Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

بروتوكول تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات للالتصور المترجمة من أنجيوتنسين الثاني المستقبلات

Published: June 7, 2016 doi: 10.3791/53866
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

Abstract

يصف هذا البروتوكول مستقبلات أنماط ملزمة للأنجيوتنسين الثاني (آنغ الثاني) في الدماغ الفئران باستخدام جين مشع معين لمستقبلات انج الثاني لأداء مستقبلات رسم الخرائط autoradiographic.

ويتم حصاد عينات الأنسجة وتخزينها في -80 درجة مئوية. ويستخدم ناظم البرد إلى قسم coronally النسيج (الدماغ) وذوبان الجليد يشن المقاطع على الشرائح المشحونة. يتم تحضين المقاطع الأنسجة محمولة على الشرائح في 125 I-SI-آنغ الثاني لradiolabel مستقبلات انج الثاني. يتم فصل الشرائح المجاورة إلى مجموعتين: "غير محددة ملزمة" (اس بي) في وجود مستقبلات تشبع تركيز غير رديولبلد انج الثاني، أو AT 1 آنغ الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT 1 R) انتقائية انج الثاني مستقبلات و'توتال ملزمة "مع عدم وجود AT 1 R خصم. وهناك تركيز تشبع من AT 2 انج الثاني مستقبلات النوع الفرعي (AT 2 R) خصم (PD123319، 10 ميكرومتر) موجود أيضا في incubatiعلى عازلة للحد 125 I-SI-آنغ الثاني ملزما للR النوع الفرعي AT 1. خلال 30 دقيقة قبل الحضانة في ~ 22 درجة مئوية، وتتعرض الشرائح برنامج الفضاء الوطني إلى 10 ميكرومتر PD123319 واللوسارتان، في حين أن 'توتال ملزمة "يتعرض الشرائح إلى 10 ميكرومتر PD123319. ثم يتم تحضين الشرائح مع 125 I-SI-آنغ الثاني في وجود PD123319 ل 'مجموع ملزمة "، وPD123319 واللوسارتان لبرنامج الفضاء الوطني في المخزن الفحص، تليها عدة" يغسل "في المخزن، والماء لإزالة الملح وغير ملزمة لجين مشع على وجه التحديد. يتم تجفيفها الشرائح باستخدام ضربة المجففات، ثم تتعرض لفيلم تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام فيلم المتخصصة والكاسيت. تم تطوير الفيلم ويتم تفحص الصور إلى جهاز كمبيوتر لقياس كثافة بصرية والكمية باستخدام نظام التصوير الملكية والبيانات. مجموعة إضافية من الشرائح وثيونين-ملطخة للمقارنات النسيجية.

وميزة استخدام مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي هو القدرة على تصورآنج مستقبلات الثاني في الموقع، في قسم من عينة الأنسجة، وتشريحيا تحديد منطقة الأنسجة عن طريق مقارنتها إلى قسم المراجع النسيجي المجاور.

Introduction

لا يزال مرض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفاة والعجز في الولايات المتحدة، مما تسبب في أكثر من 30٪ من الوفيات في الولايات المتحدة في عام 2011 1. إن الإحصاءات التي صدرت مؤخرا عن جمعية القلب الأمريكية تشير إلى أن أكثر من شخص واحد من كل ثلاثة لديها واحد أو أكثر من نوع من مرض القلب والأوعية الدموية. يستمر البحث القلب والأوعية الدموية لاتخاذ خطوات واسعة ضد فهم هذا المرض، ولكن عندما تبدأ الأجيال الحصول على كبار السن لا بد من مواصلة هذه الجهود. نظام رينين أنجيوتنسين (RAS) يلعب دورا مركزيا في تنظيم نظام القلب والأوعية الدموية في المقام الأول من خلال تعزيز تصلب الشرايين، والتهاب، تضيق الأوعية النظامية، وتفعيل الجهاز العصبي الودي (الشكل 1) 2-8.

وRAS هو نظام الهرموني الذي يتم تفعيلها عند الخلايا المجاورة للكبيبة الكلى تفرز الرينين في مجرى الدم استجابة لانخفاض ضغط الدم، وزيادة sympatالتحفيز hetic، أو انخفاض تدفق الصوديوم البقعة الكثيفة. الرينين يتأيض مولد الأنجيوتنسين (تصنيعه في الكبد) لتشكيل أنجيوتنسين الأول (آنغ لي). آنج لي ثم يتم استقلاب من قبل المحول للأنجيوتنسين انزيم (ACE)، وهو إنزيم خارجي على الجانب اللمعية من خلايا بطانة الأوعية الدموية، وخاصة في الرئتين والكليتين، لتشكيل أنجيوتنسين الثاني (آنج الثاني)، والببتيد المستجيب الرئيسي للRAS. آنج الثاني قادر على تفعيل نوعين مستقبل. مستقبلات نوع 1 (AT 1 R) ومستقبلات نوع 2 (AT 2 R)، على حد سواء التي تنظم نظام القلب والأوعية الدموية، والحفاظ على السوائل والكهارل التوازن وتعتبر الآن أن تؤثر على الوظيفة المعرفية والأمراض العصبية التنكسية العمليات 8،9. وتفيد التقارير ان، RAS في الدماغ محددة المحلي لتجميع مستقل انج الثاني. في الدماغ، ويتم تصنيعه في مولد الأنجيوتنسين البروتين السلائف في دبق نجمي الخلايا 10 تحويلها إلى آنغ لي من قبل مثل الرينين انزيم 3، ربما ملزمة prorenin لمستقبلات prorenin11، وبعد ذلك تحويلها إلى آنغ الثاني بواسطة انزيم المحول للأنجيوتنسين وهو ما يعبر عنه بكثرة على سطح الخلية من الخلايا العصبية في الدماغ (12). هذا intrabrain ولدت آنغ الثاني هو ناهض للدماغ AT 1 وايه 2 المستقبلات التي يتم عزل من المنقولة عن طريق الدم انج الثاني.

في حين أن AT 1 R تلعب دورا هاما الفسيولوجية، وأفضل المعروف للآثار المرضية في جميع أنحاء الجسم، مما يؤثر في المقام الأول على نظام القلب والأوعية الدموية والكلى (الشكل 2). عندما يربط انج الثاني لAT 1 R، فإنه يتسبب تضيق الأوعية. زيادة المقاومة لتدفق الدم ورفع ضغط الدم. كما أنها تشجع على تخليق وإفراز الألدوستيرون وفاسوبريسين، مما يؤدي إلى زيادة الصوديوم واحتباس الماء. ويمكن لهذه الآثار أيضا لحث تلف في الدماغ الإقفاري وإدراكيا ويرتبط مرض باركنسون ومرض الزهايمر، وتنظيم السكرقسم التدريب والامتحانات، وكذلك يجري تحديدها مؤخرا أن تؤثر على التعلم والذاكرة 13-15. هناك حلقة مفرغة في RAS في هذا AT 1 R على الخلايا المجاورة للكبيبة في الكلى يحول دون إفراز الرينين. ومن المثير للاهتمام، وAT 2 R عموما مكافحة ينظم عمل AT 1 R، مما تسبب توسع الأوعية، ثمرة neurite، تجدد المحاور، ومكافحة انتشار الأسلحة النووية، وcerebroprotection ضمن أشياء أخرى كثيرة 16-20. كما تم تحديد AT 2 R كهدف لمكافحة ارتفاع ضغط الدم ومؤخرا، الأدوية المضادة للسرطان 21. تحديد توطين وكثافة من مستقبلات انج الثاني في الأنسجة المختلفة، وكيف تتأثر من قبل مختلف العلاجات والحالات المرضية باستخدام الكمي قياس الكثافة تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات سوف تساعد في الكشف عن الدور الذي لعبته RAS في أمراض معينة.

