puffer, die eine Konzentration von ~ 4 & mgr; g / & mgr; l ergeben sollte.
      HINWEIS: Die Expressionskontroll verwendeten Konstrukte sind hier Pmes-IRES-GFP 10, die von einem Huhn β-Aktin - Promotor oder pCI-H2B-IRES-RFP angetrieben wird CMV - Promotor angetrieben wird.

2. Huhn In Ovo Micro-Elektroporation und in - ovo - Zellproliferationstest

  1. In Ovo Mikroinjektion von Expression Baukonstruktion und Micro-Elektroporation:
    1. Ziehen die Glaskapillaren in feinen Nadeln mit einer Mikropipettenzieher mit den folgenden optimierten Parameter für eine 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Heizdraht: Druck = 500, Wärme = 600 ° C, ziehen = 64, Geschwindigkeit = 105, und Zeit = 150 ms (siehe Tabelle 1).
    2. Die links- und rechtsgeben Mikromanipulator Stufen flankieren das Mikroskop (siehe Abbildung 1A) ein. Der Rechtshänder Mikromanipulator hält die Glaskapillare Nadel und der Linkshänder Mikromanipulator hält die Elektroden (1A).
    3. Bereiten Sie die fein gezogen Glaskapillare Nadel für Mikroinjektion durch Schneidendie Spitze der Nadel mit einer Zange während der Arbeit unter dem Mikroskop.
    4. Füllen Sie die Nadel manuell von Hand mit dem Mikromanipulator mit 2,5 ul von Plasmid-DNA mit 0,1% Fast Green getönt, während sie unter dem Mikroskop zu arbeiten.
    5. Legen Sie das Ei auf der Seite liegend in einer Form / Ei Haltevorrichtung (siehe 1A). Schneiden Sie ein rundes Fenster auf dem Ei mit einer Schere 19 (1A).
    6. Während unter dem Mikroskop arbeiten, öffnen vorsichtig die beiden Membranen den Embryo überlagert mit einer Pinzette.
    7. Während unter dem Mikroskop arbeiten, liefern mit dem Mikromanipulator und durch Mikro-Elektroporation ca. ~ 0,5 ul von Plasmid-DNA an die richtigen Ohrbläschen Lumen durch Mikroinjektion in die rechte Hand.
      1. Dazu Mikro injizieren die richtigen Ohrbläschen Lumen mit der DNA mit der rechten Mikromanipulator (1B-D) , während zur gleichen Zeit die linke Hand Holdin mitga forcep den Kopf des Embryos zu stabilisieren, weil der Kopf des Embryos in der Stufe E4 eintaucht. Nicht Mikro injizieren vorbei an den Ohrbläschen Lumen, da dies das Ohrbläschen schädigen.
      2. Unmittelbar nach der Mikroinjektion, während sie unter dem Mikroskop arbeiten, verwenden Sie die linke Mikromanipulator die positive (Anode) 2 mm Platinelektrode anterior-ventralen nach rechts Ohrbläschen und der negativen 2 mm Elektrode (Kathode) parallel zu platzieren 1 mm auseinander (Abbildung 1 C sehen). Geben Sie 4 Impulse bei 12 V mit 100 ms Dauer und 200 ms Abstand. Das linke Ohrbläschen dient als interne unbehandelten Kontrolle.
        HINWEIS: Reinigen Sie die Elektroden zwischen electroporations mit einem Wattetupfer getaucht in 1x PBS.
  2. In Ovo - Zellproliferationstest:
    1. Unmittelbar nach der Elektroporation werden 50 ul 0,25 mg / ml EdU in 1x PBS, indem manuell die 50 ul EdU Lösung auf die gesamte droppingEmbryo in ovo mit einer Pipette. Verschließen Sie die Eier mit einem Band und zurück in den Inkubator für 18-96 Std.
    2. Sie das Band vorsichtig entfernen und nach 18 innerhalb der Ohrbläschen , die Embryonen für Fluoreszenz GFP oder RFP Signal überprüfen - 24 Stunden ein Standard - Fluoreszenzmikroskop (siehe Abbildung 1 EE ') verwendet wird . Wenn Fluoreszenzsignal vorhanden ist, ernten an dieser Stelle die Embryonen für Analysen oder mit Klebeband wieder verschließen und senden Sie es für die Ernte in den Inkubator und Analysen in späteren Phasen (Abbildung 1 FP '' zu sehen).
      HINWEIS: Die Expression von GFP - Signal mit dem PME-IRES-GFP - Konstrukt ist offensichtlich , 6 - 7 Stunden nach der Elektroporation 10.

