Abstract
このプロトコルは、受容体オートラジオグラフィーマッピングを実行するためのAng II受容体に特異的な放射性リガンドを用いて、ラット脳におけるアンジオテンシンII（アンギオテンシンII）の受容体結合パターンを説明しています。
組織標本を採取し、-80℃で保存します。クライオスタットは、冠状セクションに組織（脳）を使用し、帯電したスライド上のセクションをマウント解凍します。スライドに取り付けられた組織切片は、アンギオテンシンII受容体を放射標識するために125 I-SI-アンギオテンシンII中でインキュベートします。受容体飽和の非放射性標識アンギオテンシンIIの濃度、または（1 R AT）AT 1アンギオテンシンII受容体サブタイプ選択的なアンギオテンシンII受容体アンタゴニストの存在下で、「非特異的結合」（NSP）、隣接するスライドを2つのセットに分離されています、ノーAT 1 Rアンタゴニストと「総結合」。 AT 2の飽和濃度（2 R AT）アンギオテンシンIIレセプターサブタイプ拮抗薬（PD123319、10μM）もincubati中に存在しますバッファにAT 1 Rサブタイプに結合する125 I-SI-アンギオテンシンIIを制限します。スライド10μMのPD123319にさらされている」結合は合計「ながら〜22℃で30分間のプレインキュベーションの間に、NSPのスライドは、10μMのPD123319およびロサルタンにさらされています。次いで、スライドを「全結合」、およびPD123319およびアッセイ緩衝液中のNSPのためのロサルタン、塩を除去するために、いくつかのバッファ内の「洗浄液」、そして続いて水と非ためのPD123319の存在下で、125 I-SI-アンギオテンシンIIと共にインキュベートします特異的に結合した放射性リガンド。次いで、スライドを、特殊なフィルムとカセットを使用して、オートラジオグラフィーフィルムに露光ブロードライヤーを使用して乾燥させます。フィルムは現像され、画像が独自のイメージングシステムとスプレッドシートを使用して、視覚的および定量的デンシトメトリーのためにコンピュータにスキャンされています。スライドの追加セットは、組織学的比較のためチオニン染色されています。
受容体オートラジオグラフィーを使用する利点は、視覚化する能力でありますアンギオテンシンII組織標本のセクション内のインサイツの受容体、および解剖学的には、隣接する組織の基準セクションと比較することによって組織の領域を特定します。
Introduction
心血管疾患は2011年1米国における死因の30％以上を引き起こし、米国における死亡および障害の主要な原因であり続けています。米国心臓協会からの最新の統計が3で複数の人が1を持っていることを示しています心血管疾患の種類以上。心血管研究は、この疾患の理解に対して、引き続き注力していきますが、世代が高齢になっ始めると、これらの努力を継続することが不可欠です。レニン-アンギオテンシン系（RAS）は、主として、アテローム性動脈硬化症、炎症、全身の血管収縮、交感神経系の活性化（ 図1）2-8 を促進することによって、心血管系の調節において中心的な役割を果たしています。
RASは、腎臓の傍糸球体細胞は、血圧の減少に応答して血流中にレニンを分泌するときに活性化されるホルモン系、増加sympatありますhetic刺激、または黄斑緻密によってナトリウムの流れを減少させました。レニンは、アンジオテンシンI（アンI）を形成する（肝臓で合成された）アンジオテンシノーゲンを代謝します。アンギオテンシンIは、次いで、アンジオテンシンII（ANG II）、RASの主要なエフェクターペプチドを形成するために、主に肺および腎臓で、血管内皮細胞の管腔側に、アンジオテンシン変換酵素（ACE）によって外酵素が代謝されます。アンギオテンシンIIは、2つの受容体サブタイプを活性化することができます。 （1 AT R）タイプ1受容体及び（2 R AT）2型受容体は、心臓血管系を調節する両方、体液および電解質の恒常性を維持し、現在、認知機能および神経変性疾患に影響を与えると考えられている8,9を処理します。局所脳特異RASは、独立して、アンギオテンシンIIを合成することが報告されています。脳では、前駆体タンパク質アンギオテンシノーゲンはレニンのような酵素3によってアンギオテンシンIに変換アストログリア10で合成され、おそらくはプロレニンプロレニン受容体に結合しました11、その後豊富脳12内のニューロンの細胞外表面上に発現されたアンジオテンシン変換酵素によってアンギオテンシンIIに変換されます。アンギオテンシンII生成されたこのintrabrainは1 AT脳および血液由来のAng IIから隔離されている2受容体でアゴニストです。
AT 1 Rは、重要な生理学的役割を果たしているが、それはより良い、主に心臓血管系及び腎臓（ 図2）に影響を与える、体全体にその病態生理学的効果のために知られています。アンギオテンシンIIは、AT 1 Rに結合すると、それは血管収縮を引き起こします。血流に対する抵抗性を増加させ、血圧を上昇させます。それはまた、増加したナトリウムおよび水の保持をもたらす、アルドステロンおよびバソプレシンの合成および分泌を促進します。これらの効果はまた、虚血性脳損傷および認知機能障害を誘発することができ、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびdiabeに連結されていますTES、並びに、最近学習および記憶13-15に影響を与えることが同定されています。レニン分泌を抑制し、腎臓での傍糸球体細胞に1 R ATという点で、RASでフィードバックループがあります。興味深いことに、AT 2 Rは、一般的に血管拡張、神経突起伸長、軸索再生、抗増殖、および他の多くの間で脳保護16-20を引き起こし、1 R ATの行動を反調節します。 AT 2 Rは、抗高血圧、最近、抗がん剤21のための標的として同定されています。様々な組織内のAng II受容体の局在化および密度を決定し、それらがどのように定量的デンシトメトリー受容体オートラジオグラフィーを用いた各種トリートメントや病気の状態によって影響を受けることはRASが特定の疾患に果たす役割を明らかにするのに役立ちます。
受容体オートラジオグラフィーは、アンジオテンシンIの存在を示すための有効な方法として、30年以上にわたって使用されていますI受容体と脳内のRASの他の構成要素および実験条件22-34の様々な下ラット、マウス、モルモット、イヌおよびヒトの他の組織。脳内のAng II受容体の位置を特定することの重要性は、一つは、脳内でのAng IIのアクションに例えば機能的な神経解剖学を適用することができるということである、視床下部の室傍核におけるAT 1 R（PVN）の存在は、アンの機能を示唆しています脳内のIIは、バソプレッシン、オキシトシンまたは副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）のリリース、または交感神経系の活性化を刺激します。したがって、AT 1 Rをブロックする薬は、脳のRASの活動の上に関連したこれらのPVN媒介効果のいくつかを低下させる可能性があります。進行中の作業は1 RアンタゴニストATの使用はCRHの心的外傷後ストレス障害（PTSD）誘導放出を減少させ、PTSDの症状を改善することができることを示唆している（ハートら 、出版のために提出します）。 PVN、弓器官（SFO）、および扁桃体がホメオスタシス、食欲/渇き、睡眠、記憶、感情的反応を調節するために知られており、この実証研究の対象領域です。これらの領域は、顕微鏡スライド上に脳の冠状切片を収集し、およびAng II受容体に特異的な放射性リガンドと共に特異的阻害剤で切片を処理することにより調べました。本研究では、提案したベンダーと一緒にすべての材料および試薬は記載されている、ヨウ素125は、その後、モノ125 Iのようにして精製したアンギオテンシンII受容体拮抗薬、サルコシン1、イソロイシン8のAng II（SIのAng II）を、放射性標識するために使用されたされています以前に35記載のようにHPLC法を用いて-SIのAng II。この高い比活性の放射性リガンドの使用は、X線フィルムへの放射性標識部分の露光後に、低中程度および高い受容体密度の領域の可視化を可能にします。ヨウ素125、特定量の既知量を含む脳ペースト規格にフィルムを校正することにより、領域に結合アンギオテンシンII受容体を定量することができます。実験的研究では、実験対象の脳に結合アンギオテンシンII受容体は、対照被験者の脳におけるものと比較することができます。これはアンギオテンシンIIの作用は、遺伝的状態、表現型の異常、疾患状態または薬物療法に応答して変更されているかどうかを示すことができます。この知識は、その後、RASの調節不全に関連する疾患を治療するための治療法の開発に適用することができます。代替的な受容体結合部位を同定する技術が、低減解剖学的解像度で、解離定数（K Dとしての放射性リガンド結合親和性を評価するために、濃度の範囲にわたって放射性リガンド組織ホモジネート由来の組織の膜調製物を使用する結合アッセイであります目的の組織の）および最大結合能（B max）が。
ここで説明するプロトコルは、大きく5つの共同に分けることができますmponents：受容体オートラジオグラフィーのための組織切片を準備します。受容体オートラジオグラフィー;フィルムの露光、現像、組織学;そして、濃度測定の画像解析。
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Protocol
この研究のために行うすべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針に従ってにノバサウスイースタン大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された、 第 8版（国立アカデミープレス、ワシントン、DC、2011 ）。
受容体オートラジオグラフィーのために1.準備組織切片
- 犠牲時に、収穫の新鮮な脳組織、できるだけ早く-20℃の冷凍庫にアルミ箔と場所で包みます。 20°Cの冷凍庫 - 正しい形状を維持するために、頭蓋骨の内側をシミュレートする脳の金型内の場所の脳は、アルミニウム箔と場所で包みます。 30分後、プレースシール可能な冷凍保存用バッグ内の組織とは、長期保存のために-80℃の冷凍庫に移動します。
- -80 -10℃と-18℃の最大値の最小値に設定し、クライオスタットのC冷凍庫、転送°、回避するための解凍から関心のある新鮮凍結組織標本を入手します。 唯一の媒体への試料のごく一部を埋め込む、メディアを埋め込むグリコールおよび樹脂系でマウント組織上に試料を置きます。脳のために、脳は前頭面で切片有効にするために垂直に装着されています。
- 組織は、クライオスタット内ミクロトーム上にマウント置き、しっかりと所定の位置に締めてください。背腹軸が垂直に一般的に使用するための脳のアトラスであることを同じ前 - postero座標である脳の左右を確認し、。
- スライド内のスペースのより大きな表面積を持つように垂直方向にスライド所望の厚さ（推奨さ20μm）での切断を開始し、顕微鏡上にセクションをマウント解凍。スライドの最初のセット、すなわち、5の連続セットでスライド上のセクションを収集1-1、1-2、1-3、1-4を標識し、1-5（ 図3）されています。
- 切片とスライドのセットを充填した後、最大1時間空気乾燥さスライドを可能にし、SLIを配置デ自己シール冷凍保存バッグプラスチックスライドボックスで、-20℃で保存。
2.受容体オートラジオグラフィー
注意：放射能。放射能を処理するために、保護服装を使用してください。処分は、設立に依存され、かつ適切に崩壊（半減期60日）または認証取得企業によってピックアップされるガイドラインに従わなければなりません。
- （ 図5）を -20℃冷凍庫から興味のある「-2」「-1」とスライドを外し、スライドグリップに取り付けます。一緒に「非特異的」治療のための「-1」のスライド、および「合計」治療のための「-2」のスライドをマウントします。バインディングjarはわずか10が含まれます、「合計」を（ 表1） ' を非特異的」jarは2 R拮抗薬AT PD12331910μMの最終濃度で含有し、アッセイ培地緩衝液中で、1 R拮抗薬AT（AM5）をロサルタンAM5でμMPD123319。
- スライドを反転グリップは、室温で30分間AM5 35〜40 mlを充填したプレインキュベーションコプリンジャーにスライドし、それぞれの阻害剤を配置します。それらのプレインキュベーション浴内の後続のセットは、4分間隔で開始します。
- すぐに部屋で60から90分間、10 AM5のミリリットルに加え、それぞれの阻害剤を用いた（ 図4で計算された）125 I-SI-のAng IIの所定の濃度を含む、インキュベーションスライドメーラーへのプレインキュベーション溶液からスライドを転送します温度。十分な放射性リガンドがある場合は、10スライドが変更されたスライドグリップに（背中合わせに）配置し、コプリンジャーで125 I-SI-のAng IIでインキュベートすることができます。
- 場所は、（必要な場合）、ブロットは、ゆっくり2別々の容器に蒸留水400ミリリットルで1〜2秒間旋回によりすすぎスライドグリップに戻ってスライドします。
- 図4に示すように、<（正確に1分間ずつ順次AM5 35〜40 mlを含む4コプリンジャーにスライドを移し/強いです>）。
- 最後の1分リンスした後、軽く氷冷蒸留水の4変化で1-2秒間のセクションを旋回。
- 涼しい空気とスライドを乾燥さ-ブロー（注意：熱い空気が放射性化合物を揮発さ）（ 図5）4分間異なる角度から設定4ヘアドライヤーを使用して、すべてのセクションが乾燥しているまで、ペーパータオルの上に置きます。
- マウントは、組織が両面テープを使用して、X線フィルムに並置するために段ボールの上に上に向けてスライドします。
- マウント各段ボールの上に少なくとも1、125ヨウ素のキャリブレーション標準のスライド（ 図6）。
注：キャリブレーション基準は徹底的に脳切片と同じ厚さに切断し、顕微鏡上に解凍マウントしクライオスタットある1ミリリットルツベルクリン注射器で遠心分離により圧縮フェノール環を含む化合物に結合した125ヨウ素と混合脳ペーストで構成されスライド。また、125 I較正標準で20μmの厚さで切片可塑性樹脂は、商業的に得ることができます。これらの規格でプラスチック樹脂は、部分的に40％〜の組織等価は、キャリブレーションに考慮されるべきであるように、放射線からフィルムを保護します。
3.フィルムの露光、現像
- ストラップバックX線カセットおよびオートラジオグラフィーフィルムと暗室に進んでください。カセットを開き、内側スライド（ 図6）とのダンボールを置きます。
- ライトをオフにして、セーフライトをオンにします。慎重に1膜を除去し、カセット内のスライドの上に（右下隅にギザギザのエッジに）フィルム光沢面を配置し、X線フィルムのボックスを開きます。慎重にカセットを閉じて、光（ 図6）を出て密封するためにロッキングバーをねじります。 -20℃で数日から数週間のためのスライドを公開します。
- 暗室では、カセットを開き、フィルム開発のprocを進めますESS。
- 連続してトレイにスライドを置きます。 2分、30秒、5％氷酢酸を含有する水、及び5分間定着用現像剤。フィルムはせいぜい10秒Photofloに入れ、ハングした後、20分間流水でトレイに配置されます。
低い結合を有する領域から測定可能な信号を得るために十分な長さではなく、あまりにも長い間高い結合を有する領域によってフィルムを飽和するよう：露光時間は、経験的に決定され、異なる露光時間で複数の膜を含むことができる：注意してください。許容可能な露光が得られたら、次の手順に進みます。
- 連続してトレイにスライドを置きます。 2分、30秒、5％氷酢酸を含有する水、及び5分間定着用現像剤。フィルムはせいぜい10秒Photofloに入れ、ハングした後、20分間流水でトレイに配置されます。
4.組織学
- チオニン染色および染色試薬（ 表2、 図7）を準備します。
- スライドラックに「-3」のスライドを置き、1分間脱イオン水で始まる順番に転送は、その後10分間チオニン染色液には消孤に3ディップが続きます化された水、脱イオン水で1 30秒間洗浄。
- 水に続いて、次のようにエタノール洗浄にスライドラックを置きます。 50％、70％、および30秒間90％は、1分ごとに100％エタノールで2回洗浄しました。最後に、5分間の第二のキシレン溶液に渡って転送した後、3分間キシレンにスライドラックを配置します。
- 最後のキシレン浴から一度に一つのスライドを削除し、有機溶剤封入剤中の樹脂をベースとするスライドの上縁をカバーし、スライド上に24ミリメートル×60ミリメートルカバースリップを配置。スライドは十分に乾燥〜48時間、その後、2400 dpiのグレースケールでコンピューターにスキャンすることができます。
5.濃度測定の画像解析
- 左下隅にあるギザギザのエッジに、フィルム光沢面を下に置き、イメージングシステムのコンピュータ内の任意の歪みのない膜密度情報を送信することができる独自のスキャナを使用してスキャンします。
- 独自のイメージングsysを開きます。フィルム（ - 12 図9）上の画像の今後の濃度分析のためのキャリブレーション標準を確立するために、キャリブレーションバーをTEM及び利用します。
- テンプレートを確立するか、経験的に関心のある分野を概説いずれかによって関心のある分野を測定します。データは、対照または野生型（セクション）、および領域のいずれかを収集し、フィルムに基づいて分離されます。密度（fmolの/ g）を、走査領域、および測定における総ターゲット領域（ 図9）を必ず含めてください。
- 関心領域は、強調表示のパラメータ（ 図10）の間に入ることを保証することにより、スキャンエリアバーを調整します。
- スプレッドシートへのデータのエクスポート（ 表4）。密度時間全体目標面積を掛け、その特定の領域の結合のための値を得るために、スキャン面積で割ます。これは測定されたすべての値に完了すると、特定の結合Pを生成するために合計から設立された非固有の基質憤慨。平均は、これらの値に対して実行されてもよいです。
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Representative Results
レニン-アンギオテンシン系の代謝経路の概要を、図1に示されており、アンジオテンシンII受容体サブタイプ（1 R ATおよび2 R AT）への直接的な焦点は、図2に記載されている。3ディスプレイ冠状脳の転送図 図4に見られるように、所定の125 I-シャンII濃度を用いて受容体オートラジオグラフィーの手順を介して実行された顕微鏡スライド、上のセクション。5図は、その後、段ボールなどの上に固定されている受容体オートラジオグラフィーでのスライドの乾燥工程を示しています図6に見られ、続いて開発した。 表2は、図7で説明したスライドマウントされた組織切片のためのチオニン染色手順のために使用する試薬。定量化のためのキャリブレーション標準単位はBAを決定しています表に見られるように。図8は、（相対検眼密度を）露出を撮影するために125 I濃度（fmolの/ g組織を）に関する標準曲線の確立を示しているアッセイの日にsedの。 図11は、「NSP」の区別を示していますそして、 '合計'基、ならびに組織のラベル、 図10は、全体の走査領域の正確な平均値を得ることがほぼゼロの値に閾値の設定を説明しながら（スキャン領域ピクセル）。 表4のディスプレイ定量「合計」の値から「非特異的」を減算に基づいて、特異的結合を得る工程。 「非特異的」ロサルタンを含み、かつ/またはPD123319非AT 1、または2受容体に結合した放射性リガンドの量によって作成されたバインディング。 PD123319の存在下で、AT 1受容体に結合した放射性リガンドのすべてが「合計」結合。Fをもたらします igure 11ディスプレイPVNの解剖学的な確認のためチオニン染色切片の合計対非特異的結合隣接でPVNの最終測定されたエリア。
図1： 本体内のレニンアンジオテンシン系（RAS）の代謝経路肝臓はアンジオテンシンIをアンジオテンシン変換酵素（ACE）を形成する、腎臓分泌レニンによって切断されるチモーゲンアンジオテンシノーゲンを、リリースは（アンジオテンシンIIへのアンギオテンシンI変換しますアンギオテンシンII）、心血管疾患の主要な前駆体。アンギオテンシンIIは、血管収縮を引き起こし、血圧、心拍出量、塩食欲不振、のどの渇き、及び保水性を向上させます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：1でのRは、病理学的に心血管疾患に影響を与える（2 R AT 1 R AT、） アンジオテンシン1型および2型受容体の機能 、直接渇きと塩の食欲を増加させるように作用し、中央だけでなく、他の多くの周辺細胞活性を発揮します心理的影響。 2 AT Rは、AT 1 Rアンタゴニスト36は 、それによって血管構造に有益な効果を持っていることの有効性を支援する、AT 1受容体の生理的アンタゴニストである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：Cryose顕微鏡への脳のctioningは、厚さ20μmでスライドする。クライオスタットの温度に応じて、セクションでは、時間に折り目、亀裂、カールを表示したり、ミクロトームの刃やナイフホルダーに圧縮さになります。このような場合にはセクションが破棄され、ノートは余分な20μmの前のセクションからこのセクションを分離することを示すために行われています。セクションでは、スライドを埋めるため、各スライド上の切片の最大量を収集するために必要な総面積を最大にするために垂直方向にスライド上に収集されるべきである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 受容体オートラジオグラフィーのための実験デザイン＆議定書のサンプルDifferenti。「合計」（-2）及び「非特異的」（-1）のationが直接受容体サブタイプアンタゴニストの存在下および非存在下にも関します。議定書は、スライドの数に基づいて異なる場合があり、総及び非特定のスライドのペアごとに2ずつ増加します。以前に決定放射性リガンドの濃度は、AM5への株式の希釈によって得られます。次いで、この溶液を均一に培養容器に分配されます。直接カウントは放射性リガンドの正確な濃度を確立するために、インキュベーションの前と後に撮影されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： 受容体オートラジオグラフィーで乾燥ステーションの構成乾燥時間は打撃の効率によって異なりますドライヤーだけでなく、最後のリンス後の任意の余分な水分を離れてブロットする能力。セクションが明確から白に変わるたらスライドを乾燥されます。スライドが完全に乾燥されていない場合には、放射性リガンドは、受容体結合部位に特異的でないファジー画像を生成する受容体から離れて拡散することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6： 特殊なカセットを使用して、X線フィルムに処理したスライドを公開スライドセットアップは、両グループの比較が容易になるパターンに従うことをお勧めします。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7： チオニン染色のためのセットアップ。スライドはスライドホルダーに装填し、シーケンシャル溶液中に浸漬される。タイミングが神経細胞のニッスル物質（粗面小胞体）の効果的な染色を可能にします。脱水次のスライドにマウンティング培地アプリケーションは、比較分析のためのセクションを維持したまま、スライドにカバースリップを固定することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8： 校正標準の設定は、各フィルムは、脳ペースト実験が行われた時間に基づいて、個々の較正標準を含んで 。最良適合値を記述する回帰直線は、測定され脳ペースト標準の独自のイメージングシステムプログラムによって生成されます。これは、単位は（フェムトモル/ gで、赤丸部分）、ウェットのグラム当たりに結合fmole放射性リガンドであり、この例では、放射性リガンド結合の単位に（赤楕円形でCAL性感染症、）較正基準からの相対検眼密度（ROD）値を変換します組織重量（フェムトモル/ G）。脳ペースト基準の測定は、円形のツールを使用して行われ、（赤丸部分）画像表示アイコンを使用して疑似カラーの右側に示したサンプルの中央に配置されています。円は、キャリブレーション標準は、サンプル全体をカバーする必要はありません測定ではなく、標準のさえ面積を測定する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図9： サンプルの測定値のサンプル番号、非特異的/合計、および地域によってグループを識別する複数の脳、脳領域、および複数の実験群が一緒に定量化されるので、すべての要素を区別することが重要です。対象は、脳のサンプルを示し、また、グループを示すことができます。領域がサンプリングされている複数の脳領域の同定を可能にしながら部は、それが非特異的（NSP）、または合計であるかどうかを示します。サンプル・ツール・バー（赤い四角）は、異なるサンプリングツール、 例えば 、円、正方形、テンプレート、フリーハンド、消しゴムを記述する。それは、測定される領域を画定するために使用することができます。サンプリングツールの領域内で得られたRODの値が（赤丸部分）のfmol / gで、結合の変換後の単位としてスプレッドシートに記録されています。総トンながら加えて、サンプリングツール内の全スキャン領域は、「スキャン領域ピクセル」の欄に記録されていますARGETエリア（図10の説明に記載の閾値を（超える画素数が）「総TGTエリアピクセル」の欄に記録されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図10： 規格に基づいて測定されるサンプルのためのしきい値の決意は、スキャン領域は、それぞれのフィルムに固有のものであり、設定された標準に依存します。測定領域を可能にするのfmol /グラムでスキャン領域の濃度範囲のしきい値を設定する（赤丸部分）閾値化ツールを使用してポイントどこまで、0の範囲の間に入るように（斜めの矢印で描写）較正曲線は、追加のそれを超える、フィルムが最大露光に近づいていることを示す漸近線に始まり
図11： 視床下部（PVN）と付属品嗅索の床核の室傍核を表示ブレグマへ〜1.8ミリメートルの尾側で女性の高血圧自然発症ラット（SHR）の冠状断面に結合する受容体オートラジオグラフィーの代表的な画像、（BAOT ）。（</ strong>の）（レッド- PVN、黄色- BAOT）結合AT 1 Rの結合の合計。 （B）ロサルタン（AT1R拮抗薬）およびPD123319（AT2R拮抗薬）との非特異的結合。 （C）の合計）合計TGTエリアとして記録されているスキャン領域内の閾値を超えるPVN（黒塗り）の形状を描写するように任意の閾値は、このような設定と結合1 R ATの結合。 （D）チオニン染色高い総結合を示す構造の解剖学的な確認のためにセクション、および他の脳領域または他の実験群との比較のために。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 試薬 | 量 |
| NaClを | 8.76グラム |
| Na 2 EDTA | 1.86グラム |
| バシトラシン | 141 mgの |
| 500mMの二塩基のNa 2 PO 4 | 100ミリリットル |
| 蒸留脱イオン水 | 900ミリリットル |
| NaOHまたはHClで7.2に7.1にpHを調整します | |
表1：アッセイ培地（AM5）組織の調製に使用される緩衝液の化学成分。
表2：チオニン染色試薬チオニン染色は、1.0 M酢酸ナトリウム、溶液チオニン0.5％を添加する前に4.3のpHまで滴定し、1.0Mの氷酢酸溶液を、蒸留水で構成されています。
| 日過去の基準日 | |||||||||
| バッチ | fmol / g湿重量 | 参考日 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| 標準 | NCI / mgで | fmolの/グラム | DPM /グラム | fmolの/グラム | FOM /グラム | fmolの/グラム | fmolの/グラム | fmolの/グラム | fmolの/グラム |
| 数 | 30-月 | 30-月 | 30-月 | 30-月 | 31月 | 1 - 6月 | 2 - 6月 | 3 - 6月 | 4 - 6月 |
| 1 | 9706 | 4463 | 21547320 | 4463 | 4411 | 4361 | 4311 | 4261 | 4212 |
| 2 | 5838 | 2684 | 12960360 | 2684 | 2653 | 2623 | 2593 | 2563 | 2533 |
| 3 | 2798 | 1286 | 6211560 | 1286 | 1272 | 1257 | 1243 | 1228 | 1214 |
| 4 | 1451 | 667 | 3221220 | 667 | 659 | 652 | 644 | 637 | 630 |
| 5 | 787 | 362 | 1747140 | 362 | 358 | 354 | 350 | 345 | 342 |
| 6 | 385 | 177 | 854700 | 177 | 174 | 173 | 171 | 169 | 167 |
表3：キャリブレーション標準のための毎日の減衰率の計算は、キャリブレーション標準の毎日の減衰率のスプレッドシートは、実験が実行された日付に基づいて作成する必要があります。このスプレッドシートは、60日の半減期（t 1/2）で一定の第1次速度に基づいています。 N = N 0 * E KT、Nは時間t時間0における濃度に対する（N 0）、及びK = LN2 / T 1/2で、125 Iの濃度が=あります。
| 視床下部の室傍核小体 | ターゲット | 密度のfmol /グラム | スキャン範囲 | 総対象地域 | 合計* | |
| 合計 | 1 | 996 | 4383 | 4383 | 996 | |
| 合計 | 2 | 921 | 3362 | 3362 | 921 | |
| 合計 | 3 | 818 | 3445 | 3445 | 818 | 特異結合 |
| 合計 | 4 | 710 | 2906 | 2906 | 710 | 967 |
| 平均 | 861 | 3524 | 3524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ TR>||||||
| セクション | ターゲット | 密度のfmol /グラム | スキャン範囲 | 総対象地域 | 非特異的* | 678 |
| NSP | 1 | 53 | 3072 | 1737 | 30 | 826 |
| NSP | 2 | 52 | 2959 | 1455 | 26 | |
| NSP | 3 | 86 | 3180 | 2035 | 55 | |
| NSP | 4 | 53 | 3293 | 1995 | 32 | |
| 平均 | 61 | 3126 | 1,805.5 | 36 | ||
| アクセサリOlfacの床核保守党トラクト | ||||||
| セクション | ターゲット | 洞穴-のfmol /グラム | スキャン範囲 | 総対象地域 | 合計* | |
| 合計 | 1 | 439 | 3632 | 3632 | 439 | |
| 合計 | 2 | 435 | 3632 | 3632 | 435 | |
| 合計 | 3 | 355 | 3632 | 3620 | 354 | |
| 合計 | 4 | 435 | 3632 | 3631 | 435 | 特異結合 |
| 合計 | 5 | 342 | 3632 | 3630 | 342 | 414 |
| 合計 | 6 | 334 | 3632 | 3606 | 331 | 393 |
| 平均 | 390 | 3632 | 3625 | 389 | 321 | |
| 394 | ||||||
| 315 | ||||||
| セクション | ターゲット | 洞穴-のfmol /グラム | スキャン範囲 | 総対象地域 | 非特異的* | 320 |
| NSP | 1 | 49 | 3632 | 1846 | 25 | 360 |
| NSP | 2 | 64 | 3632 | 2362 | 42 | |
| NSP | 3 | 53 | 3632 | 2275 | 33 | |
| NSP | 4 | 64 | 3632 | 2339 | 41 | |
| NSP | 5 | 51 | 3632 | 1879 | 26 | |
| NSP | 6 | 41 | 3632 | 966 | 11 | |
| 平均 | 54 | 3632 | 1945 | 30 | ||
| *合計と非speciicはフェムトモル/グラムの密度単位です。 | ||||||
| 合計=密度*全体目標面積/スキャンエリア | ||||||
| 非特異的=密度*総対象エリア/スキャンエリア | ||||||
| 総対象地域は、できるだけ0.00 fmolの/グラムに近く設定し、しきい値を超えピクセルです。 | ||||||
| 閾値を超えない画素値は、総密度の評価のために0の値を受け取ります。 | ||||||
| 閾値を超えていない画素は、非特定濃度の評価のために0の値を受け取ります。 | ||||||
| 特異的結合はマイナス非特異はフェムトモル/グラムの密度単位として表現バインディングの合計です。 | ||||||
表4：付属の嗅覚器官の視床下部とベッド核の室傍核の定量分析イメージングソフトウェアの輸出データのfmol /グラムで、スプレッドシート、スキャン領域、およびピクセルの全ターゲット領域として。 「非特異的」結合は、定量的な結合1における特定を得るために、結合「合計」から減算します。
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Discussion
説明されたプロトコルは、齧歯類脳以前に採取し、-80℃で保存の冠状切片の隣接するセクションでの放射性リガンドの結合を「合計」及び「非特異的」の視覚化を識別し、実質的にすべての組織に容易に適用することができること解剖学的に受容体または放射性リガンド結合部位の差分量を表示する下部構造を解決しました。プロトコル内で説明する手順は簡単で、分析は結果を正しく解釈するために重要です。 20μmの厚さは最適であると決定されました。部が厚すぎると、非特異的結合が困難その標的への放射性リガンドの結合を解消すること、増加します。セクションを薄く切断した場合は、正常に切断され、歪みのないシーケンシャルセクションを保存することが困難となります。最適な切削温度が原因で組織の性質やセクションと私の厚さに多少異なりますsが通常は経験的に決定します。接触がブレードと組織との間で行われた後、試料の向きは見直し、バック離れブレードから組織標本を移動し、ボールマウントを再配向することにより、再整列することができます。齧歯類の脳を切断する場合には、脳の左側と右側を確保することが重要である同前 - postero座標であり、背腹軸は、一般的に脳アトラスを使用するために垂直になります。スライドセットは組織の隣接切片に研究を行うために予め標識されています。 5スライドの最初のセットは1-1、1-2、1-3、1-4、1-5のラベルが付いています。最初のカット部（これは、それがダウンしてつや消し側は、スライドの右上隅である）左上にスライド1-1に進み、第二の切断部は、第五の切断面がスライド1-5に行くなど 、スライド1-2に行きます。第六切断部は、最初のセクションの左側にスライド1-1に行きます。スライドの最初のセットが満たされた後、スライド5の別のセットを開始しますエス、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5のラベル。このサイクルは、にまでさかのぼる脳へ、必要に応じて継続されます。 「-4」と「-5」のスライドは、バックアップとして保管されているか、別の受容体を放射性標識します。
受容体オートラジオグラフィープロトコルが使用される放射性リガンドに依存し、受容体の特性は、緩衝液、塩および阻害剤の濃度を決定するために調査されています。この手順でのAng II受容体のAT1サブタイプの測定には、高親和性ヨウ素125標識リガンド、125 I-Sarの1のIle 8 -ang II（125 I-SI-アンギオテンシンII）;ロバート・C・スペス博士ことにより放射性標識商業的にも入手可能である（ペプチド放射性ヨウ素化共有リソース、ジョージタウン大学）は、）AM5バッファ（ 表1）に溶解します。塩化ナトリウム、EDTA及びバシトラシンを有するリン酸ナトリウム緩衝液。 AM5は、メタロペとバシトラシン敏感peptidaから放射性リガンドの良好な保護を提供します結合特性を最適化するために、生理学的pHおよびNaCl濃度を提供するSES。 AM5でプレインキュベーションは、放射性リガンドの分解を最小限にするために阻害剤ペプチダーゼするために、組織切片を露出し、また、アンギオテンシンII受容体の内因性のアンギオテンシンIIを解離します。ロサルタンおよびPD123319、AT1RおよびAT2Rアンタゴニストは、それぞれ、それはそれらの標的受容体はそれぞれ、非特異的結合を評価し、AT1受容体への特異的結合を制限するために、これらの受容体に結合する放射性リガンドを防止する濃度（10μM）で添加する飽和します。アッセイのための125 I-SI-アンギオテンシンIIの所望の濃度を決定し、ストック溶液の必要な希釈は、放射性同位体の崩壊率（プロトコル表3参照）のスプレッドシートから決定されます。最適K Dの近似放射性リガンドの濃度は、本受容体の50％を占めることになるが使用されます。しかし、放射性リガンドは、より低い濃度の電子コストがかかる可能性があるため.G。K D濃度の10〜20％を使用することができます。これは、還元非特異的な特異的結合よりも結合することによって、信号対雑音比を増加させる潜在的な利点を有します。しかし、より長い露光時間が、結合画像を開発する必要があります。 （セクション3.4）上述のようにして得られた露光オーバーや露出の下であれば、スライドは、所望の暴露を達成するために、より短いまたはより長い時間のための新しいフィルムに再曝露することができます。
濃度測定画像解析は、オートラジオグラフィーのためにアプリケーションの広範な大要ならびに他のアプリケーションを提供する独自の撮像システムによって行うことができます。較正標準は、湿った組織重量（組織のための1つの比重を想定）のfmolの/グラムです。背景と一緒に各標準セットには、標準曲線を作成します。相対検眼Dから標準曲線を作成するために利用可能な重み付けせずに、いくつかの曲線フィッティングアルゴリズムがありますensity異なる較正標準用（ROD）の値。最良のデータを表す曲線の選択は異なる標準曲線のための相対誤差値を提供していないカーブフィッティングのためのサブルーチンとして経験的に行われます。 0.6〜までのロッドでは、標準曲線はpseudolinearです。しかし、フィルムは、約0.8〜0.9 ROD単位を漸近線の曲線を形成し、このポイントを超えて飽和し始めます。サンプルをブラケティングされた基準が0.9 ROD単位を超えている場合は、フェムトモル/ gの規格のpseudolinear範囲に近いサンプルの結合のより信頼性の高い値を得るための時間の短い期間のためにフィルムを再公開することをお勧めします曲線。標準曲線のこの極端に導出された値は、放射性リガンド結合における有意に大きい違いのためRODの小さな違いになります。したがって、フィルムのような結合が減少における変化を検出する能力は、その飽和点に近づきます。
特定の領域の測定では、推奨措置はフェムトモル/グラムの「密度」、ピクセル内のピクセルの「スキャン領域」、および「総対象地域'（ 図9）です。膜密度または較正標準から得られた標準曲線の任意の態様の変化は時々の値をゼロ以上を与えることができるので（ 図10）できるだけゼロに近い閾値を設定することが重要です。このような値は、スキャン領域内の全ての画素に対して平均化された場合には、人為的に低い値を導き出すことになります。非常に主観的であり得る結合での領域を同定するために使用される基準、それは最高であるが密接に主観的エラーの発生を低減することが可能な限りコントロールおよび実験脳をペアリングします。もう一つの課題は、最終的な読書を得るために平均化する方法を多くのセクションを決定することです。分析するセクションの良好な指標は、染色された組織学スライドに伴って、受け入れられたラット脳アトラスに従うことにより決定することができます。サンプリング領域のサイズもすることができ問題。補償するために、テンプレートは、任意のサイズの不一致を修正するために確立することができます。セクションの処理は、高い結合している構造の領域に影響を与え、分析中に考慮される可能性があります。これは、サンプリングツール内でそのような視床下部の室傍核とサンプリングされた脳領域の解剖学的特徴を表現するように、任意の値を超える濃度範囲を設定するために独自の画像化システムの「しきい値」ツールの別の使用を必要としますそれは、関心領域（ 図11、パネルC）を包含する。結合の量の決意に面積の測定を含むことも可能です。これは、特異的結合の時間を測定した画素数の値を乗算することにより行うことができます。ピクセルは、二つの面で支配者、または既知の寸法の長方形を撮影してメートル単位に変換することができます。に対応する画素数矩形の長さまたは面積は、次にメートル単位で表すことができます。 2400 dpiの解像度で、〜9000ピクセル=私たちのシステムで1ミリメートル2。
放射性リガンドの使用は、もはや広く使用される技術であるが、。それは、機能（その生来のリガンドと結合することができる）として自分自身を標本組織内の受容体の物理的な分布を可視化するためにいくつかの方法の一つです。さらに、それは別の方法を特徴づけるために利用可能であるなどの異なる動物の系統、または異なる年齢の動物、の間、異なる脳領域または他の構造との間の治療群間の機能的受容体の発現の変化の評価を可能にする受容体の数を、定量化することができますAT 1受容体の発現の神経解剖学的側面 は、しかしながら、それらは限られた価値を有します。 mRNAのin situハイブリダイゼーションではAT 1受容体は常に1受 容体での発現またはディストリビューションに対応していないために脳。免疫学的技術は、組織切片の染色の強度に基づいて、受容体発現の差を近似することができるが、受容体発現の数値決意を可能にするために染色するための標準曲線を作成することは不可能です。受容体オートラジオグラフィーはまた、免疫学的技術を使用して保証することはできません（特に放射性リガンドを結合するか、または他の標的）の受容体に対する特異性のレベルを提供します。 2009年には、一連の記事は、18種類のGタンパク質共役型受容体と一過性受容体電位（TRP）チャネルを評価するために使用されていた49抗体の有効性を疑問視37-43を発表しました。本質的には、抗体は、問題の受容体について野生型およびノックアウトマウスからのウエスタンブロットで同一のバンドを標識しました。その後、いくつかのグループは、AT 1および2受容体抗体44-49 AT市販使用して同様の観察を行いました。 bacteriの使用AT 1プロモーターによって駆動されるアル人工レポーター分子を生成する染色体、 例えば 、緑色蛍光タンパク質は、それらを有する基づいマウス（ただし、ラット）の脳における1受容体発現細胞ATの存在または非存在を決定する間接的な手段であります1受容体プロモーター50 AT機能。顕微鏡同定脳領域における「陽性細胞」をカウントすることが可能であるが、これらの領域におけるAT 1受容体の発現の強度の変化を定量するものではありません。したがって、この時点で直接、アンギオテンシンII受容体発現を測定するために利用できるのみが検証された技術は、放射性リガンド結合の方法です。 1受容体タンパク質AT機能の解剖学的解像度が顕微鏡レベルで必要とされる場合には、受容体オートラジオグラフィーは、このような直接測定のために利用可能な唯一の技術です。
受容体オートラジオグラフィーは制限がないわけではありません。主要concerNは、研究設定に放射性物質を使用するための要件を満たすものです。放射性物質や放射性物質の安全な処分で動作する研究者の安全を確保するために所定の位置に厳格なガイドラインと放射線安全プログラムを持っていることが必要です。これは、多くの研究設定でのそれらの使用を妨げる点に放射性物質を用いた研究のコストをエスカレート。さらに、放射性リガンドのコストが大きくなる可能性があります。放射性リガンドの数千ドルのない場合はこのようにスライドマウントされた組織切片の多くは放射性リガンドの容器中でインキュベートされた受容体オートラジオグラフィー実験は数百を使用することができます。別の制限は、組織は、前のクライオスタットの切片に凍結一定期間保存され、速やかにすすぎ、放射性リガンドに結合する受容体の能力又は目的のタンパク質を損なうことの全ては、放射性リガンドと共にインキュベーションした後、乾燥させなければならないことです。迅速なお尻を持っているリガンドのociation /解離速度は、非特異的に結合した放射性リガンドを洗い流すために必要な時間の間、受容体への放射性リガンドの結合を保持することが可能ではないかもしれません。また、フィルム露光の長い期間を放射性リガンド結合の低量で - 1ヶ月以上 - 測定可能なイメージがフィルム上に形成することができる前に必要となる場合があります。もう一つの課題は、リガンドへのヨウ素125の添加は、その標的受容体または立体障害に起因するタンパク質に結合するリガンドの能力を損なう可能性があることです。ほとんどのフィルム画像を生成することは非常に困難であることが小さい分子、 例えば 、トリチウム（3 H）の使用は、立体障害の問題を排除するが、トリチウムは、低エネルギー（ヨウ素125に対して）低い比活性を有します受容体集団。これらの問題の光では、受容体のオートラジオグラフィーは、受容体または他の目的の分子構造を特定することができないである多くの状況があります。
その李にもかかわらず、mitationsは、受容体オートラジオグラフィーは、組織内の特定の構造を同定することができ、 例えば 、実験的な変数に応じて変更された脳の領域は、正常対照脳に比べて。この知識は、アンギオテンシンIIまたは疾患の病理の他の受容体または酵素のためのAT 1 Rの役割を決定するのに役立ちます。それは潜在的な治療のために対象とする領域を示しているように、この知識は、貴重な薬理学的な意味を持っています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
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