وقد استخدم مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي لأكثر من 30 عاما في وسيلة فعالة لتشير إلى وجود أنجيوتنسين الأولأنا مستقبلات وغيرها من مكونات RAS في الدماغ وغيرها من أنسجة الجرذان والفئران، خنزير غينيا، والكلب والإنسان في إطار مجموعة من الظروف التجريبية 22-34. أهمية تحديد مستقبلات انج الثاني داخل الدماغ هو أن واحدة يمكن تطبيقها التشريح الوظيفي لتصرفات انج الثاني في الدماغ، على سبيل المثال، فإن وجود AT 1 R في النواة مجاور للبطين من منطقة ما تحت المهاد (PVN) يشير إلى وجود وظيفة من آنغ الثاني في الدماغ لتحفيز فاسوبريسين، الأوكسيتوسين أو الإفراج القشرية الافراج عن هرمون (CRH)، أو تفعيل الجهاز العصبي الودي. وهكذا، والأدوية التي تعمل على منع AT 1 R قد يقلل من بعض هذه الآثار بوساطة PVN المرتبط مع أكثر نشاط RAS الدماغ. التقدم في العمل يشير إلى أن استخدام AT 1 الخصوم R يمكن أن تقلل ما بعد الصدمة الإجهاد اضطراب (PTSD) الإفراج -induced من CRH ويخفف من أعراض اضطراب ما بعد الصدمة (هيرت وآخرون، قدم للنشر). وPVN، تحت القبوومن المعروف جهاز (SFO)، واللوزة لتنظيم التوازن، شهية / العطش والنوم والذاكرة، وردود الفعل العاطفية، وهي المناطق المستهدفة من هذه الدراسة مظاهرة. تم فحص هذه المناطق من خلال جمع أقسام الاكليلية من الدماغ على شرائح المجهر، وعلاج المقاطع مع مثبطات محددة جنبا إلى جنب مع لجين مشع معين لمستقبلات انج الثاني. في هذه الدراسة، يتم سرد، واستخدام كافة المواد والكواشف جنبا إلى جنب مع البائعين اقترح اليود 125 إلى radiolabel على مستقبلات انج الثاني، ساركوزين 1، آيسولوسين 8 انج الثاني (SI انج الثاني)، الذي كان آنذاك وتنقيته كما أحادية 125 I -SI انج الثاني باستخدام أساليب HPLC كما هو موضح سابقا (35). استخدام هذا جين مشع نشاط معين مرتفع يسمح التصور من مناطق منخفضة، متوسطة وعالية الكثافة مستقبلات بعد التعرض للأقسام رديولبلد إلى فيلم الأشعة السينية. من خلال معايرة الفيلم مع المعايير عجينة الدماغ التي تحتوي على كميات معروفة من اليود 125، ومبلغ محددمن آنغ الثاني مستقبلات ملزم في منطقة يمكن قياسها كميا. في الدراسات التجريبية، ومستقبلات انج الثاني ملزمة في أدمغة الاشخاص الخاضعين للتجارب يمكن مقارنة ذلك في أدمغة الأشخاص الخاضعين للمراقبة. يمكن أن تشير إلى هذا سواء يتم تغيير تصرفات انج الثاني ردا على حالة وراثية، شذوذ المظهري، دولة المرض أو العلاج من تعاطي المخدرات. ومن ثم يمكن تطبيق هذه المعرفة لتطوير علاجات لعلاج الأمراض المرتبطة ديسريغولاتيون من RAS. التقنيات البديلة التي تحدد مستقبل مواقع الربط، ولكن مع قرار خفض التشريحية، ملزمة المقايسات التي تستخدم الاستعدادات غشاء الأنسجة المستمدة من الخليط الأنسجة، والتي يتم تحضين مع لجين مشع على مجموعة من تركيزات لتقييم جين مشع تقارب ملزمة كما ثابت التفكك (K D ) وقدرة ملزمة القصوى (ماكس ب) من الأنسجة من الاهتمام.

بروتوكول صفها هنا يمكن تقسيمها إلى 5 المشارك الرئيسيmponents: إعداد أقسام الأنسجة لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي. مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي. تعرض فيلم والتنمية؛ علم الانسجة؛ وقياس الكثافة تحليل الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية التي أجريت لهذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة جنوب شرق نوفا في اتفاق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، 8 الطبعة ال (الأكاديميات الوطنية الصحافة، واشنطن، DC، 2011 ).

1. إعداد أقسام الأنسجة لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي

  1. على التضحية، والحصاد أنسجة المخ جديدة، والتفاف في رقائق الألومنيوم وضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن. للحفاظ على الشكل الصحيح، ووضع العقول في قالب الدماغ الذي يحاكي داخل الجمجمة، والتفاف في رقائق الألومنيوم ومكان في - 20 درجة مئوية الفريزر. بعد 30 دقيقة، والأنسجة مكان في حقيبة التخزين المجمد اغلاقها باحكام والانتقال إلى -80 درجة مئوية الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل.
    1. الحصول على عينة الأنسجة الطازجة والمجمدة من الفائدة من الفريزر -80 درجة مئوية، ونقل إلى ناظم البرد لتعيين الحد الأدنى من -10 درجة مئوية والحد الأقصى من -18 درجة مئوية، لتجنب ذوبان الجليد. ضع العينة على الأنسجة جبل مع غليكول وراتنجات المتوسطة التضمين، فقط تضمين جزء صغير من العينة في المتوسط. لالدماغ، هي التي شنت الدماغ عموديا لتمكين باجتزاء في الطائرة الاكليلية.
  2. وضع الأنسجة جبل على مشراح داخل ناظم البرد وتشديد ثابتا في مكانه. ضمان الجانب الأيسر والأيمن من الدماغ هي في الإحداثيات انتيرو-postero نفسها، وأن محور ظهراني بطني هو الأطالس الدماغ عمودي على شائعة الاستخدام.
  3. تبدأ خفض في سمك المطلوب (20 ميكرون موصى به) وذوبان الجليد جبل المقاطع على الشرائح المجهر في الاتجاه العمودي أن يكون لها مساحة سطح أكبر مساحة في الشريحة. جمع المقاطع على الشرائح في مجموعات متتابعة من خمسة، أي أول مجموعة من الشرائح وصفت 1-1، 1-2، 1-3، 1-4، و1-5 (الشكل 3).
  4. بعد ملء مجموعة من الشرائح مع أقسام، تسمح الشرائح للهواء الجاف لمدة تصل إلى 1 ساعة، ثم ضع سليقصر في مربع من البلاستيك الشريحة في حقيبة التخزين المجمد الختم الذاتي، ومخزن في -20 درجة مئوية.

2. مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي

تنبيه: النشاط الإشعاعي. استخدام الملابس الواقية للتعامل مع النشاط الإشعاعي. ويعتمد التخلص عند إنشائها، ويجب أن تتبع مبادئ توجيهية للتسوس بشكل صحيح (نصف العمر 60 يوما) أو يتم انتقاؤها من قبل شركة معتمدة.

  1. إزالة الشرائح "-1" و "-2" من مصلحة من الثلاجة -20 درجة مئوية وجبل إلى السيطرة شريحة (الشكل 5). جبل "-1" الشرائح معا لتلقي العلاج "غير محددة"، و "-2" الشرائح ل"مجموعه" العلاج. الجرار "غير محددة" سيتضمن 10 ميكرومتر تركيزات النهائي من PD123319 على AT 2 R خصم، واللوسارتان على AT 1 R خصم، في المخزن فحص المتوسطة (AM5) (الجدول 1)، و "المجموع" سيحتوي الجرار ملزمة فقط 10 ميكرومتر PD123319 في AM5.
  2. عكس الشريحةالسيطرة على وضع الشرائح في الجرار Coplin مرحلة ما قبل الحضانة مليئة 35-40 مل من AM5، ومثبطات منها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدء مجموعات لاحقة في حمام مرحلة ما قبل الحضانة الخاصة بهم في 4 فترات دقيقة.
  3. على الفور نقل الشرائح من الحل الحضانة قبل لبريدية حضانة الشرائح، التي تحتوي على 10 مل من AM5، بالإضافة إلى تركيز محدد سلفا من 125 I-SI-آنغ الثاني (محسوبة في الشكل 4) مع مثبطات منها، ل60-90 دقيقة في غرفة درجة الحرارة. إذا كان هناك جين مشع كاف، 10 الشرائح يمكن وضعها (العودة إلى الوراء) في السيطرة وتعديل الشرائح وحضنت مع 125 I-SI-آنغ الثاني في الجرار Coplin.
  4. مكان الشرائح مرة أخرى إلى السيطرة الشرائح (إذا لزم الأمر)، وصمة عار، وشطف من قبل يحوم برفق لمدة 1-2 ثانية في 400 مل من الماء المقطر في حاويتين منفصلة.
  5. نقل الشرائح بالتتابع إلى أربعة الجرار Coplin تحتوي على 35-40 مل من AM5 بالضبط 1 دقيقة لكل منهما (كما هو موضح في الشكل رقم 4 </ قوي>).
  6. بعد آخر 1 دقيقة شطف، دوامة بلطف الأقسام لمدة 1-2 ثانية في أربعة تغييرات من الجليد الباردة الماء المقطر.
  7. مجففا الشرائح مع الهواء البارد (تحذير: الهواء الساخن volatizes مجمع المشع) باستخدام أربعة مجففات الشعر اقامة من زوايا مختلفة لمدة 4 دقائق (الشكل 5)، حتى تكون جميع أقسام جافة، ثم وضع على منشفة ورقية.
  8. جبل الشرائح مع الأنسجة التي تواجه حتى على الورق المقوى لبدل إلى فيلم الأشعة السينية باستخدام الشريط مزدوجة من جانب.
  9. جبل واحد على الأقل، و 125 اليود معايرة الشرائح القياسية على كل من الورق المقوى (الشكل 6).
    ملاحظة: المعايير معايرة تتكون من عجينة الدماغ يخلط جيدا مع 125 اليود بد أن مجمعا يضم حلقة الفينول، ضغط بواسطة الطرد المركزي في حقنة 1 مل السلين، التي هي ناظم البرد مقطوع في سمك نفس أقسام الدماغ ومحمولة على ذوبان الجليد على المجهر الشرائح. بدلا من ذلك، 125 المعايير أنا المعايرة فيراتنج البلاستيك مقطوع في 20 سماكة ميكرون يمكن الحصول تجاريا. الراتنج البلاستيكية في هذه المعايير الدروع جزئيا الفيلم من الإشعاع بحيث يجب أن تؤخذ في معادلة أنسجة ~ 40٪ في المعايرة.

3. التعرض السينمائي والتنمية

  1. انتقل إلى غرفة مظلمة مع حزام الظهر كاسيت الأشعة السينية والفيلم تصوير الإشعاع الذاتي. فتح الكاسيت ووضع الورق المقوى مع الشرائح داخل (الشكل 6).
    1. تحويل الأنوار وتشغيل safelight. بعناية فتح مربع من فيلم الأشعة السينية، وإزالة فيلم واحد، ووضع الجانب اللامع الفيلم حتى (مع حافة خشنة في الزاوية اليمنى السفلى) على رأس الشرائح في الكاسيت. بعناية إغلاق الكاسيت، وتحريف الحانات قفل لاغلاق خارج الضوء (الشكل 6). كشف الشرائح لعدة أيام إلى عدة أسابيع في -20 درجة مئوية.
  2. في غرفة مظلمة، فتح الكاسيت والمضي قدما في فيلم تطوير بروكوفاق سطيف.
    1. ضع الشرائح في الصواني على التوالي. مطور لمدة 2 دقيقة، الماء الذي يحتوي على 5٪ حامض الخليك الجليدي لمدة 30 ثانية، ويتدخل لمدة 5 دقائق. الأفلام هي وضعها في علبة مع المياه الجارية لمدة 20 دقيقة، ثم وضعها في Photoflo لمدة لا تتجاوز 10 ثانية، وعلق.
      ملاحظة: يتم تحديد وقت التعرض تجريبيا ويمكن أن تنطوي على أفلام متعددة مع أوقات التعرض مختلفة: فترة طويلة بما فيه الكفاية للحصول على إشارات قابلة للقياس من المناطق مع انخفاض ملزمة، ولكن لا طالما لتشبع الفيلم من المناطق مع ارتفاع ملزمة. مرة واحدة يتم الحصول على التعرض مقبولة، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.

4. علم الأنسجة

  1. إعداد وصمة عار ثيونين والكواشف تلطيخ (الجدول 2، الشكل 7).
    1. وضع "-3" الشرائح في رف الشريحة، ونقل بالترتيب بدءا منزوع الأيونات الماء لمدة 1 دقيقة، ثم ثيونين حل وصمة عار لمدة 10 دقيقة تليها ثلاث الانخفاضات في deionمياه أوتوماتيكية، واحدة غسل 30 ثانية في الماء منزوع الأيونات.
    2. بعد الماء، وضع رف الانزلاق الى يغسل الايثانول على النحو التالي؛ 50٪، 70٪، و 90٪ لمدة 30 ثانية، تليها اثنين من يغسل الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة لكل منهما. وأخيرا، وضع رف الشريحة في الزيلين لمدة 3 دقائق، ثم نقل الى حل زيلين الثاني لمدة 5 دقائق.
  2. إزالة شريحة واحدة في وقت واحد من الحمام زيلين الماضي، وتغطية الحافة العلوية من الشريحة مع قاعدة الراتنج في المذيبات العضوية المتوسطة المتزايدة، ووضع 24 ملم × 60 ملم ساترة على الشريحة. تسمح الشرائح لتجف بما فيه الكفاية ل~ 48 ساعة ثم مسح في الكمبيوتر في 2400 الرمادي نقطة لكل بوصة.

