Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

עוברי עוף הם מערכות מודל אידיאלי ללימוד ההתפתחות העוברית מניפולציות של תפקוד הגן ניתן לבצע בקלות יחסית ב אובו. האורגן החושי השמיעה באוזן הפנימית הוא קריטי ליכולת שלנו לשמוע. זה בתים האפיתל חושי מאוד מיוחד שמורכב בתאי שיער transducing-mechano (HCS) וסביבת גליה דמוית תאים תומכים (SCS). למרות הבדלים מבניים באיברי השמיעה, מנגנונים מולקולריים להסדיר את הפיתוח של איבר השמיעה שמורים אבולוציונית בין יונקי עופות ב electroporation אובו מוגבל בעיקר בשלבים מוקדמים ב E1 -. E3. בשל ההתפתחות מאוחר יחסית של איבר השמיעה ב E5, מניפולציות של איבר השמיעה על ידי ב electroporation אובו בעבר E3 הן להיתקל בקשיים עקב הפיתוח המתקדם של עובר העוף בשלבים מאוחר יותר. השיטה המוצגת כאן היא שיטת העברת גנים חולפת למיקוד גנים של ריביתבשלב E4 - E4.5 באיבר חושי השמיעה עוף בפיתוח באמצעות in-electroporation מיקרו אובו. שיטה זו חלה על gain- ואובדן-של-פונקציות עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד הקונבנציונלי יכולה להיות משולבת עם ב assay שגשוג תאי אובו ידי הוספת EDU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) לעובר השלם בבית זמן של electroporation. השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום (GFP או RFP) פלסמידים הביטוי מאפשר הנסיין לברר במהירות אם electroporation בהצלחה ממוקד החלק השמיעתי של האוזן הפנימית בפיתוח. במאמר שיטה זו, דוגמאות מייצגות של דגימות electroporated GFP מומחשות; עובר נבצרו 18 - 96 שעות לאחר electroporation ומיקוד של GFP לאזור פרו-החושי של איבר השמיעה אושר על ידי RNA כלאה באתרה. עיתון השיטה גם מספק פרוטוקול אופטימיזציה עבור שימוש thymidine אנלוגי edu לנתח תא proliferation; דוגמא assay התפשטות תאים מבוססת edu המשלב תיוג חיסוני ולחץ כימית edu מסופקת.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

למרות הבדלים במורפולוגיה דפוסים הסלולר בין יונקי איבר חישת שמיעת עופות, הגורמים המולקולריים והשבילים אחראים לפיתוח HC חושי נחשבים ישומרו 1-3 אבולוציונית. את הגבשושיות basilar, שבו שוכנים HCS שמיעתי גיל שמסביב שלהם, מפתחת כקובץ outpocketing של otocyst האוזן הפנימית. מוקדם על מאגר של אבות HC ו SC המצוין בתוך placode otic / כוס otic עצבית-החושי התחום המוסמך (NSD). נתוני גורל מיפוי לספק ראיות כי שושלות עצביות ועל חושים תהיינה צמודות לנבוע NSD ממוקם באזור הגחון-אנטרו של כוס otic או otocyst בעכברים ועוף 4,5. ראשית, neuroblasts delaminate מן NSD להצמיח נוירונים של גנגליון השמיעתי-שיווי משקל, אשר בסופו של דבר התפצל גרעינים שמיעתיים שיווי משקל. נוירונים אלה מעצבב HCS החושית של האוזן הפנימית גרעינים בגזע המוח. תאי הב להישאר NSD נחשבים להצמיח טלאים חושיים שונים, כוללים איבר חישת השמיעה, מורכב של HCS החושית transducing-mechano ו SCS הקשורים בם.

בשני האפרוח ואת Murine, יציאת אב חוש שמיעת איבר מחזור התא והבחנת HC להתרחש מנוגדים הדרגתיים. בשנת חומוס, יציאה-מחזור תא שמיעת אבי מתחילה בסביבות ~ E5 ומתקדם מהבסיס אל הקודקוד, ומן המרכז לפריפריה 6. יום אחד מאוחר יותר, בידול HC מתחיל ב איפקס ומתקדם לבסיס 7. לימוד הפיתוח של האוזן הפנימית עוף מספק יתרונות טכניים רבים ככל שניתן לחקור מנגנונים תפקודיים בקלות יחסית ב אובו בניגוד המניפולציה עוברת ברחם במערכות מודל אחרים, מחייב ניתוחים מורכבים. השיטה המתוארת כאן משתמשת במיקרו-electroporation אובו למקד הגנים של עניין באזילה משוערתr באזור פטמית-ventrally הקדמי של שלפוחית ​​otic ספציפית E4.

