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Developmental Biology

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Embriones de pollo son sistemas modelo ideal para estudiar el desarrollo embrionario como manipulaciones de la función de genes pueden llevarse a cabo con relativa facilidad in ovo. El órgano sensorial auditivo del oído interno es fundamental para nuestra capacidad de oír. Alberga un epitelio sensorial altamente especializado que consiste en células ciliadas mecano-transducción (HC) y que rodea la glía como células de soporte (SCS). A pesar de las diferencias estructurales en los órganos auditivos, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo del órgano auditivo se conservan evolutivamente entre los mamíferos y aves En electroporación in ovo está muy limitado a las primeras etapas de E1 -. E3. Debido al desarrollo relativamente tarde del órgano auditivo en E5, manipulaciones del órgano de la audición por electroporación in ovo en el pasado E3 son difíciles debido al avanzado desarrollo del embrión de pollo en etapas posteriores. El método que aquí se presenta es un método de transferencia génica transitoria para dirigir genes de interés enetapa E4 - E4.5 en el auditorio de pollo en desarrollo a través de los órganos sensoriales in ovo micro-electroporación. Este método es aplicable para ganancia y la pérdida de funciones con vectores de expresión basados ​​en el ADN de plásmido convencional y se puede combinar con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU (5-etinil-2 'desoxiuridina) a todo el embrión en el tiempo de electroporación. El uso de la proteína fluorescente verde o roja (GFP o RFP) plásmidos de expresión permite al experimentador para determinar rápidamente si la electroporación dirigido con éxito la porción auditiva del oído interno en desarrollo. En este trabajo el método, se ilustran ejemplos representativos de las muestras GFP a electroporación; embriones se recogieron 18 a 96 h después de la electroporación y la selección de GFP a la zona de pro-sensorial del órgano auditivo se confirmó mediante hibridación in situ de ARN. El papel método también proporciona un protocolo optimizado para el uso de la timidina analógico EdU para analizar prolife célularación; Se proporciona un ejemplo de un ensayo de proliferación celular basado EdU que combina inmuno-etiquetado y haga clic en la química edu.

Introduction

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A pesar de las diferencias en la morfología celular y patrones entre los mamíferos y órgano sensorial auditivo aviar, se cree que están conservadas evolutivamente 1-3 los factores moleculares y las vías responsables del desarrollo de HC sensorial. La papila basilar, que aloja la HC auditivas y sus alrededores SC, se desarrolla como la protrusión de la otocyst oído interno. Al principio de un grupo de progenitores de HC y SC se especifica dentro de la placoda ótica / Dominio competente taza neuronal sensorial-ótica (NSD). Los datos de mapeado de destino proporcionan evidencia de que los linajes neuronales y sensoriales están vinculados y se derivan de la NSD situado en la región antero-ventral de la copa ótica o otocyst en ratones y pollos 4,5. En primer lugar, los neuroblastos delaminate de la NSD para dar lugar a las neuronas del ganglio auditivo-vestibular, que finalmente dividido en ganglios auditivo y vestibular. Estas neuronas inervan los HC sensoriales del oído interno y núcleos en el tronco cerebral. Las células Tha permanecer en el NSD se cree que dar lugar a varios parches sensoriales, incluido el órgano sensorial auditivo, que consta de los HC sensoriales mecano-transducción y sus asociados SCs.

En tanto el pollo y murino, órgano de la audición sensorial progenitora salida del ciclo celular y la diferenciación HC se producen en gradientes opuestos. En polluelo, la salida del ciclo celular progenitora auditiva comienza alrededor de ~ E5 y progresa desde la base hasta el vértice, y desde el centro hacia la periferia 6. Un día después, HC diferenciación comienza en el vértice y que avanza a la base 7. Estudiar el desarrollo del oído interno en el pollo proporciona muchas ventajas técnicas como mecanismos funcionales pueden ser investigados con relativa facilidad in ovo en comparación con la manipulación de los embriones en el útero en otros sistemas modelo, que requiere cirugías complejas. El método descrito aquí utiliza in ovo micro-electroporación para apuntar genes de interés en el Basila presuntivar área de la papila antero-ventral en la vesícula ótica específicamente a E4.

