Abstract
这个协议描述了使用特异于血管紧张素II受体进行受体放射自显影映射放射性为血管紧张素Ⅱ（血管紧张素II）中的大鼠脑受体结合模式。
组织标本收获并保存在-80℃。低温恒温器是用来冠部分组织（脑）和部分解冻 - 安装到带电的幻灯片。制作在载玻片上的组织切片在125 I SI-血管紧张素II孵育放射性标记血管紧张素Ⅱ受体。相邻的幻灯片被分成两组：“非特异性结合”非放射性标记的血管紧张素II的受体饱和的浓度，或存在（NSP）的AT 1血管紧张素II受体亚型（AT 1R）选择性血管紧张素II受体拮抗剂，与“总结合'没有AT 1 R拮抗剂。 AT 2血管紧张素Ⅱ受体亚型（AT 2 R）饱和浓度的拮抗剂（PD123319，10μM）也出现在incubati关于缓冲区限制125 I-SI-血管紧张素II结合到AT 1 R亚型。在30分钟预温育在约22℃，NSP载玻片暴露于10μM的PD123319和氯沙坦，而'总结合'载玻片暴露于10μM的PD123319。载玻片然后用125 I SI-血管紧张素II在缓冲液中培养在PD123319存在关于'总结合'和PD123319和氯沙坦为NSP在测定缓冲液，随后几个“洗涤”，和水以除去盐和非特异性结合放射性。幻灯片使用吹塑机，然后暴露于放射自显影胶片使用一个专门的电影和录像带干燥。胶片显影和图像被扫描成用于使用专有成像系统和一个电子表格视觉和定量密度的计算机。另外一组幻灯片的硫堇染色进行组织学的比较。
使用受体放射自显影的优点是可视化的能力血管紧张素II受体原位 ，一个组织试样的一个区段内，和解剖学通过比较相邻的组织学参考部分确定的组织的区域。
Introduction
心血管疾病仍然是死亡和残疾在美国，造成人员死亡，在美国超过30％的主要原因在2011年1，从美国心脏协会最近的统计数据表明，超过三分之一的人有一个或更多类型的心血管疾病。心血管研究继续迈大步对了解这种疾病，但作为一代开始变老当务之急是要继续努力。肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要由促进动脉粥样硬化，炎症，全身性的血管收缩，和激活交感神经系统的（ 图1）2-8起着在心血管系统的调节中发挥中心作用。
在RAS是当肾的肾小球旁细胞分泌肾素进入血液响应于血压下降时启动的荷尔蒙系统，增加sympathetic刺激，或由致密斑流钠降低。肾素代谢血管紧张素原（在肝脏中合成），以形成血管紧张素I（血管紧张素Ⅰ）。血管紧张素I被随后通过血管紧张素转换酶（ACE）代谢，一种外酶对血管内皮细胞的腔侧，主要在肺，肾，以形成血管紧张素II（ANG II）中，在RAS的主要效应的肽。血管紧张素Ⅱ是能够激活两种接受亚型;的1型受体（AT 1 R）和2型受体（AT 2 R），两者调节心血管系统，保持体液和电解质平衡和现在被认为影响认知功能和神经变性疾病进程8,9。本地，特定脑-RAS报道独立合成血管紧张素II。在大脑中，前体蛋白血管紧张肽原在由肾素样酶3转化为血管紧张素我星形胶质细胞10合成，可能是肾素原结合于肾素原受体11，并且随后通过其在大脑中的神经元12的胞表面上大量表达血管紧张素转换酶转化成血管紧张素II。产生的血管紧张素II这intrabrain是对大脑的AT 1和AT个从血源性血管紧张素Ⅱ分离2受体的激动剂。
而对AT 1 R起着重要的生理作用，这是更好地了解整个身体的病理生理作用，主要影响心血管系统和肾脏（ 图2）。当血管紧张素II结合到AT 1 R，它会导致血管收缩;增加血流阻力和血压升高。它还促进醛固酮和加压素的合成和分泌，从而增加钠和水潴留。这些效果也可以引起缺血性脑损伤和认知障碍，并链接到帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，和diabeTES，以及最近被鉴定为影响学习和记忆13-15。有在RAS在于一个反馈回路的AT在肾脏肾小球旁细胞1 R抑制肾素分泌。有趣的是，AT 2 R一般反调控的AT 1 R，导致在许多其他16-20血管扩张，轴突生长，轴突再生，抗增殖和cerebroprotection的动作。所述AT 2 R也被确定为抗高血压和最近，抗癌药21的靶。确定各种组织内的血管紧张素Ⅱ受体的定位和密度以及他们是如何通过定量光密度的受体放射自显影将有助于揭开RAS在特定疾病中扮演的角色不同的治疗方法和疾病状态的影响。
受体放射自显影已经使用了30多年作为一种有效的方法，用于指示血管紧张素I的存在下1受体和大脑中的RAS的其它部件和大鼠，小鼠，豚鼠，在各种实验条件下22-34狗和人的其他组织。大脑内定位血管紧张素II受体的重要性是一个可以应用功能的神经解剖学至血管紧张素II的动作在大脑中， 例如 ，AT 1 R的下丘脑（PVN）的室旁核的存在表明昂的函数II在大脑刺激加压素，催产素或促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）释放，或交感神经系统的活化。因此，阻断对AT 1 R药物可能会降低一些与在脑的RAS活性相关这些PVN介导的作用。正在进行的工作表明，AT 1 R拮抗剂的使用可以减少创伤后应激障碍（PTSD）的CRH诱导释放和缓解创伤后应激障碍的症状（伤害等 ，提交出版）。在PVN，穹窿器官（SFO），和杏仁核被称为调节体内平衡，食欲/口渴，睡眠，记忆，情绪反应，并且是本实证研究的目标区域。通过收集在显微镜玻片上脑的冠状切片，并治疗与特异性抑制剂的部分与血管紧张素II受体具有特异性放射性配体沿检查这些区域。在这项研究中，与建议的厂商沿所有材料和试剂中列出，碘-125，采用放射性标记的血管紧张素II受体拮抗剂，肌氨酸1，异亮氨酸8血管紧张素II（SI血管紧张素II），然后将其作为单声道125我纯化-SI血管紧张素II使用如前面所述的35 HPLC方法。使用这种高比活性的放射性配体的允许的放射性标记的部分暴露于X射线胶片后低，中和高受体密度的区域的可视化。通过与含有已知量的碘-125，具体量的脑糊标准校准膜血管紧张素II受体的区域结合的进行量化。在实验研究中，血管紧张素Ⅱ受体实验对象的大脑结合可以比对照受试者的大脑。这可以指示是否血管紧张素II的动作响应于遗传条件，表型异常，疾病状态或药物治疗被改变。然后，该知识可以应用到疗法来治疗与RAS的失调相关的疾病的发展。标识受体结合位点的替代技术，但具有降低的解剖分辨率，被结合使用从组织匀浆，这是与放射性配体的范围内的浓度，以评估作为解离常数放射性配体结合亲和力的培养来源的组织膜制剂测定（ 杀敌 ）和最大结合能力（B 最大值 ）的感兴趣的组织的。
这里所描述的协议可以被分解成5大共mponents：准备组织切片受体放射自显影;受体放射自显影;胶片曝光和发展;组织学;和密度图像分析。
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Protocol
这项研究进行的所有动物的程序是由诺瓦东南大学的机构动物护理和使用委员会与指南实验动物的护理和使用一致认可， 第 8版（国家科学院出版社，华盛顿特区2011 ）。
1.准备组织切片受体放射自显影
- 牺牲后，收获新鲜的脑组织，并尽快包装在铝箔并将其放置在-20℃的冰箱。要保持正确的形状，放置在大脑脑模具模拟头骨的内部，包裹在铝箔和发生在 - 20℃的冰箱中。 30分钟后，在可密封的冷冻储存袋处的组织和移动到-80℃冷冻长期储存。
- 获得的从-80℃冷冻，并转移到设定为最小的-10℃和最高的-18℃的低温恒温器，以避免解冻感兴趣的新鲜冰冻组织标本。 放置在试样上组织与二醇和基于树脂的包埋介质装入，仅嵌入试样到培养基中的一小部分。对于大脑，大脑垂直安装，以使在冠状面切片。
- 将组织安装到低温恒温器内的切片机，并在地方拧紧。确保大脑的左侧和右侧是相同的前 - postero坐标，并且背腹轴垂直于常用脑图谱。
- 开始在所需的厚度切割（20微米推荐）和解冻安装部分到显微镜载玻片在垂直方向为具有在滑动空间更大的表面积。收集部分在载玻片上以顺序每组五，即第一组幻灯片标记1-1,1-2，1-3,1-4和1-5（ 图3）。
- 填写一组幻灯片与段后，允许幻灯片空气干燥达1小时，然后将SLI德在一个自密封冷冻储存袋在-20℃的塑料载玻片盒，和存储。
2.放射自显影受体
注意：放射性。使用防护服装来处理放射性。处置成立后依赖，并且必须遵循准则正确衰减（半衰期60天）或通过认证的公司被拾起。
- 从-20℃冷冻机中取出感兴趣的“-1”和“-2”幻灯片和安装到滑动夹（ 图5）。安装“-1”的幻灯片共同为“非特定的”治疗和“-2”幻灯片“总”的待遇。 “非特异性”罐子将包含10μM的PD123319的终浓度的AT 2 R拮抗剂氯沙坦的AT 1 R拮抗物，在测定培养基缓冲液（AM5）（ 表1）中 ，“总”结合罐子将只包含10 μMPD123319在AM5。
- 反转幻灯片夹具放置载玻片到装有35-40毫升AM5的预培养科普林缸，和各自的抑制剂在室温下30分钟。在4分钟的时间间隔开始在他们的预培养浴随后集。
- 立即在室温从预温育溶液的孵育滑动邮寄者传送幻灯片，含有10ml AM5的，再加上125 I SI-血管紧张素II的预定浓度与相应的抑制剂（ 图4中的计算），60-90分钟温度。如果有足够的放射性，10幻灯片可以放置（背靠背）在修改幻灯片夹和科普林罐子125 I-SI-血管紧张素Ⅱ培养。
- 地方滑动回幻灯片夹具（如果需要），印迹，并冲洗轻轻1-2秒在400毫升蒸馏水在两个单独的容器中旋流。
- 顺序地转移滑入含35-40毫升AM5的每个（如在图4 <所示恰好1分钟4科普林罐子/ STRONG>）。
- 最后1分钟后用清水洗净，轻轻摇动部分在冰冷的蒸馏水中的四个转变1-2秒。
- 吹干冷空气的幻灯片（注意：热空气会挥发放射性化合物）利用4分钟（ 图5）不同的角度设置了四个吹风机，直到所有的路段都干，然后将纸巾上。
- 滑山与组织朝上到纸板的并置，以X光片使用双面胶带。
- 安装的至少一个，125碘校准标准滑动到每个纸板（ 图6）。
注意：校准标准包括脑糊用125碘彻底混合绑定到含有苯酚环，通过离心在1ml结核菌素注射器压实的化合物，其是低温恒温器在相同的厚度脑切片切片并解冻安装到显微镜的幻灯片。另外，125我校准标准在20微米厚切片塑性树脂可以商购获得。在这些标准的塑料树脂部分地屏蔽来自辐射的膜，使得〜40％的组织等效应计入校准。
3.胶片曝光与发展
- 继续用皮带背透视卡带和放射自显影胶片暗房。打开纸盒，并把里面滑梯（ 图6）的硬纸板。
- 把灯关了，打开安全灯。小心打开X射线胶片的箱子，取出一部电影，并将电影光面向上（与右下角的锯齿边缘）在磁带上的幻灯片上。小心关闭磁带，并旋转锁定杆密封发光（ 图6）。在-20℃下暴露数日的幻灯片到几周。
- 在暗室中，打开磁带和胶片显影PROC进行ESS。
- 放置滑入连续托盘;显影剂2分钟，含有5％冰醋酸，30秒，和定影剂进行5分钟的水。该薄膜的置于与20分钟流水的托盘，然后放入Photoflo为不超过10秒，挂起。
注意：曝光时间凭经验确定，并且可以包括与不同曝光时间的多个片：长到足以从具有低结合区获得可测量的信号，但没有限制，只要通过与高结合区域饱和膜。一旦获得可接受的曝光，然后进行到下一个步骤。
- 放置滑入连续托盘;显影剂2分钟，含有5％冰醋酸，30秒，和定影剂进行5分钟的水。该薄膜的置于与20分钟流水的托盘，然后放入Photoflo为不超过10秒，挂起。
4.组织学
- 制备硫素染色和染色试剂（ 表2， 图7）。
- 放置“-3”在滑动架，和转让顺序用离子交换水开始1分钟，然后接着是三个倾角成去电离10分钟硫素染色液美化版水域，并在去离子一水30秒洗。
- 继水，将滑动架成乙醇洗涤如下; 50％，70％，90％，30秒，然后在100％含双乙醇洗涤每个1分钟。最后，将滑动架成二甲苯为3分钟，然后转移到第二个二甲苯溶液5分钟。
- 在从最后二甲苯浴一次删除一个滑动，并覆盖与在有机溶剂中的安装平台的树脂基滑动件的上边缘，并放置一个24mm×60毫米盖玻片的幻灯片。允许幻灯片充分干燥〜48小时，然后扫描到电脑2400 dpi灰阶。
5.光密度图像分析
- 放置膜光泽面下来，用在左下角的锯齿边和扫描利用能够没有在成像系统的计算机的任何失真发送膜密度信息的专有扫描器。
- 打开专用的成像SYS统和利用校准棒以建立校准标准（ 图9 - 12）在胶片上的图像的未来光密度分析。
- 通过建立两种模板或经验概括感兴趣的领域的兴趣度的区域。数据被收集并基于膜分离，对照或野生型（部分），和区域。确保包括测量过程中的密度（飞摩尔/克），扫描区域和总目标区域（ 图9）。
- 通过确保感兴趣区域落在突出的参数（ 图10）之间调整扫描区域酒吧。
- 导出数据到电子表格（ 表4）。乘以密度倍的总的目标区域，然后通过扫描区域，以获得用于结合该特定区域的值除以。一旦这样做是为了测量所有值，底物的非特异性的既定从总得到特异性结合p怨恨。平均值，也可以对这些值进行的。
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Representative Results
所述肾素-血管紧张素系统的代谢途径的概要示于图1和直接集中在血管紧张素II受体亚型（AT 1 R和AT 2 R）在图2中进行说明。 图3显示冠状脑转移节到显微镜载玻片，然后将其通过一个受体放射自显影方法，使用预定的125 I SIANG II浓度运行， 如图4所示。 图5示出了用于在受体放射自显影的幻灯片其然后粘贴到纸板作为干燥步骤如图6所示，并随后开发的。 表2列出了用于在图中描述7校准标准单位为量化制作在载玻片上的组织切片的硫素染色过程所用试剂确定巴关于该测定的日期的sed如表3所示 。 图8示出了建立与125 I浓度（fmol的/ g组织）到胶片曝光（相对视光密度）的标准曲线的图11示出了 'NSP'之间的区别和'总'基团，以及该组织的标签，而图10描述了阈值的设定到接近零的值，以获得在整个扫描区域的精确平均值（扫描区域像素）。 表4显示了量化获得特定的工艺结合的基础上，从“总”值减去“非特定”。 “非特异性”结合含有氯沙坦和/或通过结合到非AT 1或AT 2受体的放射性配体的量在PD123319。所有PD123319的存在势必AT 1受体放射性配体产生的'总'的结合。˚F igure 11显示PVN的最终测量领域中总与非特异性结合相邻的PVN的解剖确认硫素染色的部分。
图 1： 在体内的肾素-血管紧张素系统（RAS）的代谢途径的肝脏释放酶原血管紧张素原，这是由肾分泌肾素裂解，形成血管紧张素I.血管紧张素转换酶（ACE）将血管紧张素我成血管紧张素II（血管紧张素II），心血管病的主要前体。血管紧张素Ⅱ引起血管收缩和血压，心输出量，盐食欲不振，口渴，水潴留。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 血管紧张素1型和2受体的功能（AT 1 R，AT 2 R）AT 1 R病理影响到心脑血管疾病，直接作用增加口渴和盐食欲，并发挥许多其他外围细胞的活动以及中央心理影响。 AT 2 R是AT 1受体的拮抗剂生理，在1 R的功效协助拮抗剂36从而对血管结构的有益作用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：Cryose脑的ctioning到显微镜载玻片在20微米厚。取决于低温恒温器的温度，部分将在时间显示折叠，裂纹，卷曲，或成为在切片机刀片或刀架压实。在这种情况下，部分被丢弃，做了说明，以指示额外的20微米将此部分从前面部分分离。段应在垂直方向上的幻灯片，以最大限度地需要填写一份幻灯片，因此收集每张幻灯片部分的金额最大的总面积收取。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 实验设计和协议为受体放射自显影的样本 Differenti“总”（-2）和“非特异性”（-1）的通货膨胀直接涉及受体亚型拮抗剂的存在和不存在。协议可以根据幻灯片的数量而变化，并将被增量为2对于每对总的和非特异性的幻灯片的增加。浓度放射性配，先前确定的是由股票的稀释获得进入AM5。此溶液然后均匀地分布在孵化容器。直接计数前和孵化，建立放射配的准确浓度后， 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 配置受体放射自显影干燥站干燥时间将取决于打击的效率机以及最后漂洗后吸干远离任何多余的水的能力。一旦部分转由清晰到白色的幻灯片将干燥。如果幻灯片未充分干燥则放射能扩散距离产生模糊的形象是不特定的受体结合位点的受体的路程。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：。 使用专门的磁带暴露处理幻灯片的X光片 ，建议滑动建立跟踪，其中两组比较方便的模式，请点击此处查看该图的放大版本。
图7： 设置为硫堇染色。载玻片装入滑动架并浸入顺序的解决方案。时序允许神经元的尼氏物质的有效染色（粗面内质网）。封固剂适用于以下脱水幻灯片允许固定盖玻片的幻灯片，并保留进行比较分析的章节。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8： 设置校正标准的每个膜含有它的各个校准标准的基础上，大脑膏，并在该试验完成时 。描述最佳拟合值的回归线是通过对大脑衡量标准贴专有成像系统程序产生。这将来自校准标准相对验光密度（ROD）的值（卡性病，在红色椭圆的），以结合的放射性配体的单位，在本实施例的单位（飞摩尔/ g时，红色圆圈）是每克的湿结合fmole放射性配组织重量（飞摩尔/克）。的脑糊标准测量是与圆形工具来完成，并放置在关于使用图像视图图标（红圈）在伪右侧示出的样品的中间。圆测量校准标准没有覆盖整个样本，而是衡量标准的，甚至区域。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图 9： 通过采样数，非特异性/总，以及用于样本读数区域识别组由于多个大脑，大脑区域，和多个实验组进行定量一起，它是所有的要素之间进行区分是至关重要的。标的指示大脑样品并且还可以指示基;节指示它是否是非特异性（NSP）或总，而区允许正在被采样的多个脑区域的识别。样品工具栏（红色矩形）描述了不同的取样工具， 如圆形，方形，模板，写意，橡皮擦;可用于被测定划定的区域。取样工具的领域内获得的ROD值记录在电子表格中的绑定，转换后的单位，飞摩尔/克（红圈）。此外，采样工具内的总扫描区域被记录在同时总T“扫描区域像素”列ARGET区（即超过阈值（如图10图例中的像素数）被记录在“总面积TGT像素”一栏。 请点击此处查看该图的放大版本。
图10： 阈值的样品的测定的基础上的标准进行测量的扫描面积为每个胶片唯一的，并且依赖于所定的标准。使用阈值工具（红圈）为密度范围在飞摩尔/ g的扫描区域将允许测量的区域设置的阈值（由斜箭头标示）的范围为0之间下降，到一个地步，校正曲线开始渐近线指示该薄膜接近的最大暴露，超过该附加
图11： 受体放射自显影的代表性的图像在〜1.8毫米尾椎前囟门结合女性自发性高血压大鼠（SHR）的冠状切片，显示下丘脑（PVN）和附属嗅道床核的室旁核（BAOT ）（A </ STRONG>）总的AT 1 R结合（红色- PVN，黄色- BAOT）的结合。 （ 二 ）非特异性氯沙坦（AT1R拮抗剂）和PD123319（AT2R拮抗剂）具有约束力。 AT 1 R与任意阈值设置如划定PVN（黑色填充）的形状超过扫描区域被记录为总TGT区）内阈值绑定的（C）的总结合。 （D）硫堇染色显示结构的解剖确认部分高总结合，以及与其他脑区或其他实验组比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 试剂 | 量 |
| 氯化钠 | 8.76G |
| 的 Na 2 EDTA | 1.86克 |
| 杆菌肽 | 141毫克 |
| 500毫米二元的 Na 2 PO 4 | 100毫升 |
| 去离子蒸馏水 | 900毫升 |
| 调节pH至7.1至7.2，用NaOH或HCl | |
表1：测定培养基（AM5）在组织制备中使用的缓冲液的化学成分。
表2：硫堇染色试剂的硫素染色是加入0.5％的硫素溶液之前由蒸馏水，1.0M醋酸钠和1.0M冰醋酸溶液滴定至pH为4.3。
| 过去几天基准日 | |||||||||
| 批量 | 飞摩尔/ g湿重 | 参考日期 | 1 | 2 | 3 | 4 | 五 | ||
| 标准 | NCI /毫克 | 飞摩尔/ G | DPM / G | 飞摩尔/ G | FOM / G | 飞摩尔/ G | 飞摩尔/ G | 飞摩尔/ G | 飞摩尔/ G |
| 数 | 30月 | 30月 | 30月 | 30月 | 5月31日 | 1军 | 2月 | 3月 | 4月 |
| 1 | 9706 | 4,463 | 21547320 | 4,463 | 4411 | 4361 | 4311 | 4261 | 4,212 |
| 2 | 5,838 | 2684 | 12960360 | 2684 | 2653 | 2,623 | 2593 | 2563 | 2,533 |
| 3 | 2798 | 1286 | 6211560 | 1286 | 1,272 | 1257 | 1243 | 1228 | 1214 |
| 4 | 1451 | 667 | 3221220 | 667 | 659 | 652 | 644 | 637 | 630 |
| 五 | 787 | 362 | 1747140 | 362 | 358 | 354 | 350 | 345 | 342 |
| 6 | 385 | 177 | 854700 | 177 | 174 | 173 | 171 | 169 | 167 |
表3：每日衰减率计算的校准标准每日衰减率的试算表校准标准将根据需要在其上进行实验的日期创建。此电子表格是基于一阶率60天的半衰期（T½）不变。 N = N 0 * E 克拉 ，其中N = 125我的浓度，以相对于浓度时间t在时间0（N 0）和k = LN2 /吨1/2。
| 下丘脑室旁Nucleous | 目标 | 密度飞摩尔/ G | 扫描区域 | 总目标区域 | 总* | |
| 总 | 1 | 996 | 4,383 | 4,383 | 996 | |
| 总 | 2 | 921 | 3362 | 3362 | 921 | |
| 总 | 3 | 818 | 3,445 | 3,445 | 818 | 特异性结合 |
| 总 | 4 | 710 | 2906 | 2906 | 710 | 967 |
| 平均 | 861 | 3,524 | 3,524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ TR>||||||
| 部分 | 目标 | 密度飞摩尔/ G | 扫描区域 | 总目标区域 | 非特异性* | 678 |
| NSP | 1 | 53 | 3,072 | 1737 | 三十 | 826 |
| NSP | 2 | 52 | 2959 | 1455 | 26 | |
| NSP | 3 | 86 | 3180 | 2,035 | 55 | |
| NSP | 4 | 53 | 3293 | 1995 | 32 | |
| 平均 | 61 | 3,126 | 1,805.5 | 36 | ||
| 该附件Olfac床核保守党道 | ||||||
| 部分 | 目标 | 窝点-飞摩尔/ G | 扫描区域 | 总目标区域 | 总* | |
| 总 | 1 | 439 | 3632 | 3632 | 439 | |
| 总 | 2 | 435 | 3632 | 3632 | 435 | |
| 总 | 3 | 355 | 3632 | 3,620 | 354 | |
| 总 | 4 | 435 | 3632 | 3631 | 435 | 特异性结合 |
| 总 | 五 | 342 | 3632 | 3,630 | 342 | 414 |
| 总 | 6 | 334 | 3632 | 3,606 | 331 | 393 |
| 平均 | 390 | 3632 | 3,625 | 389 | 321 | |
| 394 | ||||||
| 315 | ||||||
| 部分 | 目标 | 窝点-飞摩尔/ G | 扫描区域 | 总目标区域 | 非特异性* | 320 |
| NSP | 1 | 49 | 3632 | 1846 | 25 | 360 |
| NSP | 2 | 64 | 3632 | 2362 | 42 | |
| NSP | 3 | 53 | 3632 | 2275 | 33 | |
| NSP | 4 | 64 | 3632 | 2339 | 41 | |
| NSP | 五 | 51 | 3632 | 1,879 | 26 | |
| NSP | 6 | 41 | 3632 | 966 | 11 | |
| 平均 | 54 | 3632 | 1945 | 三十 | ||
| *总与非speciic是飞摩尔/ g的密度单位。 | ||||||
| 合计=密度*总目标区域/扫描区域 | ||||||
| 非特异性=密度*总目标区域/扫描区域 | ||||||
| 总目标区域是超过阈值，设定为接近0.00飞摩尔/ g的尽可能像素。 | ||||||
| 像素不超过阈值接收时的值为0总密度的评估。 | ||||||
| 像素不超过阈值收到值0非特定密度的评估。 | ||||||
| 特异性结合合计非特异性结合减去表示为飞摩尔/ g的密度单位。 | ||||||
表4：影像软件出口数据的附件嗅束下丘脑和床核的室旁核的定量分析在飞摩尔/ g的试算表，扫描区域，并以像素总目标区域。 “非特异性”结合是从“总”，以获得特定的AT 1定量结合的结合中减去。
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描述的协议标识“总”和“非特异性”在啮齿动物脑先前收获并保存在-80℃的冠状切片的相邻部分的放射性配体结合的可视化，并且可以容易地适用于几乎所有的组织中已解剖解决其中显示的受体或放射性配体结合位点的差的量子结构。在协议中描述的过程简单，分析是正确地解释结果的关键。测定20微米厚为最佳;如果部分过厚的非特异性结合会增加，从而难以解决的放射性配体的结合到它的目标。如果该部分被切断变薄，变得难以顺利切割和保存顺序部分不失真。在最佳切割温度会由于组织的性质和段和i的厚度略有不同S键通常凭经验确定。一旦接触叶片和组织之间进行，试样的取向可以进行审查，并通过移动该组织标本从刀片往回走，和调整所述安装球重新调整。当切割啮齿动物脑关键是要确保大脑的左侧和右侧是相同的前 - postero坐标，并且背腹轴垂直于常用脑图谱。幻灯集预标记，以对组织的相邻部分进行研究。 5幻灯片的第一集合标记1-1,1-2，1-3,1-4和1-5。在第一切口部在左上角的推移滑动1-1（这是幻灯片的右上角，当它是磨砂面朝下）;第二次切割部分那张幻灯片1-2 等 。第五部分切那张幻灯片1-5。第六部分切那张幻灯片1-1首节的左侧。第一组幻灯片被填满后，启动另一套5下滑ES，标记2-1,2-2，2-3，2-4，和2-5。这个周期继续，早进入脑是必要的。的“-4”和“-5”载玻片保持作为备用或放射性标记不同的受体。
受体放射自显影协议取决于所使用的放射性配体与被调查的受体的特征来确定的缓冲液，盐和酶抑制剂的浓度。对血管紧张素Ⅱ受体的此过程中的AT1亚型的测定中，高亲和力碘-125标记的配体，（125）I-SAR 1岛8 -Ang II（125 I SI-血管紧张素II）;放射性罗伯特C.斯佩思，博士（肽放射性碘标记共享资源，乔治城大学），这也是可商购）溶于AM5缓冲液（ 表1）;磷酸钠缓冲液用氯化钠，EDTA和杆菌肽。 AM5提供了从金属肽和杆菌肽敏感peptida的放射性很好的保护SES提供生理pH和NaCl浓度以优化结合特征。预孵育在AM5暴露组织切片以肽酶抑制剂以减少放射性配体的降解，并且还从血管紧张素II受体解离的内源性血管紧张素II。氯沙坦和PD123319，AT1R和AT2R拮抗剂，分别表示饱和的靶受体的浓度（10μM）加入，以防止放射性从结合这些受体以评估非特异性结合，并限制特定结合到AT1受体，分别。 125 I-SI-血管紧张素II为测定所需的浓度被确定和所需的储液的稀释从放射性同位素衰变速率的电子表格确定（见协议表3）。最佳放射性配体接近在K D上浓度使用这将占据本受体的50％。然而，由于放射性配体可能是昂贵的较低浓度ë.G。在K D水平的10-20％可以使用。这具有通过减少非特异性结合超过特异性结合更增加了信号噪声比的一个潜在的优势。然而，需要较长的曝光时间来开发的结合的图像。如上（第3.4节）所述，如果所获得的曝光过度或曝光不足，幻灯片可以重新暴露于较短和/或更长的时间来实现期望的曝光新膜。
光密度的图像分析可以由专用的成像系统，该系统提供了用于放射自显影的应用的广泛简以及其它应用来实现。校准标准在飞摩尔/ g湿组织重量（假设为组织中的比重）的。每个组标准，与背景一起将产生标准曲线。有带和不带加权可以产生从相对验光配镜为d的标准曲线几个曲线拟合算法密度（ROD）值不同的校准标准。最能代表所述数据的曲线选择作为子例程用于曲线拟合为不同的标准曲线不提供相对误差值凭经验进行。在棒高达〜0.6，标准曲线是拟线性。然而，电影开始趋于饱和超出了这一点形成了各地的渐近线0.8至0.9 ROD单位的曲线。如果所包围的样品的标准是在0.9以上ROD单元，建议重新露出薄膜为一个短的时间，以获得飞摩尔/ g的样品更接近标准的拟线性范围的结合的更可靠的值曲线。在这种极端的标准曲线得到的值将导致在放射配体结合显著较大差异ROD小的差异。因此随着膜接近它的饱和点的能力，以检测结合减少的变化。
对于特定区域的测量，建议措施是飞摩尔/ G'密度'，像素“扫描区”和“总目标区域”以像素为单位（ 图9）。设置为接近零越好（ 图10）的阈值，因为在膜密度或从校准标准产生的标准曲线的任意方面的变化，有时得到的值小于零是重要的。如果这些值的平均值在扫描区域的所有像素，将得出一个人为低值。用来识别具有结合可以是非常主观的地区的标准，所以最好是紧密配对对照和实验大脑尽可能降低主观误差的发生率。另一个挑战是决定多少章节，平均得到一个最终读数。部分分析的一个很好的迹象可以按照一个公认的老鼠大脑图谱，用染色组织学幻灯片一起确定。取样区域的大小也可以是一个问题。为了补偿，模板可以建立以校正任何大小差异。这些部分的处理也可能会影响具有高的结合结构的一个区域，并且在分析过程中加以考虑。这需要在专用的成像系统来设置一个密度范围超过一个任意值以便表示脑部区域的解剖特点的替代使用'阈值“工具的被采样诸如下丘脑的采样工具中的室旁核该包括感兴趣的区域（ 图11，图C）。它也可以包括区域测量到的结合量的测定。这可以通过为特定结合倍，测定该像素的数量的值乘以进行。像素可以通过在成像两个平面一把尺子，或已知尺寸的矩形转换为公制单位。对应于象素的数目矩形的长度或面积然后可以在公制单位来表示。 2400 dpi的分辨率，〜9000像素= 1 平方毫米在我们的系统。
虽然使用放射性配位体的不再是一个广泛使用的技术;它是为数不多的方式来可视化受体的物流内的组织标本作为本身的功能（能够结合其先天的配体）之一。此外，它可以定量受体，以使在治疗组之间的功能性受体表达的变化的评价的不同脑区或其它结构之间的数字，动物的不同菌株，或不同年龄的动物等的替代方法可用来表征之间AT 1受体表达的神经解剖学的方面，但是，它们具有有限的价值。在mRNA的原位杂交AT -1受体并不总是与在AT 1受体的表达或分布对应脑。而免疫学技术可以近似在基于组织切片的染色的强度受体表达的差异，这是不可能，以产生标准曲线用于染色以允许受体表达的数值确定。受体放射自显影还提供了特异性（特异性结合的放射性配体或其他目标）受体，可以不使用免疫学技术被保证的一个级别。在2009年，一系列文章发表37-43该质疑正在用来评估18个不同的G蛋白偶联受体和瞬时受体电位（TRP）通道49抗体的有效性。从本质上说，抗体标记的来自野生型和有问题的受体基因敲除小鼠蛋白质印迹相同的频带。随后，几组已经使用市售提出了类似意见AT 1和AT 2受体抗体44-49。使用bacteri的其产生的报告分子， 例如 ，绿色荧光蛋白，由AT 1子驱动人人工染色体是确定在小鼠的AT 1受体表达细胞的存在或不存在的一种间接方法（但不是大鼠）大脑基于它们具有功能AT 1受体子50。是可能的计数“阳性细胞”，在显微镜下确定的大脑区域，但不能在这些区域中的AT 1受体的表达强度进行定量的变化。因此，在这个时候唯一的验证技术，可用于直接测量血管紧张素Ⅱ受体表达的放射性配体结合的方法。并且，如果需要在微观水平上的AT 1受体蛋白质的功能解剖分辨率，受体放射自显影只能用于这种直接测量的技术。
受体放射自显影也不是没有局限性。主要concern是满足要求在研究设置中使用的放射性材料。有必要具有与到位严格的准则辐射安全程序，以确保谁与放射性材料和放射性材料的安全处置工作的研究人员的安全。此升级研究使用放射性物质排除对许多科研设置的使用点的成本。此外，放射性配的成本可能是巨大的。因此，在其中大量的载玻片上的组织切片中的放射性配体的容器中培养的受体放射自显影实验可如果不是上千放射性美元使用数百。另一个限制是，组织必须切片上低温恒温器之前被冷冻，储存一段时间，并迅速漂洗并用放射性配体，所有这些都可以损害受体的放射性配体结合的能力或感兴趣的蛋白温育后干燥。对于具有快速的屁股配体引产/解离动力学，它可能无法在冲洗远非特异性结合的放射性配体所需的时间保留放射性配体与受体的结合。另外，具有低量的放射性配体结合胶片曝光的长时间的 - 一个月以上 - 前一个可测量的图像可以形成在胶片上可能是必需的。另一个挑战是，除了碘-125的至配体可能会损害该配体结合其靶受体或蛋白质的能力，由于空间位阻。使用更小的分子， 例如 ，氚（3 H）的消除空间位阻问题，但氚具有这样低能量和低比活性（相对于碘-125），这是非常困难的，以产生对大多数的薄膜图象受体的人群。在这些问题的光，有许多情况，其中受体放射自显影是无法识别的受体或其他感兴趣的分子结构。
尽管李mitations，受体放射自显影可以识别一个组织内的特定的结构， 例如 ，响应于实验变量改变的大脑区域相比正常对照的大脑。这种知识可以帮助确定所述AT 1 R为血管紧张素II或在疾病的病理学其它受体或酶的作用。这方面的知识具有有价值的药理学意义的，因为它表示的目标为潜在的治疗领域。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
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