Electroporation ב אובו הוא טכניקה כי הוא מבוסס היטב נפוץ 8-14. העיקרון של טכניקת electroporation מבוסס על העובדה כי נוקלאוטידים (למשל, ה- DNA פלסמיד, DNA הסינטטי, או RNA oligonucleotides) הם בעלי מטען שלילי. ה- DNA מוזרק לתוך הרקמה של עניין. כאשר זרם חשמלי ומוצבות הרקמות, הזרם פותח נקבוביים חולף מרכיבי דופן התא ומאפשר הספיג של DNA, כמו ה- DNA המטען השלילי זורם לכיוון האלקטרודה החיובית (האנודה). בניסויים הרווחים של פונקציה, גנים של עניין הם subcloned נפוץ לתוך פלסמידים ביטוי המכילים קלטות ביטוי מתאימות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). בניסויים הפסד של פונקציה בונה מדכא שלילי דומיננטי מבוססי פלסמיד, או RNAi, או בונה morpholino הם גommonly בשימוש 15,16. כדי לעכב microRNA (מירנה) miRNAs פונקציה בונה ספוג, שהן בדרך כלל פלסמיד מבוסס, יכול לשמש 17. השיטה המתוארת כאן מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים התפשטות והבחנה באיבר השמיעה, כמו בשיטה מיקרו-electroporation אובו ניתן לשלב בקלות עם ב assay שגשוג התאים אובו ידי הוספת edu לעובר שלם.

את electroporation והוספת edu מתבצע E4 של שלפוחית ​​otic, שהוא יום אחד לפני תחילת היציאה מחזור התא באיבר השמיעה. ניתוח של איבר השמיעה הוא בדרך כלל מבוצע 18 - 96 שעות לאחר electroporation ב E5 (תחילת יציאת מחזור תא ובתאים חושיים), E6 (תחילת בידול HC), ו E7 (במהלך התמיינות HC); ובהמשך עד ~ E9 (סוף בידול HC). שיטת electroporation זה של העברת גנים הוא חולף שנמשך כ ~ 4 ימים, because הגנים של עניין לא להשתלב בגנום, אבל השיטה ישימה לשימוש עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד המתאים, אשר יש להם את היכולת להשתלב בגנום, כגון העברת גנים בתיווך Tol2 11. באמצעות שיטה זו GFP החזק או ביטוי RFP נמשך ~ 4 ימי השבלול, ולאחר מכן הם האותות לדעוך, עדיין מספקים חלון זמן מספיק כדי ללמוד על ההתפתחות הסבוכה של איבר השמיעה. זה בשיטת העברת גני אובו הוא רומן ומאפשר למקד את איבר השמיעה המשוער ספציפית E4, שבו הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. זוהי תוספת טובה שיטות חלופיות, אשר electroporate בבית הרבה שלבי התפתחות צעירים 11,12 או בהשוואה לשימוש של תרבויות explant גבשושיות basilar במבחנת 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הביצים עובר שלא נולד הם דאגו וטפלו אתיים ובאנושיות. כל הפרוטוקולים לשימוש עובר שלא נולד אושרו על ידי הטיפול בבעלי חי הוועדה השתמשתי בבית ספר ג'ונס הופקינס לרפואה, בולטימור, מרילנד.