La electroporación in ovo es una técnica que está bien establecido y comúnmente utilizado 8-14. El principio de la técnica de electroporación se basa en el hecho de que los nucleótidos (por ejemplo, ADN plásmido, ADN sintético, o ARN oligonucleótidos) están cargadas negativamente. El ADN se inyecta en el tejido de interés. Cuando una corriente eléctrica se coloca a través del tejido, la corriente abre los poros transitorios en las paredes celulares y permite la captación del ADN, como fluye el ADN cargado negativamente hacia el electrodo positivo (ánodo). Para los experimentos de ganancia de función, los genes de interés se subclonan comúnmente en plásmidos de expresión que contienen casetes de expresión adecuados para la proteína verde fluorescente (GFP) o la proteína fluorescente roja (RFP). Para los experimentos de construcciones de pérdida de función basados ​​en plásmidos dominantes negativos represores, o RNAi, o construcciones de morfolino son commonly utiliza 15,16. Para inhibir microARN (miARN) de función miRNAs construcciones de esponja, que son típicamente plásmido basado, se puede utilizar 17. El método aquí descrito permite la investigación de los mecanismos moleculares que controlan la proliferación y diferenciación en el órgano auditivo, como el método en micro-electroporación in ovo se puede combinar fácilmente con en ensayo de proliferación celular in ovo mediante la adición de EdU a todo el embrión.

La electroporación y la adición de EdU se realiza a E4 en la vesícula ótica, que es un día antes del inicio de la salida del ciclo celular en el órgano auditivo. Análisis del órgano de la audición se realiza típicamente 18 de - 96 horas después de la electroporación en E5 (inicio de la salida del ciclo celular progenitora sensorial), E6 (inicio de la diferenciación HC), y E7 (durante la diferenciación HC); y más tarde hasta ~ E9 (final de la diferenciación HC). Este método de electroporación de la transferencia genética es transitoria que dura aproximadamente ~ 4 días, because los genes de interés no se integran en el genoma, pero el método es aplicable para su uso con vectores de expresión basados ​​en el ADN de plásmido apropiado, que tiene la capacidad de integrarse en el genoma, tales como la transferencia de genes mediada por Tol2 11. Con este método robusto GFP o RFP expresión dura ~ 4 días en la cóclea, después de lo cual las señales se desvanecen, sin embargo, proporcionan una ventana de tiempo suficiente para estudiar la intrincada desarrollo del órgano auditivo. Esto, a su método de transferencia génica in ovo es novedosa y permite apuntar específicamente el órgano auditivo presuntiva en E4, que es óptima para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Es una buena adición a procedimientos alternativos, que electroporate en etapas de desarrollo mucho más jóvenes o 11,12 en comparación con el uso de cultivos de explantes in vitro papilas basilar 18.

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Protocol

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Los huevos no eclosionados y embriones son atendidos y tratados con ética y humanamente. Todos los protocolos para el uso de embriones sin eclosionar fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo en la Escuela de Medicina Johns Hopkins, Baltimore, Maryland.

1. Los huevos y la preparación de construcciones de expresión

  1. Huevos:
    1. Incubar 3 - 4 docenas de huevos de gallina fertilizados (Gallus gallus) acostado sobre sus lados a 37 ° C.
      1. Después de 24 horas de incubación, tirar de 3 cc de albúmina con una jeringa desde el extremo posterior redonda del huevo y sellar el agujero con cinta adhesiva transparente. Esto crea una cámara de aire entre el embrión y la cáscara del huevo, lo que permite la facilidad de acceso al embrión sin el embrión se adhiera a la shell cuando el corte de la ventana para el acceso en la parte superior del huevo 19.
      2. En 117 horas de tiempo de incubación, los embriones etapa de acuerdo con 20 etapas de desarrollo Hamburger y Hamiltonen E4 (HH24-25) (Ver Figura 1D).
  2. Construcciones de expresión:
    1. Preparar el DNA plásmido usando reactivos y el protocolo proporcionado por el fabricante de un kit de preparación disponible comercialmente. En la etapa final de preparación, eluir el ADN en 500 l de TE (Tris-EDTA) tampón proporcionado en el kit en un tubo de 1,5 ml.
    2. El etanol precipitar el ADN para concentrarla mediante la adición de 50 l de 3 M de acetato de sodio y 1 ml de etanol 100% al tubo. Se coloca el tubo a -20 ° CO / N.
    3. Centrifugar el tubo durante 30 min a 14.000 rpm a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y aire secar el sedimento durante 10 min a RT. Disolver el precipitado en 15 l de tampón TE, lo que debería dar una concentración de ~ 4 mg / l.
      NOTA: El control de construcciones de expresión utilizados aquí son PME-IRES-GFP 10, que es impulsado por un promotor de pollo β-actina, o PCI-H2B-IRES-RFP CMV.

2. pollo in ovo Micro-electroporación in ovo y ensayo de proliferación celular

  1. En Ovo Microinyección de construcción de expresión y Micro-electroporación:
    1. Tire de los tubos capilares de vidrio en agujas finas usando un extractor de micropipeta con los siguientes parámetros optimizados para una 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Calefacción Filament: Presión = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, velocidad = 105, y la hora = 150 ms (ver Tabla 1).
    2. Establecieron la izquierda y etapas micromanipulador diestros que flanquean el microscopio (véase la Figura 1A). El micromanipulador Dretà sostiene la aguja capilar de vidrio y el micro-manipulador zurdos sostiene los electrodos (Figura 1A).
    3. Preparar la aguja capilar de vidrio finamente tirado por microinyección cortandola punta de la aguja con un fórceps durante el trabajo bajo el microscopio.
    4. Llene la aguja de forma manual a mano utilizando el micromanipulador con 2,5 l de ADN plásmido teñidas con 0,1% Fast Green mientras se trabaja bajo el microscopio.
    5. Colocar el huevo acostado de lado dentro de un dispositivo de retención de moldes / huevo (ver Figura 1A). Cortar una ventana redonda en la parte superior del huevo con unas tijeras 19 (Figura 1A).
    6. Mientras que trabajar bajo el microscopio, abra con cuidado las dos membranas superpuestas el embrión utilizando pinzas.
    7. Mientras que trabajar bajo el microscopio, entregar aproximadamente ~ 0,5 l de ADN plásmido a la derecha del lumen de la vesícula ótica por microinyección de forma manual utilizando la mano derecha utilizando el micro-manipulador y por micro-electroporación.
      1. Para ello, micro-inyectar el derecho lumen vesícula ótica con el ADN con la mano derecha micromanipulador (Figura 1B-D), mientras que al mismo tiempo usando la mano izquierda aguantandoga pinza de sostener la cabeza del embrión, porque la cabeza del embrión se sumerge en la etapa E4. No te micro-inyectar más allá del lumen de la vesícula ótica, ya que esto dañará la vesícula ótica.
      2. Inmediatamente después de la microinyección, mientras se trabaja bajo el microscopio, usar de la izquierda micro-manipulador para colocar el positivo (ánodo) 2 mm electrodo de platino anterior-ventral a la vesícula ótica derecho y el electrodo 2 mm negativo (cátodo) en paralelo 1 mm entre sí (véase la Figura 1 C). Entregar 4 pulsos a 12 V con 100 ms de duración y 200 mseg separación. La vesícula ótica izquierda sirve como un control no tratado interna.
        NOTA: Limpie los electrodos en el medio electroporaciones con un bastoncillo de algodón empapado en 1x PBS.
  2. En Ovo ensayo de proliferación celular:
    1. Inmediatamente después de la electroporación se añaden 50 l de 0,25 mg / ml en 1 x PBS EdU dejando caer manualmente la solución EdU 50 l en el conjuntoembrión in ovo utilizando una pipeta. Sellar los huevos con la cinta y volver a la incubadora durante 18 a 96 hr.
    2. Retirar con cuidado la cinta y comprobar los embriones para GFP señal fluorescente o RFP dentro de la vesícula ótica después de 18 - 24 horas usando un microscopio fluorescente estándar (ver Figura 1 EE '). Si la señal fluorescente está presente, en este punto cosechar los embriones de los análisis o vuelva a sellar con cinta y devolverlo a la incubadora para la recolección y análisis en etapas posteriores (ver Figura 1 FP '').
      NOTA: La expresión de GFP señal con la construcción PME-IRES-GFP es evidente 6 - 7 horas después de la electroporación 10.

3. La recolección de embriones y Procesamiento de tejidos para la ARN hibridación in situ e inmunohistoquímica

  1. Recoger los embriones utilizando fórceps. Enjuague el embrión en 1x PBS frío. Retire las cabezas de los embriones, cortando la cabeza por el cuelloel uso de fórceps, y colocar las cabezas en paraformaldehído al 4% O / N a 4 ° C. Perforar el cerebro utilizando una pinza para permitir la penetración de la paraformaldehído 4% dentro de la cabeza.
  2. Deshidratar las cabezas en sacarosa al 30% (en PBS 1x) O / N a 4 ° C.
  3. Montar las cabezas en medio crioprotector mediante congelación rápida en una suspensión de hielo seco y metilbutano (2-metilbutano). Por otra parte, la rápida congelación de las cabezas en medio crioprotector con nitrógeno líquido. Almacenar las cabezas montadas a -80 ° C.
  4. Cryosection las cabezas en 12 micras de espesor secciones de tejidos y recoger todas las secciones de tejido que contiene el oído interno-en portaobjetos de vidrio de microscopio superfrosted.
  5. Realizar RNA estándar de hibridación in situ e inmunohistoquímica, como se describe previamente 4,21, y analizar para la proliferación celular EdU siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante del kit.
    NOTA: Las células ciliadas se pueden identificar usando policlonales de conejo α-myosinVIIA (MYO7A) unatibody (1: 1000, Proteus Biosciences) y anticuerpo secundario marcado con fluorescencia (1: 250, de cabra anti-conejo AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Captura y Procesamiento

  1. Tomar imágenes con equipos de imagen digital. Resultados de inmunohistoquímica imagen con un microscopio de fluorescencia estándar y los resultados de la in situ usando un microscopio de campo amplio estándar (que van de 5x a 40x en aumento).
  2. Procesar las imágenes utilizando el software de procesamiento de imágenes.

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Representative Results

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En este ADN método de papel plásmido que consiste en proteína fluorescente verde (GFP) casetes de expresión fue el blanco en el pollo en desarrollo papila basilar (BP) con parámetros optimizados de 12 V y 4 pulsos con 100 duración de pulso mseg y los intervalos de 200 mseg, produciendo un ~ 50% de tasa de supervivencia de los embriones y la eficiencia de plásmidos de ADN de direccionamiento en el BP. De imagen fluorescente de la expresión de GFP nativa en el desarrollo de embriones mostró este método de electroporación se dirige preferentemente la cara anterior-ventral de la otocyst, que da lugar a la BP (Figura 1 EE '; flecha blanca) y la expresión de GFP se puede seguir durante un transcurso de tiempo de hasta aproximadamente ~ 4 días (Figura 1 EH). Se utilizó RNA de hibridación in situ (ISH) para determinar si la electroporación dirigido con éxito la porción auditiva del oído interno en desarrollo. Para determinar si GFP fue tomada por auditivaprogenitores sensoriales, experimentos ISH se realizaron en secciones adyacentes de BP. Dentro de los progenitores en desarrollo sensoriales BP se identificaron por su expresión de Sox2 (Figura 1 K y N) y la franja loca (Lfng) (Figura 1 J). Estos experimentos demuestran que los progenitores sensoriales en todo el BP en desarrollo, como se muestra para la base (Figura 1 I; soporte de negro) y el ápice (Figura 1 L; soporte de negro), fueron atacados con éxito y expresan GFP después de 68 h de electroporación (Figura 1 I y L; corchetes negros). Además, GFP se expresó fuera del dominio sensorial en las células epiteliales no sensoriales (Figura 1 I y L; flechas rojas) y en el ganglio auditivo (Figura 1I y L; ag, flechas amarillas) marcado por la expresión NeuroD1 (Figura 1M) . En un experimento típico GFP (Figura 1 H); esto permite al investigador analizar el patrón espacial y temporal de la retirada del ciclo celular y la diferenciación de progenitores sensorial en el desarrollo de la PA. Para determinar el comportamiento proliferativo de células progenitoras sensoriales, se añadió el EdU análogo de la timidina en el momento de electroporación a E4. Cuatro días más tarde, EdU incorporación en el desarrollo de la PA se analizó en secciones de tejido usando "clic" química. Se utilizó inmuno-etiquetado para la proteína HC-específica myosinVIIA (MYO7A) para identificar los HC diferenciadores en el desarrollo de la PA. En la parte apical de la BP MYO7A + HC eran con frecuencia EdU + (Figura 1 PP ', P' ', flechas blancas), mientras que en la base de sólo unos pocos MYO7A + HC habían incorporado EdU (Figura 1 OO'; O '', flechas blancas), lo que sugiere que en el momento de la adición EdU en E4, pro sensorialgenitores en la base ya se publican en gran medida mitótico. Estos resultados confirman estudios previos de los gradientes de salida del ciclo celular y la diferenciación HC opuestas en el pollo BP 6,7.

Figura 1
La Figura 1. En Ovo electroporación & In Ovo Ensayo de proliferación celular. (AD) de imágenes de campo claro método de electroporación. En micro-inyección in ovo en la vesícula ótica derecho (B) y la colocación de los electrodos después de la micro-inyección dirigidas a la zona anterior-ventral en la vesícula ótica (C). Embrión en fase HH24-25 después de la microinyección y electroporación (D; vesícula ótica verde, negro flecha). (EH) proteína fluorescente verde (GFP) la expresión después de la electroporación. ( (E ') la expresión de GFP a las 18 horas (vesícula ótica, flecha blanca). (FH) Las flechas blancas indican que la expresión de GFP a 40 hr (F, vesícula ótica), 68 horas (G, PA), y en 88 horas (H, PA). (EN) adyacentes cocleares tejido secciones de la BP probaron para GFP, transcripciones Lfng, Sox2, y NeuroD1 por ARN hibridación in situ en 68 horas. Lfng (J, soporte negro) y Sox2 (K y N, soporte negro) marcan el epitelio sensorial y NeuroD1 (M) marca el ganglio auditivo (ag). GFP se expresa dentro sensorial (I y L, soporte negro) y el tejido no sensorial (I y L, flechas rojas), y la unaganglio uditory (I y L, flechas amarillas). (OP '') imágenes fluorescentes de myosinVIIA (MYO7A) / EdU etiquetado. (O'-O '' y P 'P' ') aumentos más altos de O y P. (O 'y P') Más EdU etiquetado está presente en el epitelio sensorial en el vértice (P ', soporte de blanco) que en la base (O', soporte de blanco). O '' y P '') se fusionaron imágenes fluorescentes, flechas blancas señalan MYO7A (+) / Edu (+) las células ciliadas en el vértice (P '') y la base (O ''). Más EdU (+) las células están presentes en el ganglio auditivo en el vértice (P, ag) que en la base (O, AG). (saco; sáculo en O). (A, anterior y V, ventral en los paneles B yE). Escala de barras de 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El método aquí descrito de in ovo micro-electroporación se ha optimizado para la transferencia de genes en el órgano auditivo en desarrollo. Es compatible con vectores de expresión basados ​​en el ADN de plásmido normalmente se utilizan para manipular la función del gen / expresión. El momento de la electroporación a E4 es óptimo para las investigaciones que se centran en el desarrollo de HC en el órgano auditivo. Los pasos más críticos son micro-inyección de la DNA en el lumen vesícula ótica sin ir demasiado profundo con la aguja y dañar la vesícula ótica (ver Fig. 1A-D), la orientación del ADN en el dominio anterior-ventral de la vesícula ótica por la colocación de los electrodos en consecuencia (véase la figura 1C.), y la entrega de los parámetros de electroporación optimizadas de 4 pulsos a 12 V. Estos parámetros están optimizados electroporación y la concentración de ADN plásmido optimizado (aproximadamente el 3,5 - 4 mg / l) para dirigir específicamente la presunta auditiva órgano en E4. Inicialmente empezamos out realización electroporaciones a 6 V, que no produjo señales fluorescentes. La tensión se incrementó de forma incremental mediante el uso de 8 V y 10 V, 12 V, siendo lo ideal. Del mismo modo, el número de impulsos para entregar y se optimizaron las duraciones de pulso y el espaciamiento de los pulsos. A los 12 V, 4 pulsos con 100 ms de duración y 200 mseg separación es ideal. Estos parámetros no sólo son ideales para la obtención de la transferencia genética eficiente en la E4, pero también son ideales para una tasa de supervivencia de los embriones de aproximadamente ~ 50%. Si no se obtiene una señal fluorescente dentro de las 24 horas de la electroporación, la siguiente debe ser considerado: 1.) Asegúrese de que la concentración de plásmido de ADN es de al menos 3,5 g / l. 2.) ajustar el parámetro de electroporación por 2 V, por ejemplo a 10 o 14 V. En cuanto a la obtención de embriones E4 HH24-25) de la etapa (a menos de 117 h de tiempo de incubación (véase la Fig. 1D), la temperatura de la incubadora para los huevos deberían optimizarse dentro de 37 - 39ºC, con más o menos horas de incuel tiempo necesario bación de 117 horas dependiendo de la temperatura utilizada, ya que hay variaciones en espera y los diferentes temperaturas usando incubadoras entre diferentes laboratorios. Varios análogos de la timidina incluyendo BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) o EdU se pueden utilizar para estudiar en la proliferación celular in ovo. Sin embargo, el uso de cualquiera de los compuestos tiene que ser optimizada para cada etapa de desarrollo como demasiado del compuesto prueba tóxica para la viabilidad celular / embrión y demasiado poco del compuesto resulta ineficaz. Este método describe el uso optimizado de EdU a una concentración de 0,25 mg / ml aplicarse como 50 l en todo el embrión in ovo específicamente para el estudio de la proliferación celular y ciclo celular-salida de E4 en adelante.

En la electroporación in ovo como un método de manipulación genética tiene algunas limitaciones. Se requiere un número relativamente grande de los huevos para electroporaciones en E4 con construcciones de control apropiados y para los ExperimentaCondiciones l. Esto se debe a una proporción de huevos, aproximadamente ~ 27%, siendo inutilizables para la electroporación debido a una combinación de falta de fertilización, defectos en el desarrollo, y la muerte embrionaria. Otro factor importante a considerar es la tasa de supervivencia de los embriones después de la electroporación. La tasa de supervivencia es de aproximadamente 50 ~%. Esto es debido al hecho de que los embriones mayores en E4 no sobreviven bien después de haber sido manipulado; los embriones más jóvenes son más resistentes y tolerar el ser manipuladas mejor. Las expresiones de los genes de interés después de la electroporación en E4 son focal y localizada a lo largo de todo el conducto coclear incluyendo tejido no sensorial y sensorial, así como el ganglio auditivo. La razón de la expresión más focal y localizada se debe a que el objetivo de la electroporación es el, órgano auditivo sin desarrollar presuntivo en E4, antes de que el órgano auditivo pollo comienza a crecer a cabo a E5 y se alarga en su forma en forma de hoz característica por ~ E9 1 . Por último, THMétodo E es transitorio donde las señales de expresión sólo permanecen durante ~ 4 días, debido a que los genes de interés utilizados aquí no se integran en el genoma. Sin embargo, el método se puede utilizar con construcciones de expresión basados ​​en plásmidos adecuados que tienen la capacidad de integrarse en el genoma.

Dominar el método de electroporación requiere algo de práctica, los ojos y las manos entrenadas, y la experiencia en el trabajo con embriones de pollo. Los procedimientos previstos en el desarrollo del oído interno de pollo y los atlas de desarrollo sirven como guías de buenas y son buenos puntos de partida para un novato. Después de dominar el método con estos parámetros de electroporación optimizados, el método se puede utilizar para las manipulaciones en la vesícula ótica cerrado de E2 a ~ E4.5. Aunque para la electroporación en E2 y E3, 10 V se debe utilizar en lugar de 12 V. Para la electroporación en E1 dirigidas a la placoda ótica y la taza ótica, electrodos de platino para requisitos particulares con los parámetros de electroporación modificados se pueden utilizar 8-10. Además de estudiar el desarrollo del órgano auditivo este método también se presta a estudiar el desarrollo de la inervación ganglio auditivo. Análisis de la expresión de GFP en las muestras sometidas a electroporación reveló que dirigido específicamente a la vesícula ótica antero-ventral no sólo dirige el dominio sensorial dentro del epitelio competente neuronal-sensorial (NSD), pero también se dirige a la población de neuronas que residen dentro de la DSN. neuronas aferentes que inervan los órganos sensoriales vestibulares y auditivas son principalmente de origen placodal ótica. La neurogénesis se produce durante un período de tiempo prolongado aproximadamente desde ~ e1.5 - E4.5 en el pollo, en donde los neuroblastos, sometidos a una intensa proliferación celular delaminate de forma continua desde el epitelio NSD de la copa ótica (~ e1.5) y la vesícula ótica (E ~2.5 - E4.5) y poblar como diferenciación de las neuronas del ganglio coclear-vestibular (CVG; VIII par craneal) 8,10,13,22.

Por otra parte, con algunas modificaciones órganos vestibulares pueden ser dirigidos con el método presentado. Por ejemplo, la cresta anterior de presunción puede ser dirigido en el E3, que se encuentra en la extremidad anterior dorsal de la NSD antero-ventral 9. Electroporación en E4 de orientación los rendimientos vesícula ótica anterior-ventrales focales todavía robustos expresiones GFP de transcripción en el tejido sensorial y no sensorial en todos los órganos vestibulares sensoriales, es decir, las crestas y utricluar y máculas sacular (datos no mostrados).

En conclusión, el método ovo en que aquí se presenta es específico para la realización de ganancia y la pérdida de las funciones a partir de E4 y para el estudio de la proliferación y diferenciación en el pollo órgano auditivo en desarrollo. Por otra parte, este método se puede adaptar fácilmente para el estudio de otros enner oído fenómenos de desarrollo, incluyendo la neurogénesis oído interno y el desarrollo de los órganos vestibulares.

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Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Doris K. Wu de plásmidos de expresión y sondas in situ, el Centro de la Universidad Johns Hopkins para la instalación de imágenes Biología Sensorial y el Centro para la audición y el equilibrio. Este trabajo fue apoyado por NIDCD subvención T32 DC000023 de LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación
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Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

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