5. تحليل صورة قياس الكثافة

  1. وضع الجانب اللامع الفيلم إلى أسفل، مع حافة خشنة في الزاوية اليسرى السفلية والمسح الضوئي باستخدام ماسحة الملكية قادرة على نقل المعلومات كثافة الفيلم من دون أي تحريف في الكمبيوتر نظام التصوير.
  2. فتح تميز الكلية الملكية التصويرتيم والاستفادة من الحانات المعايرة لوضع معايير المعايرة لتحليل قياس الكثافة في المستقبل من الصور على فيلم (أرقام 9-12).
  3. المناطق قدر من الفائدة عن طريق إما إنشاء القالب أو تحدد تجريبيا مجالات الاهتمام. والبيانات التي تم جمعها وفصلها على أساس الفيلم، إما السيطرة أو النوع البري (قسم)، والمنطقة. تأكد من تضمين الكثافة (fmol / ز)، منطقة المسح الضوئي، ومجموع المنطقة المستهدفة في القياسات (الشكل 9).
    1. ضبط الحانات منطقة المسح الضوئي عن طريق ضمان أن المنطقة ذات الاهتمام يقع بين المعلمات من تسليط الضوء على (الشكل 10).
    2. تصدير البيانات إلى جدول (الجدول 4). مضاعفة مرات كثافة المساحة الإجمالية المستهدفة، ثم القسمة على منطقة المسح الضوئي من أجل الحصول على قيمة الربط في تلك المنطقة المحددة. حالما يتم ذلك لجميع القيم المقاسة، الركيزة التي أنشئت غير محددة من مجموع تسفر ع محددة ملزمةتستاء. ويمكن أيضا أن يؤديها المتوسطات لهذه القيم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر محة عامة عن المسار الأيضي للنظام رينين أنجيوتنسين في الشكل (1) والتركيز المباشر على أنواع فرعية مستقبلات الأنجيوتنسين الثاني (AT 1 R وايه 2 R) الموضح في الشكل 2 الشكل 3 يعرض نقل الدماغ الاكليلية أقسام على الشرائح المجهر، التي يتم تشغيلها بعد ذلك من خلال إجراء مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي باستخدام تركيز 125 I-سيانغ الثاني سلفا كما رأينا في الشكل 4 الشكل 5 يوضح خطوة لتجفيف الشرائح في تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات التي ثم تلصق على الورق المقوى كما رأينا في الشكل 6، وبعد ذلك وضعت الجدول 2 قوائم يتم تحديد الكواشف المستخدمة لإجراء تلطيخ ثيونين للأقسام الأنسجة محمولة على شريحة وصفها في الشكل 7 وحدات قياسية معايرة لتقدير باالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في تاريخ الفحص كما يتضح في الجدول 3. ويبين الشكل 8 إنشاء منحنى القياسية المتعلقة 125 أنا تركيز (fmol / ز الأنسجة) لتصوير التعرض (نسبة كثافة متعلق بإخصائي النظارات). الشكل 11 يوضح الفرق بين "برنامج التضامن الوطني" و "الكلية" مجموعات، وكذلك التسميات النسيج، في حين يصف الشكل 10 تحديد العتبة إلى قيمة الصفر بالقرب من الحصول على قيمة دقيقة متوسط ​​للمنطقة الممسوحة ضوئيا بأكملها (مسح منطقة بكسل). الجدول 4 يعرض الكمي عملية الحصول محددة وملزمة على أساس طرح "غير محددة" من "مجموع" القيم. "غير محددة" ملزم الذي يحتوي على اللوسارتان و / أو إنشاء PD123319 بمقدار جين مشع ملزمة بعدم-AT 1، أو AT 2 مستقبلات. كل من جين مشع بد أن AT 1 المستقبلات في وجود PD123319 تعطي "المجموع" ملزمة. F igure 11 يعرض مناطق محسوبة النهائية للPVN في المجموع ملزمة المتاخمة مقابل غير محددة إلى القسم الملون ثيونين لتأكيد التشريحي للPVN.

شكل 1
الشكل 1: المسار الأيضي للنظام الرينين-أنجيوتنسين (RAS) في الجسم والكبد بتحرير مولد الأنجيوتنسين زايموجين، الذي هو المشقوق من قبل رينين يفرز الكلى، وتشكيل أنجيوتنسين الأول للأنجيوتنسين تحويل انزيم (ACE) يحول آنغ لي في أنجيوتنسين الثاني ( آنج الثاني)، والسلائف الرئيسي لأمراض القلب والأوعية الدموية. آنج الثاني يسبب تضيق الأوعية، ويزيد ضغط الدم، والنتاج القلبي، وشهية الملح، والعطش، والاحتفاظ بالماء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"> الشكل 2
الشكل 2: وظائف من نوع أنجيوتنسين 1 و 2 مستقبلات (AT 1 R، AT 2 R) AT 1 R يؤثر بشكل مرضي أمراض القلب والأوعية الدموية، ويعمل مباشرة لزيادة العطش والرغبة في الملح، ويمارس العديد من الأنشطة الخلوية الطرفية الأخرى، وكذلك وسط الآثار النفسية. AT 2 R هو خصم الفسيولوجية للمستقبلات AT 1، والمساعدة في فعالية AT 1 R الخصوم 36 وبالتالي وجود آثار مفيدة على بنية الأوعية الدموية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): Cryosectioning من الدماغ على الشرائح المجهر في 20 ميكرون سمك. وتبعا لدرجة حرارة ناظم البرد، والأقسام في بعض الأحيان عرض طيات، والشقوق، الشباك، أو تصبح المتراصة على شفرة مشراح أو حامل سكين. في مثل هذه الحالات يتم تجاهل القسم ويتم مذكرة تشير إلى أن اضافي 20 ميكرون سيفصل هذا القسم من المقطع السابق. وينبغي جمع المقاطع على الشرائح في الاتجاه الرأسي من أجل تحقيق أقصى قدر من المساحة الإجمالية المطلوبة لملء شريحة وجمع أكبر قدر من الفروع في كل شريحة ول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: عينة من تصميم التجارب وبروتوكول لمستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي Differentiأوجه من "المجموع" (-2) و "غير محددة" (-1) تتصل مباشرة الى حضور وغياب خصم مستقبلات النوع الفرعي. قد تختلف البروتوكول على أساس عدد من الشرائح، وسيزداد بزيادات 2 لكل زوج من الشرائح الكاملة وغير محددة. تركيز جين مشع، يتم الحصول عليها عن طريق التخفيف من الأسهم في AM5 التي سبق تحديدها. ثم يتم توزيع هذا الحل بالتساوي على حاويات الحضانة. تؤخذ التهم مباشرة قبل وبعد الحضانة لتأسيس التركيز الدقيق لجين مشع. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: تكوين لمحطة التجفيف في تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات مرات التجفيف سوف تختلف بناء على كفاءة ضربة مجففات فضلا عن القدرة على صمة عار بعيدا أي المياه الزائدة بعد يشطف الماضية. سيتم المجفف الشرائح مرة واحدة يتحول قسم من الواضح إلى الأبيض. إذا لم يتم تجفيفها بالكامل الشرائح ثم لجين مشع يمكن منتشر بعيدا عن إنتاج صورة ضبابية غير محددة لمستقبلات مواقع الربط مستقبلات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل (6):.. تعريض الشرائح المعالجة إلى فيلم الأشعة السينية باستخدام كاسيت المتخصصة ينصح الشريحة انشاء اتباع نمط حيث يتم تسهيل المقارنة بين كلا المجموعتين الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