1. ביצים הכנת בונה הביטוי

  1. ביצים:
    1. דגירה 3 - 4 ביצים עוף מופרית תריסר (גאלוס גאלוס) שוכב על צדם על 37 מעלות צלזיוס.
      1. לאחר 24 שעות של דגירה, למשוך 3 סמ"ק של חלבון עם מזרק מתום הסיבוב לאחור של הביצה לאטום את החור עם קלטת ברורה. זה יוצר אוויר בין העובר לבין קליפת הביצה, המאפשר נוחות הגישה עובר ללא עובר דבק הקליפה בעת חיתוך בחלון לגישה על גבי הביצה 19.
      2. 117 שעות של זמן דגירה, לביים את העוברים על פי המבורגר המילטון 20 שלבי התפתחותב E4 (HH24-25) (ראה איור 1D).
  2. ביטוי בונה:
    1. הכן את ה- DNA פלסמיד באמצעות ריאגנטים והפרוטוקול שספק היצרן של ערכת הכנה זמינה מסחרי. בצעד של הכנה הסופי, elute את ה- DNA לתוך 500 μl TE (טריס-EDTA) חיץ המסופק בערכה לתוך צינור 1.5 מ"ל.
    2. אתנול להאיץ את ה- DNA להתרכז אותו על ידי הוספת 50 μl של 3 M נתרן אצטט 1 מ"ל של אתנול 100% אל הצינור. מניחים את הצינור ב -20 ° CO / N.
    3. צנטריפוגה הצינור במשך 30 דקות ב 14,000 סל"ד ב 4 ° C.. הסר את supernatant ואוויר-יבש גלולה במשך 10 דקות ב RT. ממיסים את גלולה ב 15 μl חיץ TE, אשר אמור להניב ריכוז של ~ 4 מיקרוגרם / μl.
      ההערה: בונת ביטוי השליטה בשימוש הנה pMES-IRES-GFP 10, אשר מונע על ידי אמרגן העוף β-יקטין, או-H2B PCI-IRES-RFP CMV.

2. עוף ב אובו מיקרו electroporation ו ב assay שגשוג התאים לג'ימי

  1. ב אובו מיקרו הזרקה של Construct הביטוי-electroporation מיקרו:
    1. משוך את צינורות זכוכית נימי לתוך מחטים דקות באמצעות חולץ מיקרו-פיפטה עם פרמטרים אופטימיזציה הבאים עבור 2.5 x 2.5 מ"מ Box פלטינום חימום נימה: לחץ = 500, חום = 600 ° C, משוך = 64, מהירות = 105, ושעה = 150 msec (ראה טבלה 1).
    2. הגדרת מתייחסות לזה בשלבים-מניפולטור מיקרו ימניים איגוף המיקרוסקופ (ראו איור 1 א). The-מניפולטור מייקרו הימני מחזיק את מחט נימי הזכוכית במייקרו-מניפולטור האם אתה השמאלי מחזיק האלקטרודות (איור 1 א).
    3. הכן את מחט זכוכית נימי דק משכו עבור הזרקת מיקרו ידי חיתוךקצה המחט עם מלקחיים תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ.
    4. מלאו את המחט באופן ידני על ידי היד באמצעות-מניפולטור מיקרו עם 2.5 μl של ה- DNA פלסמיד כהים עם 0.1% Fast הירוק תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ.
    5. מניח את הביצה שוכבת על צידו בתוך מכשיר חזק עובש / ביצה (ראה איור 1 א). חותכי חלון עגול על גבי הביצה באמצעות מספריים 19 (איור 1 א).
    6. תוך כדי העבודה תחת מיקרוסקופ, לפתוח בזהירות את שתי ממברנות שכיסו את העובר באמצעות מלקחיים.
    7. תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, לספק כ ~ 0.5 μl של ה- DNA פלסמיד לומן שלפוחית ​​תקין otic ידי הזרקת מיקרו באופן ידני באמצעות יד ימין באמצעות-מניפולטור מיקרו ידי-electroporation מיקרו.
      1. לשם כך, מיקרו-להזריק לומן שלפוחית ​​otic תקין עם ה- DNA עם-מניפולטור מיקרו ימנית ביד (איור 1 ב- D) בעוד באותו זמן באמצעות אוחזים ביד שמאלמלקחי ga כדי לייצב את הראש של העובר, כי הראש של העובר טובל בשלב E4. אל מיקרו-להזריק בעבר לומן שלפוחית ​​otic, כי זה יפגע שלפוחית ​​otic.
      2. מיד לאחר הזרקת מיקרו, תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, השתמש-מניפולטור מיקרו שבצד שמאל כדי למקם את (האנודה) חיובי 2 מ"מ הקדמי-הגחון אלקטרודה פלטינה אל שלפוחית ​​תקין otic לבין אלקטרודה 2 מ"מ שלילית (הקתודה) במקביל 1 מ"מ זה מזה (ראה איור ג 1). לספק 4 פעימות ב 12 V עם 100 משך msec וריווח 200 msec. שלפוחית ​​otic עזבה משמשת קבוצת ביקורת פנימית.
        הערה: יש לנקות את האלקטרודות בין electroporations עם מקלון צמר גפן שקצהו טבול 1x PBS.
  2. ב assay שגשוג התאים לג'ימי:
    1. מיד לאחר electroporation להוסיף 50 μl של 0.25 מ"ג / מ"ל ​​edu ב 1x PBS על ידי הטלת ידני 50 μl פתרון Edu על כלהעובר ב אובו בעזרת פיפטה. חותם את הביצים עם קלטת ולחזור בחממה במשך 18 - 96 שעות.
    2. מוציאים בזהירות את הקלטת ולבדוק את העוברים על אות ה- GFP או RFP ניאון בתוך שלפוחית ​​otic לאחר 18 - 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי (ראה איור 1 א 'א' '). אם אות ניאון הוא ההווה, בשלב זה לקצור את העוברים ניתוחים או לאטום עם קלטת ולהחזיר אותו אל האינקובטור לקציר ומנתח בשלבים מאוחרים יותר (ראה איור 1 FP '').
      הערה: הביטוי של אות ה- GFP עם מבנה pMES-IRES-GFP ניכר 6 - 7 שעות לאחר electroporation 10.

קציר העובר 3. עיבוד רקמות עבור RNA הכלאה באתרו ו אימונוהיסטוכימיה

  1. קציר את העוברים באמצעות מלקחיים. יש לשטוף את העובר ב PBS 1x הקר. הסר את הראש של העוברים, על ידי חיתוך הראש בצווארובאמצעות מלקחיים, ומניחים את הראש לתוך O paraformaldehyde 4% / N ב 4 ° C. לנקב את המוח באמצעות מלקחיים כדי לאפשר חדיר של paraformaldehyde 4% בתוך הראש.
  2. מייבשים את הראשים סוכרוז 30% (ב 1x PBS) O / N ב 4 ° C.
  3. הר ראשי במדיום cryoprotective ידי להקפאה מהירה בתוך slurry קרח methylbutane יבש (2-Methylbutane). לחלופין, מהיר להקפיא את הראשים במדיום cryoprotective עם חנקן נוזלי. אחסן את ראשי הרכוב ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. Cryosection הראשי לתוך 12 מיקרומטר סעיפי רקמה עבים לאסוף את כל חלקי רקמה הפנימיים המכילה אוזן על גבי שקופיות זכוכית מיקרוסקופ superfrosted.
  5. בצע RNA תקן הכלאה באתרו אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר לעיל 4,21, ולנתח עבור התפשטות תאים edu בעקבות פרוטוקול שסיפק היצרן של הערכה.
    הערה: תאי שיער ניתן לזהות באמצעות ארנב polyclonal α-MyosinVIIa (Myo7a)tibody (1: 1,000, Biosciences פרוטאוס) ו נוגדנים משני שכותרתו fluorescently (1: 250, נגד ארנב עיזים AlexaFluor 488; Invitrogen).

לכידת תמונה 4. ועיבוד

  1. צלמו תמונות עם ציוד הדמיה דיגיטלית. תוצאות אימונוהיסטוכימיה תמונה עם מיקרוסקופ ותוצאות תקן הניאון של באתרו באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטי (החל 5x כדי 40x בהגדלה).
  2. לעבד את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ב DNA פלסמיד נייר שיטה זו מורכבת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) קלטות ביטוי הייתה ממוקדת לתוך פטמית basilar עוף מתפתחות (BP) עם פרמטרים אופטימיזציה של 12 וולט ו -4 פעימות עם 100 משך ומרווחי דופק msec של 200 msec, מניב ~ 50% שיעור הישרדות עובר ויעילות של ה- DNA פלסמיד מיקוד לתוך BP. הדמית פלורסנט ביטוי GFP יליד בפיתוח עובר הראתה שיטה זו של electroporation מעדיף מטרות ההיבט הקדמי-גחון של otocyst, כי מוליד את BP (EE איור 1 '; החץ לבן) וביטוי GFP ניתן בעקבות מעל לקורס במשרה בסכום של עד כ ~ 4 ימים (איור 1 EH). RNA הכלאה באתרו (שאני עורך) שימש כדי לקבוע אם electroporation ממוקד החלק השמיעתי בהצלחה של האוזן הפנימית בפיתוח. כדי לקבוע אם ה- GFP נלקח על ידי שמיעהאבות חושיים, ניסויים שאני עורך בוצעו על סעיפי BP סמוכים. בתוך אבות חושית בפיתוח BP זוהו על ידי הביטוי שלהם של Sox2 (איור 1 K ו- N) ואת השוליים הסהרוריים (Lfng) (איור 1 J). ניסויים אלו מראים כי אבות חושיים ברחבי BP לפתח, כפי שמוצג על הבסיס (האיור 1 I; הסוגר שחור) איפקס (איור 1 ליטר; סוגר שחור), הותקפו בהצלחה ולהביע GFP לאחר 68 שעות של electroporation (איור 1 אני ו- L; בסוגריים שחורים). בנוסף, ה- GFP באה לידי ביטוי מחוץ לתחום חושי בתאי האפיתל ללא חושית (איור 1 I ו- L; חיצים אדומים) ו גנגליון השמיעה (איור 1 ט ו- L; AG, חיצים צהובים) בסימן ביטוי Neurod1 (איור 1M) . בעוד GFP ניסוי טיפוסי (איור 1 H); זה מאפשר לחוקר לנתח את דפוס במרחב ובזמן הנסיגה חושית ובתאים מחזור התא והתמיינות של BP מתפתחות. כדי לקבוע את התנהגות השגשוג של אבות חושיים, edu thymidine האנלוגי התווסף בעת electroporation ב E4. ארבעה ימים לאחר מכן, התאגדות edu של פיתוח BP נותחה בסעיפי רקמות באמצעות "לחץ" כימיה. חיסונית-תיוג לחלבון HC ספציפי MyosinVIIa (Myo7a) שימש לזיהוי HCS הבחנה של BP מתפתחות. בפרשת הפסגה של BP Myo7a + HCS היו לעתים קרובות EDU + (איור 1 PP '; P' ', חצים לבנים), ואילו בבסיס רק כמה Myo7a + HCS שילב edu (איור 1 OO'; O '', חצים לבנים), דבר המצביע על כך במועד בנוסף edu ב E4, פרו חושייםgenitors בבסיס כבר לפרסם mitotic ברובו. תוצאות אלו מאשרות מחקרים קודמים של מתנגדים הדרגתיים של יציאת מחזור התא והבחנת HC ב האפרוח BP 6,7.

איור 1
איור 1. ב אובו Electroporation & ב אובו תא הפצת Assay. (AD) תמונות Brightfield של שיטת electroporation. בשנת הזרקת מיקרו אובו לתוך שלפוחית ​​otic ימינה (B) והמיקום של האלקטרודות לאחר הזרקת מיקרו מיקוד באזור הקדמי-הגחון שלפוחית ​​otic (C). העובר בשלב HH24-25 לאחר הזרקת מיקרו electroporation (D; שלפוחית ​​otic ירוק, חץ שחור). (EH) חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ביטוי לאחר electroporation. ( (E ') ביטוי של GFP ב 18 שעות (שלפוחית ​​otic, חץ לבן). (FH) חיצים לבנים מצביעים על ביטוי של GFP ב 40 שעות (F, שלפוחית ​​otic), 68 שעות (G, BP), ו ב 88 שעות (H, BP). (IN) סמכו שבלול רקמות-סעיפים של BP תרו אחרים GFP, Lfng, Sox2, ו Neurod1 תמלילים ידי RNA כלאה באתרו ב 68 שעות. Lfng (J, סוגר שחור) Sox2 (K ו- N, תושבת שחורה) לציון האפיתל חושי Neurod1 (M) מסמן את גנגליון השמיעה (AG). GFP מתבטא בתוך חושית (I ו- L, סוגר שחור) ורקמות הלא-חושית (I ו- L, חצים אדומים), ו אגנגליון uditory (I ו- L, חיצים צהובים). (OP '') תמונות פלורסנט של MyosinVIIa (Myo7a) / edu תיוג. (O'-O '' ו P'-P '') בהגדלות גדולות של O ו- P. (O 'ו-ע') עוד edu תיוג קיים בתוך האפיתל החושית בשיא (P ', סוגר לבן) מאשר בבסיס (O', סוגר לבן). O '' ו- P '') מוזג תמונות ניאון, חצי לבנים מצביעים על Myo7a (+) / edu (+) בתאי שיער בשיא (P '') והבסיס (O ''). עוד edu (+) תאים נמצאים בתוך הגנגליון השמיעה בשיא (P, AG) מאשר בבסיס (O, AG). (שק; שקיק ב O). (A, Anterior ו- V, הגחון בסי לוחותE). סולם bars 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השיטה המתוארת כאן של מיקרו-electroporation אובו מותאמת במיוחד עבור העברת גנים לתוך איבר השמיעה מתפתחות. זה תואם עם וקטורי ביטוי פלסמיד מבוסס DNA משמשים בדרך כלל כדי לתפעל גן פונקציה / ביטוי. העיתוי של electroporation ב E4 הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. השלבים הקריטיים ביותר הם מיקרו-הזרקת DNA לתוך לומן שלפוחית ​​otic מבלי לעבור עמוק מדי עם המחט ופגיעה שלפוחית ​​otic (ראה איור. 1A-D), מיקוד ה- DNA לתוך תחום-הגחון הקדמי של שלפוחית ​​otic ידי הצבת אלקטרודות בהתאם (ראה איור 1 ג.), ושולחים את הפרמטרים electroporation אופטימיזציה של 4 פעימות ב 12 V. אלה מותאמים פרמטרים electroporation אופטימיזציה ריכוז של DNA פלסמיד (~ 3.5 - 4 מיקרוגרם / μl) למיקוד השמיעה משוערת במיוחד איבר ב E4. בתחילה התחלנו out ניצוח electroporations ב -6 V, אשר הניב שום אותות ניאון. המתח הוגדל באופן הדרגתי באמצעות 8 V ו -10 V, עם 12 V למצב האופטימלי. באופן דומה, מספר פעימות לספק ואת משכי הדופק ואת המרווח של פולסים היו אופטימיזציה. לאחר 12 V, 4 פעימות עם 100 משך msec ו -200 מרווח msec הן אידיאליות. פרמטרים אלה הם לא רק אידיאליים עבור קבלת העברת גנים יעילה E4, אבל הם אידיאליים גם עבור שיעור הישרדות עובר של כ ~ 50%. אם אין אות ניאון מתקבלת תוך 24 שעות של electroporation, הבא צריך להיחשב: 1.) ודא כי ריכוז ה- DNA פלסמיד הוא לפחות 3.5 מיקרוגרם / μl. 2.) התאם את פרמטר electroporation ידי 2 V, למשל עד 10 או 14 V. באשר קבלת E4 (HH24-25) עוברים שלב בתוך 117 שעות של זמן הדגירה (ראה איור. 1D), הטמפרטורה בחממה במשך הביצים צריכות להיות מותאם בין 37 - 39 מעלות צלזיוס עם שעות יותר או פחות של incuזמן bation צורך מ 117 שעות תלויים בטמפרטורה בשימוש, כי יש וריאציות מחזיקים והפעלת טמפרטורה באמצעות חממות שונות בין מעבדות שונות. אנלוגים thymidine שונים כולל BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) או edu יכול לשמש כדי ללמוד התפשטות תאים אובו. עם זאת, השימוש או תרכובת צריך להיות מותאם לכל שלב התפתחותי כמו יותר מדי של המתחם מוכיח רעיל עבור כדאיויות תא / עובר קטן מדי של המתחם מוכיח יעיל. שיטה זו מתארת ​​את השימוש אופטימיזציה של edu בריכוז של 0.25 מ"ג / מ"ל להחיל 50 μl על העובר כולו ב אובו במיוחד ללימוד התפשטות תאים ותא-מחזור-היציאה מן E4 ואילך.

ב electroporation אובו כשיטה מניפולציה גן יש מספר מגבלות. מספר רב יחסי של ביצים נדרשים עבור electroporations ב E4 עם בונת בקרה מתאימה עבור experimentaתנאי l. זאת בשל שיעור של ביצים, כ ~ 27%, להיות שמיש עבור electroporation עקב שילוב של חוסר ההפריה, פגמים התפתחותיים, ומוות עוברי. גורם חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא שיעור ההישרדות של העוברים לאחר electroporation. שיעור ההישרדות הוא כ ~ 50%. זאת בשל העובדה כי עוברי מבוגרים ב E4 אינם שורדים היטב לאחר מניפולציות; עובר צעיר יותר גמישים להשלים עם העובדה שהוא מניפולציות טובות יותר. ביטויים של גנים של עניין לאחר electroporation ב E4 הם מוקד מקומי ברחבי צינור שבלול כולו כולל רקמות שאינם חושיים וחושיים וכן גנגליון השמיעה. סיבת ביטוי המוקד המקומי יותר משום היעד של electroporation הוא איבר השמיעה המשוער, מפותח ב- E4, לפני איבר שמיעת העוף מתחיל לצמוח החוצה E5 ו מתארך לתוך הטופס בצורת המגל האופייני שלה על ידי ~ E9 1 . לבסוף, השיטת ה הוא חולף שבו אותות ביטוי להישאר רק ~ 4 ימים, משום שהגנים של הריבית ששימש כאן לא להשתלב בגנום. עם זאת, השיטה יכולה לשמש עם בונת ביטוי מבוסס פלסמיד מתאימה כי יש את היכולת להשתלב בגנום.

מאסטרינג שיטת electroporation דורש קצת תרגול, עיניים מאומנות ידות, ניסיון בעבודה עם עוברי תרנגולת. ההתייחסויות מסופקות אטלסים התפתחותית פיתוח ועוף אוזן פנימי לשמש מדריכים טובים הן נקודת התחלה טובה עבור טירון. לאחר שהתמחה בשיטה עם פרמטרי electroporation שעברו אופטימיזציה, השיטה יכולה לשמש מניפולציות של שלפוחית ​​otic הסגורה בין E2 ל ~ E4.5. למרות עבור electroporating ב E2 ו- E3, 10 V אמור לשמש במקום 12 V. עבור electroporation ב E1 מיקוד placode otic כוס otic, אלקטרודות פלטינה אישית עם פרמטרים electroporation שונה ניתן להשתמש 8-10. בנוסף ללימוד הפיתוח של איבר השמיעה בשיטה זו גם משאילה את עצמו כדי ללמוד את הפיתוח של גנגליון שמיעת innervating. ניתוח של ביטוי של GFP בדגימות electroporated גילה כי מיקוד ספציפי שלפוחית ​​otic גחון-הקדמית לא רק מטרות התחום החושי בתוך האפיתל (NSD) מוסמכות חושיות העצבי אלא גם מטרות האוכלוסייה העצבית השוכנת בתוך NSD. הנוירונים מביא innervating אברי החישה שיווי המשקל ואת השמיעה הם בעיקר ממוצא placodal otic. Neurogenesis מתרחש לאחר תקופת זמן ממושכת כ מ ~ E1.5 - E4.5 ב האפרוח, שבו neuroblasts, עוברת התפשטות תאים אינטנסיבי delaminate ברציפות מן האפיתל NSD של כוס otic (~ E1.5) ואת שלפוחית ​​otic (~ E2.5 - E4.5) ולאכלס כמו הבחנה נוירונים גנגליון שבלול-שיווי המשקל (CVG; עצב הגולגולת השמיני) 8,10,13,22.

יתר על כן, עם כמה שינויי איברי שיווי משקל יכולים להיות ממוקד עם השיטה המוצגת. לדוגמא, crista הקדמי המשוער יכול להיות ממוקד ב- E3, השוכן על הקצה הקדמי הגבה של NSD-גחון הקדמי 9. Electroporating ב E4 מיקוד תשואות שלפוחית ​​otic הקדמי-גחון מוקדי ביטויים חזקים עדיין תמליל GFP בתוך רקמה חושית והלא-חושית בכל איברי שיווי המשקל החושיים, כלומר cristae, ו utricluar ו maculae saccular (מידע לא מוצג).

לסיכום, השיטה לג'ימי המוצג כאן היא ספציפית לביצוע רווח-והפסד-פונקציות החל E4 ו ללימוד התפשטות והבחנה באיבר שמיעת עוף המתפתחות. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להתאים בקלות ללימוד אחראוזן נר תופעות התפתחותיות, כוללים נוירוגנזה אוזן פנימי והתפתחות אברי שיווי משקל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר דוריס ק וו עבור פלסמידים הביטוי והן בדיקות באתרו, במרכז האוניברסיטאי ג'ונס הופקינס עבור מתקן הדמיה ביולוגיה חושי והמרכז השמיעה ושיווי המשקל. עבודה זו נתמכה על ידי NIDCD גרנט T32 DC000023 אל LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter