Abstract
Ce protocole décrit les profils de liaison aux récepteurs de l'angiotensine II (Ang II) dans le cerveau de rat en utilisant un radioligand spécifique pour les récepteurs de l'angiotensine II pour effectuer la cartographie des récepteurs autoradiographique.
Les échantillons de tissus sont prélevés et conservés à -80 ° C. Un cryostat est utilisé pour la section coronale du tissu (cerveau) et dégel monter les sections sur des lames chargées. Les coupes de tissus montées coulissantes sont incubées dans 125 I-IS-Ang II de l' Ang II radiomarquer des récepteurs. Coulisseaux adjacents sont séparés en deux ensembles: "liaison non spécifique" (PSN) en présence d'un récepteur de concentration saturante de non-radiomarquée Ang II, ou un type AT 1 du récepteur angiotensine II (AT 1 R) , antagoniste sélectif des récepteurs de l' angiotensine II , et «liaison totale» sans AT 1 R antagoniste. Une concentration saturante d'AT 2 sous - type de récepteur angiotensine II (AT 2 R) antagoniste (de PD123319 10 uM) est également présent dans le incubatisur le tampon pour limiter 125 I-SI-Ang liaison à l'AT 1 R sous - type II. Pendant 30 minutes de pré-incubation à ~ 22 ° C, les lames NSP sont exposées à 10 uM PD123319 et losartan, tandis que «liaison totale» lames sont exposées à 10 uM PD123319. Les lames sont ensuite incubés avec 125 I-SI-Ang II en présence du PD123319 pour ' la liaison totale », et PD123319 et losartan pour NSP dans le tampon d'essai, suivi de plusieurs« lavages »dans un tampon, et de l' eau pour éliminer le sel et non spécifiquement lié radioligand. Les lames sont séchées à l'aide d'un sèche-soufflage, puis exposés à un film d'autoradiographie en utilisant un film spécialisé et d'une cassette. Le film est développé et les images sont numérisées dans un ordinateur pour la densitométrie visuelle et quantitative en utilisant un système d'imagerie propriétaire et une feuille de calcul. Un ensemble supplémentaire de diapositives sont thionine-colorées pour les comparaisons histologiques.
L'avantage d'utiliser une autoradiographie du récepteur est la capacité à visualiserAng II récepteurs in situ, au sein d' une section d'un échantillon de tissu et anatomiquement identifier la région du tissu en le comparant à une coupe histologique adjacente de référence.
Introduction
Les maladies cardiovasculaires continue d'être la principale cause de décès et d' invalidité aux Etats-Unis, causant plus de 30% des décès aux États - Unis en 2011 1. Les statistiques les plus récentes de l'American Heart Association indique que plus d'une personne sur trois a un ou plusieurs types de maladies cardiovasculaires. la recherche cardiovasculaire continue à faire des progrès contre la compréhension de cette maladie, mais que les générations commencent vieillit, il est impératif de poursuivre ces efforts. Le système rénine-angiotensine (SRA) joue un rôle central dans la régulation du système cardio - vasculaire principalement par la promotion de l' athérosclérose, l' inflammation, la vasoconstriction systémique et l' activation du système nerveux sympathique (Figure 1) 2-8.
RAS est un système hormonal qui est activé lorsque les cellules juxtaglomérulaires du rein sécrètent la rénine dans le sang en réponse à la diminution de la pression sanguine, une augmentation sympatla stimulation hetic ou diminution du flux de sodium par la macula densa. Métabolise rénine angiotensinogène (synthétisé dans le foie) pour former de l'angiotensine I (Ang I). Ang I est ensuite métabolisé par l'enzyme de conversion (ACE), un ectoenzyme sur le côté luminale des cellules endothéliales vasculaires, principalement dans les poumons et les reins, pour former l'angiotensine II (Ang II), le principal peptide effecteur du RAS. Ang II est capable d'activer deux sous-types de récepteurs; le récepteur de type 1 (AT 1 R) et le récepteur de type 2 (AT 2 R), les deux qui régulent le système cardio - vasculaire, maintenir l' homéostasie hydrique et électrolytique et sont maintenant considérés pour affecter la fonction cognitive et la maladie neurodégénérative traite 8,9. A, RAS spécifique du cerveau local est rapporté pour synthétiser indépendamment Ang II. Dans le cerveau, l'angiotensinogène protéine précurseur est synthétisée dans les astrocytes 10 converti en angiotensine I par la rénine d' une enzyme analogue 3, éventuellement prorénine lié au récepteur de la prorénine11, et par la suite convertie en angiotensine II par l' enzyme de conversion de l' angiotensine , qui est abondamment exprimé sur la surface extracellulaire de neurones dans le cerveau 12. Ce intrabrain généré Ang II est l'agoniste pour le cerveau AT 1 et AT 2 récepteurs qui sont isolés à partir du sang transmis par Ang II.
Alors que l'AT 1 R joue un rôle physiologique important, il est mieux connu pour ses effets physiopathologiques dans tout le corps, affectant principalement le système cardio - vasculaire et les reins (figure 2). Lorsque Ang II se lie à l'AT 1 R, il provoque une vasoconstriction; augmentation de la résistance à la circulation sanguine et d'élever la pression artérielle. Elle favorise également la synthèse et la sécrétion d'aldostérone et la vasopressine, conduisant à une augmentation de sodium et la rétention d'eau. Ces effets peuvent également induire des lésions cérébrales ischémiques et les troubles cognitifs et est liée à la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, et Diabetes, ainsi que d' être récemment identifié à affecter l' apprentissage et de la mémoire 13-15. Il y a une boucle de rétroaction dans le RAS en ce que R 1 sur les cellules juxtaglomérulaires du rein inhibe la sécrétion de rénine. Fait intéressant, AT 2 R généralement contre-régule l'action d'AT 1 R, ce qui provoque la vasodilatation, la croissance des neurites, la régénération axonale, anti-prolifération et cerebroprotection parmi beaucoup d' autres 16-20. AT R 2 a également été identifié comme une cible pour l' anti-hypertension et , plus récemment, des médicaments anticancéreux 21. Détermination de la localisation et la densité des récepteurs Ang II dans les différents tissus et comment ils sont touchés par divers traitements et états pathologiques en utilisant quantitative autoradiographie des récepteurs densitométrique va aider à découvrir le rôle du RAS joue dans des maladies spécifiques.
Récepteur autoradiographie a été utilisé pendant plus de 30 ans comme une méthode efficace pour indiquer la présence de l'angiotensine II récepteurs et d' autres composants de la RAS dans le cerveau et d' autres tissus du rat, souris, cochon de Guinée, le chien et l' homme sous une variété de conditions expérimentales 22-34. L'importance de la localisation des récepteurs Ang II dans le cerveau est que l' on peut appliquer neuroanatomie fonctionnelle aux actions de Ang II dans le cerveau, par exemple, la présence d'AT 1 R dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN) suggère une fonction d'Ang II dans le cerveau pour stimuler la vasopressine, l'ocytocine ou de l'hormone de libération de la corticotropine (CRH) de presse, ou l'activation du système nerveux sympathique. Ainsi, les médicaments qui bloquent l'AT 1 R pourraient diminuer certains de ces effets PVN médiées associés avec plus de l' activité des RAS du cerveau. Les travaux en cours suggèrent que l'utilisation d'AT 1 R antagonistes peut diminuer Post-Traumatic Stress Disorder (PTSD) la libération induite par la CRH et améliorer les symptômes de stress post - traumatique (Hurt et al., Soumis pour publication). Le PVN, subfornicalorgane (SFO), et l'amygdale sont connus pour réguler l'homéostasie, l'appétit / soif, le sommeil, la mémoire, les réactions émotionnelles, et sont les zones cibles de cette étude de démonstration. Ces régions ont été examinées par la collecte des coupes coronales d'un cerveau sur des lames de microscope, et le traitement des sections avec des inhibiteurs spécifiques avec un radioligand spécifique des récepteurs Ang II. Dans cette étude, tous les matériaux et les réactifs ainsi que les fournisseurs suggérés sont répertoriés, l' iode-125 a été utilisé pour radiomarquer un antagoniste de l' angiotensine II du récepteur, la sarcosine 1, l' isoleucine 8 Ang II (SI Ang II), qui a été ensuite purifié comme mono 125I -SI Ang II en utilisant des méthodes HPLC comme décrit précédemment 35. L'utilisation de cette activité radioligand spécifique élevée permet la visualisation des zones de faible densité, modérée et élevée du récepteur après exposition des sections radiomarqués à un film x-ray. En calibrant le film avec les normes de pâte du cerveau contenant des quantités connues d'iode-125, le montant spécifiquedu récepteur Ang II de liaison dans une zone peut être quantifiée. Dans des études expérimentales, le récepteur de liaison de l'angiotensine II dans le cerveau des sujets expérimentaux peut être comparée à celle dans les cerveaux de sujets témoins. Cela peut indiquer si les actions de Ang II sont modifiées en réponse à une maladie génétique, anomalie phénotypique, l'état de la maladie ou un traitement médicamenteux. Cette connaissance peut alors être appliquée sur le développement de thérapies pour traiter des maladies associées à une dérégulation de la RAS. Des techniques alternatives qui permettent d' identifier les sites de liaison au récepteur, mais avec une résolution anatomique réduite, sont des dosages qui utilisent des préparations de membranes de tissu provenant d'homogénats de tissus, qui sont mises en incubation avec le radioligand sur une plage de concentrations afin d' évaluer l' affinité de liaison de radioligand comme la constante de dissociation (K D lient ) et une capacité de liaison maximale (B max) du tissu d'intérêt.
Le protocole décrit ici peut être décomposé en 5 co majeuremponents: Préparation de coupes de tissus pour des récepteurs autoradiographie; Receptor autoradiographie; Exposition du film et le développement; Histologie; et densitométrique Analyse d'image.
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Protocol
Toutes les procédures animales réalisées pour cette étude ont été approuvés par le soin et l' utilisation Commission institutionnelle animale de l' Université Nova Southeastern en accord avec le Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire, 8 e édition (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).
1. Sections de tissus Préparation des récepteurs autoradiographie
- Après le sacrifice, les tissus du cerveau frais de récolte, et envelopper dans du papier d'aluminium et placer dans un congélateur à -20 ° C le plus rapidement possible. Pour maintenir la forme correcte, placer le cerveau dans un moule du cerveau qui simule l'intérieur du crâne, envelopper dans du papier d'aluminium et placer dans un - 20 ° C congélateur. Au bout de 30 min, placer les tissus dans un sac de stockage de congélation et passer à un C congélateur -80 ° pour le stockage à long terme.
- Obtenir l'échantillon de tissus congelés frais d'intérêt de la décongélation -80 ° C congélateur, et le transfert à un cryostat fixé à un minimum de -10 ° C et un maximum de -18 ° C, pour éviter. Placer l'échantillon sur le tissu de montage avec un glycol et milieu d'enrobage à base de résine, que l'incorporation d'une petite partie de l'échantillon dans le milieu. Pour le cerveau, le cerveau est monté verticalement pour permettre sectionner dans le plan coronal.
- Placez le tissu de montage sur le microtome dans le cryostat et serrer fermement en place. Veiller à la gauche et le côté droit du cerveau sont les mêmes coordonnées antéro-postéro, et que l'axe dorso-ventral est atlas du cerveau perpendiculaire couramment utilisés.
- Commencer la coupe à l'épaisseur désirée (20 um recommandé) et de dégel monter les sections sur des lames de microscope dans une direction verticale par rapport à une surface supérieure de l'espace dans la glissière. Collecter des sections sur des lames dans des ensembles séquentiels de cinq, à savoir la première série de diapositives sont étiquetés 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 et 1-5 (Figure 3).
- Après avoir rempli une série de diapositives avec des sections, permettent des diapositives à l'air sec pour un maximum de 1 heure, puis placez le slides dans une boîte en plastique à glissière dans un sac de rangement congélateur auto-obturant, et conserver à -20 ° C.
2. Receptor autoradiographie
ATTENTION: Radioactivité. Utiliser des vêtements de protection pour manipuler la radioactivité. L'élimination est dépendait de l'établissement, et doit suivre les directives à la pourriture correctement (demi-vie de 60 jours) ou d'être repris par une entreprise certifiée.
- Retirez les "-1" et "-2" diapositives d'intérêt de la -20 ° C congélateur et monter dans les poignées de glissement (Figure 5). Monter les "-1" diapositives ensemble pour le traitement «non spécifique», et les «-2» diapositives pour le traitement «total». Bocaux «non spécifiques» contiendront 10 uM des concentrations finales de PD123319 un AT 2 R antagoniste, et losartan un AT 1 R antagoniste, dans un tampon de milieu d'essai (AM5) (tableau 1), le «total» des pots de liaison ne contiendront 10 uM PD123319 dans AM5.
- Inversez la diapositiveles poignées pour placer les lames dans les pots de Coplin de pré-incubation remplis de 35 à 40 ml d'AM5 et les inhibiteurs respectifs pendant 30 min à température ambiante. Démarrer les ensembles suivants dans leur bain de pré-incubation à des intervalles de 4 min.
- Transférer immédiatement les lames de la solution d'incubation préalable des expéditeurs de courrier d' incubation de diapositives, contenant 10 ml d'AM5, en plus d' une concentration prédéterminée de 125 I-IS-Ang II (calculé sur la figure 4) avec les inhibiteurs respectifs, pendant 60 à 90 min à la chambre température. S'il y a radioligand suffisante, 10 diapositives peuvent être placés (dos à dos) dans les poignées de glissement modifiées et incubées avec 125 I-SI-Ang II dans des bocaux Coplin.
- La place glisse de nouveau dans les poignées de glissement (si nécessaire), blot, et rincer en remuant doucement pendant 1-2 sec dans 400 ml d'eau distillée dans deux récipients séparés.
- Transférer les lames séquentiellement en quatre jarres de Coplin contenant 35-40 ml de AM5 pendant exactement 1 min chacun (comme illustré sur la figure 4 </ Strong>).
- Après le dernier rinçage 1 min, agiter doucement les sections pendant 1-2 secondes dans quatre changements d'eau distillée glacée.
- Séchez les lames avec de l' air frais (Attention: l' air chaud volatilise le composé radioactif) en utilisant quatre sèche-cheveux mis en place sous des angles différents pour 4 min (Figure 5), jusqu'à ce que toutes les sections sont secs, puis placer sur une serviette en papier.
- Mont glisse avec des tissus vers le haut sur un carton pour l'apposition d'un film radiographique en utilisant du ruban adhésif double face.
- Mont au moins un, 125 calibration Iode lame standard sur chaque carton (Figure 6).
Nota: Les étalons sont constituées de pâte de cerveau mélangé intimement avec 125 d' iode lié à un composé contenant un noyau phénolique, tassé par centrifugation dans une seringue de 1 ml de tuberculine, qui sont cryostat sectionnées à la même épaisseur que les sections de cerveau et de dégel monté sur un microscope diapositives. Alternativement, 125 étalons I dansrésine de plastique en coupe à 20 um d'épaisseur peut être obtenue dans le commerce. La résine plastique dans ces normes protège partiellement la pellicule à partir du rayonnement de telle sorte qu'une équivalence tissulaire de ~ 40% doit être pris en compte dans la calibration.
3. Film d'exposition et de développement
- Passez à une chambre noire avec une sangle-back cassette radiographique et le film d'autoradiographie. Ouvrez la cassette et placez le carton avec coulisse à l' intérieur (figure 6).
- Éteignez les lumières et allumez le inactinique. Ouvrez soigneusement la boîte de films X-Ray, retirer un film, et placez le côté brillant du film (avec la bord dentelé sur le coin en bas à droite) sur le dessus des diapositives de la cassette. Refermez soigneusement la cassette, et tordre les barres de verrouillage pour sceller la lumière (figure 6). Exposer les diapositives de plusieurs jours à plusieurs semaines à -20 ° C.
- Dans la chambre noire, ouvrir la cassette et procéder au développement de films process.
- Placer les lames dans les bacs consécutifs; développeur pendant 2 min, de l'eau contenant 5% d'acide acétique glacial pendant 30 s et fixer pendant 5 min. Les films sont les placés dans un bac avec de l'eau courante pendant 20 min, puis placés dans Photoflo pas plus de 10 secondes et accroché.
Remarque: Le temps d'exposition est déterminée empiriquement et peut impliquer plusieurs films avec différents temps d'exposition: assez longtemps pour obtenir des signaux mesurables à partir des zones à faible liaison, mais pas aussi longtemps que pour saturer le film par des zones à forte liaison. Une fois l'exposition acceptables sont obtenus, puis passez à l'étape suivante.
- Placer les lames dans les bacs consécutifs; développeur pendant 2 min, de l'eau contenant 5% d'acide acétique glacial pendant 30 s et fixer pendant 5 min. Les films sont les placés dans un bac avec de l'eau courante pendant 20 min, puis placés dans Photoflo pas plus de 10 secondes et accroché.
4. histologie
- Préparer la tache de la thionine et de réactifs de coloration (Tableau 2, figure 7).
- Placer les lames "-3" dans la grille coulissante, et le transfert dans un ordre séquentiel en commençant avec de l'eau déminéralisée pendant 1 min, puis la thionine solution de colorant pendant 10 minutes suivie de trois trempettes dans Deionles eaux lisés, et un lavage de 30 secondes dans de l'eau déminéralisée.
- Après l'eau, placez la grille coulissante dans des lavages à l'éthanol comme suit; 50%, 70% et 90% pendant 30 secondes, suivi de deux lavages à l'éthanol à 100% pendant 1 min à chaque fois. Enfin, placer la grille coulissante dans le xylène pendant 3 min, puis les transférer vers une deuxième solution de xylène pendant 5 min.
- Retirer une diapositive à la fois dans le dernier bain de xylène, et couvrir le bord supérieur de la lame avec une base de résine dans un solvant organique milieu de montage, et placer un 24 mm x 60 mm lamelle sur la lame. Laisser les lames suffisamment sec pour ~ 48 h et ensuite numériser dans l'ordinateur à 2400 dpi en niveaux de gris.
5. densitométrique Analyse d'image
- Placez le côté brillant du film vers le bas, avec le bord dentelé sur le coin inférieur gauche et numériser à l'aide d'un scanner exclusif capable de transmettre les informations de densité de film sans aucune distorsion dans l'ordinateur du système d'imagerie.
- Ouvrez le fichier sys d'imagerie propriétairessystème et d' utiliser les barres d'étalonnage pour établir des normes d'étalonnage pour la future analyse densitométrique des images sur le film (figures 9 - 12).
- zones de mesure de l'intérêt soit par l'établissement d'un modèle ou décrivant de manière empirique les domaines d'intérêt. Les données sont collectées et la séparation basée sur le film, soit le contrôle ou de type sauvage (section), et de la région. Assurez - vous d'inclure la densité (fmol / g), la zone d' analyse, et de la zone cible totale dans les mesures (Figure 9).
- Ajuster les barres de la zone de balayage en assurant que la région d'intérêt se situe entre les paramètres de mettre en évidence (figure 10).
- Exporter des données dans une feuille de calcul (tableau 4). Multiplier les temps de densité de la zone cible totale, puis diviser par la zone de numérisation afin d'obtenir la valeur de la liaison de cette zone spécifique. Une fois que cela est fait pour toutes les valeurs mesurées, le substrat non spécifique établie à partir totale pour obtenir le p de liaison spécifiqueressentiment. Les moyennes peuvent également être réalisées pour ces valeurs.
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Representative Results
La vue d' ensemble de la voie métabolique du système rénine-angiotensine est représenté sur la figure 1 et la mise au point directe sur les sous - types de récepteurs de l' angiotensine II (AT 1 R et AT 2 R) est décrite dans la figure 2. La figure 3 montre le transfert de cerveau coronale sections sur des lames de microscope, qui sont ensuite à travers une procédure de autoradiographie de récepteur en utilisant une concentration de 125 I-Siang II prédéterminée comme on le voit sur la figure 4. la figure 5 illustre l'étape de séchage pour les diapositives du autoradiographie des récepteurs qui sont ensuite apposées sur un carton comme vu sur la figure 6, et par la suite mis au point. le tableau 2 énumère les réactifs utilisés pour la procédure de coloration thionine pour des coupes de tissus les diapositives montées décrites dans la figure 7. unités standard d' étalonnage pour la quantification sont déterminées based à la date de l'essai comme on le voit dans le tableau 3. La figure 8 montre la mise en place d'une courbe standard concernant 125 I concentration (fmol / g de tissu) pour filmer l' exposition (densité optométrie relative). Figure 11 illustre la distinction entre «NSP» et les groupes «totaux», ainsi que les étiquettes de tissu, tandis que la figure 10 décrit le réglage du seuil à une valeur proche de zéro pour obtenir une valeur moyenne précise pour l' ensemble de la zone balayée (Area-de pixel scan). le tableau 4 présente la quantification processus d'obtention de la liaison spécifique basée sur la soustraction de la «non spécifique» des valeurs «total». «Non spécifique» de liaison qui contient losartan et / ou PD123319 est créé par la quantité de radioligand lié à la non-AT 1, ou AT 2 récepteurs. Tout le radioligand lié à récepteurs AT 1 , en présence de PD123319 donne le «total» de liaison. F igure 11 affiche les zones de mesure finale de la PVN au total par rapport à la liaison non spécifique à une section adjacente colorée de thionine pour la confirmation anatomique du NPV.
Figure 1:. Voie métabolique de l'angiotensine rénine (RAS) dans le corps Le foie libère l'angiotensinogène zymogène, qui est clivée par la rénine rénale sécrété, en formant de l' angiotensine I. L' angiotensine enzyme de conversion (ACE) convertit l' angiotensine I en angiotensine II ( Ang II), le principal précurseur des maladies cardiovasculaires. Ang II provoque une vasoconstriction et augmente la pression artérielle, le débit cardiaque, l' appétit pour le sel, la soif et la rétention d'eau. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Fonctions du type Angiotensin 1 et 2 récepteurs (AT 1 R, 2 R) AT 1 R affecte pathologiquement les maladies cardiovasculaires, agit directement pour augmenter la soif et l' appétit pour le sel, et exerce de nombreuses autres activités cellulaires périphériques ainsi que le centre effets psychologiques. AT 2 R est un antagoniste physiologique du récepteur AT 1, l' aide à l'efficacité de l' AT 1 R 36 antagonistes ayant ainsi des effets bénéfiques sur la structure vasculaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Cryosectioning du cerveau sur des lames de microscope à 20 um d' épaisseur. En fonction de la température du cryostat, les sections seront parfois afficher des plis, des fissures, le curling, ou devenir compacté sur la lame de microtome ou porte-couteau. Dans ce cas, la section est rejetée et une note est faite pour indiquer que un supplément de 20 um sépareront cette section de la section précédente. Les articles doivent être recueillies sur des lames dans une direction verticale afin de maximiser la surface totale nécessaire pour remplir un chariot et donc de recueillir la plus grande quantité de sections sur chaque diapositive. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Sample of Experimental Design & Protocole pour Receptor autoradiographie Differentiation de «total» (-2) et «non spécifique» (-1) est directement liée à la présence et l'absence de sous-type de l'antagoniste du récepteur. Protocole peut varier en fonction du nombre de diapositives, et augmentera par tranches de 2 pour chaque paire de diapositives totales et non spécifiques. concentration de radioligand, préalablement déterminée est obtenue par dilution du stock en AM5. Cette solution est ensuite réparti uniformément dans les récipients d'incubation. Les comptages directs sont prises avant et après incubation pour établir la concentration exacte du radioligand. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Configuration pour la station de séchage dans autoradiographie de récepteur Les temps de séchage varient en fonction de l'efficacité du coupsèche-linge, ainsi que la capacité à effacer l'écart tout excès d'eau après les dernières rinçages. Diapositives sera séché une fois que la section passe du clair au blanc. Si les lames ne sont pas complètement séchées puis le radioligand peut diffuser à distance du récepteur produisant une image floue qui ne sont pas spécifiques pour les sites de liaison au récepteur. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:.. Exposer lames traitées à un film de rayons X en utilisant une cassette spécialisée Diapositive set-up est recommandé de suivre un modèle où la comparaison des deux groupes est facilitée S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: Mise en place pour la thionine Coloration. Les lames sont chargées dans un support de diapositives et immergés dans des solutions séquentielles. Timing permet la coloration efficace de la substance Nissl (réticulum endoplasmique rugueux) des neurones. Une application milieu de montage pour les diapositives suivantes déshydratation permet la fixation de la lamelle à la diapositive, en préservant les sections pour l' analyse comparative. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8:. Réglage du standard d'étalonnage Chaque film contient les standards de calibrage individuelles, basées sur la pâte du cerveau et le moment où l'expérience a été effectuée . Une droite de régression qui décrit les meilleures valeurs d'ajustement est généré par un programme de système d'imagerie exclusif pour les standards de pâte de cerveau mesurées. Ceci convertit la densité optométrie (ROD) la valeur relative des normes d'étalonnage (de stds cal, dans l'ovale rouge) aux unités de radioligand de liaison, dans cet exemple, les unités (fmol / g, entouré en rouge) sont radioligand fmoles lié par gramme de mouillé le poids de tissu (fmol / g). La mesure des normes de pâte du cerveau se fait avec l'outil circulaire et placé au milieu de l'échantillon représenté sur la droite dans pseudocolor en utilisant l'icône de vue de l'image (entouré en rouge). Le cercle de mesurer l'étalon n'a pas à couvrir l'ensemble de l' échantillon, mais plutôt mesurer une même zone de la norme. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 9:. L' identification des groupes par numéro d'échantillon, non spécifique / total, et les régions pour les mesures d'échantillons Parce que plusieurs cerveaux, les régions du cerveau, et plusieurs groupes expérimentaux sont quantifiés ensemble, il est essentiel de faire la différence entre tous les facteurs. Le sujet indique l'échantillon de cerveau et peut également indiquer un groupe; la section indique si elle est non spécifique (PNS) ou totale, tandis que la région permet l'identification de plusieurs régions du cerveau qui sont en cours d'échantillonnage. La barre d'outils de l' échantillon (rectangle rouge) décrit les différents outils d'échantillonnage, par exemple, cercle, carré, modèle, freehand, gomme; qui peuvent être utilisés pour délimiter la zone à mesurer. Les valeurs de ROD obtenues dans la zone de l'outil d'échantillonnage sont enregistrées sur la feuille de calcul comme des unités converties de liaison, fmol / g (entouré en rouge). En outre, la zone de numérisation totale dans l'outil d'échantillonnage est enregistré dans la colonne "Scan zone-pixel" tandis que le total tzone Arget (le nombre de pixels qui dépassent la valeur de seuil (décrit dans la figure 10 légende) est enregistré dans la colonne "Total Tgt Area-pixel". S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 10: Détermination du seuil pour les échantillons à mesurer sur la base des normes La zone de numérisation est unique pour chaque film, et dépend des normes établies.. Utilisation de l'outil de seuillage (entouré en rouge) pour définir des valeurs de seuil pour la plage de densité pour la zone de numérisation en fmol / g permettra les zones mesurées (délimitée par des flèches en diagonale) à tomber entre une plage de 0, jusqu'à un point où la courbe d'étalonnage commence à asymptote indiquant que le film est sur le point d'une exposition maximale au delà de laquelle plus
Figure 11: Des images représentatives de autoradiographie de récepteur se liant à des coupes coronales d'un rat spontanément hypertendu femelle (SHR) à ~ 1,8 mm caudale à bregma, affichant le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus (PVN) et le noyau du lit de l'accessoire tractus olfactif (BAOT .) (A </ strong>) Total liaison de AT 1 R de liaison (Rouge- PVN, Yellow- BAOT). (B) La liaison non spécifique avec le losartan (AT1R antagoniste) et PD123319 (AT2R antagoniste). Liaison (C) Total des AT 1 R liaison avec la mise en un tel seuil arbitraire à délimiter la forme du PVN (remplissage noir) dépassant la valeur de seuil dans la zone de numérisation qui est enregistré en tant que Secteur total TGT). (D) thionine tachée section pour confirmation anatomique des structures montrant haute liaison totale, et à titre de comparaison avec d' autres régions du cerveau ou d' autres groupes expérimentaux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Réactifs | Montant |
| NaCl | 8,76g |
| Na2EDTA | 1,86 g |
| bacitracine | 141 mg |
| 500 mM dibasique Na 2 PO 4 | 100 ml |
| Distillée Eau déminéralisée | 900 ml |
| Ajuster le pH à 7,1 à 7,2 avec du NaOH ou du HCl | |
Tableau 1: Assay Medium (AM5) Les composants chimiques du tampon utilisé dans la préparation des tissus..
Tableau 2:. Thionine Stain réactifs La tache thionine se compose d'eau distillée, 1,0 M d' acétate de sodium et d'une solution 1,0 M acide acétique glacial, titrée à un pH de 4,3 avant l'addition d' une solution à 0,5% thionine.
| Jours passés date de référence | |||||||||
| Lot | fmol / g de poids humide | Ref date de | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Standard | nCi / mg | fmol / g | dpm / g | fmol / g | fom / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g |
| nombre | 30 mai | 30 mai | 30 mai | 30 mai | 31-mai | 1-Jun | 2-Juin | 3-Juin | 4-Juin |
| 1 | 9706 | 4463 | 21547320 | 4463 | 4411 | 4361 | 4311 | 4261 | 4212 |
| 2 | 5838 | 2684 | 12960360 | 2684 | 2653 | 2623 | 2593 | 2563 | 2533 |
| 3 | 2798 | 1286 | 6211560 | 1286 | 1272 | 1257 | 1243 | 1228 | 1214 |
| 4 | 1451 | 667 | 3221220 | 667 | 659 | 652 | 644 | 637 | 630 |
| 5 | 787 | 362 | 1747140 | 362 | 358 | 354 | 350 | 345 | 342 |
| 6 | 385 | 177 | 854700 | 177 | 174 | 173 | 171 | 169 | 167 |
Tableau 3:. Calculs Daily Decay Rate pour les normes d' étalonnage Une feuille de calcul de taux de décroissance quotidien pour les normes d'étalonnage devra être créé sur la base des dates auxquelles l'expérience a été réalisée. Cette feuille de calcul est basé sur la première vitesse constante avec une demi-vie (t ½) de 60 jours pour. N = N 0 * e kt, où N = concentration de 125 I, à l' instant t par rapport à la concentration à l' instant 0 (N 0), et k = ln2 / t 1/2.
| Paraventriculaire nucleous de l'hypothalamus | Cible | Densité-fmol / g | Zone de numérisation | Superficie totale cible | Total* | |
| Total | 1 | 996 | 4383 | 4383 | 996 | |
| Total | 2 | 921 | 3362 | 3362 | 921 | |
| Total | 3 | 818 | 3445 | 3445 | 818 | Liaison spécifique |
| Total | 4 | 710 | 2906 | 2906 | 710 | 967 |
| MOYENNE | 861 | 3524 | 3524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ Tr>||||||
| Section | Cible | Densité-fmol / g | Zone de numérisation | Superficie totale cible | Non spécifique * | 678 |
| NSP | 1 | 53 | 3072 | 1737 | 30 | 826 |
| NSP | 2 | 52 | 2959 | 1455 | 26 | |
| NSP | 3 | 86 | 3180 | 2035 | 55 | |
| NSP | 4 | 53 | 3293 | 1,995 | 32 | |
| MOYENNE | 61 | 3126 | 1,805.5 | 36 | ||
| Nucleus lit du Olfac Accessoiretory Tract | ||||||
| Section | Cible | Dens-fmol / g | Zone de numérisation | Superficie totale cible | Total* | |
| Total | 1 | 439 | 3632 | 3632 | 439 | |
| Total | 2 | 435 | 3632 | 3632 | 435 | |
| Total | 3 | 355 | 3632 | 3620 | 354 | |
| Total | 4 | 435 | 3632 | 3631 | 435 | Liaison spécifique |
| Total | 5 | 342 | 3632 | 3630 | 342 | 414 |
| Total | 6 | 334 | 3632 | 3606 | 331 | 393 |
| MOYENNE | 390 | 3632 | 3625 | 389 | 321 | |
| 394 | ||||||
| 315 | ||||||
| Section | Cible | Dens-fmol / g | Zone de numérisation | Superficie totale cible | Non spécifique * | 320 |
| NSP | 1 | 49 | 3632 | 1846 | 25 | 360 |
| NSP | 2 | 64 | 3632 | 2362 | 42 | |
| NSP | 3 | 53 | 3632 | 2275 | 33 | |
| NSP | 4 | 64 | 3632 | 2339 | 41 | |
| NSP | 5 | 51 | 3632 | 1,879 | 26 | |
| NSP | 6 | 41 | 3632 | 966 | 11 | |
| MOYENNE | 54 | 3632 | 1.945 | 30 | ||
| * Total et non speciic sont des unités de densité de fmol / g. | ||||||
| Total = densité * zone cible total / zone de numérisation | ||||||
| = Densité * zone cible totale / zone de numérisation non spécifique | ||||||
| Zone cible totale est de pixels qui ont dépassé la valeur de seuil, définies comme près de 0,00 fmol / g que possible. | ||||||
| Pixels ne dépassant pas le seuilvaleur reçoivent une valeur de 0 pour l'évaluation de la densité totale. | ||||||
| Pixels ne dépassant pas la valeur de seuil reçoivent une valeur de 0 pour l'évaluation de la densité non spécifique. | ||||||
| La liaison spécifique est totale non spécifique moins liaison exprimée en unités de densité de fmol / g. | ||||||
Tableau 4: Analyse quantitative du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus et lit noyau de l'accessoire olfactif des voies données sur les exportations de logiciels d'imagerie comme une feuille de calcul dans fmol / g, zone de numérisation, et la zone cible totale en pixels.. «Non spécifique» est soustrait liaison du «total» de liaison afin d'obtenir le spécifique AT 1 quantitative liaison.
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Discussion
Le protocole décrit identifie la visualisation de «total» et «non spécifique» de liaison du radioligand dans des sections adjacentes de coupes coronales d'un cerveau de rongeur précédemment récolté et stocké à -80 ° C, et peut être facilement applicable à pratiquement tous les tissus qui a anatomiquement résolu substructures qui affichent des montants différentiels des récepteurs ou des sites de liaison de radioligands. Les procédures décrites dans le protocole sont simples et l'analyse est essentielle pour interpréter correctement les résultats. L'épaisseur de 20 um a été déterminé comme étant optimal; si la section est trop épaisse, la liaison non spécifique augmentera, ce qui rend difficile la résolution de la liaison du radioligand à sa cible. Si la section est coupée plus mince, il devient difficile de couper avec succès et enregistrer des sections séquentielles sans distorsion. La température de coupe optimale varie légèrement en raison de la nature du tissu et de l'épaisseur des sections et des is habituellement déterminée empiriquement. Une fois que le contact est établi entre la lame et le tissu, l'orientation de l'échantillon peut être examiné, et réaligné en déplaçant l'échantillon de tissu arrière de la lame, et en réorientant le ballon de montage. Lors de la coupe d'un cerveau de rongeurs, il est essentiel de veiller à la gauche et le côté droit du cerveau sont les mêmes coordonnées antéro-postéro, et que l'axe dorso-ventral est atlas du cerveau perpendiculaire couramment utilisés. ensembles de diapositives sont pré-étiquetés afin de mener des études sur des sections adjacentes de tissus. Les premières séries de 5 lames sont étiquetés 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 et 1-5. La première section de coupe va à la diapositive 1-1 dans le coin supérieur gauche (ce qui est le coin supérieur droit de la diapositive quand il est côté dépoli vers le bas); la deuxième section de coupe va à la diapositive 1-2, etc. La cinquième section de coupe va à la diapositive 1-5. La section sixième coupe va à la diapositive 1-1 à la gauche de la première section. Après la première série de diapositives est rempli, commencer une autre série de 5 glissées, marqué 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 et 2-5. Ce cycle se poursuit aussi loin dans le cerveau que nécessaire. Le "4" et "-5" diapositives sont gardés comme une sauvegarde ou pour radiomarquer un récepteur différent.
Le protocole de l'autoradiographie du récepteur dépend du radioligand utilisé et les caractéristiques des récepteurs étant sondé pour déterminer les concentrations des tampons, des sels et des inhibiteurs. Pour la mesure du sous - type de récepteurs AT1 Ang II dans cette procédure, un ligand marqué de haute affinité d' iode-125, 125 I-Sar 1 Ile 8 -Ang II (125 I-SI-Ang II); radiomarqué par Robert C. Speth, Ph.D. (Peptide iode radioactif ressource partagée, Georgetown University), qui est également disponible dans le commerce) sont dissous dans du tampon AM5 (tableau 1); un tampon phosphate de sodium avec du chlorure de sodium, l'EDTA et la bacitracine. AM5 offre une bonne protection du radioligand de métallopeptidases et peptida de bacitracine-sensiblesSES fournissant un pH physiologique et de la concentration de NaCl pour optimiser les caractéristiques de liaison. La pré-incubation dans AM5 expose les sections de tissu pour les inhibiteurs de peptidase pour minimiser la dégradation de radioligand, ainsi que l'Ang II dissocie endogène des récepteurs de l'angiotensine II. Losartan et PD123319, AT1R et AT2R antagonistes, respectivement, qui saturent les récepteurs cibles sont ajoutées à des concentrations (10 pM) pour empêcher le radioligand de se lier à ces récepteurs pour évaluer la liaison non spécifique et limiter la liaison au récepteur AT1 spécifique, respectivement. La concentration souhaitée de 125 I-SI-Ang II pour le dosage est déterminée et la dilution requise de la solution mère est déterminée à partir d' une feuille de calcul du taux de décroissance de radioisotopes (voir protocole tableau 3). Une concentration optimale de radioligand une approximation de la valeur de KD est utilisé qui occuperait 50% des récepteurs présents. Cependant, parce que radioligands peuvent être coûteuses concentrations plus faibles e.g. 10 à 20% de la concentration en K D peut être utilisé. Ceci présente un avantage potentiel d'augmenter le rapport signal à bruit en réduisant une liaison non spécifique de plus de la liaison spécifique. Cependant, de plus longues durées d'exposition sont nécessaires pour développer une image de la liaison. Comme indiqué ci-dessus (section 3.4), si l'exposition obtenue est au-dessus ou sous-exposée, les diapositives peuvent être ré-exposés à un nouveau film pour une plus courte et / ou plus de temps pour obtenir l'exposition souhaitée.
l'analyse densitométrique de l'image peut être faite par un système d'imagerie de propriété industrielle qui fournit un recueil détaillé des applications pour autoradiographie, ainsi que d'autres applications. Les étalons sont en fmol / g de poids de tissu humide (en supposant une densité de l'autre pour le tissu). Chaque ensemble standard, avec un arrière-plan va générer une courbe standard. Il existe plusieurs algorithmes d'ajustement de courbe avec et sans pondération disponible pour générer une courbe standard de la d optométrie par rapportensité (ROD) des valeurs pour les différentes normes d'étalonnage. Sélection de la courbe qui représente le mieux les données se fait empiriquement que le sous-programme pour la courbe de montage ne fournit pas les valeurs d'erreur relatives pour les différentes courbes standard. A RODs jusqu'à ~ 0,6, la courbe standard est pseudolinear. Cependant, le film commence à saturer au-delà de ce point formant une courbe qui Asymptotes environ 0,8 à 0,9 unités de ROD. Si les normes qui sont bracketing les échantillons sont au-dessus des unités 0,9 ROD, il est recommandé de ré-exposer le film pour une courte période de temps pour obtenir des valeurs plus fiables de fmol / g de liaison des échantillons plus près de la plage de pseudolinear de la norme courbe. Les valeurs dérivées à cet extrême de la courbe standard se traduira par de petites différences dans ROD pour significativement plus grandes différences de radioligand de liaison. D'où la possibilité de détecter les changements dans des baisses de liaison que le film se rapproche de son point de saturation.
Pour les mesures de régions spécifiques,les mesures recommandées sont «Densité» en fmol / g, «zone Scan» en pixels, et «zone cible totale» en pixels (figure 9). Il est important de définir une valeur de seuil aussi proche de zéro que possible (figure 10) en raison des variations de densité de film ou l'aspect arbitraire de la courbe standard dérivée des normes d'étalonnage peuvent parfois donner des valeurs inférieures à zéro. Si ces valeurs sont en moyenne pour tous les pixels dans la zone de numérisation ne retirerait une valeur artificiellement bas. Les critères utilisés pour identifier les domaines avec la liaison peut être très subjective, il est donc préférable de jumeler étroitement le contrôle et les cerveaux expérimentaux autant que possible afin de réduire l'incidence des erreurs subjectives. Un autre défi est de décider combien de sections à la moyenne pour obtenir une lecture finale. Une bonne indication des sections à analyser peut être déterminée en suivant un atlas acceptées de cerveau de rat, ainsi que les lames d'histologie colorées. La taille de la zone d'échantillonnage peut également être unproblème. Pour compenser, un modèle peut être établi pour corriger les écarts de taille. Le traitement des sections pourrait aussi affecter une zone de la structure qui a élevé de liaison et doivent être considérés lors de l'analyse. Cela nécessite une utilisation alternative de l'outil «seuillage» dans le système d'imagerie exclusif pour définir une plage de densité supérieure à une valeur arbitraire, de façon à représenter des caractéristiques anatomiques de la région du cerveau en cours d'échantillonnage telle que le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus dans un outil d'échantillonnage qui englobe la région d'intérêt (Figure 11, panel C). Il est également possible d'inclure la mesure de surface dans la détermination de la quantité de liaison. Cela peut être fait en multipliant la valeur de temps de liaison spécifique du nombre de pixels qui ont été mesurés. Les pixels peuvent être converties en unités métriques en imageant une règle dans deux plans, ou d'un rectangle de dimensions connues. Le nombre de pixels qui correspondent à lalongueur ou aire du rectangle peuvent alors être exprimées en unités métriques. À 2400 dpi, ~ 9.000 pixels = 1 mm 2 dans notre système.
Bien que l'utilisation de ligands radioactifs est plus une technique largement utilisée; il est l'un des rares moyens de visualiser la distribution physique des récepteurs dans le tissu des spécimens eux-mêmes comme fonctionnelle (capables de se lier son ligand innée). En outre, il peut quantifier le nombre de récepteurs pour permettre l' évaluation des changements dans l' expression des récepteurs fonctionnels entre les groupes de traitement, entre les différentes régions du cerveau ou d' autres structures, entre les différentes souches d'animaux ou d' animaux d'âges différents, etc. D' autres méthodes sont disponibles pour caractériser aspects neuroanatomiques de AT 1 l' expression du récepteur, cependant, ils ont une valeur limitée. L'hybridation in situ de l' ARNm pour récepteurs AT 1 ne correspond pas toujours avec des récepteurs AT 1 expression ou de la distribution dans lecerveau. Bien que les techniques immunologiques peuvent se rapprocher des différences dans l'expression du récepteur sur la base de l'intensité de la coloration des coupes de tissus, il est impossible de générer une courbe standard pour la coloration afin de permettre une détermination numérique de l'expression du récepteur. Autoradiographie du récepteur fournit également un degré de spécificité pour les récepteurs (ou d'autres cibles qui se lient spécifiquement à des radioligands) qui ne peut être garantie en utilisant des techniques immunologiques. En 2009, une série d'articles ont été publiés 37-43 qui remettait en question la validité des 49 anticorps qui ont été utilisés pour évaluer 18 G récepteurs couplés aux protéines différentes et un canal transitoire potentiel de récepteur (TRP). En substance, les anticorps marqués bandes identiques sur western blots de type sauvage et des souris knock-out pour les récepteurs en question. Par la suite, plusieurs groupes ont fait des observations similaires à l' aide disponible dans le commerce AT 1 et AT 2 anticorps anti-récepteur 44-49. L'utilisation d'un bactérial chromosome artificiel qui génère une molécule rapporteur, par exemple, la protéine fluorescente verte, entraînée par le AT1 promoteur est un moyen indirect de déterminer la présence ou l' absence d'AT 1 de cellules exprimant le récepteur de souris (mais pas chez le rat) , le cerveau en fonction de leur présentant fonctionnel AT promoteur 1 récepteur 50. Il est possible de compter «cellules positives» dans des régions cérébrales identifiées microscopiquement, mais pas pour quantifier les changements dans l'intensité de l' expression du récepteur AT 1 dans ces régions. Ainsi, à cette époque, les techniques ne validées que disponibles pour mesurer directement l'expression du récepteur Ang II sont radioligand méthodes contraignantes. Et, si la résolution anatomique fonctionnelle AT 1 protéine réceptrice est nécessaire à un niveau microscopique, autoradiographie des récepteurs est la seule technique disponible pour une telle mesure directe.
Receptor autoradiographie est pas sans limites. Le concer majeurn est que de répondre aux exigences d'utiliser des matières radioactives dans un cadre de recherche. Il est nécessaire d'avoir un programme de sécurité de rayonnement avec des directives strictes en place pour assurer la sécurité des chercheurs qui travaillent avec des matières radioactives et la disposition sécuritaire des matières radioactives. Cette escalade du coût de la recherche en utilisant des matières radioactives à un point qui empêche leur utilisation dans de nombreux contextes de recherche. En outre, le coût de radioligands peut être considérable. Ainsi, une expérience de autoradiographie de récepteur dans lequel un grand nombre de coupes de tissus diapositives montées sont incubés dans des contenants de radioligand peut utiliser des centaines, voire des milliers de dollars de radioligand. Une autre limitation est que les tissus doivent être congelés avant la coupe sur un cryostat, stockées pendant une période de temps, et a rapidement rincé et séché après incubation avec le radioligand, qui peuvent nuire à la capacité des récepteurs ou des protéines d'intérêt pour lier le radioligand . Pour des ligands qui ont le cul rapideociation cinétique / de dissociation, il peut être impossible de maintenir la liaison du radioligand au récepteur pendant le temps nécessaire pour rincer le radioligand non lié spécifiquement. En outre, avec de faibles quantités de longues périodes d'exposition du film de liaison de radioligand - un mois ou plus - peut être nécessaire avant une image mesurable peut se former sur le film. Un autre défi est que l'addition de l'iode-125 à un ligand peut altérer la capacité du ligand à se lier à son récepteur ou d'une protéine cible en raison d'un empêchement stérique. L'utilisation d'une petite molécule, par exemple, le tritium (3 H) élimine le problème de l' encombrement stérique, mais le tritium a une telle énergie et une faible activité spécifique ( par rapport à l' iode-125) , qu'il est extrêmement difficile de générer une image de film pour la plupart populations de récepteurs. À la lumière de ces questions, il y a beaucoup de situations dans lesquelles autoradiographie de récepteur est incapable d'identifier des récepteurs ou d'autres structures moléculaires d'intérêt.
Malgré sa limitations, autoradiographie de récepteur peuvent identifier des structures spécifiques au sein d' un tissu, par exemple, les régions du cerveau modifiées en réponse à des variables expérimentales par rapport à un cerveau de contrôle normal. Cette connaissance peut aider à déterminer le rôle de l'AT 1 R pour l' Ang II ou d' autres récepteurs ou des enzymes dans la pathologie de la maladie. Cette connaissance a des implications pharmacologiques intéressantes, car elle indique les zones à cibler pour des thérapies potentielles.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
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