3. Embryo Ernten und Gewebeverarbeitung für die RNA in situ Hybridisierung und Immunhistochemie

  1. Ernten Sie die Embryonen mit einer Pinzette. Spülen Sie den Embryo in kaltem 1x PBS. Entfernen Sie die Köpfe der Embryonen, durch Schneiden der Kopf durch den Halsmit einer Pinzette und legen die Köpfe in 4% Paraformaldehyd O / N bei 4 ° C. Stechen Sie das Gehirn eine forcep mit Durchdringung der 4% Paraformaldehyd im Inneren des Kopfes zu ermöglichen.
  2. Entwässern die Köpfe in 30% Saccharose (in 1x PBS) O / N bei 4 ° C.
  3. Montieren Sie die Köpfe in Kryoprotektivum durch schnelles Einfrieren in einem Brei aus Trockeneis und Methylbutan (2-Methyl). Alternativ frieren schneller die Köpfe in kryoprotektiver Medium mit flüssigem Stickstoff. Lagern Sie die montierten Köpfe bei -80 ° C.
  4. Kryoschnittes die Köpfe in 12 & mgr; m dicke Gewebeschnitte und sammeln Sie alle Innenohr haltigen Gewebeschnitte auf superfrosted Mikroskop Objektträger aus Glas.
  5. Führen Sie Standard - RNA in situ Hybridisierung und Immunhistochemie , wie zuvor beschrieben 4,21 und analysieren für EdU Zellproliferation nach dem Protokoll vom Hersteller des Kits zur Verfügung gestellt.
    HINWEIS: Haarzellen unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-α-MyosinVIIa (MYO7A) ein identifiziert werden könnentibody (1: 1000, Proteus Biosciences) und fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper (1: 250, Ziege anti-Kaninchen AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Bildaufnahme- und Bildverarbeitungs

  1. Nehmen Sie Bilder mit digitalen Bildgeräte. Bild Immunhistochemie Ergebnisse mit einem Standard - Fluoreszenzmikroskop und die Ergebnisse der in situ ein Standardweitfeldmikroskop ( im Bereich von 5x bis 40x in Vergrßerung) gemessen.
  2. Verarbeiten Sie die Bilder mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware.

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Representative Results

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Bei diesem Verfahren wird DNA Papier Plasmid des grün fluoreszierenden Proteins aus (GFP) Expressionskassetten wurde in die Entwicklung von Hühner basilar Papille gezielte (BP) mit optimierten Parametern von 12 V und 4 Impulsen mit 100 msec Impulsdauer und Intervalle von 200 ms, ein Nachgeben ~ 50% Embryo-Überlebensrate und Effizienz von Plasmid-DNA in die BP-Targeting. Fluorescent Imaging von nativen GFP - Expression Embryonen in Entwicklungs zeigte diese Methode der Elektroporation richtet vorzugsweise die anterior-ventral Aspekt der otocyst, die Anlass zu der BP gibt (Abbildung 1 EE '; weißer Pfeil) und GFP - Expression kann über einen Zeitverlauf verfolgt werden von bis zu etwa ~ 4 Tage (Abbildung 1 EH). RNA in situ Hybridisierung (ISH) wurde verwendet , um zu bestimmen , ob die Elektroporation erfolgreich den auditorischen Abschnitt des Entwicklungsinnenohr abgezielt. Um zu bestimmen, ob GFP wurde von auditorischen aufgenommensensorische Vorläufern, ISH-Experimente wurden an benachbarten BP Abschnitten durchgeführt. Innerhalb der Entwicklung von BP sensorischen Vorläufern wurden durch ihre Expression von Sox2 (Abbildung 1 K und N) und Lunatic Fringe (Lfng) (Abbildung 1 J) identifiziert. Diese Experimente zeigen , dass sensorische Progenitoren in den Entwicklungs BP, wie für die Basis dargestellt (Abbildung 1 I; schwarze Klammer) und der Spitze (1 L; schwarze Klammer), wurden erfolgreich gezielt und exprimieren GFP nach 68 h Elektroporation (1 I und L; schwarze Klammern). (; Rote Pfeile Abbildung 1 I und L) und im auditorischen Ganglion (1I und L; ag, gelbe Pfeile) gekennzeichnet durch Neurod1 Ausdruck (Abbildung 1 M) Zusätzlich GFP wurde außerhalb der sensorischen Domäne in nicht-sensorischen Epithelzellen exprimiert . In einem typischen Experiment GFP (1 H); Dies ermöglicht dem Prüfer, die räumliche und zeitliche Muster von Sinnesvorläuferzellzyklus Entnahme- und Differenzierung in der Entwicklungs BP zu analysieren. Um die proliferative Verhalten sensorischer Progenitoren bestimmen, das Thymidin-Analogon EdU wurde zum Zeitpunkt der Elektroporation bei E4 zugegeben. Vier Tage später EdU Einarbeitung in die Entwicklung von BP wurde in Gewebeschnitten analysiert "Klick" Chemie. Immuno-Kennzeichnung für die HC-spezifische Protein MyosinVIIa (MYO7A) verwendet HCs in der Entwicklung von BP zu identifizieren, zu differenzieren. Im apikalen Teil der BP MYO7A HCs + waren häufig EdU + (Abbildung 1 PP ', P' ', weiße Pfeile) hatte, während sie in der Basis nur wenige MYO7A + HCs EdU (Abbildung 1 OO eingebaut'; O '', weiße Pfeile), was darauf hindeutet, dass zum Zeitpunkt der Zugabe bei EdU E4, Sinnes Progenitors in der Basis sind bereits weitgehend mitotischen posten. Diese Ergebnisse bestätigen frühere Studien von Gradienten von Zellzyklus - Ausgang und HC Differenzierung im Küken BP 6,7 gegenüber.

Abbildung 1
Figure 1. In Ovo Electroporation & In Ovo Cell Proliferation Assay. (AD) Hellfeldbilder von Elektroporationsverfahren. In ovo Mikroinjektion in die rechte Ohrbläschen (B) und die Platzierung der Elektroden nach der Mikroinjektion Targeting des anterior-ventralen Bereich in das Ohrbläschen (C). Embryo im Stadium HH24-25 nach Mikroinjektion und Elektroporation (D; grün Ohrbläschen, schwarzer Pfeil). (EH) Das grün fluoreszierende Protein (GFP) Expression nach der Elektroporation. ( (E ') die GFP - Expression bei 18 Stunden (otic Vesikel, weißer Pfeil). (FH) Weiße Pfeile zeigen auf GFP - Expression bei 40 Stunden (F, otic Vesikel), 68 h (G, BP), und bei 88 h (H, BP). (IN) benachbart Cochlea Gewebeschnitte des BP sondiert für GFP, Lfng, Sox2 und Neurod1 Transkripte durch RNA in situ - Hybridisierung bei 68 Std. Lfng (J, schwarzen Klammer) und Sox2 (K und N, schwarzen Klammer) markieren die Sinnesepithel und Neurod1 (M) markiert den auditorischen Ganglion (ag). GFP in sensorischen ausgedrückt wird (I und L, schwarz Halter) und nicht-sensorische Gewebe (I und L, rote Pfeile), und die eineuditory Ganglion (I und L, gelbe Pfeile). (OP '') Fluoreszenzbilder von MyosinVIIa (MYO7A) / EdU Kennzeichnung. (O'-O '' und P'-P '') Höhere Vergrößerungen von O und P. (O 'und P') Mehr EdU Kennzeichnung im Sinnesepithel an der Spitze vorhanden ist (P ', weiß Klammer) als an der Basis (O', weiß Klammer). O '' und P '') Zusammengeführt Fluoreszenzbilder, weiße Pfeile zeigen auf MYO7A (+) / EdU (+) Haarzellen an der Spitze (P '') und der Basis (O ''). Weitere EdU (+) Zellen sind , die innerhalb des Gehör ganglion am Scheitelpunkt (P, ag) als an der Basis (O, ag). (sac; saccule in O). (A, Anterior und V, ventrale in den Feldern B undE). Maßstabsbalken 100 um. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Das hier beschriebene Verfahren der in - ovo - Mikro Elektroporation wird für den Gentransfer in die Entwicklungs Hörorgan optimiert. Es ist kompatibel mit Plasmid-DNA basierenden Expressionsvektoren typischerweise verwendet, um die Genfunktion / Ausdruck zu manipulieren. Der Zeitpunkt der Elektroporation bei E4 ist für Untersuchungen optimal, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Die wichtigsten Schritte sind die DNA in das Ohrbläschen Lumen Mikrospritz ohne mit der Nadel geht zu tief und Beschädigung der Ohrbläschen (siehe Fig. 1A-D), um die DNA in die anterior-ventral Domäne des Ohrbläschen Targeting durch die Elektroden entsprechend platzieren (siehe 1C.) und werden Elektroporationsparameter optimiert und Konzentration von Plasmid - DNA , die diese bei 12 V die optimierten Elektroporationsparameter von 4 Impulse liefern optimierte (~ 3,5-4 ug / ul) für speziell auf die vermutliche auditorischen Targeting Orgel bei E4. Zunächst haben wir begonnen, out leitenden electroporations bei 6 V, die keine Fluoreszenzsignale ergaben. Die Spannung wurde schrittweise erhöht durch Verwendung von 8 V und 10 V, mit 12 V, optimal zu sein. In ähnlicher Weise wurden die Anzahl der Pulse zu liefern, und die Pulsdauern und der Abstand der Impulse optimiert. Bei 12 V, 4 Impulse mit 100 ms Dauer und 200 ms Abstand ist ideal. Diese Parameter sind nicht nur ideal für den Erhalt der effizienten Gentransfer bei E4, sondern sind auch ideal für einen Embryo Überlebensrate von etwa ~ 50%. Wenn kein Fluoreszenzsignal innerhalb von 24 Stunden der Elektroporation erhalten wird, sollten folgende Punkte beachtet werden: 1.) Stellen Sie sicher, dass die Plasmid-DNA-Konzentration mindestens 3,5 ug / ul ist. 2.) Stellen Sie die Elektroporation Parameter von 2 V, zum Beispiel 10 oder 14 V. Wie zu erhalten , E4 (HH24-25) Stufe Embryonen innerhalb 117 h Inkubationszeit (siehe Abb. 1D), die Bruttemperatur für die Eier sollten 39 ° C mit mehr oder weniger Stunden incu - zwischen 37 optimiert werdenBation Zeit benötigt als 117 h in Abhängigkeit von der Temperatur verwendet, da es Variationen sind in Halte und Temperaturen mit verschiedenen Inkubatoren unter verschiedenen Laboratorien ausgeführt wird. Verschiedene Thymidin - Analoga einschließlich BrdU (5-Bromo-2'-desoxyuridin) oder EdU kann zu studieren in ovo - Zellproliferation verwendet werden. Jedoch hat die Verwendung von entweder Verbindung für jede Entwicklungsstufe optimiert werden, da zu viel der Verbindung für die Zelle / Embryo Lebensfähigkeit toxisch erweist und zu wenig der Verbindung erweist sich als unwirksam. Dieses Verfahren beschreibt die optimierte Verwendung von EdU bei einer Konzentration von 0,25 mg / ml 50 & mgr; l auf die gesamte Embryo in ovo spezifisch weiter zur Untersuchung der Zellproliferation und Zellzyklus-Ausgang aus E4 angelegt.

In ovo Elektroporation als Methode der Genmanipulation hat einige Einschränkungen. Eine relativ große Anzahl von Eiern für electroporations bei E4 mit entsprechenden Kontrollstrukturen und für die Experimenta erforderlichl Bedingungen. Dies beruht auf einem Verhältnis von Eiern, etwa ~ 27%, aufgrund einer Kombination von fehlenden Befruchtung zur Elektroporation unbrauchbar sind, Entwicklungsstörungen, und embryonaler Tod. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Überlebensrate der Embryonen nach der Elektroporation. Die Überlebensrate beträgt etwa ~ 50%. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass ältere Embryonen bei E4 nicht überleben gut nach manipuliert wird; jüngeren Embryonen sind elastischer und besser manipuliert tolerieren wird. Ausdrücke der Gene von Interesse nach der Elektroporation bei E4 im Mittelpunkt stehen und während der gesamten Cochlea-Kanal einschließlich nicht-sensiblen und sensorischen Gewebes sowie den Gehör Ganglion lokalisiert. Der Grund für die mehr fokale und lokalisierte Ausdruck ist , weil das Ziel der Elektroporation ist die vermutliche, unentwickelten Hörorgan bei E4, bevor das Huhn Hörorgan beginnt bei E5 zu wachsen und längt in seine charakteristische sichelförmige Form von ~ E9 1 . Schließlich the Verfahren ist vergänglich, wo Expressionssignale nur für ~ 4 Tage bleiben, weil die Gene von Interesse hier verwendet werden, nicht in das Genom integrieren. Jedoch kann das Verfahren mit geeigneten Plasmid-basierten Expressionskonstrukten verwendet werden, die die Fähigkeit haben, um in das Genom integrieren.

das Elektroporationsverfahren meistern erfordert einige Übung, geschulten Augen und Hände, und Know-how mit Hühnerembryonen zu arbeiten. Die Referenzen für Innenohrentwicklung und Huhn Entwicklungs Atlanten dienen als gute Führer und sind gute Ausgangspunkte für einen Anfänger zur Verfügung gestellt. die Methode mit diesen optimierten Elektroporationsparameter nach Mastern kann das Verfahren für Manipulationen in der geschlossenen Ohrbläschen von E2 auf ~ E4.5 verwendet werden. Obwohl für an E2 und E3 Elektroporation sollte 10 V Ohrplakode und otic Tasse, maßgeschneiderte Platinelektroden mit modifizierten Elektroporationsparameter Targeting statt 12 V. Für die Elektroporation bei E1 verwendet werden, können verwendet werden, 8-10 frühere Ereignisse in otic Entwicklung einschließlich Innenohr Neurogenese und die Entwicklung der vestibulären Sinnesorgane zu untersuchen. Zusätzlich zu der Entwicklung des Hörorgans Studium dieses Verfahren eignet sich auch die Entwicklung des innervating auditory ganglion zu studieren. Die Analyse der GFP - Expression in einer Elektroporation Proben ergab , dass nicht nur speziell auf die anterior-ventralen Ohrbläschen der Ausrichtung auf die sensorische Domäne innerhalb des neuronalen sensorischen zuständigen (NSD) Epithel , sondern richtet sich auch an die neuronalen Population , die innerhalb der NSD befinden. Afferent Neuronen innervieren die vestibulären und Gehörsinnesorgane sind in erster Linie von otic placodal Herkunft. Neurogenese kommt über einen längeren Zeitraum von etwa ~ E1.5 - E4.5 in chick, wo Neuroblasten, erfährt intensive Zellproliferation kontinuierlich aus dem NSD Epithel des otic cup delaminieren (~ E1.5) und Ohrbläschen (~ E2.5 - E4.5) und bevölkern als Neuronen des Cochlea-vestibulären Ganglion (CVG Differenzierung; VIII Hirnnerv) 8,10,13,22.

Darüber hinaus mit einigen Modifikationen können Vestibularorgane der Methode, ausgerichtet sein. Zum Beispiel kann die präsumptive anterioren crista bei E3 ausgerichtet werden, die 9 auf der dorsalen vorderen Spitze des anterior-ventral NSD liegt. Elektroporation bei E4 die anterior-ventralen Ohrbläschen Ausbeuten fokalen dennoch robuste GFP - Transkript Ausdrücke in sensorischen und nicht-sensorische Gewebe in allen von den sensorischen Vestibularorgane Targeting, nämlich die Cristae und utricluar und saccular maculae (Daten nicht gezeigt).

Abschließend stellte der in - ovo - Verfahren hier ist spezifisch für die Durchführung von Gewinn-und Verlust-Funktionen bei E4 beginnen und für die Proliferation und Differenzierung in der sich entwickelnden Hühner Hörorgan zu studieren. Darüber hinaus kann dieses Verfahren leicht für die Untersuchung anderer angepasst werden inner Ohr Entwicklungserscheinungen, einschließlich Innenohr Neurogenese und die Entwicklung von Vestibularorgane.

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Acknowledgments

Wir danken Dr. Doris K. Wu für Expressionsplasmide und in - situ - Sonden, die Johns Hopkins University Center für Sinnesbiologie Bildgebung Anlage und das Zentrum für Hören und Gleichgewicht. Diese Arbeit wurde von NIDCD Grants T32 DC000023 zu LE unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation
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Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

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