r.within الصفحات = "1"> الرقم 7
الرقم 7: تعيين المتابعة لثيونين تلطيخ. يتم تحميل الشرائح في حامل الشرائح ومغمورة إلى حلول متتابعة. توقيت يسمح لتلطيخ الفعال للمادة نيسل (الخام الشبكة الإندوبلازمية) من الخلايا العصبية. تطبيق المتوسط ​​تصاعد على الشرائح التالية الجفاف يسمح لتحديد ساترة إلى الشريحة، والحفاظ على أقسام للتحليل المقارن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8: وضع معيار معايرة يحتوي كل فيلم معاييرها المعايرة الفردية، استنادا إلى عجينة الدماغ والوقت الذي تم التجربة . يتم إنشاء خط الانحدار واصفا أفضل القيم صالح باستخدام برنامج نظام التصوير الملكية لمعايير عجينة الدماغ قياسها. وهذا يحول القيمة النسبية الكثافة متعلق بإخصائي النظارات (رود) من المعايير معايرة (الأمراض المنقولة جنسيا كال، في الدائرة البيضاوية الحمراء) إلى وحدات من جين مشع ملزمة، في هذا المثال وحدات (fmol / ز، دائري باللون الأحمر) وجين مشع fmole ملزمة لكل غرام من الرطب وزن الأنسجة (fmol / ز). ويتم قياس معايير عجينة الدماغ مع أداة دائرية وتوضع في وسط العينة التي تظهر على اليمين في pseudocolor باستخدام أيقونة عرض صورة (دائري باللون الأحمر). دائرة لقياس ايوجد معيار المعايرة لتغطية العينة كلها، وإنما قياس مساحة حتى من المعيار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/53866fig9.jpg "/>
الرقم 9: تحديد مجموعة من عدد العينة، غير محددة / المجموع، ومناطق للقراءات عينة لأن كميا أدمغة متعددة، مناطق الدماغ، والمجموعات التجريبية متعددة معا، لا بد من التفريق بين كل من العوامل. يشير هذا الموضوع العينة الدماغ ويمكن أن تشير أيضا إلى الجماعة؛ ويشير القسم سواء كانت غير محددة (اس بي) أو الكلي، في حين يسمح للمنطقة وتحديد المناطق الدماغية المتعددة التي يتم أخذ عينات. شريط الأدوات عينة (مستطيل أحمر) يصف أدوات أخذ العينات المختلفة، على سبيل المثال، دائرة، مربع، قالب، مرفوعة، ممحاة، والتي يمكن استخدامها لتحديد المنطقة المراد قياسها. وسجلت قيم رود حصلت داخل المنطقة من أداة أخذ العينات على جدول الوحدات كما المحولة ملزمة، fmol / ز (دائري باللون الأحمر). وبالإضافة إلى ذلك، يتم تسجيل المساحة الكلية للمسح داخل أداة أخذ العينات في عمود "مسح منطقة بكسل" في حين أن إجمالي ريتم تسجيل منطقة arget (عدد البيكسلات التي تتجاوز قيمة العتبة (وصفها في الشكل 10 أسطورة) في عمود "إجمالي TGT منطقة بكسل". يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10
الشكل 10: تحديد عتبة العينات المراد قياسها على أساس معايير ومنطقة المسح الضوئي هي فريدة من نوعها لكل فيلم، ويعتمد على المعايير المحددة. باستخدام أداة العتبة (دائري باللون الأحمر) لتعيين قيم الحد الأدنى لنطاق كثافة لمنطقة المسح الضوئي في fmol / ز سيسمح للمناطق قياس (بين العلامتين السهام قطري) لتقع بين مجموعة من 0، إلى حد ما حيث يبدأ منحنى المعايرة إلى الخط المقارب مشيرا إلى أن الفيلم تقترب من التعرض القصوى، والتي تتجاوز إضافية يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 11
الرقم 11: صور الممثل تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات ملزمة لأقسام الاكليلية من الإناث الفئران ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي (SHR) في ~ 1.8 ملم الذيلية إلى Bregma، عرض نواة مجاور للبطين من منطقة ما تحت المهاد (PVN) ونواة السرير من ملحق الجهاز الشمي (BAOT ). (A </ قوي>) إجمالي ملزم من AT 1 R ملزمة (الأحمر- PVN، Yellow- BAOT). (ب) عدم محددة ملزمة مع اللوسارتان (AT1R خصم) وPD123319 (AT2R خصم). (C) إجمالي ملزم من AT 1 R ملزم مع الإعداد عتبة التعسفية مثل لتحديد شكل PVN (ملء الأسود) تتجاوز قيمة العتبة داخل منطقة المسح الضوئي التي يتم تسجيلها كما إجمالي المساحة TGT). (D) ثيونين الملون القسم للتأكيد التشريحي للهياكل تبين ارتفاع مجموع ملزمة، وللمقارنة مع مناطق أخرى من الدماغ أو المجموعات التجريبية الأخرى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكواشف كمية
كلوريد الصوديوم 8.76 ز
نا 2 EDTA 1.86 ز
باسيتراسين 141 ملغ
500 ملم ثنائي القاعدة نا 2 ص 4 100 مل
المقطر منزوع الأيونات الماء 900 مل
ضبط درجة الحموضة إلى 7،1-7،2 مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك

الجدول 1: الفحص المتوسطة (AM5) المكونات الكيميائية للالعازلة المستخدمة في إعداد الأنسجة.

الجدول 1
الجدول 2: ثيونين صمة عار الكواشف يتكون صمة عار ثيونين تتكون من الماء المقطر، 1.0 M خلات الصوديوم و 1.0 حل M الجليدية حمض الخليك، معاير لدرجة الحموضة من 4.3 قبل إضافة 0.5٪ ثيونين حل.

t.within صفحة = "دائما">
أيام التاريخ المرجعي الماضي
دفعة fmol / غرام من الوزن الرطب تاريخ المرجع 1 2 3 4 5
معيار نانوكوري / ملغ fmol / ز DPM / ز fmol / ز حرية التنقل / ز fmol / ز fmol / ز fmol / ز fmol / ز
عدد 30 مايو 30 مايو 30 مايو 30 مايو 31 مايو 1-يونيو 2-يونيو 3 يونيو 4-يونيو
1 9706 4463 21547320 4463 4411 4361 4311 4261 4212
2 5838 2684 12960360 2684 2653 2623 2593 2563 2533
3 2798 1286 6211560 1286 1272 1257 1243 1228 1214
4 1451 667 3221220 667 659 652 644 637 630
5 787 362 1747140 362 358 354 350 345 342
6 385 177 854700 177 174 173 171 169 167

الجدول 3: الحسابات اليومية تسوس السعر لمعايير المعايرة سوف تحتاج إلى أن تنشأ على أساس التواريخ التي تم إجراء التجربة جدول بيانات معدل تسوس اليومي للمعايير المعايرة. وتستند هذه البيانات على أول معدل أجل مستمر مع نصف الحياة (ر ½) لمدة 60 يوما. N = N 0 * البريد كيلوطن، حيث N = تركيز 125 أنا، في الوقت t بالنسبة للتركيز في وقت 0 (N 0)، و k = LN2 / ر 1/2.

قسم </ tr>
مجاور للبطين Nucleous من المهاد
هدف الكثافة fmol / ز منطقة المسح الضوئي إجمالى مساحة الهدف مجموع*
مجموع 1 996 4383 4383 996
مجموع 2 921 3362 3362 921
مجموع 3 818 3445 3445 818 محددة وملزمة
مجموع 4 710 2906 2906 710 967
متوسط 861 3524 3524 861 895
763
قسم هدف الكثافة fmol / ز منطقة المسح الضوئي إجمالى مساحة الهدف غير محددة * 678
برنامج الفضاء الوطني 1 53 3072 1737 30 826
برنامج الفضاء الوطني 2 52 2959 1455 26
برنامج الفضاء الوطني 3 86 3180 2035 55
برنامج الفضاء الوطني 4 53 3293 1995 32
متوسط 61 3126 1،805.5 36
السرير نواة الاكسسوار Olfacحزب المحافظين المسالك
قسم هدف أوكار-fmol / ز منطقة المسح الضوئي إجمالى مساحة الهدف مجموع*
مجموع 1 439 3632 3632 439
مجموع 2 435 3632 3632 435
مجموع 3 355 3632 3620 354
مجموع 4 435 3632 3631 435 محددة وملزمة
مجموع 5 342 3632 3630 342 414
مجموع 6 334 3632 3606 331 393
متوسط 390 3632 3625 389 321
394
315
قسم هدف أوكار-fmol / ز منطقة المسح الضوئي إجمالى مساحة الهدف غير محددة * 320
برنامج الفضاء الوطني 1 49 3632 1846 25 360
برنامج الفضاء الوطني 2 64 3632 2362 42
برنامج الفضاء الوطني 3 53 3632 2275 33
برنامج الفضاء الوطني 4 64 3632 2339 41
برنامج الفضاء الوطني 5 51 3632 1879 26
برنامج الفضاء الوطني 6 41 3632 966 11
متوسط 54 3632 1945 30
* إجمالي وغير speciic وحدات كثافة fmol / ز.
مجموع = الكثافة * إجمالي المنطقة المستهدفة / منطقة المسح الضوئي
غير محددة = الكثافة * المساحة الإجمالية المستهدفة / منطقة المسح الضوئي
إجمالى مساحة الهدف هو بكسل التي فاقت قيمة العتبة، تعيين أقرب إلى 0.00 fmol / ز ممكن.
بكسل لا يتجاوز عتبةقيمة تتلقى قيمة 0 للتقييم من إجمالي الكثافة.
بكسل لا تتجاوز قيمة العتبة تتلقى قيمة 0 لتقييم كثافة غير محددة.
محددة وملزمة هو مجموع ناقص غير محددة الملزمة أعرب وحدات كثافة fmol / ز.

الجدول 4: التحليل الكمي للنواة مجاور للبطين من منطقة ما تحت المهاد وسرير نواة ملحق حاسة الشم المسالك بيانات صادرات البرمجيات التصوير كجدول بيانات في fmol / ز، منطقة المسح الضوئي، ومجموع المنطقة المستهدفة في بكسل. "غير محددة" ملزمة يتم طرح من "المجموع" ملزمة من أجل الحصول على محددة AT 1 ملزم الكمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويحدد بروتوكول صفها التصور من "مجموع" و "غير محددة" ملزمة للجين مشع في المقاطع المتجاورة من أقسام الاكليلية من الدماغ القوارض من قبل حصادها وتخزينها في -80 درجة مئوية، ويمكن أن تكون قابلة للتطبيق بسهولة إلى كل الأنسجة التي حلت تشريحيا الأساسات التي تعرض كميات التفاضلية من المستقبلات أو مواقع لجين مشع ملزمة. الإجراءات الموضحة ضمن بروتوكول بسيطة وتحليل أمر بالغ الأهمية لتفسير النتائج بشكل صحيح. تم تحديد سماكة 20 ميكرون لتكون الأمثل. إذا كان المقطع سميكا جدا وغير محددة وملزمة وزيادة، مما يجعل من الصعب حل ملزم للجين مشع إلى هدفه. إذا تم قطع قسم أرق، يصبح من الصعب خفض بنجاح، وحفظ المقاطع متتابعة دون تحريف. ودرجة الحرارة المثلى القطع تختلف قليلا نظرا لطبيعة الأنسجة وسماكة المقاطع وأناق عادة ما تحدد تجريبيا. مرة واحدة يتم الاتصال بين النصل والأنسجة، ويمكن إعادة النظر في التوجه للعينة، وتكييفها عن طريق تحريك عينة الأنسجة تتراجع عن النصل، وإعادة توجيه الكرة في تصاعد مستمر. عندما قطع دماغ القوارض فمن الأهمية بمكان لضمان الجانب الأيسر والأيمن من الدماغ هي في الإحداثيات انتيرو-postero نفسها، وأن محور ظهراني بطني هو الأطالس الدماغ عمودي على شائعة الاستخدام. مجموعات الشرائح وقبل المسمى من أجل إجراء دراسات حول أقسام المجاورة للأنسجة. وصفت مجموعات الأولى من 5 شرائح 1-1، 1-2، 1-3، 1-4، و1-5. يذهب قسم أول خطوة من نوعها على الشريحة 1-1 في الزاوية اليسرى العليا (وهذا هو أعلى الزاوية اليمنى من الشريحة عندما يكون الجانب بلوري لأسفل). يذهب قسم ثاني خفض في الشريحة 1-2، الخ يذهب القسم قطع الخامس على الشريحة 1-5. يذهب قسم قطع السادس على الشريحة 1-1 على يسار الباب الأول. بعد شغل أول مجموعة من الشرائح، تبدأ مجموعة أخرى من 5 انزلقوفاق، وصفت 2-1، 2-2، 2-3، 2-4، و2-5. وتستمر هذه الدورة بقدر ما يعود إلى الدماغ عند الضرورة. و"-4" و "-5" وتحفظ الشرائح كنسخة احتياطية أو لradiolabel مستقبلات مختلفة.

يعتمد بروتوكول مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي على جين مشع يستخدم وخصائص المستقبلات يجري مسح لتحديد تركيزات من مخازن والأملاح ومثبطات. لقياس النوع الفرعي AT1 مستقبلات انج الثاني في هذا الإجراء، وهي عالية تقارب اليود 125 وصفت يجند، 125 I-سار 1 إيل 8 -Ang الثاني (125 I-SI-آنغ الثاني)؛ رديولبلد التي كتبها روبرت سبيت، دكتوراه يذوب (الببتيد Radioiodination الموارد المشتركة، جامعة جورج تاون)، الذي هو أيضا المتاحة تجاريا) في المخزن AM5 (الجدول 1). منطقة عازلة فوسفات الصوديوم مع كلوريد الصوديوم، EDTA وباسيتراسين. AM5 يوفر حماية جيدة للجين مشع من metallopeptidases وpeptida الحساسة باسيتراسينإس إي إس توفير درجة الحموضة الفسيولوجية وتركيز كلوريد الصوديوم لتحسين خصائص ملزمة. مرحلة ما قبل الحضانة في AM5 تكشف المقاطع الأنسجة لببتيداز مثبطات للحد من تدهور جين مشع، وأيضا تنأى الذاتية انج الثاني من المستقبلات انج الثاني. اللوسارتان وPD123319، AT1R وAT2R الخصوم، على التوالي، التي تشبع تضاف مستقبلات هدفهم بتركيزات (10 ميكرومتر) لمنع جين مشع من ملزمة لهذه المستقبلات لتقييم غير محددة وملزمة والحد محددة ملزمة لمستقبلات AT1، على التوالي. يتم تحديد التركيز المطلوب 125 I-SI-آنغ الثاني للمقايسة ويتم تحديد التخفيف المطلوب من محلول المخزون من جدول معدل تسوس النظائر المشعة (انظر بروتوكول الجدول 3). على النحو الأمثل ويستخدم تركيز جين مشع تقارب K D التي لن تشغل 50٪ من المستقبلات الحالية. ومع ذلك، لأن radioligands يمكن أن يكون مكلفا انخفاض تركيزات ه.G. 10-20٪ من تركيز K D يمكن استخدامها. هذا له ميزة المحتملة لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عن طريق خفض غير محددة ملزمة أكثر من ملزمة محددة. ومع ذلك، هناك حاجة التعرض مرات أطول لوضع صورة ملزمة. كما ذكر أعلاه (القسم 3.4)، إذا تعرض عليها فوق أو تحت المكشوفة، والشرائح يمكن إعادة يتعرض لفيلم جديد للأقصر و / أو وقتا أطول لتحقيق التعرض المطلوب.

ويمكن أن يتم تحليل صورة قياس الكثافة من قبل نظام التصوير الشخصية التي تقدم خلاصة واسعة من التطبيقات للتصوير الإشعاع الذاتي فضلا عن التطبيقات الأخرى. معايير المعايرة هي في fmol / غرام من الوزن الرطب الأنسجة (على افتراض الثقل النوعي واحد لالأنسجة). وسيكون لكل مجموعة قياسية، جنبا إلى جنب مع خلفية توليد منحنى القياسية. وهناك العديد من خوارزميات المناسب منحنى مع وبدون ترجيح المتاحة لتوليد منحنى قياسي من د متعلق بإخصائي النظارات النسبيensity (رود) القيم للمعايير معايرة مختلفة. ويتم اختيار منحنى الذي يمثل أفضل البيانات تجريبيا كما روتين لمنحنى المناسب لا توفر قيم الخطأ النسبية للمنحنيات قياسية مختلفة. في قضبان تصل إلى ~ 0.6، المنحنى هو معيار pseudolinear. ومع ذلك، يبدأ الفيلم لتشبع بعد هذه النقطة تشكيل منحنى أن الخطوط المقاربة حول 0،8-0،9 وحدة رود. إذا كانت المعايير التي يتم بين أقواس العينات فوق وحدات 0.9 رود، فمن المستحسن أن إعادة فضح-الفيلم لفترة أقصر من الوقت للحصول على قيم أكثر موثوقية من fmol / ز ملزم من العينات أقرب إلى مجموعة pseudolinear المعيار منحنى. والقيم المستمدة في هذا التطرف من المنحنى القياسي يؤدي إلى اختلافات صغيرة في رود الاختلافات أكبر بكثير في جين مشع ملزمة. وبالتالي القدرة على اكتشاف التغيرات في انخفاض ملزمة مع اقتراب الفيلم نقطة التشبع.

لقياس مناطق معينة،التدابير الموصى بها هي "الكثافة" في fmol / ز، "منطقة المسح الضوئي" في بكسل، و "إجمالي المساحة المستهدف" في بكسل (الشكل 9). من المهم تعيين قيمة عتبة أقرب إلى الصفر ممكن (الشكل 10) بسبب التغيرات في الكثافة فيلم أو الجانب التعسفي من المنحنى القياسي المستمدة من المعايير معايرة يمكن أن تعطي أحيانا القيم أقل من الصفر. إذا بلغ متوسط ​​هذه القيم لجميع بكسل في منطقة المسح الضوئي انها تستمد قيمة منخفضة بشكل مصطنع. المعايير المستخدمة لتحديد المناطق التي يمكن أن تكون ملزمة ذاتية جدا، لذلك فمن الأفضل أن الزوج عن كثب مراقبة والعقول التجريبية قدر الإمكان للحد من وقوع أخطاء غير موضوعية. وهناك تحد آخر هو أن تقرر عدد الأقسام في المتوسط ​​للحصول على القراءة النهائية. ومؤشرا جيدا لأقسام لتحليل يمكن تحديد باتباع أطلس دماغ الفئران المقبولة، جنبا إلى جنب مع شرائح الأنسجة الملون. حجم منطقة أخذ العينات ويمكن أيضا أن يكونمشكلة. من أجل التعويض، يمكن إنشاء قالب لتصحيح أي اختلافات الحجم. علاج المقاطع يمكن أن تؤثر أيضا على منطقة من الهيكل الذي ملزمة عالية وسوف يتم بحثها خلال التحليل. ويتطلب ذلك استخدام بديل من أداة "العتبة" في نظام التصوير الملكية لتحديد مدى كثافة تتجاوز قيمة التعسفية وذلك لتمثيل الخصائص التشريحية للمنطقة في الدماغ يتم أخذ عينات مثل نواة مجاور للبطين من منطقة ما تحت المهاد في أداة أخذ العينات التي تشمل المنطقة من اهتمام (الشكل 11، لوحة C). ومن الممكن أيضا أن تشمل قياس المنطقة إلى تحديد كمية ملزمة. ويمكن القيام بذلك عن طريق ضرب قيمة مرات محددة ملزمة عدد البكسل التي تم قياسها. يمكن تحويلها إلى وحدات بكسل متري عن طريق التصوير الحاكم في طائرتين، أو مستطيل الأبعاد المعروفة. عدد البكسل التي تتوافق معويمكن بعد ذلك أعرب طول أو مساحة المستطيل في وحدات متري. في 2400 نقطة في البوصة، ~ 9000 بكسل = 1 ملم 2 في نظامنا.

على الرغم من أن استخدام بروابط المشعة لم يعد أسلوب يستخدم على نطاق واسع. وهي واحدة من عدد قليل من الطرق لتصور التوزيع المادي من المستقبلات داخل أنسجة العينات أنفسهم وظيفية (قادرة على الربط يجند لها الفطري). بالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن quantitate عدد مستقبلات لتمكين تقييم التغيرات في التعبير مستقبلات الوظيفي بين مجموعات العلاج، بين مناطق الدماغ المختلفة أو غيرها من الهياكل، بين سلالات مختلفة من الحيوانات، أو الحيوانات من مختلف الأعمار، وما هي الطرق البديلة المتاحة للتميز جوانب تشريحي عصبي التعبير مستقبلات AT 1، ومع ذلك، لديهم قيمة محدودة. في الموقع التهجين مرنا لشركة AT 1 مستقبلات لا تتوافق دائما مع AT 1 مستقبلات التعبير أو التوزيع فيالدماغ. في حين التقنيات المناعية يمكن أن تقارب الاختلافات في التعبير مستقبلات استنادا إلى كثافة تلطيخ أقسام الأنسجة، فإنه ليس من الممكن لتوليد منحنى القياسية لتلطيخ للسماح لتقرير العددي للتعبير مستقبلات. يوفر مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي أيضا مستوى من الدقة لمستقبلات (أو غيرها من الأهداف التي تربط تحديدا radioligands) التي لا يمكن أن تكون مضمونة باستخدام التقنيات المناعية. في عام 2009، ونشرت سلسلة من المقالات 37-43 تشكك في صحة 49 الأجسام المضادة التي كانت تستخدم لتقييم 18 مختلفة G مستقبلات البروتين يقترن وقناة عابرة إمكانات مستقبلات (TRP). في جوهرها، والأجسام المضادة وصفت العصابات متطابقة حول البقع الغربية من النوع البري والفئران خروج المغلوب للمستقبلات في السؤال. وفي وقت لاحق، جعلت العديد من الجماعات ملاحظات مماثلة باستخدام المتاحة تجاريا AT 1 وايه 2 الأجسام المضادة لمستقبلات 44-49. استخدام البكترياآل الكروموسوم الاصطناعي الذي يولد جزيء مراسل، على سبيل المثال، البروتين الفلوري الأخضر، مدفوعا AT 1 المروج وسيلة غير مباشرة لتحديد وجود أو عدم وجود AT 1 الخلايا التعبير عن مستقبلات في الماوس (ولكن ليس فأر) العقول على أساس وجود لها وظيفية AT 1 مستقبلات المروج 50. فمن الممكن لحساب "خلايا إيجابية" في مناطق الدماغ التي تم تحديدها مجهريا، ولكن ليس ل quantitate التغيرات في كثافة التعبير عن مستقبلات AT 1 في هذه المناطق. وهكذا في هذا الوقت تقنيات فقط التحقق من صحة تلك المتوفرة لقياس مباشرة تعبير مستقبلات انج الثانية هي لجين مشع أساليب ملزمة. وإذا كانت هناك حاجة قرار تشريحية وظيفية AT 1 مستقبلات البروتين في المستوى المجهري، مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي هو الأسلوب الوحيد المتاح لمثل هذا القياس المباشر.

مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي لا يخلو من القيود. هذا القلق الرئيسيn غير ذلك من تلبية متطلبات استخدام المواد المشعة في إعداد البحوث. ومن الضروري أن يكون لديك برنامج السلامة من الإشعاع مع المبادئ التوجيهية صارمة لضمان سلامة من الباحثين الذين يعملون مع المواد المشعة والتصرف الآمن للمواد المشعة. هذا تصاعد تكلفة الابحاث التي تستخدم المواد المشعة إلى النقطة التي تحول دون استخدامها في العديد من إعدادات البحث. بالإضافة إلى ذلك، فإن تكلفة radioligands يمكن أن تكون كبيرة. وهكذا تجربة مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي الذي يتم تحضين عدد كبير من أقسام الأنسجة محمولة على الشرائح في حاويات من جين مشع يمكن استخدام المئات إن لم يكن الآلاف من الدولارات من جين مشع. الحد الآخر هو أن الأنسجة يجب أن تجمد قبل باجتزاء على ناظم البرد وتخزينها لفترة من الوقت، وسرعان ما تشطف وتجفف بعد الحضانة مع لجين مشع، والتي يمكن أن تنال من قدرة المستقبلات أو البروتين من الاهتمام لربط جين مشع . لبروابط أن يكون الحمار السريعociation حركية / التفكك، فإنه قد لا يكون من الممكن الإبقاء على الملزم للجين مشع لمستقبلات خلال الوقت اللازم لشطف بعيدا جين مشع ملزمة غير وجه التحديد. أيضا، مع كميات قليلة من جين مشع ملزمة فترات طويلة من التعرض فيلم - شهر واحد أو أكثر - قد يكون مطلوبا قبل صورة قابلة للقياس يمكن أن تشكل على الفيلم. وهناك تحد آخر هو أن إضافة اليود 125 ليجند قد تضعف قدرة يجند لربط مستقبلات البروتين المستهدف أو بسبب عائق الفراغية. استخدام جزيء أصغر، على سبيل المثال، التريتيوم (3 H) يلغي مشكلة الإعاقة الفراغية، ولكن التريتيوم لديه هذه الطاقة المنخفضة والنشاط النوعي المنخفض (نسبة إلى اليود 125) أنه من الصعب للغاية لتوليد صورة الفيلم لأكثر السكان مستقبلات. في ضوء هذه القضايا، وهناك العديد من الحالات التي مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي غير قادر على تحديد مستقبلات أو الهياكل الجزيئية الأخرى ذات الاهتمام.

وعلى الرغم من لى لmitations، مستقبلات تصوير الإشعاع الذاتي يمكن تحديد هياكل محددة داخل الأنسجة، وعلى سبيل المثال، مناطق الدماغ تتغير استجابة للمتغيرات التجريبية مقارنة إلى عنصر تحكم الدماغ العادي. هذه المعرفة يمكن أن تساعد في تحديد دور R AT 1 لانج الثاني أو غيرها من مستقبلات أو الإنزيمات في علم الأمراض من الأمراض. هذه المعرفة لها آثار الدوائية قيمة، لأنه يشير إلى المناطق المستهدفة لعلاجات محتملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
500 ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24 mm x 60 mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8 x 11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep/OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides, Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Tags

علم الأعصاب، العدد 112، مستقبلات، تصوير الإشعاع الذاتي، ناظم البرد، باجتزاء الدماغ، والأشعة السينية، فيلم، وتطوير، AT
بروتوكول تصوير الإشعاع الذاتي مستقبلات للالتصور المترجمة من أنجيوتنسين الثاني المستقبلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linares, A., Couling, L. E.,… More

Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter