Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Genöverföring till kyckling hörselorganet genom doi: 10.3791/53864 Published: April 17, 2016

Abstract

Kycklingembryon är idealiska modellsystem för att studera embryonal utveckling som manipulationer av genfunktion kan genomföras relativt enkelt in ovo. Innerörat hörselsinnesorgan är avgörande för vår förmåga att höra. Det finns en mycket specialiserad sensorisk epitel som består av mekano överförande hårceller (HCS) och omgivande gliaceller liknande stödjande celler (SCS). Trots strukturella skillnader i hörselorganen är molekylära mekanismer som reglerar utvecklingen av hörselorganet evolutionärt konserverat mellan däggdjur och aves I ovo elektroporering är i stort sett begränsad till tidiga skeden vid E1 -. E3. På grund av den relativa sena utvecklingen av hörselorganet vid E5, manipulationer av hörselorganet med in ovo elektroporering tidigare E3 är svårt på grund av vidareutveckling av kycklingembryo i senare skeden. Den metod som presenteras här är en övergående genöverföringsmetod för inriktning gener av intresse vidskede E4 - E4.5 i utvecklings kyckling auditiva sinnesorgan via in ovo mikro elektroporering. Denna metod är tillämpbar för gain-och förlust-av-funktioner med konventionell plasmid DNA-baserade expressionsvektorer och kan kombineras med in ovo cellprolifereringsanalys genom tillsats edu (5-etynyl-2'-deoxiuridin) till hela embryot vid tiden för elektroporering. Användningen av grön eller röd fluorescerande protein (GFP eller RFP) expressionsplasmider låter försöksledaren att snabbt avgöra om elektroporering framgångsrikt riktade hörsel del av utvecklingsinnerörat. I denna metod papper, är representativa exempel på GFP electroporated prover illustreras; embryon skördades 18-96 h efter elektroporering och inriktningen av GFP till pro-sensoriska området i hörselorganet bekräftades genom RNA in situ hybridisering. Metoden papper ger också ett optimerat protokoll för användningen av tymidin-analog edu att analysera cell proliftion; ett exempel på en EDU baserad cellproliferationsanalys som kombinerar immuno-märkning och klicka edu kemi tillhandahålls.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trots skillnader i morfologi och cell mönstring mellan däggdjurs- och fågelhörselsinnesorgan, är de molekylära faktorer och vägar som ansvarar för sensorisk HC utveckling tros vara evolutionärt konserverade 1-3. Den basilar papilla, som inrymmer hörsel HC och deras omgivande SCS, utvecklas som ett KONTANT i innerörat otocyst. Tidigt en pool av HC och SC stamceller anges inom öron placode / öron cup neurala sensorisk kompetent domän (NSD). Öde-kartdata bevisa att neuronala och sensoriska linjer är länkade och uppstår från NSD ligger i antero-ventrala regionen av öron cup eller otocyst i möss och kyckling 4,5. Först, neuroblaster delaminera från NSD att ge upphov till nervceller i hörsel-vestibulära ganglion, som så småningom uppdelad i auditiv och vestibulär ganglierna. Dessa neuroner innerverar de sensoriska HC i innerörat och kärnor i hjärnstammen. Cellerna thpå kvar i NSD tros ge upphov till olika sensoriska patchar, inklusive hörselsinnesorgan, som består av de mekano överförande sensoriska HC och tillhörande kaster.

I både brud och mus, hörselorganet sensorisk stamcellstransplantation cykel exit och HC differentiering förekommer i motsatta gradienter. I chick börjar hörsel stamcellstransplantation cykel exit runt ~ E5 och utvecklas från basen till spetsen och från centrum till periferin 6. En dag senare, börjar HC differentiering i spetsen och utvecklas till basen 7. Studera utvecklingen av innerörat i kyckling ger många tekniska fördelar som funktionella mekanismer kan undersökas med relativ lätthet i ovo i motsats till att manipulera embryon i livmodern i andra modellsystem, som kräver komplexa operationer. Den här beskrivna metoden använder in ovo mikro elektroporering att rikta gener av intresse i den presumtiva Basilar papilla område anterior-ventralt i öron vesikler specifikt på E4.

Elektroporering in ovo är en teknik som är väl etablerade och används vanligen 8-14. Principen för elektroporation teknik är baserad på det faktum att nukleotider (t.ex. plasmid-DNA, syntetiskt DNA, eller RNA-oligonukleotider) är negativt laddade. DNA injiceras in i vävnaden av intresse. När en elektrisk ström är placerad tvärs över vävnaden, öppnas det aktuella upp transienta porer i cellväggarna och möjliggör upptag av DNA: t, som den negativt laddade DNA strömmar mot den positiva elektroden (anoden). För förstärknings-of-funktion experiment, är gener av intresse som vanligen subklonades i expressionsplasmider som innehåller lämpliga expressionskassetter för grönt fluorescerande protein (GFP) eller röd fluorescerande protein (RFP). För förlust-of-funktion experiment plasmid-baserad dominanta negativa repressor konstruktioner, eller RNAi, eller morfolino konstruktioner är commonly används 15,16. För att inhibera mikro-RNA (miRNA) funktions miRNA svamp-konstruktioner, vilka typiskt plasmid baserad, kan användas 17. Den här beskrivna metoden gör det möjligt att undersöka de molekylära mekanismer som styr proliferation och differentiering i hörselorganet, som i ovo mikroelektro metoden kan lätt kombineras med in ovo cellprolifereringsanalys genom att tillsätta edu till hela embryot.

Elektroporation och tillsats av edu utförs vid E4 i öron vesikler, som är en dag före inträdet av cellcykelutgång vid hörselorganet. Analys av hörselorganet är typiskt 18-96 timmar efter elektroporering vid E5 (uppkomsten av sensoriska stamcellstransplantation cykel exit), E6 (uppkomsten av HC differentiering), och E7 (under HC differentiering); och senare upp till ~ E9 (slutet av HC differentiering). Denna elektro metod för genöverföring är övergående varar ungefär ~ 4 dagar becauSE generna av intresse inte integreras i genomet, men metoden är tillämpbar för användning med lämplig plasmid DNA-baserade expressionsvektorer, som har förmåga att integrera i genomet, såsom Tol2 genöverföring 11. Med denna metod robusta GFP eller RFP uttryck varar ~ 4 dagar i snäckan, varefter pekar signalerna bleknar, men ger en god tid att studera den invecklade utveckling av hörselorganet. Detta in ovo genöverföring metod är ny och gör det möjligt att specifikt rikta in sig på presumtiva hörselorganet vid E4, vilket är optimalt för undersökningar som fokuserar på HC utveckling i hörselorganet. Det är ett bra komplement till alternativa metoder, som electroporate vid mycket yngre utvecklingsstadier 11,12 eller jämfört med användning av in vitro-basilar papiller Explantation kulturer 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Äggen och okläckta embryon vårdas och behandlas etiskt och humant. Alla protokoll för unhatched embryo användning godkändes av Animal Care och användning kommittén vid Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, Maryland.

1. Ägg och Framställning av expressionskonstruktioner

  1. ägg:
    1. Inkubera 3-4 dussin befruktade hönsägg (Gallus gallus) som ligger platt på sina sidor vid 37 ° C.
      1. Efter 24 h av inkubation, pull 3 cc av äggvita med en spruta från den runda bakre änden av ägget och försegla hålet med genomskinlig tejp. Detta skapar en luftkammare mellan embryot och äggskal, vilket möjliggör enkel åtkomst till embryot utan embryot fastnar på skalet vid kapning fönstret för åtkomst ovanpå ägget 19.
      2. Vid 117 h av inkubationstid steg embryona enligt Hamburger och Hamilton 20 utvecklingsstadierpå E4 (HH24-25) (se figur 1D).
  2. Expressionskonstruktioner:
    1. Förbered plasmid-DNA med användning av reagens och protokoll som tillhandahålls av tillverkaren av ett kommersiellt tillgängligt förberedelse kit. Vid det sista steget i beredningen, eluera DNA i 500 | j, l TE (Tris-EDTA) buffert tillhandahållet i kitet i en 1,5 ml rör.
    2. Etanol fälla ut DNA: t för att koncentrera den genom tillsats av 50 | il 3 M natriumacetat och 1 ml 100% etanol till röret. Placera röret vid -20 ° CO / N.
    3. Centrifugera röret i 30 min vid 14000 rpm vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och lufttorka pelleten i 10 min vid RT. Upplösa pelleten i 15 | il TE-buffert, vilket bör ge en koncentration av ~ 4 ^ g / ^ il.
      OBS: kontrollexpressionskonstruktioner som används här är pMES-IRES-GFP 10, som drivs av en kyckling β-aktin-promotor, eller pCI-H2B-IRES-RFP CMV-promotorn.

2. Kyckling in ovo Micro-elektroporering och in ovo cellprolifereringsanalys

  1. I Ovo mikroinjektion av uttryckskonstruktion och Micro-elektroporering:
    1. Dra glaskapillärrör till fina nålar med hjälp av en mikro-pipett avdragare med följande optimerade parametrar för en 2,5 x 2,5 mm Box Platinum Uppvärmning Filament: Tryck = 500, Heat = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, och tid = 150 msek (se tabell 1).
    2. Ställ in vänster- och högerhänt mikromanipuleringssteg flankerar mikroskop (se figur 1A). Rätt-handed mikro manipulator håller glaskapillär nålen och vänsterhänt mikro manipulator håller elektroderna (Figur 1A).
    3. Förbered fint dras glas kapillär nål för mikroinjektion genom att skäraspetsen av nålen med en pincett under arbetet under mikroskop.
    4. Fyll nålen manuellt för hand med hjälp av mikro-manipulator med 2,5 pl plasmid DNA tonade med 0,1% Snabb grönt medan du arbetar under mikroskop.
    5. Placera ägget liggande på sidan i en form / ägg hållaranordningen (se figur 1A). Skära ett runt fönster på toppen av ägget med hjälp av en sax 19 (Figur 1A).
    6. Under arbetet under mikroskop, öppna försiktigt de två membranen liggande embryot med pincett.
    7. Under arbetet under mikroskop, leverera cirka ~ 0,5 pl plasmid-DNA till höger öron vesikler lumen genom mikroinjektion manuellt med höger hand med hjälp av mikro-manipulator och mikro elektroporering.
      1. För att göra det, mikro-injicera rätt öron vesikler lumen med DNA med höger hand mikro manipulator (Figur 1B-D) medan samtidigt med den vänstra Holdinga forcep att stabilisera huvudet av embryot, eftersom huvudet av embryot doppar vid steg E4. Inte mikro-injicera förbi öron vesikler lumen, eftersom detta kommer att skada öron vesikler.
      2. Omedelbart efter mikroinjektion, samtidigt som du arbetar under mikroskop, använd Vänster mikro manipulator för att placera den positiva (anoden) 2 mm platinaelektrod anterior-ventrala till höger öron vesikler och negativa 2 mm elektrod (katod) parallellt 1 mm från varandra (se figur 1 C). Leverera 4 pulser på 12 V med 100 ms varaktighet och 200 ms mellanrum. Den vänstra öron vesikler fungerar som en intern obehandlad kontroll.
        OBS: Rengör elektroderna mellan electroporations med en bomullspinne doppad i 1x PBS.
  2. In ovo cellproliferationsanalys:
    1. Omedelbart efter elektroporation tillsätt 50 | il av 0,25 mg / ml edu i 1x PBS genom att manuellt släppa 50 pl EDU lösningen på det helaembryo in ovo med hjälp av en pipett. Försegla äggen med tejp och återgå till inkubatorn under 18-96 timmar.
    2. Försiktigt bort tejpen och kontrollera embryon för fluorescerande GFP eller RFP signal inom öron vesikler efter 18-24 timmar med en vanlig fluorescerande mikroskop (se figur 1 EE). Om fluorescenssignal är närvarande, vid denna tidpunkt skörda embryon för analyser eller återförsluta med tejp och returnera den till inkubatorn för skörd och analyser i senare skeden (se figur 1 FP).
      OBS: Expression av GFP signal med pMES-IRES-GFP-konstruktionen är uppenbart 6-7 timmar efter elektroporering 10.

3. Embryo Skörd och Tissue Processing för RNA in situ hybridisering och Immunohistokemi

  1. Skörda embryon med hjälp av pincett. Skölj embryot i kall 1 x PBS. Ta bort huvuden embryon genom att skära huvudet av sin halsmed hjälp av pincett och placera huvudena i 4% paraformaldehyd O / N vid 4 ° C. Punktera hjärnan med användning av en tång för att medge penetrering av 4% paraformaldehyd inne i huvudet.
  2. Dehydratisera huvudena i 30% sackaros (i 1 x PBS) O / N vid 4 ° C.
  3. Montera huvudena i kryoskyddande medium genom snabb frysning i en slurry av torris och metylbutan (2-metylbutan). Alternativt, snabb frysa huvuden i kryoskyddande medium med flytande kväve. Förvara monterade huvuden vid -80 ° C.
  4. Kryosektion huvudena i 12 um tjocka vävnadssnitt och samla alla innerörat innehåller sektioner vävnads på superfrosted mikroskop glas.
  5. Utföra standard RNA in situ hybridisering och immunhistokemi som tidigare beskrivits 4,21, och analysera för edu cellproliferation efter protokollet som tillhandahålls av tillverkaren av kitet.
    OBS: Hår celler kan identifieras med hjälp av kanin polyklonala α-MyosinVIIa (Myo7a) entibody (1: 1000, Proteus Biosciences) och fluorescensmärkt sekundär antikropp (1: 250, get anti-kanin Alexafluor 488; Invitrogen).

4. Bildinsamling och bearbetning

  1. Ta bilder med digital bildbehandlingsutrustning. Bild immunohistokemi resultat med en standard fluorescerande mikroskop och resultaten av in situ med en vanlig brett fält mikroskop (från 5x till 40x i förstoring).
  2. Bearbeta bilderna med hjälp av bildbehandlingsprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denna metod papper plasmid DNA bestående av grönt fluorescerande protein (GFP) expressionskassetter riktades i utvecklings kyckling basilar papilla (BP) med optimerade parametrar för 12 V och 4 pulser med 100 ms pulslängd och intervall om 200 ms, vilket ger en ~ 50% embryo överlevnad och effektivitet av plasmid-DNA inriktning i BP. Fluorescerande avbildning av nativt GFP-uttryck i utvecklingen av embryon visade denna metod för elektroporering är inriktad preferentiellt anterior-ventrala aspekten av otocyst, som ger upphov till BP (Figur 1 EE '; vit pil) och GFP uttryck kan följas över ett tidsförlopp upp till ca ~ 4 dagar (Figur 1 EH). RNA in situ hybridisering (ISH) användes för att bestämma huruvida elektroporation framgångsrikt målinriktad hörseldelen av framkallningsinnerörat. För att avgöra om GFP togs upp av hörselsensoriska progenitorer ades ISH experiment utfördes på intilliggande BP sektioner. Inom utvecklings BP sensoriska progenitorer identifierades genom deras uttryck av Sox2 (figur 1 K och N) och Lunatic frans (Lfng) (Figur 1 J). Dessa experiment visar att sensoriska gångare i hela utvecklings BP, som visas för basen (Figur 1 I. svart konsol) och apex (Figur 1 L, svart konsol), framgångsrikt målinriktad och uttrycka GFP efter 68 timmar av elektroporering (Figur 1 I och L, svarta parentes). Dessutom var GFP uttrycktes utanför den sensoriska domän i icke-sensoriska epitelceller (Figur 1 I och L, röda pilar) och i hörselganglion (figur 1I och L, ag, gula pilar) kännetecknas av Neurod1 uttryck (figur 1M) . I ett typiskt experiment GFP (Figur 1 H); detta gör utredaren analysera den rumsliga och tidsmässiga mönster av sensorisk stamcellstransplantation cykeltillbakadragande och differentieringen i utvecklings BP. För att bestämma den proliferativa beteendet hos sensoriska progenitorer ades tymidinanalog edu sattes vid tidpunkten för elektroporering vid E4. Fyra dagar senare var EDU inkorporering i utvecklings BP analyseras i vävnadssnitt med hjälp av "klick" kemi. Immuno-märkning för HC-specifikt protein MyosinVIIa (Myo7a) användes för att identifiera differentier HC i utvecklings BP. I den apikala delen av BP Myo7a var + HC ofta edu + (Figur 1 PP ', P' ', vita pilar), medan i basen endast ett fåtal Myo7a + HCs hade inkorporerat edu (figur 1 OO'; O '', vita pilar), vilket tyder på att vid tidpunkten för edu tillsats vid E4, sensorisk progenitors i botten redan i hög grad lägga mitotiska. Dessa resultat bekräftar tidigare studier av motsatta gradienter av cellcykel exit och HC differentiering i chick BP 6,7.

Figur 1
Figur 1. I Ovo Elektroporation & I Ovo Cell Proliferation Assay. (AD) bright bilder av elektro metod. I ovo mikroinjektion i den högra öron vesikler (B) och placering av elektroderna efter mikroinjektion riktar anterior-ventrala område öron vesikler (C). Embryo vid steg HH24-25 efter mikroinjektion och elektroporering (D, grön öron vesikler, svart pil). (EH) grönt fluorescerande protein (GFP) uttryck efter elektroporering. ( (E ') GFP uttryck vid 18 timmar (öron vesikler, vit pil). (FH) Vita pilarna pekar på GFP-expression vid 40 h (F, öron vesikler), 68 h (G, BP), och vid 88 h (H, BP). (IN) Intilliggande cochlear vävnadssektioner av BP sonde för GFP, Lfng, Sox2, och Neurod1 transkript genom RNA in situ hybridisering vid 68 h. Lfng (J, svart fäste) och Sox2 (K och N, svart fäste) markera sensoriska epitel och Neurod1 (M) markerar hörselganglion (ag). GFP uttrycks i sensoriska (i och L, svart konsol) och icke-sensoriska vävnad (i och L, röda pilar), och enuditory ganglion (I och L, gula pilar). (OP '') Fluorescerande bilder av MyosinVIIa (Myo7a) / EDU märkning. (O'-O '' och P'-P '') Högre förstoringar av O och P. (O 'och P') Mer EDU märkning närvarande i sensoriska epitel vid spetsen (P ', vit fäste) än vid basen (O', vit fäste). O '' och P '') Sammanslagen fluorescerande bilder, vita pilarna pekar på Myo7a (+) / edu (+) hårceller vid toppen (P '') och basen (O ''). Fler edu (+) celler är närvarande inom hörselganglion vid spetsen (P, ag) än vid basen (O, ag). (sac; saccule i O). (A, främre och V, Ventral i paneler B ochE). Skalstrecken 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den här beskrivna metoden för in ovo mikro elektroporering är optimerad för genöverföring i utvecklingshörselorganet. Den är kompatibel med plasmiden DNA-baserade expressionsvektorer som typiskt används för att manipulera genfunktion / uttryck. Tidpunkten för elektroporering vid E4 är optimal för undersökningar som fokuserar på HC utveckling i hörselorganet. De mest kritiska stegen är mikro-injicering av DNA i öron vesikler lumen utan att gå alltför djupt med nålen och skadar öron vesikler (se fig. 1A-D), med inriktning på DNA i den främre-ventrala domänen av öron vesikler genom placera elektroderna i enlighet med (se figur 1C.), och leverera optimerade elektroporering parametrar 4 pulser vid 12 V. Dessa är optimerade elektroporering parametrar och optimerad koncentration av plasmid-DNA (~ 3,5-4 mikrogram / ​​l) för att specifikt rikta den presumtiva hörsel organ på E4. Inledningsvis började vi oUT genomför electroporations på 6 V, vilket gav inga fluorescerande signaler. Spänningen var stegvis ökas genom att använda 8 V och 10 V, med 12 V är optimal. På liknande sätt, att antalet pulser leverera och de pulsvaraktig och avståndet mellan pulserna optimerades. Vid 12 V, är idealiskt 4 pulser med 100 ms varaktighet och 200 ms mellanrum. Dessa parametrar är inte bara perfekt för att få en effektiv genöverföring vid E4, men är också perfekt för ett embryo överlevnad på cirka ~ 50%. Om ingen fluorescerande signal erhålls inom 24 h av elektroporering, bör följande beaktas: 1.) Kontrollera att plasmid-DNA-koncentrationen är åtminstone 3,5 | ig / | il. 2.) Justera elektroporering parametern genom två V, exempelvis till 10 eller 14 V. När det gäller att erhålla embryon E4 (HH24-25) scen inom 117 h av inkubationstiden (se fig. 1D), inkubatortemperaturen för äggen bör optimeras mellan 37-39 ° C med fler eller färre timmar incubation tid som behövs än 117 h beroende på temperaturen som används, eftersom det finns variationer i att hålla igång temperaturer med olika inkubatorer mellan olika laboratorier. Olika tymidinanaloger inklusive BrdU (5-brom-2'-deoxiuridin) eller EDU kan användas för att studera in ovo cellproliferation. Emellertid har användningen av antingen förening som skall optimeras för varje utvecklingsstadium som alltför mycket av föreningen visar toxiska cell / embryo livskraft och för lite av föreningen bevisar ineffektivt. Denna metod beskriver optimerad användning av edu vid en koncentration av 0,25 mg / ml används som 50 ^ på hela embryo i ovo speciellt för att studera celltillväxt och cellcykel utträde från E4 framåt.

I ovo elektroporering som en metod för genmanipulation har vissa begränsningar. En relativ stort antal ägg krävs för electroporations på E4 med lämpliga kontroll konstruktioner och för Experimental villkor. Detta beror på att en del av ägg, ungefär ~ 27%, är oanvändbar för elektroporering beror på en kombination av brist på befruktning, utvecklingsdefekter och embryonal död. En annan viktig faktor att beakta är överlevnadsgraden för embryona efter elektroporering. Överlevnadsgraden är ca ~ 50%. Detta beror på det faktum att äldre embryon vid E4 inte överlever väl efter manipuleras; yngre embryon är mer motståndskraftiga och tåla att bli manipulerad bättre. Uttryck av gener av intresse efter elektroporering vid E4 är fokal och lokaliserade i hela cochlea kanalen inklusive icke-sensoriska och sensoriska vävnad samt hörselganglion. Anledningen till den mer fokal och lokaliserad expression beror på att målet för elektroporation är den presumtiva, outvecklade hörselorganet vid E4, innan kycklingen hörselorganet börjar växa ut vid E5 och töjer in i dess karakteristiska sickle-formade form genom ~ E9 ett . Slutligen, the metod är övergående, där expressionssignaler endast kvar under ~ 4 dagar, eftersom generna av intresse som används här inte integrerar in i genomet. Emellertid kan förfarandet användas med lämpliga plasmid-baserad expressionskonstruktioner som inte har förmågan att integrera in i genomet.

Mastering elektroporering metoden kräver lite övning, tränade ögon och händer, och kunskaper i att arbeta med kycklingembryon. Referenserna anges innerörat utveckling och kyckling utvecklings atlaser tjäna som bra guider och är bra utgångspunkter för en nybörjare. Efter behärska metoden med dessa optimerade elektroporation parametrar, kan metoden användas för manipulationer i stängda öron vesikler från E2 till ~ E4.5. Även för electroporating på E2 och E3, bör 10 V användas i stället för 12 V. För elektroporering vid E1 inriktning öron placode och öron kopp, anpassade platinaelektroder med modifierad elektroporation parametrar kan användas 8-10. Förutom att studera utvecklingen av hörselorganet denna metod lämpar sig också för att studera utvecklingen av innerverar hörselganglion. Analys av GFP-uttryck i elektroporerade prover visade att rikta specifikt anterior-ventrala öron vesikler inte bara riktar sig sinnes domän inom neurala sensorisk behörig (NSD) epitel utan också inriktat på neuronal population som uppehålla sig inom NSD. Afferenta neuroner som innerverar de vestibulära och hörsel sensoriska organ är främst av otisk placodal ursprung. Neurogenes äger rum över en utsträckt tidsperiod ungefär från ~ E1.5 - E4.5 i kyckling, där neuroblaster och som undergår intensiv cellproliferation delaminera kontinuerligt från NSD epitelet i örat koppen (~ E1.5) och öron vesikler (~ E2,5 - E4.5) och fylla som differentierande neuroner cochlea-vestibulära ganglion (CVG, VIII kranialnerven) 8,10,13,22.

Dessutom, med vissa modifieringar vestibulära organ kan riktas med metoden presenteras. Till exempel kan den presumtiva anterior crista riktas till E3, som ligger på den dorsala främre spetsen av den främre-ventral NSD 9. Electroporating vid E4 riktar de främre-ventrala öron vesikler utbyten Bländar ännu robusta GFP-transkriptuttryck inom sensorisk och icke-sensoriska vävnad i alla de sensoriska vestibulära organ, nämligen cristae, och utricluar och saccular maculae (data ej visade).

Sammanfattningsvis är in ovo metod som presenteras här specifikt för att genomföra vinst-och förlust av funktioner som startar vid E4 och för att studera proliferation och differentiering i utvecklings kyckling hörselorganet. Dessutom kan denna metod enkelt anpassas för att studera andra iner örat utvecklings fenomen, inklusive innerörat neurogenes och utveckling av vestibulära organ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Doris K. Wu för expressionsplasmider och in situ-sonder, Johns Hopkins University Center for Sensory Biology imaging anläggning och Centrum för hörsel- och balans. Detta arbete stöddes av NIDCD Grant T32 DC000023 LE

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 1x PBS pH 7.4 gibco 10010-023
Fast Green FCF Powder Sigma F7252-5G
EdU Powder Invitrogen E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit Invitrogen C10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) Qiagen 12643
ECM 830 ElectroSquarePorator  BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable Kit BTX Harvard Apparatus 45-0216
Right Handed & Left Handed Micromanipulators World Precision Instruments Inc.  M3301R & M3301L
Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts World Precision Instruments Inc.  M10
Metal Steel Base Plate 12x24 inch World Precision Instruments Inc.  5479
Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors World Precision Instruments Inc.  14120
Micropippette Puller for pulling needles Sutter Instrument Co. P-97
2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament Sutter Instrument Co.
Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm FHC 27-30-0
Hamilton Glass Syringe 100 μl Hamilton 80601 Model 710LT
Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe Fisher Scientific O122-1
Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic Becton Dickinson and Company (BD) 427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Disposable Syringes Becton Dickinson and Company (BD) 309657
Disposable 21 Gauge Needles Becton Dickinson and Company (BD) 305122
One pair of 2 mm Platinum Electrodes Bulldog Bio. / Nepagene CUY611P3-2
Electrode Holder Bulldog Bio. / Nepagene CUY580
One pair of Dumont fine forceps number 5 Fine Science Tools (FST)
Matte finish invisible tape for sealing eggs Office Depot 520-928
Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific 23-400-101
Sterile filter tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. e306 (2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
Genöverföring till kyckling hörselorganet genom<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-elektroporering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).More

Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation. J. Vis. Exp. (110), e53864, doi:10.3791/53864 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter