Abstract
이 프로토콜은 중앙 II 수용체 수용체 방사 법적 매핑을 수행하기위한 특정한 방사성 리간드를 사용하여 쥐의 뇌에서 안지오텐신 II (중앙 II)에 대한 수용체 결합 패턴을 설명합니다.
조직 표본 채취 및 -80 ° C에 저장됩니다. 그라 이오 스탯은 coronally 섹션에 조직 (뇌)를 사용하고 충전 슬라이드에 섹션을 장착 해동. 슬라이드에 장착 된 조직 섹션은 중앙 II 수용체를 방사성 표지 125 I-SI-중앙 II에서 배양된다. 인접한 슬라이드 두 가지로 구분된다 : 수용체 포화 비 방사성 중앙 II의 농도 또는 존재하에 (NSP)를 '비특이적 결합을'1 중앙 II 수용체 아형 AT (1 R AT) 선택적 중앙 II 수용체 길항제 , 1 R 길항제 없음으로 '결합되지 합계'. 이 중앙 II 수용체 아형 AT (2 AT R)의 포화 농도의 길항제 (PD123319, 10 μM)도 incubati에 존재버퍼에 AT (1) R 하위 유형에 결합하는 125 I-SI-중앙 II를 제한합니다. 22 ° C가, NSP 슬라이드 10 μM PD123319과 로사 르탄에 노출되어 ~에서 30 분 사전 부화 중에 슬라이드 10 μM PD123319에 노출되는 '바인딩 합계'있다. 슬라이드는 '결합 합계'위한 PD123319의 존재하에 125 I-SI 중앙 II와 함께 배양하고, 분석 완충액에 NSP위한 PD123319과 로사 르탄, 여러 '세척'다음 완충액 및 물을 염과의 비를 제거한다 특히 방사성 리간드를 결합. 슬라이드는 전문 필름 카세트를 사용하여 다음자가 방사선 필름에 노출 타격 건조기를 사용하여 건조된다. 필름을 현상하고 이미지 독자적인 영상 시스템 및 스프레드 시트를 사용하여 시각적이고 정량적 농도계위한 컴퓨터로 스캐닝된다. 슬라이드의 추가 설정은 조직 학적 비교를 thionin 염색된다.
수용체자가 방사선을 사용하는 장점은 시각화하는 능력이다중앙 II 티슈 시험편의 단면 내의 시츄 수용체 및 해부학 인접한 조직 학적 기준 단면과 비교하여 조직의 영역을 식별한다.
Introduction
심혈관 질환 2011 년 1 년 미국에서 사망의 30 % 이상을 일으키는 원인이 미국에서 사망과 장애의 주요 원인이되고 있습니다. 미국 심장 협회 (American Heart Association)에서 가장 최근의 통계는 세 개 이상 한 사람이 하나가 나타냅니다 심혈관 질환의 이상 유형입니다. 심장 혈관 연구는이 질병을 이해에 진전을 만들기 위해 계속되지만 세대가 나이가 점점 시작으로 이러한 노력을 계속하는 것이 필수적이다. 레닌 - 안지오텐신 시스템 (RAS)는 주로 (도 1) 2-8 교감 신경계의 동맥 경화, 염증, 전신 혈관 수축 및 활성화를 촉진하여 심혈 관계의 조절에 중요한 역할을한다.
RAS 장치 혈압 감소하는 신장의 방 사구체 세포 응답하여 혈류로 레닌 분비 될 때 활성화되는 호르몬 시스템, sympat 증가hetic 자극, 또는 황반 densa에 의한 나트륨의 흐름을 감소. 레닌 안지오텐신 I (ANG I)을 형성 (간에서 합성) 안 지오 텐시 노겐을 대사. 중앙 I는 안지오텐신 II (ANG II) 상기 RAS의 주요 이펙터 펩타이드를 형성하기 위해, 주로 폐, 신장, 혈관 내피 세포의 내강 측에, 안지오텐신 전환 효소 (ACE)에 의해 ectoenzyme을 대사한다. 중앙 II는 두 개의 수용체 아형을 활성화 할 수있다; (1 AT R) 타입 1 수용체 (2 R AT) 2 형 수용체는 심장 혈관 시스템을 조절하는 모두, 유체 및 전해질 항상성을 유지하고 지금은인지 기능 및 신경 퇴행성 질환에 영향을 미치는 것으로 간주됩니다 8,9을 처리합니다. 로컬, 뇌 특정 RAS는 독립적으로 중앙 II를 합성보고됩니다. 뇌에서, 전구체 단백질 지오 텐시 노겐는 레닌과 같은 효소 I (3) 중앙으로 변환 별아교 세포 (10)에서 합성되고, 아마도 prorenin prorenin 수용체에 결합(11)이어서 풍부 뇌 12 뉴런의 세포 표면에 발현되는 안지오텐신 전환 효소에 의해 중앙 II로 전환. 중앙 II 생성이 intrabrain 1 AT 뇌에 대한 혈액을 매개로 중앙 II 분리되어 2 수용체에 작용 물질이다.
상기 한 R 중요한 생리 학적 역할을하지만, 더 나은 주로 심혈관 및 신장 (도 2)에 영향을 몸 전체의 병태 생리 학적 효과로 알려져있다. 중앙 II는 AT (1) R에 결합하면 혈관 수축의 원인; 혈류에 대한 저항을 증가시키고 혈압을 올리는. 또한, 증가 된 나트륨 및 보수성 선도 및 바소프레신 알도스테론의 합성 및 분비를 촉진한다. 이러한 효과는 허혈성 뇌 손상 및인지 장애를 유발할 수 있으며, 파킨슨 병, 알츠하이머 병에 연결되며, diabeTES, 최근에 발견 된뿐만 아니라 학습과 기억 13-15에 영향을 줄 수 있습니다. 신장의 방 사구체 세포에 1 R AT 점에서 RAS의 피드백 루프는 레닌 분비가 억제됩니다. 흥미롭게도, AT (2) R은 일반적으로 1 R AT, 많은 다른 16 ~ 20 사이에서 혈관 확장, 신경 돌기의 가지, 축삭 재생, 항 증식 및 cerebroprotection의 원인의 조치를 반대 조절한다. 상기 R 2는 항 고혈압 최근에는 항암제 (21) 타겟으로서 확인되었다. 다양한 조직 내에서 중앙 II 수용체의 현지화 및 밀도를 결정하는 방법 그들은 RAS 특정 질병의 역할을 파악하는 데 도움이됩니다 양적 농도계 수용체자가 방사선을 사용하여 다양한 트리트먼트와 질병 상태에 의해 영향을받습니다.
수용체자가 방사선는 안지오텐신 I의 존재를 지시하기위한 효과적인 방법으로서 30 년 이상 사용되어왔다I 수용체와 뇌에서 RAS의 다른 구성 요소와 실험 조건 22-34의 다양한에서 쥐, 마우스, 기니 돼지, 개와 인간의 다른 조직. 뇌에서 중앙 II 수용체 위치의 중요성은 하나의 뇌에서 중앙 II의 작용에 기능적 신경 해부학을 적용 할 수 있다는 것, 예를 들면 시상 하부 (PVN)의 뇌실 핵 AT 한 R의 존재는 중앙의 기능을 제시 뇌 II는 바소프레신, 옥시토신 또는 부 신피질 자극 호르몬 방출 호르몬 (CRH) 방출, 또는 교감 신경계의 활성화를 촉진한다. 따라서, AT (1) R을 차단하는 약물은 뇌 RAS의 활동을 통해과 관련이 PVN 매개 효과의 일부를 줄일 수 있습니다. 진행중인 작업은 1 R 길항제 AT의 사용은 CRH의 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) - 유도 방출을 감소시키고 PTSD의 증상을 개선 할 수 있음을 시사한다 (상처 등., 게시를 위해 제출). PVN, subfornical기관 (SFO)와 편도체는 항상성, 식욕 / 갈증, 수면, 기억, 감정 반응을 조절하기위한 알려져 있으며,이 시범 연구의 대상 지역이다. 이 영역은 현미경 슬라이드에 뇌의 코로나 섹션을 수집하고, 중앙 II 수용체에 대한 특정 방사성 리간드와 함께 특정 억제제와 섹션을 처리하여 조사 하였다. 본 연구에서 제안 된 벤더와 함께 모든 물질 및 시약 나열 요오드 125는 모노 125 I로 정제 된 중앙 II 수용체 길항제, 사르코 1 이소류신 8 중앙 II (SI 중앙 II)을 방사성 표지하는 데 사용되는 이전 35 설명 된 바와 같이 HPLC 방법을 사용하여 -SI 중앙 II. 이러한 높은 비 활동 방사성 리간드의 사용은 X 선 필름에 방사성 표지 부분의 노출 된 후 낮은 중간 및 높은 수용체 밀도 영역의 가시화를 허용한다. 요오드 (125)는 특정 량의 공지 된 양을 함유하는 뇌 페이스트 표준 필름을 교정함으로써영역에 결합 중앙 II 수용체 정량화 할 수있다. 실험 연구에서, 피험자의 뇌에서 바인딩 중앙 II 수용체 대조군의 뇌에서와 비교 될 수있다. 이것은 중앙 II의 행동이 유전 적 조건, 표현형 이상, 질병 상태 또는 약물 치료에 대한 응답으로 변경할지 여부를 표시 할 수 있습니다. 이 기술은 다음 RAS의 조절 곤란과 연관된 질환을 치료하는 치료제의 개발에 적용 할 수있다. 해부학 적 해상도하지만 사이트를 수용체 결합을 식별하는 대안적인 기술은, 해리 상수 방사성 리간드 결합 친화도를 평가하기위한 농도 범위에 걸쳐 방사성 리간드와 인큐베이션 조직 균질 물로부터 유도 된 조직의 막 제제를 사용하여 검정 (K D를 바인딩 관심의 조직) 및 최대 바인딩 용량 (B 최대).
여기에 설명 된 프로토콜은 5 대 공동으로 세분화 될 수있다mponents : 수용체자가 방사선에 대한 조직 섹션을 준비; 수용체자가 방사선; 필름의 노출 및 개발; 조직학; 및 농도계 이미지 분석.
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Protocol
이 연구 수행 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 맞은 노바 사우스 이스턴 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다, 제 8 판 (국립 아카데미 프레스, 워싱턴 DC, 2011 ).
수용체자가 방사선 1. 준비 조직 섹션
- 희생시 수확 신선한 뇌 조직, 및 알루미늄 호일 대신에 포장 -20 ° C에 냉동 빨리. 20 ° C 냉동 - 정확한 형상을 유지 두개골 내를 모의하는 뇌 몰드에서 뇌를 배치하기 위해, 알루미늄 호일 대신 랩. 30 분 후, 장소 밀봉 냉동 보관 백에 조직 및 장기 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 장치로 이동한다.
- -80 -10 ° C 및 -18 ℃의 최대의 최소로 설정 그라 이오 스탯에 C의 냉동고 및 전송 °, 피하기 위해 해동 관심의 냉동 조직 표본을 얻습니다. 조직 상에 시료만을 배지에 시료의 작은 부분을 포함하는 글리콜 수지계 매립 매체 마운트 놓는다. 뇌의 경우, 뇌는 관상면에서 절편 수 있도록 수직으로 장착된다.
- 조직은 저온 유지 장치 내에서 마이크로톰에 탑재하고 제자리에 단단히 조여 놓습니다. 배측 - 복부 축이 수직 일반적으로 사용하는 뇌지도 책이라는 동일한 안테 - postero 좌표에있는 뇌의 왼쪽과 오른쪽을 확인하고.
- 원하는 두께로 절단 시작 (20 μm의 권장) 및 슬라이드의 공간보다 큰 표면적을 갖고 수직 방향으로 현미경 슬라이드 상에 마운트 부 해동. 슬라이드의 첫 번째 세트는 (그림 3) 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5 표시되어 있습니다 즉, 오의 연속 세트의 슬라이드 상에 섹션을 수집합니다.
- 섹션과 슬라이드 세트를 작성 후 최대 1 시간 동안 공기 건조에 슬라이드, 다음 SLI를 배치 할 수 있도록-20 ° C에서 플라스틱 슬라이드 자체 밀봉 냉동 보관 가방 상자, 저장에 데스.
2. 수용체자가 방사선
주의 : 방사능. 방사능을 처리하기 위해 보호 복장을 사용합니다. 폐기 시설에 의존하고, 제대로 (반감기 60 일) 부패하거나 인증 기업으로 뽑힐 지침을 따라야합니다.
- (그림 5)를 -20 ° C 냉장고에서 관심의 "-2" "-1"과 슬라이드를 제거하고 슬라이드 그립으로 마운트합니다. 함께 '비 특정'치료를위한 "-1"슬라이드 및 '전체'치료를위한 "-2"슬라이드를 탑재합니다. 바인딩 항아리가 10이 포함됩니다의 '총'(표 1) '비 특정'항아리 2 R 길항제 AT PD123319 10 μm의 최종 농도를 포함하며, 분석 매체 버퍼에, 1 R 길항제 AT (AM5을)를을 로사 르탄 AM5에서 μM PD123319.
- 슬라이드 전환그립을 실온에서 30 분 동안 AM5의 35-40 mL로 충전 전 배양 코 플린 항아리에 슬라이드 각각의 억제제를 배치한다. 4 분 간격으로 자신의 전 배양 조에서 다음 세트를 시작합니다.
- 즉시 방에서 60 ~ 90 분 동안 10 AM5 ml의 플러스 각각의 억제제 (그림 4에서 계산) 125 I-SI-중앙 II의 소정의 농도를 포함, 배양 슬라이드 우편물에 대한 사전 배양 용액에서 슬라이드를 전송 온도. 충분한 방사성이있는 경우, 10 슬라이드 수정 슬라이드 그립에 (다시 다시하는) 배치 및 코 플린 단지에 125 I-SI-중앙 II와 함께 배양 할 수있다.
- 장소 (필요한 경우), 블롯을 부드럽게 두 개의 별도의 용기에 증류수 400 ㎖에 1-2 초 동안 소용돌이에 의해 린스 슬라이드 그립에 다시 슬라이드.
- 정확히 1 분마다 (그림 4 <에 도시 된 바와 같이 대한 AM5의 35 ~ 40 ml에 포함 된 네 개의 코 플린 단지에 순차적으로 슬라이드를 이동/ STRONG>).
- 마지막 1 분 린스 후, 부드럽게 얼음 차가운 증류수 사 변경에 1-2 초 동안 섹션을 소용돌이 친다.
- - 불어 건조 시원한 공기와 슬라이드 (주의 : 뜨거운 공기가 방사성 화합물 휘발) 4 분 (그림 5)에 대해 서로 다른 각도에서 설정 네 헤어 드라이어를 사용하여, 모든 섹션이 건조 될 때까지, 다음 종이 타월에 배치합니다.
- 마운트 조직은 양면 테이프를 사용하여 X 선 필름에 동격의 판지에 위쪽을 향하도록 슬라이드.
- 적어도 하나의 마운트, 각 판지 위에 125 요오드 교정 표준 슬라이드 (그림 6).
주 : 검정 표준은 완전히 머리 부와 동일한 두께로 절단하고 현미경 위에 해동 - 장착 저온 유지되는 한 용액 투베르쿨린 주사기를 원심 분리에 의해 압축 된 페놀 고리를 포함하는 화합물에 결합 된 125 요오드 혼합 뇌 페이스트 이루어져 슬라이드. 대안에서, 125 I 교정 표준20 ㎛의 두께로 절단 플라스틱 수지는 상업적으로 얻을 수있다. 이러한 표준의 플라스틱 수지가 부분적 ~ 40 %의 조직 동등성 보정에 반영되어야하는 방사선 차폐 필름.
3. 필름의 노출 및 현상
- 스트랩 백 X 레이 카세트 및자가 방사선 필름과 암실로 진행합니다. 카세트를 열고 내부 슬라이드 (그림 6)와 골 판지를 배치합니다.
- 불을 끄고 안전 등의 전원을 켭니다. 조심스럽게, X 레이 필름의 상자를 열고 한 필름을 제거하고, 카세트에서 슬라이드의 상단에 (오른쪽 아래 모서리에있는 들쭉날쭉 한 가장자리) 필름 광택면을 배치합니다. 조심스럽게 카세트를 닫고, 빛 (그림 6) 밖으로 밀봉 잠금 막대를 비틀어. -20 ° C에서 몇 주에 며칠 동안 슬라이드를 노출.
- 암실에서, 카세트를 열고 필름 현상 PROC 진행ESS.
- 연속 트레이에 슬라이드를 놓고; 2 분 동안 개발자, 5 분 동안 5 % 빙초산 30 초 산, 그리고 해결사를 함유하는 물. 필름은 20 분 동안 흐르는 물과 트레이에 배치 한 후 더 이상 10 이상의 초 Photoflo에 넣고 걸.
낮은 바인딩과 지역에서 측정 신호를 얻기 위해 충분히,하지만 너무 오래 높은 결합을 가진 지역으로 필름을 포화과 같이 노출 시간은 경험적으로 결정되고 다른 노출 시간과 여러 영화를 포함 할 수 있습니다. 허용 노출이 얻어지면, 다음 단계로 진행합니다.
- 연속 트레이에 슬라이드를 놓고; 2 분 동안 개발자, 5 분 동안 5 % 빙초산 30 초 산, 그리고 해결사를 함유하는 물. 필름은 20 분 동안 흐르는 물과 트레이에 배치 한 후 더 이상 10 이상의 초 Photoflo에 넣고 걸.
4. 조직학
- thionin 염색 및 염색 시약 (표 2, 그림 7)를 준비합니다.
- 슬라이드 랙에 "-3"슬라이드를 놓고 1 분 동안 탈 이온수로 시작하는 순차적으로 전송 한 후 10 분 동안 thionin 얼룩 솔루션은 deion에 세 딥 다음화된 물, 탈 이온수 한 30 초 세척.
- 다음과 같이 물을 따르면, 에탄올 세척에 슬라이드 선반을 두십시오; 각각 1 분 100 % 둘 에탄올 세척 한 다음 50 %, 70 %, 30 초 동안 90 %. 마지막으로, 3 분 동안 크실렌으로 슬라이드 랙을 배치 한 다음 5 분 동안 제 크실렌 용액 위에 옮긴다.
- 마지막 자일 렌 화장실에서 한 번에 하나의 슬라이드를 제거하고 유기 용매 장착 매체 수지베이스와 슬라이드의 상단 커버 및 슬라이드 상에 24mm X 60mm의 coverslip에 배치합니다. ~ 48 시간 동안 슬라이드가 충분히 건조 허용하고 2,400 dpi의 그레이 스케일에서 컴퓨터로 스캔합니다.
5. 농도계 이미지 분석
- 왼쪽 하단에있는 들쭉날쭉 한 가장자리 아래로 필름 광택면을 놓고 이미징 시스템의 컴퓨터에서 왜곡없이 막 밀도 정보를 전송할 수있는 전용 스캐너를 사용하여 스캔.
- 독점 영상 SYS를 엽니 다TEM과 활용 교정 바 필름의 이미지 (- 12,도 9)의 미래 농도계 분석 교정 표준을 확립한다.
- 템플릿을 설정 또는 경험적으로 관심의 영역을 요약하거나하여 관심의 측정 영역. 데이터는, 제어 또는 야생형 (부) 및 지역를 수집하고 영화를 기반으로 분리된다. (그림 9) 측정에서 밀도 (fmol / g), 스캔 영역, 총 대상 면적을 포함해야합니다.
- 관심의 영역이 강조의 매개 변수 (그림 10) 사이에 떨어지는 것을 보장하여 스캔 영역 막대를 조정합니다.
- 스프레드 시트로 데이터 내보내기 (표 4). 밀도 시간을 총 타깃 영역을 곱하고 그 특정 영역의 결합에 대한 값을 얻기 위해 스캔 영역으로 나눈다. 이 측정 값 모두 완료되면, 특정 바인딩 (P)을 수득 총 설정된 비특이적 기판화내다. 평균은 이들 값에 대해 수행 될 수있다.
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Representative Results
레닌 - 안지오텐신 시스템의 대사 경로의 개요도 2에 설명되어있는도 1 (R 1 R AT 2 AT) 안지오텐신 II 수용체 아형에 직접 포커스에 나타낸다. (3) 디스플레이를 관상 뇌의 이동도 도 4에 도시 된 바와 같이 다음 소정의 125 I-시앙 II 농도를 사용하여 수용체자가 방사선 절차를 통해 실행된다 현미경 슬라이드 상에 부. 도표 5는 골판지 등 상에 부착 된 수용체자가 방사선의 슬라이드에 대한 건조 공정을 도시 이어서,도 6에서 볼 및 개발 하였다. 표 2 목록을 정량 7. 교정 표준 단위 도면에 기재된 슬라이드 마운트 조직 섹션에 대한 thionin 염색 과정에 사용 된 시약은 BA를 결정표에서 볼 수 있듯이 분석의 날짜에 나오지 3. 그림 8은 11도. (125) I 농도 (fmol / g 조직) 노출 (상대 검안 밀도)를 촬영하기 위해 관련된 표준 곡선의 설립을 보여줍니다 'NSP'사이의 차이를 보여줍니다 및 '전체'그룹뿐만 아니라 조직 라벨,도 10은 전체 주사 영역에 대한 정확한 평균값을 획득하기 위해 제로에 가까운 값으로 임계 값의 설정을 설명하면서 (스캔 영역 화소). 표 4에 표시 정량 특정를 얻는 과정은 '전체'값으로부터 '비특이적'를 감산에 기초하여 바인딩. "비특이적"로사 르탄을 포함 및 / 또는 PD123319 비 AT-1 또는 제 2의 수용체 결합 된 방사선 리간드의 양에 의해 생성되는 결합. PD123319의 존재 하에서 하나의 수용체에 결합 된 방사성 리간드의 모두는 '전체'바인딩. F를 수득 igure 11 표시 PVN의 해부학 확인을위한 thionin 스테인드 섹션으로 총 대 비 특이 적 결합에 인접한에서 PVN의 최종 측정 영역.
그림 1 :. 본문에 레닌 안지오텐신 시스템 (RAS)의 대사 경로 간은 안지오텐신 II에 효소 (ACE) 중앙 I 변환 변환 안지오텐신 I. 안지오텐신를 형성하는 신장 분비되는 레닌에 의해 절단되는 발효균의 지오 텐시 노겐을, (출시 중앙 II), 심혈관 질환의 주요 전구체. 중앙 II는 혈관 수축의 원인, 혈압, 심 박출량, 소금 식욕, 갈증, 물 보존을 증가시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 1, R은 병리학 적 심혈관 질환에 영향을 미치는에서 안지오텐신 타입 1과 2 수용체의 기능 (1 R AT, 2 R AT)는 직접 갈증과 소금 식욕을 증가시키는 역할을하고, 중앙뿐만 아니라 다른 많은 주변 세포 활성을 발휘 심리적 효과. 2 AT R은 AT (1) R의 효능에 지원은 AT 1 수용체의 생리 학적 길항제 인 혈관 구조에 36 이에 갖는 유익한 효과 길항제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Cryose현미경 상으로 뇌의 ctioning 20 μm의 두께로 슬라이드. 그라 이오 스탯의 온도에 따라, 섹션 시간은 주름, 균열, 컬링을 표시하거나 마이크로톰 블레이드 또는 칼 홀더에 압축 될 것이다에. 이러한 경우 부분은 삭제되고 메모가 추가로 20 μm의 이전 섹션에서이 부분을 분리 할 것을 나타 내기 위해서 이루어진다. 섹션 슬라이드를 채우기 때문에 각 슬라이드에 섹션의 가장 큰 금액을 수집하는 데 필요한 전체 면적을 최대화하기 위해 수직 방향으로 슬라이드를 수집해야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 수용체자가 방사선에 대한 실험 설계 및 프로토콜의 샘플 Differenti'전체'(-2)와 '비특이적'(1)의 ATION 직접 수용체 아형 길항제의 유무에 관한 것이다. 프로토콜 슬라이드의 개수에 따라 달라질 수 있으며, 총 비 특정 슬라이드의 각 쌍에 대해 2 씩 증가한다. 방사성 리간드의 농도는, 이전에 AM5 재고 희석하여 얻어지는 결정. 이 용액을 고르게 한 다음 배양 용기에 분배한다. 직접 계산 전에 촬영과 방사성 리간드의 정확한 농도를 확립 배양 후.되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 :. 수용체자가 방사선에 건조 스테이션의 구성 건조 시간은 타격의 효율성에 따라 달라집니다건조기뿐만 아니라 마지막 헹굼 후 물기를 멀리 가릴 수있는 능력. 섹션이 명확에서 흰색으로 변 일단 슬라이드 건조됩니다. 슬라이드가 완전히 건조되지 않은 경우, 방사성 리간드 멀리 사이트를 결합 수용체에 대한 특정하지 않은 퍼지 이미지를 생성 수용체에서 확산 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :.. 전문 카세트를 사용하여 X 선 필름 처리 슬라이드를 노출 슬라이드 설정은 두 그룹의 비교가 용이 패턴을 따르도록 권장 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : Thionin 염색에 대한 설정입니다. 슬라이드는 슬라이드 홀더에 장착하고 순차적 솔루션에 담근다. 타이밍은 신경 세포의 Nissl 물질의 효과적인 염색 (거친 소포체) 수 있습니다. 탈수 다음 슬라이드에 대한 설치 매체 응용 프로그램은 슬라이드에 커버 슬립의 고정 비교 분석에 대한 부분을 보존 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8. 보정 표준을 각각의 필름은 뇌 페이스트 및 실험이 수행 된 시간에 기초하여 그 각각의 교정 기준을 포함 . 가장 적합한 값을 설명하는 회귀선은 측정 된 뇌 페이스트 표준 고유의 이미징 시스템 프로그램에 의해 생성된다. 이 유닛 (fmol / g, 빨간색 동그라미) 젖은 그램 당 결합 fmole 방사성 있습니다이 예에서, 방사성 리간드 결합의 단위 (빨간색 타원형의 칼 성병) 교정 표준에서 상대 검안 밀도 (ROD) 값을 변환 조직 무게 (fmol / g). 뇌 페이스트 표준 측정은 원형 공구 수행하고 (적색 원) 이미지보기 아이콘을 사용 사색의 우측에 도시 된 샘플의 중앙에 배치된다. 원은 교정 표준은 전체 샘플을 포함 할 필요가 없습니다 측정하는 것이 아니라 표준의도 면적을 측정 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 9. 여러 뇌, 뇌 영역, 복수 실험군 함께 정량하고 있기 때문에 시료 번호 비특이적 / 총 샘플 측정을위한 영역으로 그룹 식별이 모든 요소를 구별하는 것이 중요하다. 주제는 뇌 샘플을 나타내며 또한 그룹을 나타낼 수 있습니다; 단면 영역은 샘플링되고 다수의 뇌 영역의 식별이 가능하면서 비특이적 (NSP) 또는 전체가인지를 나타낸다. 샘플 도구 모음 (빨간색 사각형) 다른 샘플링 도구, 예를 들어, 원, 사각형, 템플릿, 자유, 지우개 설명; 그 측정 할 영역을 서술하기 위해 사용될 수있다. 샘플링 도구의 지역에서 얻은 ROD 값은 fmol / g (빨간색 원), 스프레드 시트에 바인딩으로 변환 된 단위를 기록된다. 또한, 샘플링 공구 내의 전체 스캔 영역 전체 t 동안 "스캔 영역 화소 '항목에 기록된다arget 영역 (그림 10 전설에 설명 된 임계 값을 (초과 픽셀 수)가 "총 TGT 지역 픽셀"열에 기록되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 10 : 샘플에 대한 임계 값의 결정은 표준을 기반으로 측정 할 스캔 영역은 각각의 영화에 대해 고유 한 설정 기준에 따라 달라집니다.. 측정 된 영역에 대한 수 fmol / g의 스캔 영역의 밀도 범위에 대한 임계 값을 설정 (빨간색 원)가 임계 도구를 사용하여 점 위치까지 0의 범위 사이 가을 (대각선 화살표로 구분) 검량선은, 필름은 최대 노출 가까워 나타내는 점근선 시작 부가 넘어서는
그림 11 : 시상 하부 (PVN)와 액세서리 후각 기관의 침대 핵의 뇌실 핵을 표시 브레 그마에 ~ 1.8 mm의 꼬리에 여성 자발적으로 고혈압 쥐 (SHR)의 코로나 부분에 결합하는 수용체자가 방사선의 대표 이미지 (BAOT ). (A </ STRONG>) (1) R은 (레드 - PVN, 노랑 - BAOT)를 결합 AT의 결합 총. (B) 로사 르탄 (AT1R 길항제) 및 PD123319 (AT2R 길항제)와 결합 비특이적. (C) 총) 전체 TGT 영역으로서 기록 된 스캔 영역 내에서 임계 값을 초과 PVN (검정 칠)의 형상을 서술하는 바와 같이, 임의의 임계 값 등의 설정을 바인딩 한 R AT의 결합. 도시 구조의 해부학 적 확인을 위해 (D) Thionin 스테인드 섹션 높은 결합 총, 그리고 다른 뇌 영역 또는 다른 실험 그룹과 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시약 | 양 |
| 염화나트륨 | 8.76지 |
| 나 2 EDTA | 1.86 g |
| 바시 트라 신 | 141 mg의 |
| 500 mM의 이염 나 2 PO 4 | 100 ㎖ |
| 증류 탈 이온수 | 900 ml의 |
| 수산화 나트륨 또는 염산으로 7.2로 7.1의 pH를 조정 | |
표 1 : 분석 중간 (AM5) 조직의 제조에 사용되는 버퍼의 화학 성분..
표 2 :. Thionin 얼룩 시약 thionin 얼룩은 이전 솔루션 thionin 0.5 %를 추가로 4.3의 pH를 적정, 증류수 최대 1.0 M 아세트산 나트륨 1.0 M 빙하 아세트산 용액을한다.
| 일 과거 기준 날짜 | |||||||||
| 일괄 | fmol / g 젖은 무게 | 참고 날짜 | 1 | 이 | 삼 | 4 | (5) | ||
| 표준 | NCI / mg의 | fmol / g | DPM / g | fmol / g | FOM / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g |
| 번호 | 30 월 | 30 월 | 30 월 | 30 월 | 31 월 | 1 ~ 6 월 | 2 6 월 | 3 ~ 6 월 | 4 ~ 6 월 |
| 1 | 9,706 | 4,463 | 21547320 | 4,463 | 4,411 | 4,361 | 4,311 | 4,261 | 4,212 |
| 이 | 5,838 | 2,684 | 12960360 | 2,684 | 2,653 | 2,623 | 2,593 | 2,563 | 2,533 |
| 삼 | 2,798 | 1,286 | 6211560 | 1,286 | 1,272 | 1,257 | 1,243 | 1,228 | 1,214 |
| 4 | 1,451 | 667 | 3221220 | 667 | 659 | (652) | 644 | 637 | (630) |
| (5) | 787 | (362) | 1747140 | (362) | (358) | (354) | (350) | (345) | (342) |
| 6 | 385 | 177 | 854700 | 177 | (174) | 173 | (171) | 169 | 167 |
표 3 :. 교정 표준을위한 일일 감소율 계산 교정 표준을위한 매일 붕괴 속도 스프레드 시트는 실험이 수행 된 날짜를 기준으로 작성해야합니다. 이것은 스프레드 시트가 60 일의 반감기 (t의 ½)와 상수 1 차 속도에 기초한다. N = N 0 * E KT, N은 시간 0 (N 0) = K (LN2) / t의 1/2의 농도가 시간 t에 대하여, I (125)의 농도 = 여기서.
| 시상 하부의 뇌실 Nucleous | 목표 | 고밀도 fmol / g | 스캔 영역 | 전체 대상 지역 | 합계* | |
| 합계 | 1 | 996 | 4,383 | 4,383 | 996 | |
| 합계 | 이 | (921) | 3,362 | 3,362 | (921) | |
| 합계 | 삼 | (818) | 3,445 | 3,445 | (818) | 바인딩 특정 |
| 합계 | 4 | (710) | 2,906 | 2,906 | (710) | 967 |
| 평균 | 861 | 3,524 | 3,524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ TR>||||||
| 섹션 | 목표 | 고밀도 fmol / g | 스캔 영역 | 전체 대상 지역 | 비 특정 * | 678 |
| NSP | 1 | (53) | 3,072 | 1,737 | (30) | (826) |
| NSP | 이 | (52) | 2,959 | 1,455 | (26) | |
| NSP | 삼 | (86) | 3,180 | 2,035 | (55) | |
| NSP | 4 | (53) | 3,293 | 1,995 | (32) | |
| 평균 | (61) | 3,126 | 1,805.5 | (36) | ||
| 부속품 Olfac의 침대 핵토리 요로 | ||||||
| 섹션 | 목표 | 굴-fmol / g | 스캔 영역 | 전체 대상 지역 | 합계* | |
| 합계 | 1 | 439 | 3,632 | 3,632 | 439 | |
| 합계 | 이 | (435) | 3,632 | 3,632 | (435) | |
| 합계 | 삼 | (355) | 3,632 | 3,620 | (354) | |
| 합계 | 4 | (435) | 3,632 | 3,631 | (435) | 바인딩 특정 |
| 합계 | (5) | (342) | 3,632 | 3,630 | (342) | (414) |
| 합계 | 6 | (334) | 3,632 | 3,606 | (331) | 393 |
| 평균 | 390 | 3,632 | 3,625 | 389 | (321) | |
| 394 | ||||||
| (315) | ||||||
| 섹션 | 목표 | 굴-fmol / g | 스캔 영역 | 전체 대상 지역 | 비 특정 * | (320) |
| NSP | 1 | 49 | 3,632 | 1,846 | (25) | 360 |
| NSP | 이 | (64) | 3,632 | 2,362 | (42) | |
| NSP | 삼 | (53) | 3,632 | 2,275 | (33) | |
| NSP | 4 | (64) | 3,632 | 2,339 | (41) | |
| NSP | (5) | (51) | 3,632 | 1,879 | (26) | |
| NSP | 6 | (41) | 3,632 | 966 | (11) | |
| 평균 | (54) | 3,632 | 1,945 | (30) | ||
| * 전체 및 비 speciic는 fmol / g의 밀도 단위입니다. | ||||||
| 총 = 밀도 * 전체 대상 영역 / 스캔 영역 | ||||||
| 비특이적 = 밀도 * 총 타깃 영역 / 스캔 영역 | ||||||
| 총 타깃 영역이 임계 값을 넘은 가능한 0.00 fmol / g에 가깝게 설정 화소이다. | ||||||
| 픽셀 임계 값을 초과하지 않는값은 전체 밀도의 평가를 위해 0의 값을받을 수 있습니다. | ||||||
| 임계 값을 초과하지 않는 픽셀 비특이적 밀도 평가 0의 값을 수신한다. | ||||||
| 특이 적 결합은 영하 비특이적가 fmol / g 밀도 단위로 표현 바인딩 합계이다. | ||||||
표 4 :. (픽셀 단위) fmol /에서 스프레드 시트를 들어, 스캔 영역, 총 대상 지역의 액세서리 후각 기관 이미징 소프트웨어 수출 데이터 시상 하부와 침대 핵의 뇌실 핵의 정량 분석. '비특이적는 양적 바인딩 1 비를 얻기 위해 결합'전체 '으로부터 감산 바인딩.
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Discussion
기술 된 프로토콜은 설치류 뇌 이전에 수거하고 -80 ℃에서 보관의 관상 부의 인접 부에서의 방사성 리간드의 결합을 '전체'및 '비특이적'의 시각화를 식별하고, 거의 모든 조직에 용이하게 적용 할 수 있다는 해부학 적 수용체 또는 방사성 리간드 결합 부위의 차이 금액을 표시 하부 구조를 해결했다. 프로토콜에서 설명하는 절차는 간단하고 정확하게 분석 결과를 해석 중요하다. 20 ㎛의 두께를 최적으로 결정 하였다; 단면이 너무 두꺼우면, 비 특이 적 결합 어려운 목표로 방사성 리간드의 결합을 해결하는 데있어 증가한다. 부분이 얇게 절단하면, 성공적으로 절단하고, 변형이없는 연속 부분을 저장하는 것이 곤란해진다. 최적의 절삭 온도로 인해 조직의 특성과 절 그리고 난의 두께가 약간 달라집니다이야 일반적으로 경험적으로 결정. 접촉 블레이드와 조직 사이되면, 시편의 배향을 검토하고, 다시 거리 블레이드로부터 조직 표본을 이동하고, 장착 공 재 방향으로 재정렬 할 수있다. 설치류의 뇌를 절단 할 때의 배측 - 복부 축이 직교 일반적으로 사용하는 뇌 도해되는 것과 안테-postero 좌표이다를 뇌의 왼쪽과 오른쪽을 확보하는 것이 중요하고. 슬라이드 세트는 조직의 인접한 부분에 연구를 수행하기 위해 사전에 표시되어 있습니다. 5 슬라이드의 첫 번째 세트 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5로 표시되어 있습니다. 첫 번째 컷 섹션 (이 그것을 아래로 젖 빛 측면이 슬라이드의 오른쪽 상단입니다) 왼쪽 상단에 슬라이드 1-1에 간다; 두 번째 컷 부분은 다섯 번째 절단면 슬라이드 1-5에가는 등 슬라이드 1-2에 간다. 여섯 번째 컷 부분은 첫 번째 섹션의 왼쪽에 슬라이드 1-1에 간다. 슬라이드의 제 1 세트가 작성되면, 슬라이드 (5)의 또 다른 세트를 시작할에스, 2-1, 2-2, 2-3, 2-4 및 2-5 표시. 이 사이클까지 다시 뇌에 필요한만큼 계속된다. 은 "-4"하고는 "-5"슬라이드를 백업 또는 다른 수용체를 방사성 표지로 유지된다.
수용체 오토 라디오 프로토콜을 사용하는 방사성 리간드에 의존하고, 수용체의 특성은 완충제, 염 및 억제제의 농도를 결정하기 위해 조사된다. 이 과정에서 중앙 II 수용체의 AT1 하위 유형의 측정, 높은 친 화성 요오드-125 라벨 리간드, 125 I-사르 1 일드 8 -Ang II (125 I-SI-중앙 II); 로버트 C. 스페 박사에 의해 방사성 표지 또한 시판입니다 (펩타이드 방사성 요오드화 공유 자원, 조지 타운 대학)) AM5 버퍼 (표 1) 용해; 염화나트륨, EDTA 및 바시 트라 신와 인산 나트륨 완충액. AM5는 metallopeptidases 및 바시 트라 신에 민감한 peptida에서 방사성 리간드의 좋은 보호 기능을 제공합니다생리 학적 pH 및 염화나트륨 농도를 제공 SES는 결합 특성을 최적화한다. AM5의 사전 인큐베이션은 방사성 리간드의 분해를 최소화하는 펩 티다 제 억제제 위해 조직 절편을 노출하고, 또한 중앙 II 수용체의 내생 중앙 II 해리. 로사 르탄 및 PD123319, AT1R 및 AT2R 길항제는 각각 그 타겟 수용체 각각 비특이적 결합을 평가하고 AT1 수용체에 특이 적 결합을 한정하는 수용체에 결합시켜 방사성 리간드를 방지하는 농도 (10 μM)로 첨가되어 포화. 분석 125 I-SI 중앙 II의 원하는 농도가 결정되고 원액 필요한 희석 (프로토콜 표 3 참조), 방사성 동위 원소 감쇠율 스프레드 시트로부터 결정된다. 최적 K D 근사 방사성 리간드의 농도는 본 수용체의 50 %를 차지하고있는 것이 사용된다. 그러나 radioligands 비싼 낮은 농도 전자 수 있기 때문에· G. K 개의 D 농도의 ~ 20 %를 사용할 수있다. 이 환원 비 특정 특이 적 결합보다 결합하여 신호대 잡음비를 증가시키는 잠재적 인 이점을 갖는다. 그러나, 긴 노출 시간이 결합 화상을 개발해야한다. (3.4) 상술 한 바와 같이 얻어진 노광 위에 또는 아래 노출 된 경우, 상기 슬라이드 짧은 및 / 또는 목적하는 노출을 달성하기 위해 더 긴 시간이 새로운 필름에 재 노출 될 수있다.
농도계 이미지 분석은 오토 라디오 어플 광범위한 요약서뿐만 아니라 다른 애플리케이션을 제공하는 전용 이미징 시스템에 의해 수행 될 수있다. 검정 표준은 습윤 티슈 중량 (티슈 하나의 비중을 가정)의 fmol / g으로된다. 배경과 함께 각각의 표준 세트는 표준 곡선을 생성합니다. 와 상대 검안 D에서 표준 곡선을 생성하는 데 사용할 수 있습니다 가중치없이 여러 곡선 피팅 알고리즘이 있습니다다른 교정 표준 ensity (ROD) 값. 최고의 데이터를 나타내는 곡선의 선택은 다른 표준 곡선에 대한 상대 오차 값을 제공하지 않는 커브 피팅을위한 서브 루틴으로 경험적으로 이루어진다. 최대 ~ 0.6 봉에서 표준 곡선은 pseudolinear입니다. 그러나이 영화는 약 0.8 ~ 0.9 ROD 단위를 점근선 곡선을 형성하는이 시점을 넘어 포화하기 시작합니다. 샘플을 다단계되는 표준 0.9 ROD 부 이상일 경우에는 fmol / g 표준의 pseudolinear 범위에 가까운 샘플의 결합보다 안정적인 값을 획득하기 위해 짧은 시간 기간 동안 필름을 재 노출 시키도록 권장 곡선. 표준 곡선이 극단적에서 파생 된 값은 방사성 리간드 결합에 상당히 큰 차이 ROD의 작은 차이가 발생합니다. 필름의 포화 점에 근접함에 따라서 감소 능력은 결합의 변화를 검출한다.
특정 지역의 측정을 위해,권장 조치는 '밀도'fmol / g에서, 픽셀 '검색 영역', 픽셀에서 '전체 대상 지역'(그림 9)입니다. 이는 막 밀도 또는 검정 표준으로부터 유도 된 표준 곡선의 임의의 양태의 변형은 0보다 작은 값을 부여 할 수 있기 때문에 가능 (도 10) 0에 가까운 임계 값을 설정하는 것이 중요하다. 이러한 값은 스캔 영역의 모든 픽셀을 평균하는 경우가 인위적으로 낮은 값을 도출한다. 매우 주관적 일 수 바인딩 영역을 식별하는 데 사용되는 기준 그래서 최선 밀접 주관적인 에러 발생률을 줄이기 위해 가능한 한 많이 제어 실험 뇌 페어링. 또 다른 문제는 최종 독서를 얻기 위해 평균 얼마나 많은 부분 결정하는 것입니다. 분석 섹션들의 좋은 지표가 얼룩진 조직학 슬라이드와 함께 수락 된 쥐의 뇌 아틀라스에 따라 결정될 수있다. 샘플링 에리어의 크기도 될 수있다문제. 보상하기 위하여, 템플릿은 어떤 크기의 차이를 보정하기 위해 설정 될 수있다. 섹션의 치료는 높은 결합 한 구조의 영역에 영향을 분석에서 고려되어야 할 수있다. 이것은 뇌 영역의 해부학 적 특징을 표현하기 위해 임의의 값을 초과하는 농도의 범위를 설정하는 고유의 이미징 시스템의 '임계'도구의 다른 사용을 요구하는 것은 샘플링 도구 내 시상 하부의 뇌실 결핵 같은 샘플링되고 그 관심 영역 (그림 11, 패널 C)를 포함한다. 또한 결합 량의 측정으로 측정 영역을 포함 할 수있다. 이 특정 결합 회 측정 한 화소 수의 값을 곱함으로써 수행 될 수있다. 픽셀은 두 가지면에서 통치자, 또는 알려진 크기의 사각형을 이미지화하여 미터 단위로 변환 할 수 있습니다. 에 해당하는 픽셀 수직사각형의 길이 또는 면적은 미터 단위로 표현 될 수있다. 2,400 dpi의 해상도 ~ 9,000 픽셀 = 우리의 시스템에서 1mm 2.
방사성 리간드의 사용을 더 이상 널리 사용되는 기술되지만; 그것은 (그 타고난 리간드를 결합 할 수있는) 조직 자체가 기능성 표본 내에서 수용체의 물리적 분포를 시각화 할 수있는 몇 가지 방법 중 하나입니다. 또한,이 대안적인 방법을 특성화하기 위해 사용할 수있는 등의 다른 동물 균주 또는 상이한 연령의 동물 사이, 다른 뇌 영역 또는 다른 구조물과 처리 군 사이의 기능적 수용체 발현의 변화의 평가를 가능하게하는 수용체의 수를 정량 할 AT 1 수용체 발현의 신경 해부학 적 측면, 그러나 제한 값을 갖는다. 의 mRNA의 현장 하이브리드 1 수용체 AT 항상 1 수용체 AT 식 또는 배포에 해당하지 않습니다에 대한뇌. 면역 기술은 조직 절편의 염색 강도에 기초하여 수용체 발현의 차이를 근사 할 수 있지만,이 수용체의 발현 수치 판정 있도록 염색 표준 곡선을 생성하는 것은 불가능하다. 수용체자가 방사선은 또한 면역 학적 기술을 이용하여 보증 할 수 없다 (즉 radioligands 결합 또는 다른 대상) 수용체에 대한 특이성의 레벨을 제공한다. 2009 년 연재는 18 가지 G 단백질 결합 수용체 및 일시적 수용체 전위 (TRP) 채널을 평가하기 위해 사용 하였다 (49) 항체의 유효성에 의문 37-43을 발표 하였다. 본질적으로, 항체는 야생형 문제의 수용체 녹아웃 마우스에서 서쪽 오 점에서 동일 대역을 표시. 그 후, 여러 그룹을 1, 2 수용체 항체 44-49 AT 시판 사용하여 유사한 관찰을 만들었습니다. bacteri의 사용1 프로모터에 의해 구동되는 리포터 분자, 예를 들면, 녹색 형광 단백질을 생성하는 등 인공 염색체들이 갖는 기초 (그러나 래트)의 뇌 마우스 1 수용체 발현 세포 AT의 유무를 판정하는 간접 수단 수용체 촉진제 50 AT 기능. 또한 현미경으로 식별 뇌 영역에서 "양성 세포"를 계산하지만, 이들 영역의 AT 수용체 발현의 강도 변화를 정량화 할 수 없다. 따라서이 시점에서 바로 중앙 II 수용체 발현을 측정 할 수있는 유일한 검증 기술은 방사성 리간드 결합 방법이다. 1 수용체 단백질 AT 기능의 해부학 해상도는 미세한 수준에서 필요한 경우, 수용체자가 방사선은 직접 측정 할 수있는 유일한 기술이다.
수용체자가 방사선은 제한이없는 것은 아니다. 주요 concern은 조사 환경에서 방사능 물질을 사용하는 요건을 충족시키는 것을이다. 또한, 방사성 물질 및 방사성 물질의 안전한 배치 작업 연구자들의 안전을 보장하기 위해 대신 엄격한 가이드 라인 방사선 안전 프로그램이 필요하다. 이것은 많은 연구 설정에서 사용을 배제 시점에 방사성 물질을 이용한 연구 비용 이관. 또한 radioligands의 비용이 상당 할 수있다. 방사성 리간드의 수천 달러하지 않으면 따라서 슬라이드 마운트 조직 섹션의 다수의 방사성 리간드의 용기에 배양 된 수용체자가 방사선 실험 백을 사용할 수있다. 또 다른 제한은 조직이 앞서 저온 유지 장치에 절편을 고정 시간 동안 저장하고 신속하게 세정하고, 방사성 리간드에 결합하는 수용체의 능력 또는 관심 단백질을 손상시킬 수 있으므로, 방사성 리간드와 함께 항온 처리 한 후 건조시킬 수 있어야한다는 것이다 . 빠른 엉덩이를 리간드ociation / 해리 동력학, 비 - 특이 적 방사성 리간드 결합을 얻어 린스하는 데 필요한 시간 동안 수용체에 대한 방사성 리간드의 결합을 유지하는 것이 가능하지 않을 수도있다. 또한, 필름을 노광 장기간 방사성 리간드 결합 소량으로 - 한 달 이상 - 측정 가능한 화상을 필름에 형성 할 수 있기 전에 요구 될 수있다. 또 다른 문제는 리간드에 요오드 125의 첨가에 의한 입체 장애에 목표 수용체 또는 단백질에 결합하는 리간드의 능력을 손상시킬 수 있다는 것이다. 대부분 필름 화상을 생성하는 것은 매우 곤란하다는 작은 분자, 예를 들면, 트리튬 (3 H)의 사용은 입체 장애의 문제를 제거하지만, 삼중 수소는 낮은 에너지 (요오드 125에 대해) 낮은 특정 활성을 갖는 수용체 인구. 이러한 문제에 비추어, 수용체자가 방사선이 수용체 또는 관심의 다른 분자 구조를 식별 할 수없는있는 여러 상황이 있습니다.
그 리에도 불구하고mitations은 수용체자가 방사선은 조직 내 특정 구조를 식별 할 수있는, 예를 들면, 실험 변수에 응답하여 변경된 뇌 영역은 정상 뇌 비교. 이 지식은 중앙 II 또는 질병의 병리의 다른 수용체 나 효소의 AT (1) R의 역할을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 잠재적 인 치료를위한 표적으로 영역을 나타냅니다으로이 지식은 가치있는 약리학 적 의미를 가지고있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
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