Abstract
Dit protocol beschrijft receptor bindende patronen voor angiotensine II (Ang II) in de rattenhersenen met een radioligand specifiek voor Ang II receptoren receptor autoradiografische mapping uitvoert.
Weefselmonsters geoogst en opgeslagen bij -80 ° C. Een cryostaat wordt gebruikt om coronaalwaarts sectie van het weefsel (hersenen) en dooi-mount de secties op geladen dia's. De slide gemonteerde weefselcoupes worden uitgebroed in 125 I-SI-Ang II naar Ang II receptoren radioactief te merken. Aangrenzende glijbanen zijn gescheiden in twee groepen: "niet-specifieke binding (NSP) in aanwezigheid van een receptor verzadigende concentratie van niet- radioactief gemerkt Ang II, of een AT 1 Ang II receptor subtype (AT 1 R) selectieve angiotensine II receptorantagonist en 'totale binding' zonder AT 1 R antagonist. Een verzadigende concentratie van 2 Ang II receptor subtype (AT 2 R) antagonist (PD123319, 10 uM) is ook aanwezig in de incubatiop buffer te beperken 125 I-SI-Ang II binding aan de AT 1 R subtype. Gedurende een 30 min pre-incubatie bij ~ 22 ° C, NSP objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319 en losartan, terwijl 'de totale binding' objectglaasjes worden blootgesteld aan 10 uM PD123319. Objectglaasjes worden vervolgens geïncubeerd met 125I-SI-Ang II in aanwezigheid van PD123319 voor 'totale binding' en PD123319 en losartan voor NSP in assay buffer, gevolgd door verscheidene "wassingen in buffer, water en zout en niet- verwijderen specifiek gebonden radioligand. Droog de glaasjes gebruikt blow-drogers, vervolgens blootgesteld aan autoradiografie film met een speciale folie en cassette. De film wordt ontwikkeld en de beelden worden gescand in een computer voor visuele en kwantitatieve densitometrie behulp van een eigen imaging-systeem en een spreadsheet. Een extra set van dia's worden thionine-gekleurd voor histologische vergelijkingen.
Het voordeel van autoradiografie receptor is de mogelijkheid om te visualiserenAng II receptoren in situ binnen een sectie van een weefselspecimen en anatomisch bepalen het gebied van het weefsel door het te vergelijken met een aangrenzend histologische referentiesectie.
Introduction
Hart- en vaatziekten nog steeds de belangrijkste oorzaak van overlijden en invaliditeit in de Verenigde Staten, waardoor meer dan 30% van de sterfgevallen in de VS in 2011 1. De meest recente statistieken van de American Heart Association geven aan dat meer dan één op de drie mensen heeft één of meer typen van cardiovasculaire ziekte. Cardiovasculair onderzoek blijft stappen te maken tegen het begrijpen van deze ziekte, maar als de generaties beginnen ouder is het noodzakelijk om deze inspanningen voort te zetten. Het renine-angiotensine systeem (RAS) speelt een centrale rol in de regulatie van het cardiovasculaire systeem voornamelijk door het bevorderen atherosclerose, ontsteking, systemische vasoconstrictie en activatie van het sympathische zenuwstelsel (figuur 1) 2-8.
RAS is een hormonaal systeem dat wordt geactiveerd wanneer juxtaglomerulaire cellen in de nier scheiden renine in de bloedstroom in reactie op verlaagde bloeddruk, verhoogde sympathetic stimulatie, of verlaagd natrium stroom door de macula densa. Renine metaboliseert angiotensinogeen (gesynthetiseerd in de lever) op angiotensine I (Ang I) te vormen. Ang I wordt vervolgens gemetaboliseerd door angiotensine omzettend enzym (ACE), een ecto-enzym aan de luminale zijde van vasculaire endotheliale cellen, voornamelijk in de longen en de nieren, in angiotensine II (Ang II), de belangrijkste effector RAS peptide te vormen. Ang II kan activeren twee receptorsubtypen; type 1 receptor (AT 1 R) en type 2 receptor (AT 2 R), welke beide het cardiovasculaire systeem reguleren, onderhouden vocht en elektrolyten homeostase en wordt nu beschouwd als cognitieve functies en neurodegeneratieve ziekten beïnvloeden verwerkt 8,9. Een lokale, brain-specifieke RAS wordt gemeld om zelfstandig te synthetiseren Ang II. In de hersenen, wordt het precursoreiwit angiotensinogen gesynthetiseerd in astroglia 10 omgezet Ang I een renine enzym 3, eventueel prorenin gebonden aan de receptor prorenin11, en vervolgens omgezet in Ang II-ACE die overvloedig op het extracellulaire oppervlak van neuronen tot expressie wordt gebracht in de hersenen 12. Dit intrabrain gegenereerd Ang II is de agonist voor de hersenen AT 1 en AT 2-receptoren die worden geïsoleerd uit bloed overgedragen Ang II.
Terwijl de AT 1 R een belangrijke fysiologische rol speelt, is beter bekend om de pathofysiologische effecten in het lichaam, vooral die de cardiovasculaire systeem en de nieren (afbeelding 2). Wanneer Ang II aan de AT 1 R bindt, veroorzaakt vasoconstrictie; toenemende weerstand tegen de bloedstroom en de bloeddruk te verhogen. Het bevordert ook de synthese en uitscheiding van aldosteron en vasopressine, leidt tot verhoogde natrium- en waterretentie. Deze effecten kunnen induceren ischemische hersenschade en cognitieve stoornissen die verband houdt met de ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer en Diabetes, alsmede zijn recent geïdentificeerd beïnvloeden leren en geheugen 13-15. Er is een terugkoppellus in het RAS, dat AT 1 R op de juxtaglomerulaire cellen in de nier remt renine secretie. Interessant is dat de AT 2 R algemeen tegen regelt de werking van AT 1 R, waardoor vasodilatatie, neurietuitgroei, axonale regeneratie, anti-proliferatie en cerebroprotection onder vele anderen 16-20. De AT 2 R is ook geïdentificeerd als een doelwit voor anti-hypertensie en recent, antikankergeneesmiddelen 21. Het bepalen van de lokalisatie en concentratie van Ang II receptoren in verschillende weefsels en hoe ze worden beïnvloed door verschillende behandelingen en ziektetoestanden met behulp van kwantitatieve densitometrische receptor autoradiografie helpt onthullen de rol speelt in de RAS specifieke ziekten.
Receptor autoradiografie is gebruikt voor meer dan 30 jaar als een effectieve methode voor het aangeven van de aanwezigheid van angiotensine II receptoren en andere componenten van de RAS in de hersenen en andere weefsels van de rat, muis, cavia, hond en mens onder verschillende experimentele omstandigheden 22-34. Het belang van het vinden Ang II receptoren in de hersenen is dat één functionele neuroanatomy kunnen toepassen op de werking van angiotensine II in de hersenen, bijvoorbeeld de aanwezigheid van AT 1 R in de paraventriculaire kern van de hypothalamus (PVN) suggereert een functie van Ang II in de hersenen vasopressine, oxytocine of corticotropine releasing hormoon (CRH) afgifte of activering van het sympathische zenuwstelsel stimuleren. Aldus geneesmiddelen die de AT 1 R blokkeren kunnen sommige PVN gemedieerde effecten geassocieerd met overactiviteit van de hersenen RAS verlagen. Werk in uitvoering suggereert dat het gebruik van AT 1 R-antagonisten Post-Traumatische Stress Stoornis (PTSS) geïnduceerde afgifte van CRH kan verminderen en verbeteren van de symptomen van PTSS (Hurt et al., Ingediend voor publicatie). De PVN, subfornicaleorgel (SFO), en de amygdala zijn bekend voor de regulering van homeostase, honger / dorst, slaap, geheugen, emotionele reacties, en zijn de doelgebieden van deze demonstratie studie. Deze gebieden werden onderzocht door het verzamelen van coronale secties van hersenen op microscoopglaasjes, en behandelen van de secties met specifieke remmers samen met een specifiek radioligand voor Ang II receptoren. In deze studie, alle materialen en reagentia met voorgestelde leveranciers staan, jodium-125 werd gebruikt om een angiotensine II receptor antagonist, sarcosine 1, isoleucine 8 Ang II (SI Ang II), dat vervolgens werd gezuiverd zoals de mono 125I radioactief te -SI Ang II onder toepassing van HPLC methodes zoals eerder 35 beschreven. Het gebruik van deze hoge specifieke activiteit radioligand maakt de visualisatie van gebieden van lage, matige en hoge receptordichtheid na blootstelling van de radioactief gemerkte secties röntgenfilm. Door het kalibreren van de film met de hersenen plakken normen die bekende hoeveelheden jodium-125, het specifieke bedragvan Ang II receptor binding in een gebied kunnen worden gekwantificeerd. In experimentele studies, kunnen de angiotensine II receptor binding in de hersenen van proefpersonen worden vergeleken met die in de hersenen van controlepersonen. Dit kan aangeven of het optreden van Ang II worden gewijzigd als reactie op een genetische aandoening, fenotypische afwijking, ziekte of behandeling met geneesmiddelen. Deze kennis kan vervolgens worden toegepast op de ontwikkeling van therapieën voor ziekten geassocieerd met ontregeling van het RAS behandelen. Alternatieve technieken receptorbindingsplaatsen identificeren, maar met beperkte anatomische resolutie, bindingsonderzoeken die weefselmembraan preparaten uit weefsel homogenaten, die zijn geïncubeerd met het radioligand over een bereik van concentraties radioligand bindingsaffiniteit als de dissociatieconstante beoordelen gebruiken (KD ) en maximaal bindingsvermogen (B max) van het weefsel van belang.
De hier beschreven protocol kunnen worden onderverdeeld in 5 grote components: Het voorbereiden van coupes voor Receptor Autoradiography; Receptor Autoradiografie; Film belichting en ontwikkeling; histologie; en Densitometrische Image Analysis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures voor deze studie uitgevoerd werden in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Nova Southeastern University, 8 e editie (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).
1. Voorbereiden Tissue Secties voor Receptor Autoradiography
- Bij het offer, oogst verse hersenweefsel, en wikkel in aluminiumfolie en plaats in een -20 ° C vriezer zo snel mogelijk. Om de juiste vorm te behouden, plaats de hersenen in de hersenen schimmel die de binnenkant van de schedel simuleert, wikkel in aluminiumfolie en plaats in een - 20 ° C vriezer. Na 30 min, plaats weefsels in een afsluitbare zak en vriezer naar een -80 ° C vriezer voor langdurige opslag.
- Haal de bevroren weefselspecimen plaats van de -80 ° C vriezer, en overbrengen in een cryostaat ingesteld op een minimum van -10 ° C en ten hoogste -18 ° C, om te voorkomen ontdooien. Plaats het monster op het weefsel houder met een glycol en harsbasis inbeddingmedium, Insluiten alleen een klein deel van het monster in het medium. Voor de hersenen, wordt de hersenen verticaal gemonteerd in staat te stellen het snijden in het frontale vlak.
- Plaats het weefsel monteren op de microtoom binnen de cryostaat en stevig vast op zijn plaats. Zorgen de linker- en rechterkant van de hersenen dezelfde antero-postero coördinaten en de dorso-ventrale as loodrecht op gebruikte atlassen hersenen.
- Gaan knippen op de gewenste dikte (20 um aanbevolen) en ontdooien monteer de secties op objectglaasjes in een verticale richting naar een groter oppervlak van de ruimte in de schuif hebben. Verzamel secties op objectglaasjes in opeenvolgende groepen van vijf, dat wil zeggen de eerste reeks dia gelabeld 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 en 1-5 (figuur 3).
- Na het invullen van een reeks dia met secties, laat dia's aan de lucht drogen voor maximaal 1 uur, plaats dan de slides in een plastic dia doos in een zelfdichtende vriezer opbergtas, en bewaar bij -20 ° C.
2. Receptor Autoradiografie
LET OP: De radioactiviteit. Gebruik beschermende kledij om radioactiviteit te behandelen. Verwijdering wordt afhing van vestiging, en moeten richtlijnen te volgen om goed te vervallen (halfwaardetijd 60 dagen) of worden opgepikt door een gecertificeerd bedrijf.
- Verwijder de "-1" en "-2" dia's van de belangstelling van de -20 ° C vriezer en monteer in slide grepen (Figuur 5). Monteer de "-1" slides samen voor 'niet-specifieke' behandeling en de '-2' slides voor 'totale' behandeling. 'Niet-specifieke' potten zal 10 pM uiteindelijke concentraties van PD123319 een bevatten AT 2 R-antagonist, en losartan een AT 1 R-antagonist, in testmedium buffer (AM5) (tabel 1), de 'totale' binding potjes bevat alleen 10 uM PD123319 in AM5.
- Keren de diagrepen de dia's in het pre-incubatie Coplin potten gevuld met 35-40 ml AM5 en respectievelijke inhibitoren plaats gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Begin volgende sets hun voorincubatie bad bij 4 min intervallen.
- Onmiddellijk overdracht dia's uit de pre incubatieoplossing de incubatie slide mailers gemaakt met 10 ml AM5, plus een vooraf bepaalde concentratie van 125I-SI-Ang II (berekend figuur 4) met de respectieve remmers gedurende 60-90 minuten bij kamertemperatuur temperatuur. Bij voldoende radioligand, kunnen 10 slides worden geplaatst (rug aan rug) in gewijzigde Preparaathouders en geïncubeerd met 125I-SI-Ang II Coplin potten.
- Plaats schuift terug in de slede grepen (indien nodig), blot en spoel onder voorzichtig schudden gedurende 1-2 seconden in 400 ml gedestilleerd water in twee afzonderlijke houders.
- Breng de dia achtereenvolgens in vier Coplin potten met 35-40 ml AM5 gedurende precies 1 min ieder (zie figuur 4 </ Strong>).
- Na de laatste 1 min spoelen, zachtjes swirl de secties voor 1-2 sec in vier veranderingen in ijskoud gedestilleerd water.
- Föhnen van de dia's met koele lucht (Let op: hete lucht volatizes de radioactieve stof) met behulp van vier föhn opgezet vanuit verschillende hoeken voor 4 min (Figuur 5), totdat alle onderdelen droog zijn, plaats dan op een papieren handdoek.
- Mount dia's met de weefsels naar boven op een karton voor bijstelling naar X-ray film met behulp van dubbelzijdig plakband.
- Mount tenminste één, 125 Jodium kalibratiestandaard dia op elk karton (figuur 6).
Opmerking: Kalibratienormen bestaan uit de hersenen pasta grondig gemengd met 125 Jodium gebonden aan een verbinding die een fenol ring, verdicht door centrifugatie in een 1 ml tuberculine spuit, dat cryostaat coupes dezelfde dikte als de hersencoupes en ontdooien gemonteerd op microscoop slides. Als alternatief, 125 ik kalibratie normenkunststofhars coupes 20 urn dikte kan commercieel verkregen worden. De kunststof hars in deze normen beschermt gedeeltelijk de film uit de straling zodanig dat een weefsel gelijkwaardigheid van ~ 40% moet worden verwerkt in de kalibratie.
3. Film Exposure and Development
- Overgaan tot een donkere kamer met een strap-back röntgencassettehouder en autoradiografie film. Open de cassette en plaats het karton met glijbanen binnen (figuur 6).
- Doe het licht uit en zet de safelight. Open voorzichtig de doos van X-Ray film, verwijder dan één film, en plaats de film glanzende zijde naar boven (met de scherpe rand aan de rechterbenedenhoek) op de top van de dia's in de cassette. Sluit voorzichtig de cassette, en draai de vergrendeling bars voor het afdichten van het licht (Figuur 6). Expose de dia's voor enkele dagen tot enkele weken bij -20 ° C.
- In de donkere kamer, opent u de cassette en door te gaan met de film ontwikkelen process.
- Zet de objectglaasjes in de bakken na elkaar; ontwikkelaar 2 min, water dat 5% ijsazijn gedurende 30 sec, en fixeer 5 min. De films worden de geplaatst in een bak met stromend water gedurende 20 min, vervolgens in Photoflo niet langer dan 10 seconden en hing.
Opmerking: De belichtingstijd wordt empirisch bepaald en kan meerdere films met verschillende belichtingstijden omvatten: lang genoeg om meetbare signalen uit gebieden met lage bindingsaffiniteit te verkrijgen, maar niet zo lang dat de film verzadigen door gebieden met een hoge bindingsaffiniteit. Zodra aanvaardbare risico's worden verkregen, ga dan naar de volgende stap.
- Zet de objectglaasjes in de bakken na elkaar; ontwikkelaar 2 min, water dat 5% ijsazijn gedurende 30 sec, en fixeer 5 min. De films worden de geplaatst in een bak met stromend water gedurende 20 min, vervolgens in Photoflo niet langer dan 10 seconden en hing.
4. Histologie
- Bereid de thionine vlek en kleurstoffen (tabel 2, figuur 7).
- Plaats de "-3" in de slede-rek en overschrijving volgorde beginnend met gedemineraliseerd water gedurende 1 min, vervolgens thionine vlek gedurende 10 minuten gevolgd door drie onderdompelingen in Deionized wateren, en een 30 sec wassen in gedemineraliseerd water.
- Naar aanleiding van het water, plaats de dia rek in ethanol wast als volgt; 50%, 70% en 90% gedurende 30 seconden, gevolgd door twee wasbeurten ethanol bij 100% gedurende 1 min elk. Tenslotte zet de schuif rek in xyleen gedurende 3 min, vervolgens over naar een tweede xyleen oplossing gedurende 5 min.
- Verwijder een dia in een tijd van de laatste xyleen bad, en hebben betrekking op de bovenste rand van de dia met een hars base in een organisch oplosmiddel montage medium, en plaats een 24 mm x 60 mm dekglaasje op de dia. Laat dia's voldoende droog voor ~ 48 uur en vervolgens te scannen naar de computer op 2400 dpi grijstinten.
5. Densitometrische Beeldanalyse
- Plaats de film glimmende kant naar beneden, met de scherpe rand aan de linker onderhoek en scannen met behulp van een eigen scanner in staat is het verzenden van de informatie film dichtheid zonder enige vervorming in de imaging-systeem computer.
- Open de eigen beeldvorming system en gebruik maken van de kalibratie bars om de kalibratie normen vast te stellen voor toekomstige densitometrische analyse van de beelden op de film (figuren 9-12).
- Maatregel gebieden van belang door ofwel de oprichting van een sjabloon of empirisch waarin de gebieden van belang. De gegevens worden verzameld en de gescheiden op basis van film, ofwel controle of wild-type (sectie), en de regio. Zorg ervoor dat de dichtheid (fmol / g), scan-gebied, en de totale doelgebied in de metingen omvatten (Figuur 9).
- Pas scangebied bars door ervoor te zorgen dat de regio van belang valt tussen parameters van aandacht voor (Figuur 10).
- Exporteer gegevens in een spreadsheet (tabel 4). Vermenigvuldig de dichtheid maal de totale doelgebied, dan delen door het scangebied om de waarde voor de binding van die specifieke gebied te verkrijgen. Zodra dit is gedaan om alle waarden gemeten, substraat de gevestigde niet-specifieke van total tot de specifieke binding p opleverenkwalijk. Gemiddelden kan ook worden uitgevoerd voor deze waarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het overzicht van de metabole route van het renine-angiotensine-systeem is getoond in figuur 1 en de directe aandacht voor de angiotensine II-receptor subtypen (AT1 R en AT 2R) is beschreven in figuur 2. Figuur 3 toont de overdracht van coronale hersenen delen op microscoopglaasjes, die vervolgens worden geleid door een receptor autoradiografie werkwijze volgens een vooraf bepaalde 125I-siang II concentratie zoals in figuur 4. Figuur 5 illustreert de droogstap van de dia's in de receptor autoradiografie die vervolgens worden aangebracht op een kartonnen als gezien in figuur 6, en vervolgens ontwikkeld. Tabel 2 geeft de voor de thionine kleuring procedure voor de slede gemonteerde weefselcoupes beschreven in figuur 7. Kalibratiestandaard eenheden kwantificatie reagentia bepaald based op de dag van de test zoals getoond in Tabel 3. Figuur 8 toont de opstelling van een standaard curve van 125I concentratie (fmol / g weefsel) blootstelling (relatieve dichtheid optometric) film. Figuur 11 toont het onderscheid tussen "NSP ' en "totale" groepen, alsmede de labels weefsel, terwijl figuur 10 wordt de instelling van de drempel een bijna nul waarde aan een nauwkeurige gemiddelde waarde voor de gehele aftastgebied verkregen (scangebied pixels). Tabel 4 toont de kwantificering proces om specifieke binding af te trekken op basis van de "niet-specifieke" van "totale" waarden. "Non-specifieke" binding die losartan bevat en / of PD123319 wordt gecreëerd door de hoeveelheid radioligand gebonden aan niet-AT 1 of 2 AT receptoren. Alle radioligand gebonden aan AT 1 receptoren in aanwezigheid van PD123319 geeft de "totale" binding. F igure 11 toont de uiteindelijke gemeten gebieden van de PVN totale versus niet-specifieke binding naast een thionine gekleurde coupe van de anatomische bevestiging van de PVN.
Figuur 1:. Metabole route van het renine angiotensine systeem (RAS) in het lichaam De lever releases de zymogeen angiotensinogeen, die wordt gesplitst door-nieren uitgescheiden renine, de vorming van angiotensine I. Angiotensine converting enzyme (ACE) zet Ang I in angiotensine II ( Ang II), de belangrijkste precursor van hart- en vaatziekten. Ang II veroorzaakt vasoconstrictie, en verhoogt de bloeddruk, cardiac output, zout honger, dorst en het vasthouden van water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Functies van de angiotensine type 1 en 2 receptoren (AT 1 R, AT 2R) AT 1 R pathologisch cardiovasculaire ziekte treft direct werkt om dorst en zout eetlust en oefent vele andere perifere cellulaire activiteiten als centraal psychologische effecten. AT 2 R is een fysiologische antagonist van de AT 1 receptor, assisteren bij de werkzaamheid van AT 1 R antagonisten 36 waardoor het hebben van gunstige effecten op de vasculaire structuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cryosectioning van hersenen op microscoopglaasjes bij 20 urn dik. Afhankelijk van de temperatuur van de cryostaat wordt de secties soms weergegeven plooien, scheuren, krullen, of worden samengeperst voor de microtoom mes of meshouder. In dat geval het gedeelte wordt verwijderd en genoteerd wordt om aan te geven dat een extra 20 urn dit gedeelte los van de vorige paragraaf. Secties worden verzameld op dia's in een verticale richting om de totale oppervlakte die nodig is om vullen een glijbaan en dus het verzamelen van de grootste hoeveelheid van de punten op elke dia te maximaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Voorbeeld van Experimental Design & Protocol voor Receptor Autoradiography differentiatie van "totale" (-2) en "niet-specifieke" (-1) direct betrekking op de aanwezigheid en afwezigheid van receptorsubtype-antagonist. Protocol kan variëren gebaseerd op het aantal dia, en zal toenemen met stappen van 2 per stel totale en aspecifieke slides. Radioligand concentratie, vooraf bepaalde wordt verkregen door verdunning van de voorraad in AM5. Deze oplossing wordt vervolgens gelijkmatig verdeeld over de incubatie containers. Direct tellingen worden genomen voor en na incubatie om de exacte concentratie van de radioligand vast te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Configuratie voor het drogen van het station in receptor autoradiografie Droogtijden variëren afhankelijk van de efficiëntie van de klapdrogers evenals de mogelijkheid om weg te deppen overtollige water na de laatste spoelgangen. Dia's zal worden gedroogd zodra de sectie verandert van helder naar wit. Als dia's niet volledig vervolgens gedroogd kan de radioligand weg van de receptor het produceren van een wazig beeld dat niet specifiek voor de receptor bindingsplaatsen verspreiden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:.. Ontmaskeren behandeld dia's x-ray film met behulp van een speciale cassette Slide set-up wordt aanbevolen om een patroon waarin de vergelijking van beide groepen wordt vergemakkelijkt volgen Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Set-up voor thionine kleuring. Dia's worden geladen in een houder en ondergedompeld in sequentiële oplossingen. Timing zorgt voor een effectieve kleuring van de Nissl stof (ruwe endoplasmatisch reticulum) van neuronen. Een montage medium toepassing om de dia's volgende uitdroging zorgt voor de vaststelling van de dekglaasje aan de dia, het behoud van de secties voor vergelijkende analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8:. IJkstandaard instellen Elke film bevat de individuele kalibratienormen basis van de hersenen plakken en het tijdstip waarop het experiment werd uitgevoerd . Een regressielijn beschreven Best fit waarden gegenereerd door een eigen afbeeldingssysteem programma voor de gemeten hersenen pasta normen. Dit zet de relatieve optometrische dichtheid (ROD) waarde van calibratiestandaarden (cal stds, rood ovaal) eenheden radioligand binding, in dit voorbeeld de eenheden (fmol / g, omcirkeld in rood) zijn fmol radioligand gebonden per gram natte weefselgewicht (fmol / g). De meting van de hersenen pasta normen wordt gedaan met de cirkelvormige gereedschap en geplaatst in het midden van de rechts weergegeven in pseudocolor met het pictogram view (rood omcirkeld) monster. De cirkel om het meten van de kalibratie standaard hoeft niet het gehele monster te dekken, maar het meten van een gelijkmatige oppervlakte van de standaard. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/53866fig9.jpg "/>
Figuur 9:. Het identificeren van groepen op sample nummer, niet-specifieke / totaal, en de regio's voor het monster lezingen Omdat meerdere hersenen, gebieden van de hersenen, en meerdere experimentele groepen samen worden gekwantificeerd, is het belangrijk om onderscheid te maken tussen alle factoren. Het onderwerp geeft de hersenen monster en kan ook de groep aan te geven; sectie geeft aan of het niet-specifieke (NSP) of totaal, terwijl de regio maakt de identificatie van verschillende hersengebieden die worden bemonsterd. Het monster werkbalk (rode rechthoek) beschrijft verschillende sampling gereedschap, bijv, cirkel, vierkant, sjabloon, de vrije hand, gum; die kunnen worden gebruikt om specifieke bakenen te meten. De ROD verkregen waarden binnen het gebied van de monstername gereedschap worden opgenomen op de spreadsheet als omgezette eenheden van binding, fmol / g (rood omcirkeld). Bovendien wordt de totale scangebied in de Bemonsteringsgereedschap genoteerd in de kolom "scangebied pixel" terwijl de totale te onderzoeken gebied (het aantal pixels dat de drempelwaarde (in figuur 10 legende beschreven overschrijden) is opgenomen in de kolom "Total Tgt Area-pixel". Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Bepaling van de drempel te meten monsters steunen op de het scangebied is uniek voor elke film, en is afhankelijk van de gestelde eisen.. Met de drempelwaarde gereedschap (rood omcirkeld) drempelwaarden voor de dichtheidsgebied het scangebied in fmol / g zal de gebieden bepaald (aangegeven door de diagonale pijlen) vallen tussen een bereik van 0 tot een punt waar de kalibratiecurve begint asymptoot aangeeft dat de film nadert een maximale positie, waarboven aanvullende
Figuur 11: Representatieve beelden van de receptor autoradiografie binding aan coronale secties van een vrouwelijke spontaan hypertensieve rat (SHR) bij ~ 1,8 mm caudaal Bregma, de weergave van de paraventriculaire kern van de hypothalamus (PVN) en het bed kern van het accessoire olfactorische darmkanaal (baot ). (A </ strong>) Totaal binding van AT 1 R binding (Red- PVN, Geel- baot). (B) Niet-specifieke binding met losartan (AT1R antagonist) en PD123319 (AT2R antagonist). (C) Totale binding van AT 1 R binding met een arbitraire drempel zodanig instellen om de vorm van de PVN (zwarte vulling) afgebakend boven de drempelwaarde binnen Het scangebied is geregistreerd als totale Tgt Area). (D) thionine gebrandschilderd sectie voor anatomische bevestiging van de structuren die een hoge totale binding, en ter vergelijking met andere gebieden van de hersenen of andere experimentele groepen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| reagentia | Bedrag |
| NaCl | 8.76g |
| Na 2 EDTA | 1,86 g |
| bacitracine | 141 mg |
| 500 mM Dibasisch Na 2 PO 4 | 100 ml |
| Gedistilleerd Gedeïoniseerd Water | 900 ml |
| Pas de pH op 7,1-7,2 met NaOH of HCl | |
Tabel 1: Assay Medium (AM5) Chemische componenten van de buffer gebruikt bij het prepareren van weefsels..
Tabel 2:. Thionine Stain Reagentia De thionine vlek bestaat uit gedestilleerd water, 1,0 M natriumacetaat en 1,0 M ijsazijn oplossing getitreerd tot een pH van 4,3 voorafgaand aan het toevoegen van een 0,5% oplossing thionine.
| Dagen verleden peildatum | |||||||||
| Partij | fmol / g nat gewicht | Ref Date | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Standaard | nCi / mg | fmol / g | dpm / g | fmol / g | FOM / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g |
| aantal | 30-May | 30-May | 30-May | 30-May | 31-May | 1-Jun | 2 juni | 3 juni | 4 juni |
| 1 | 9706 | 4463 | 21.547.320 | 4463 | 4411 | 4361 | 4311 | 4261 | 4212 |
| 2 | 5838 | 2684 | 12.960.360 | 2684 | 2653 | 2623 | 2593 | 2563 | 2533 |
| 3 | 2798 | 1286 | 6.211.560 | 1286 | 1272 | 1257 | 1243 | 1228 | 1214 |
| 4 | 1451 | 667 | 3.221.220 | 667 | 659 | 652 | 644 | 637 | 630 |
| 5 | 787 | 362 | 1.747.140 | 362 | 358 | 354 | 350 | 345 | 342 |
| 6 | 385 | 177 | 854.700 | 177 | 174 | 173 | 171 | 169 | 167 |
Tabel 3:. Dagelijks Decay Rate Berekeningen voor Calibration Standards Een dagelijkse vervalsnelheid spreadsheet voor de kalibratie normen zal moeten worden gemaakt op basis van de data waarop het experiment werd uitgevoerd. Deze spreadsheet is gebaseerd op de eerste orde snelheidsconstante met een halfwaardetijd (t ½) van 60 dagen. N = N 0 * e kt, waarbij N = concentratie 125I, op tijdstip t ten opzichte van de concentratie op tijdstip 0 (0 N) en k = ln2 / t 1/2.
| Paraventricular nucleus van de hypothalamus | Doel | Density-fmol / g | Scangebied | Totaal Doel Area | Totaal* | |
| Totaal | 1 | 996 | 4383 | 4383 | 996 | |
| Totaal | 2 | 921 | 3362 | 3362 | 921 | |
| Totaal | 3 | 818 | 3445 | 3445 | 818 | specifieke binding |
| Totaal | 4 | 710 | 2906 | 2906 | 710 | 967 |
| GEMIDDELDE | 861 | 3524 | 3524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ Tr>||||||
| sectie | Doel | Density-fmol / g | Scangebied | Totaal Doel Area | Niet-specifieke * | 678 |
| NSP | 1 | 53 | 3072 | 1737 | 30 | 826 |
| NSP | 2 | 52 | 2959 | 1455 | 26 | |
| NSP | 3 | 86 | 3180 | 2035 | 55 | |
| NSP | 4 | 53 | 3293 | 1995 | 32 | |
| GEMIDDELDE | 61 | 3126 | 1,805.5 | 36 | ||
| Bed Nucleus van de Accessory Olfactory Tract | ||||||
| sectie | Doel | Dens-fmol / g | Scangebied | Totaal Doel Area | Totaal* | |
| Totaal | 1 | 439 | 3632 | 3632 | 439 | |
| Totaal | 2 | 435 | 3632 | 3632 | 435 | |
| Totaal | 3 | 355 | 3632 | 3620 | 354 | |
| Totaal | 4 | 435 | 3632 | 3631 | 435 | specifieke binding |
| Totaal | 5 | 342 | 3632 | 3630 | 342 | 414 |
| Totaal | 6 | 334 | 3632 | 3606 | 331 | 393 |
| GEMIDDELDE | 390 | 3632 | 3625 | 389 | 321 | |
| 394 | ||||||
| 315 | ||||||
| sectie | Doel | Dens-fmol / g | Scangebied | Totaal Doel Area | Niet-specifieke * | 320 |
| NSP | 1 | 49 | 3632 | 1846 | 25 | 360 |
| NSP | 2 | 64 | 3632 | 2362 | 42 | |
| NSP | 3 | 53 | 3632 | 2275 | 33 | |
| NSP | 4 | 64 | 3632 | 2339 | 41 | |
| NSP | 5 | 51 | 3632 | 1879 | 26 | |
| NSP | 6 | 41 | 3632 | 966 | 11 | |
| GEMIDDELDE | 54 | 3632 | 1945 | 30 | ||
| * Total en Non-speciic zijn dichtheid eenheden van fmol / g. | ||||||
| Totaal = dichtheid * totale doelgebied / scan area | ||||||
| Niet-specifieke = dichtheid * totale doelgebied / scan area | ||||||
| Totaal Doel Area is pixels dat de drempelwaarde overschreden, stelt zo dicht mogelijk bij 0,00 fmol / g mogelijk te maken. | ||||||
| Pixels niet meer dan de drempelwaarde krijgen een waarde van 0 voor de beoordeling van de totale dichtheid. | ||||||
| Pixels niet meer dan de drempelwaarde ontvangen een waarde van 0 voor de beoordeling van de niet-specifieke dichtheid. | ||||||
| Specifieke binding is totale minus niet-specifieke binding uitgedrukt dichtheid eenheden fmol / g. | ||||||
Tabel 4: Kwantitatieve analyse van paraventricular kern van de hypothalamus en de bed kern van de accessoire olfactorische darmkanaal export Imaging software gegevens als een spreadsheet in fmol / g, scangebied, en de totale doelgebied in pixels.. "Non-specifieke" binding wordt afgetrokken van "totale" binding om de specifieke verkrijgen AT 1 kwantitatieve binding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol beschreven identificeert de visualisatie van "totale" en "niet-specifieke" binding van de radioligand in aangrenzende secties van coronale secties van een knaagdierhersenen eerder geoogst en opgeslagen bij -80 ° C, en kan goed toepasbaar op vrijwel elk weefsel dat heeft anatomisch opgelost substructuren die differentiële bedragen van receptoren of radioligand bindende websites. De beschreven binnen het protocol procedures zijn eenvoudig en de analyse is van cruciaal belang voor de juiste interpretatie van de resultaten. De 20 um dikte werd bepaald optimaal zijn; wanneer het deel te dik is de niet-specifieke binding te verhogen, waardoor het moeilijk is de binding van het radioligand te lossen zijn doel. Indien het gedeelte dunner is gesneden, wordt het moeilijk om succesvol snijden en opeenvolgende secties slaan zonder vervorming. De optimale snijtemperatuur zullen enigszins variëren afhankelijk van de aard van het weefsel en de dikte van de secties en is meestal empirisch bepaald. Zodra contact wordt gemaakt tussen het blad en het weefsel, kan de oriëntatie van het monster worden herzien, en opnieuw uitgelijnd door het bewegen van het weefselspecimen terug uit de buurt van het mes, en heroriëntering van de montage-bal. Bij het snijden van een knaagdier hersenen is het essentieel om de linker en rechter hersenhelft waarborgen in dezelfde antero-postero coördinaten en de dorso-ventrale as loodrecht op gebruikte atlassen hersenen. Slide sets zijn pre-gelabeld om studies uit te voeren op aangrenzende delen van de weefsels. De eerste sets van 5 dia's worden gelabeld 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 en 1-5. De eerste snede gaat op dia 1-1 in de linker bovenhoek (dit is de rechterbovenhoek van de schuif wanneer het matte kant naar beneden); de tweede snede gaat op dia 1-2, enz. De vijfde snede gaat op dia 1-5. De zesde snede gaat op dia 1-1 aan de linkerkant van het eerste deel. Na de eerste set van dia's is gevuld, start een andere set van 5 gleedes, gelabeld 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 en 2-5. Deze cyclus wordt voortgezet zo ver terug in de hersenen noodzakelijk. De "-4" en "-5" dia's worden als back-up of een andere receptor radioactief te onderhouden.
De receptor autoradiografie protocol afhankelijk van het gebruikte radioactieve ligand en de kenmerken van de receptoren worden onderzocht om de concentratie van buffers, zouten en remmers te bepalen. Voor het meten van de AT1-subtype van Ang II receptoren in deze procedure, een hoge affiniteit jodium-125 gemerkte ligand 125I-Sar 1 Ile 8 -Ang II (125 I-SI-Ang II); radioactief gemerkt door Robert C. Speth, Ph.D. (Peptide Radioactieve jodering de gedeelde, Georgetown University), die ook in de handel verkrijgbaar) wordt opgelost in AM5 buffer (Tabel 1); een natriumfosfaatbuffer met natriumchloride, EDTA en bacitracine. AM5 een goede bescherming van het radioligand van metallopeptidases en bacitracine-gevoelige peptidases die een fysiologische pH en NaCl concentratie bindingseigenschappen te optimaliseren. Voorincubatie in AM5 loopt de weefselcoupes peptidase remmers radioligand degradatie te minimaliseren, alsmede dissocieert endogeen Ang II van Ang II receptoren. Losartan en PD123319, AT1R en AT2R antagonisten respectievelijk dat verzadigen hun doelgroep receptoren worden toegevoegd in concentraties (10 uM) om te voorkomen dat het radioligand van binding aan deze receptoren niet-specifieke binding te beoordelen en specifieke binding aan de AT1-receptor te beperken, respectievelijk. De gewenste concentratie van 125I-SI-Ang II voor de test bepaald en de benodigde verdunning van de voorraadoplossing wordt bepaald uit een spreadsheet van de radio-isotoop vervalsnelheid (zie protocol tabel 3). Optimale concentratie van radioligand benadert de Kd wordt gebruikt die zouden bezetten 50% van deze receptoren. Echter, omdat radioliganden kan kostbaar lagere concentraties e zijn.G. 10-20% van de KD concentratie kan worden gebruikt. Dit heeft een potentieel voordeel van het verhogen van de signaal-ruisverhouding door het verminderen van niet-specifieke binding meer dan specifieke binding. Echter, langere belichtingstijden vereist om een beeld van de binding te ontwikkelen. Zoals hierboven (sectie 3.4) genoteerd, indien de belichting verkregen over- of onderbelicht, slides opnieuw worden blootgesteld aan een nieuwe film voor een kortere en / of langer duren voordat de gewenste belichting.
Densitometrische beeldanalyse kan door een eigen afbeeldingssysteem dat een uitgebreide compendium van de aanvragen voor autoradiografie en andere applicaties. Calibratiestandaarden in fmol / g nat gewicht weefsel (uitgaande van een dichtheid van een voor het weefsel). Elke standaard set, samen met een achtergrond zal een standaard curve te genereren. Er zijn verschillende curve-fitting algoritme met en zonder weging beschikking van een standaardcurve van de relatieve optometric d genererenensity (ROD) waarden voor de verschillende kalibratie standaarden. Selectie van de curve dat het beste het data empirisch uitgevoerd als subroutine voor curve fitting biedt geen relatieve fout waarden voor de verschillende standaard curves. Bij RODs tot ~ 0,6, de standaard curve is pseudolinear. Echter, de film begint te verzadigen voorbij dit punt een kromme vormend dat ongeveer 0,8-0,9 ROD eenheden asymptoten. Indien de voorschriften die bracketing de monsters boven 0,9 ROD eenheden, is het raadzaam om opnieuw blootstellen film voor een kortere periode betrouwbaardere waarden van fmol / g binding van de monsters dichter bij de pseudolinear bereik van de standaard te verkrijgen kromme. Afgeleide waarden in dit uiteinde van de standaardkromme zal verschillen ontstaan in ROD aanmerkelijk grotere verschillen in radioligandbinding. Vandaar de mogelijkheid om wijzigingen in binding afneemt detecteren de film nadert het verzadigingspunt.
Voor metingen van specifieke regio's,aanbevolen maatregelen 'Density' in fmol / g, 'Scan zone' in pixels, en 'Total Target Area' in pixels (Figuur 9). Het is belangrijk om een drempelwaarde zo dicht mogelijk bij nul (figuur 10) ingesteld omdat variaties in filmdichtheid of willekeurige aspect van de standaardcurve verkregen uit de kalibratiestandaarden soms waarden geven dan nul. Indien dergelijke waarden worden gemiddeld voor alle pixels in de omgeving Scan zou het een kunstmatig lage waarde ontlenen. De gebruikte gebieden identificeren binding kan zeer subjectief criteria, zodat het het beste om nauw koppelen de controle en experimentele hersenen zoveel mogelijk het optreden van subjectieve fouten te verminderen. Een andere uitdaging is om te beslissen hoeveel secties tot gemiddeld een definitieve uitslag te krijgen. Een goede indicatie van de punten te analyseren kan worden bepaald door het volgen van een geaccepteerd rattenhersenen atlas, samen met het lood histologie objectglaasjes. De omvang van de bemonstering gebied kan ook eenprobleem. Ter compensatie kan een sjabloon worden ingesteld om te corrigeren voor elke grootte verschillen. De behandeling van de secties kan ook gebieden bestrijkt van de structuur die hoge bindende en dat bij analyse worden beschouwd. Dit vereist een alternatief gebruik van het gereedschap drempelwaarde in het eigen afbeeldingssysteem een dichtheidstraject vastgesteld dan een willekeurige waarde teneinde met de anatomische kenmerken van het hersengebied vertegenwoordigen zodanig bemonsterd de paraventriculaire nucleus van de hypothalamus binnen een bemonsteringsgereedschap dat omvat het gebied van belang (Figuur 11, paneel C). Het is ook mogelijk de oppervlaktemeting bij de berekening van de hoeveelheid binding omvatten. Dit kan door de waarde voor specifieke binding maal het aantal pixels die werden gemeten vermenigvuldigen. Pixels kunnen worden omgezet in metrische eenheden afbeelden van een liniaal in twee vlakken, of een rechthoek met bekende afmetingen. Het aantal pixels die overeenkomen met delengte of oppervlak van de rechthoek kunnen vervolgens worden uitgedrukt in metrische eenheden. Bij 2400 dpi resolutie, ~ 9000 pixels = 1 mm 2 in ons systeem.
Hoewel het gebruik van radioactieve liganden niet meer gebruikte techniek; Het is een van de weinige manieren om de fysieke distributie van receptoren visualiseren in het weefsel specimens zelf als functionele (kan binden haar aangeboren ligand). Bovendien kan het aantal receptoren evalueren van veranderingen in de functionele receptor expressie tussen behandelgroepen schakelen tussen verschillende hersengebieden of andere structuren kwantificeren, de verschillende stammen van dieren of dieren van verschillende leeftijd, etc. Alternatieve methoden beschikbaar te karakteriseren neuroanatomische aspecten van AT 1 receptor expressie, maar ze hebben beperkte waarde. In situ hybridisatie van mRNA voor AT 1-receptoren niet altijd overeenkomt met AT 1 receptor expressie of distributie in dehersenen. Terwijl immunologische technieken verschillen in receptor expressie op basis van de intensiteit van de kleuring van weefselcoupes kan benaderen, is het niet mogelijk een standaardcurve voor het kleuren zodat een numerieke van receptor expressie. Autoradiografie receptor verschaft ook een mate van specificiteit voor receptoren (en andere doelen die specifiek binden radioliganden) die niet kan worden gewaarborgd met behulp van immunologische technieken. In 2009, een reeks artikelen verschenen 37-43 dat de geldigheid van 49 antilichamen die werden gebruikt om 18 verschillende G-eiwit gekoppelde receptoren en een transient receptor potential (TRP) kanalen beoordelen ondervraagd. In wezen, antilichamen die zijn gemerkt identieke banden op western blots van wild-type en knockout muizen voor de receptoren in kwestie. Vervolgens zijn er verschillende groepen soortgelijke opmerkingen gemaakt met behulp van commercieel verkrijgbare AT 1 en AT 2 receptor antilichamen 44-49. Het gebruik van een bacterial kunstmatig chromosoom die een reportermolecuul, bijvoorbeeld groen fluorescerend eiwit, aangedreven door de AT 1 promoter genereert een indirect bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van AT 1-receptor tot expressie brengende cellen in muizen (maar niet rat) hersenen gebaseerd op hun met een functionele AT 1 receptor promotor 50. Het is mogelijk om "positieve cellen" tellen microscopisch geïdentificeerd hersengebieden, maar veranderingen in de intensiteit van expressie van de AT 1 receptor in deze regio te kwantificeren. Dus momenteel de enige gevalideerde technieken die beschikbaar zijn voor direct meten Ang II receptor expressie radioligand binding methoden. En als anatomische resolutie van functionele AT 1 receptor eiwit nodig is op een microscopisch niveau receptor autoradiografie is de enige techniek voor dergelijke directe meting.
Receptor autoradiografie is niet zonder beperkingen. De belangrijkste concern is dat het voldoen aan de vereisten om radioactieve materialen te gebruiken in een onderzoeksomgeving. Er moet een stralingsveiligheid programma strikte richtlijnen om de veiligheid van onderzoekers die met radioactieve stoffen en het veilige gebruik van radioactieve stoffen verzekeren hebben. Dit escaleert de kosten van het onderzoek met behulp van radioactieve stoffen op een punt dat het gebruik ervan in veel onderzoek instellingen uitsluit. Bovendien kunnen de kosten van radioliganden aanzienlijk zijn. Dus een receptor autoradiografie experiment waarin een groot aantal dia gemonteerde weefselcoupes geïncubeerd in containers radioligand kan gebruiken honderden zo niet duizenden dollars radioligand. Een andere beperking is dat weefsel moet worden bevroren vóór snijden op een cryostaat, opgeslagen gedurende een tijdsperiode en snel gespoeld en gedroogd na incubatie met radioligand, die allemaal het vermogen van de receptoren of eiwit van belang zijn voor de radioligand binden beïnvloeden . Voor liganden die een snelle kontociation / dissociatie kinetiek, kan het niet mogelijk zijn om de binding van het radioligand aan de receptor behouden gedurende de tijd die nodig is om weg te spoelen niet-specifiek gebonden radioligand. Ook met lage hoeveelheden radioligand binding lange perioden van blootstelling film - een maand of meer - kan nodig zijn voordat er een meetbaar beeld kan vormen op de film. Een ander probleem is dat toevoeging van jodium-125 een ligand het vermogen van het ligand om te binden aan de doelreceptor of eiwit kan verminderen als gevolg van sterische hindering. Het gebruik van een kleinere moleculen, bijvoorbeeld tritium (3 H) elimineert het probleem van sterische hindering, maar tritium zulke lage energie en lage specifieke activiteit (ten opzichte van jodium-125), dat het uiterst moeilijk om beeld een film voor de meeste genereren receptorpopulaties. In het licht van deze problemen, zijn er veel situaties waarin receptor autoradiografie niet in staat is aan receptoren of andere moleculaire structuren van belang te identificeren.
Ondanks de limitations kan autoradiografie receptor specifieke structuren herkennen in een weefsel, bijvoorbeeld hersengebieden veranderd in reactie op experimentele variabelen in vergelijking met een normale controle hersenen. Deze kennis kan helpen bij het bepalen van de rol van de AT 1 R Ang II of andere receptoren of enzymen in de pathologie van de ziekte. Deze kennis heeft waardevolle farmacologische implicaties, omdat het aangeeft gebieden te richten voor mogelijke therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S.
- Ganten, D., et al.
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D.
- Speth, R., Giese, M.
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R.
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).
