Abstract
Denne protokollen beskriver reseptor bindende mønstre for Angiotensin II (Ang II) i rottehjernen ved hjelp av en radioligand bestemt for Ang II-reseptorer for å utføre reseptor autoradiografisk kartlegging.
Vevsprøver er høstet og lagret ved -80 ° C. En Kryostaten brukes til coronally seksjon vev (hjerne) og tine-mount seksjonene på ladede lysbilder. Glidemontert vevssnitt inkuberes i 125 I-SI-Ang II å radio Ang II-reseptorer. Tilstøtende lysbilder er delt opp i to sett: 'ikke-spesifikk binding "(NSP), i nærvær av en reseptor mette konsentrasjon av ikke-radiomerket Ang II, eller en AT-1 Ang II reseptor-undertype (AT 1 R) selektiv Ang II reseptor-antagonist og "total binding 'uten AT en R antagonist. En metningskonsentrasjon på 2 Ang II reseptor-undertype (AT 2R) antagonist (PD123319, 10 pM) er også til stede i den incubatipå buffer for å begrense 125 I-SI-Ang II binding til AT 1 R subtype. I løpet av en 30 minutters preinkubering ved ~ 22 ° C, blir NSP lysbilder eksponert for 10 uM PD123319 og losartan, mens "total binding" lysbilder er utsatt for 10 uM PD123319. Objektglassene ble deretter inkubert med 125 I-SI-Ang II i nærvær av PD123319 for "total binding", og PD123319 og losartan for NSP i analysebuffer, etterfulgt av flere vaskinger '' i buffer, og vann for å fjerne salt og ikke- spesifikt bundet radioligand. Skinnene er tørket bruker blow-tørketrommel, deretter utsatt for autoradiografi film ved hjelp av en spesialisert film og kassett. Filmen er utviklet og bildene er skannet inn i en datamaskin for visuell og kvantitativ densitometry bruker en proprietær imaging system og et regneark. Et ekstra sett med lysbilder er thionin-farget for histologiske sammenligninger.
Fordelen med å bruke reseptor autoradiografi er evnen til å visualisereAng II-reseptorer in situ, i et utsnitt av en vevsprøve, og anatomisk identifiserer det område av vev ved å sammenligne det med en tilstøtende histologiske referansedelen.
Introduction
Hjerte- og karsykdommer fortsetter å være den ledende årsak til død og uførhet i USA, forårsaker mer enn 30% av dødsfall i USA i 2011 en. De siste statistikk fra American Heart Association viser at mer enn én person i tre har en eller mer type kardiovaskulær sykdom. Cardiovascular forskning fortsetter å gjøre fremskritt mot å forstå denne sykdommen, men som generasjoner begynner å bli eldre er det viktig å fortsette dette arbeidet. Renin-angiotensin-systemet (RAS) spiller en sentral rolle i regulering av det kardiovaskulære systemet først og fremst ved å fremme aterosklerose, inflammasjon, systemisk vasokonstriksjon, og aktivering av det sympatiske nervesystemet (figur 1) 2-8.
RAS er en hormonell system som aktiveres når juxtaglomerulære celler i nyrene utskiller renin i blodstrømmen som reaksjon på redusert blodtrykk, øket sympathetic stimulering, eller redusert natrium flyt av makula densa. Renin metaboliserer angiotensinogen (syntetisert i leveren) for å danne angiotensin I (Ang I). Ang I blir deretter metabolisert av angiotensin-konverterende enzym (ACE), en ectoenzyme på den luminale siden av vaskulære endotelceller, først og fremst i lunger og nyrer, for å danne angiotensin II (Ang II), den viktigste effektor peptidet av RAS. Ang II er i stand til å aktivere to reseptor-subtyper; type 1 reseptor (AT 1 R) og type 2-reseptoren (AT 2 R), både som regulerer det kardiovaskulære systemet, opprettholde væske- og elektrolytt homeostase og er nå ansett å påvirke kognitiv funksjon og nevrodegenerativ sykdom prosesser 8,9. En lokal, hjerne-spesifikk RAS er rapportert til selvstendig syntetisere Ang II. I hjernen, er det forløperproteinet angiotensinogen syntetisert astroglia 10 omdannet til Ang I ved en renin-enzym 3, eventuelt prorenin bundet til reseptoren prorenin11, og deretter omdannes til Ang II ved angiotensin-konverterende enzym som er rikelig uttrykt på den ekstracellulære overflaten av neuroner i hjernen 12. Dette intrabrain genererte Ang II er en agonist for hjernen AT 1 og AT-2-reseptorer som er isolert fra blod-båret Ang II.
Mens AT en R spiller en viktig fysiologisk rolle, er det bedre kjent for sine patofysiologiske effekter i hele kroppen, først og fremst påvirker det kardiovaskulære systemet og nyrer (figur 2). Når Ang II bindes til AT 1 R, fører det til vasokonstriksjon; økende motstand mot blodstrømmen og å øke blodtrykket. Det fremmer også syntese og sekresjon av aldosteron og vasopressin, som fører til øket natrium- og vannretensjon. Disse effektene kan også forårsake iskemisk hjerneskade og kognitiv svikt og er knyttet til Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, og Diabetes Tates, så vel som å være nylig identifisert til å påvirke læring og hukommelse 13-15. Det er en tilbakekoblingssløyfe i den RAS ved at i en R på juxtaglomerulære celler i nyrene hemmer renin sekresjon. Interessant, AT 2 R generelt kontra regulerer virkningen av AT 1 R, forårsaker vasodilatasjon, neurittutvekst, aksonal regenerasjon, anti-spredning, og cerebroprotection blant mange andre 16-20. AT 2 R har også blitt identifisert som et mål for anti-hypertensjon og nylig, anti-kreft narkotika 21. Fastsettelse av lokalisering og tetthet av Ang II-reseptorer i ulike vev og hvordan de påvirkes av forskjellige behandlinger og sykdomstilstander ved hjelp av kvantitativ densitometrisk reseptor autoradiografi vil bidra til å avdekke hvilken rolle RAS spiller i spesifikke sykdommer.
Receptor autoradiografi har vært brukt i over 30 år som en effektiv metode for å indikere tilstedeværelsen av angiotensin II reseptorer og andre komponenter av RAS i hjernen og andre vev fra rotte, mus, marsvin, hund og menneske under forskjellige eksperimentelle betingelser 22-34. Betydningen av å lokalisere Ang II-reseptorer i hjernen er at man kan anvende funksjonelle neuroanatomy av handlingene til Ang II i hjernen, for eksempel nærvær av en R i den paraventrikulære kjerne av hypothalamus (PVN) foreslår en funksjon av Ang II i hjernen for å stimulere vasopressin, oksytocin eller kortikotropin-frigjørende hormon (CRH) frigivelse, eller aktivering av det sympatiske nervesystemet. Således kan medikamenter som blokkerer den AT-1 R redusere noen av disse PVN-medierte effekter forbundet med overaktivitet av hjernen RAS. Varer i arbeid antyder at bruk av AT 1 R-antagonister kan redusere Post-traumatisk stresslidelse (PTSD) -indusert frigjøring av CRH og bedre symptomene på PTSD (Hurt et al., Innsendt for publisering). Den PVN, subfornicalorgan (SFO), og amygdala er kjent for å regulere homeostase, appetitt / tørst, søvn, hukommelse, følelsesmessige reaksjoner, og er målområdene i denne demonstrasjonen studien. Disse områdene ble undersøkt ved å samle koronale deler av en hjerne på objektglass, og behandle de deler med spesifikke hemmere sammen med en bestemt radioligand for Ang II-reseptorer. I denne studien ble alle materialer og reagenser sammen med foreslåtte leverandører er oppført, jod-125 ble anvendt for å radiomerke en Ang II reseptor antagonist, sarkosin 1, isoleucin 8 Ang II (SI Ang II), som så ble renset som mono 125I -Si Ang II ved hjelp av HPLC-metoder som beskrevet tidligere 35. Anvendelsen av denne høye spesifikk aktivitet radioligand tillater visualisering av områder med lav, middels og høy tetthet reseptoren etter eksponering av de radiomerkede seksjonene til røntgenfilm. Ved kalibrering av filmen med hjerne lim-standarder inneholdende kjente mengder av jod-125, bestemt beløpav Ang II reseptor binding i et område kan kvantifiseres. I eksperimentelle studier, kan den Ang II reseptor binding i hjernen til eksperimentelle fag sammenlignes med at i hjernen til kontrollpersoner. Dette kan indikere hvorvidt handlingene til Ang II er endret som reaksjon på en genetisk sykdom, fenotypisk abnormitet, sykdomstilstand eller medikamentell behandling. Denne kunnskapen kan deretter brukes til utvikling av terapi for behandling av sykdommer forbundet med dysregulering av RAS. Alternative teknikker som identifiserer reseptor-bindingsseter, men med redusert anatomisk oppløsning, blir bindingsanalyser som bruker vevet membranpreparater avledet fra vevshomogenater, som er inkubert med radioliganden over et område av konsentrasjoner for å vurdere radioligand bindingsaffiniteten som dissosiasjonskonstanten (K D ) og maksimal bindingskapasitet (B maks) i vevet av interesse.
Protokollen er beskrevet her kan bli brutt ned i fem store components: Forberede vevssnitt for Receptor Autoradiografi; Receptor Autoradiografi; Film Eksponering og utvikling; histologi; og Densitometrisk bildeanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Nova Southeastern University i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, 8. utgave (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).
1. Klar vevssnitt for Receptor Autoradiografi
- Ved ofring, slakte friske hjernevevet, og pakk inn i aluminiumsfolie og legg i en -20 ° C fryser så snart som mulig. For å opprettholde riktig form, legg hjernen i en hjerne mold som simulerer innsiden av skallen, pakk inn i aluminiumsfolie og legg i en - 20 ° C fryser. Etter 30 min, sted vev i en lukkbar fryser oppbevaringspose og flytte til en -80 ° C fryser for langtidslagring.
- Oppnå de ferske frosne vevsprøve av interesse fra -80 ° C fryseren, og overføring til en cryostat settes til et minimum på -10 ° C og maksimum -18 ° C, for å unngå tining. Plasser prøven på vev festet med en glykol og harpiksbasert innstøpningsmediet, bare å bygge inn en liten del av prøven til mediet. For hjernen, er hjernen montert vertikalt for å muliggjøre seksjonering i coronal plan.
- Plasser vev festet inn mikrotomen i cryostat og stram på plass. Sørg for venstre og høyre side av hjernen er i samme Antero-Postero koordinater, og at dorso-ventral aksen er vinkelrett på brukte hjerne atlas.
- Begynn å kutte i ønsket tykkelse (20 mikrometer anbefales) og tine montere delene bort på objektglass i en vertikal retning for å få en større overflate plass i lysbildet. Samle deler ut mot skred i sekvensielle sett med fem, det vil si det første settet med lysbilder er merket 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, og 1-5 (figur 3).
- Etter å fylle et sett av lysbilder med seksjoner, la lysbilder lufttørke for inntil 1 time, deretter plassere SLIdes i en plast lysbilde boks i en selvtettende fryser oppbevaringspose, og oppbevares ved -20 ° C.
2. Receptor Autoradiografi
FORSIKTIG: Radioaktivitet. Bruk beskyttende antrekk for å håndtere radioaktivitet. Deponering er avhang etablering, og må følge retningslinjene til riktig forfalle (halveringstid 60 dager) eller bli plukket opp av en sertifisert bedrift.
- Fjern "-1" og "-2" lysbilder av interesse fra -20 ° C fryser og montere inn objektholderen (Figur 5). Monter "-1" lysbilder sammen for 'ikke-spesifikke' behandling, og "-2" lysbilder for 'total' behandling. "Non-spesifikke 'krukker vil inneholde 10 mikrometer endelige konsentrasjoner av PD123319 en AT 2 R antagonist, og losartan en AT en R-antagonist, i analyse medium buffer (AM5) (tabell 1), den" totale "bindende krukker vil bare inneholde 10 iM PD123319 i AM5.
- Snu lysbildegrep for å plassere objektglassene inn i preinkubasjon Coplin glass fylt med 35-40 ml av AM5 og respektive inhibitorer i 30 minutter ved romtemperatur. Begynn påfølgende settene i sin pre-inkubasjon bad på 4 min intervaller.
- Umiddelbart overføre lysbilder fra før inkubering løsning på de inkubering glide reklame, inneholdende 10 ml av AM5, i tillegg til en forutbestemt konsentrasjon av 125 I-SI-Ang II (beregnet på figur 4) med de respektive inhibitorer, for 60 til 90 minutter ved værelses temperatur. Hvis det er tilstrekkelig radioligand, kan 10 lysbilder plasseres (rygg mot rygg) i modifiserte objektholderen og inkubert med 125 I-SI-Ang II i Coplin krukker.
- Place glir tilbake inn i objektholderen (om nødvendig), blot, og skyll forsiktig virvlende for 1-2 sek i 400 ml destillert vann i to separate beholdere.
- Overfør lysbildene sekvensielt inn i fire Coplin krukker inneholdende 35-40 ml AM5 for nøyaktig 1 min hver (som illustrert i figur 4 </ Strong>).
- Etter siste 1 min skylling, forsiktig virvel seksjonene for 1-2 sek i fire endringer iskaldt destillert vann.
- Føne lysbildene med kjølig luft (OBS: varmluft volatizes den radioaktive forbindelsen) med fire hårføner satt opp fra forskjellige vinkler for 4 min (figur 5), før alle delene er tørre, og sett på et papirhåndkle.
- Mount glass med vev vendt opp på en papp for apposisjon til røntgenfilm ved bruk av dobbeltsidig tape.
- Montere i det minste en, 125 Jod kalibreringsstandard glir på hver kartong (figur 6).
Merk: kalibreringsstandarder bestå av hjerne pastaen blandes grundig med 125 Jod bundet til en forbindelse inneholdende en fenol ring, komprimeres ved sentrifugering i en 1 ml tuberkulinsprøyte, som befinner kryostaten i snitt på samme tykkelse som hjerneseksjoner og tine-montert på mikroskop lysbilder. Alternativt 125 Jeg kalibreringsstandarder iplastisk harpiks i snitt på 20 pm tykkelse kan oppnås kommersielt. Den plast harpiks i disse standardene delvis beskytter filmen fra strålingen slik at en vev verdigheten av ~ 40% bør være priset inn kalibreringen.
3. Film Eksponering og utvikling
- Fortsett til et mørkerom med en strap-tilbake X-ray kassetten og autoradiografi film. Åpne kassett og plasser papp med lysbilder inne (figur 6).
- Slå av lyset og slå på sikkerhetslys. Åpne forsiktig boksen av X-Ray film, fjerner du en film, og plasserer filmen blanke siden opp (med taggete kant nederst i høyre hjørne) på toppen av lysbildene i kassetten. Lukke nøye kassetten, og vri låse barer å forsegle ut lys (Figur 6). Expose lysbildene i flere dager til flere uker ved -20 ° C.
- I mørkerommet, åpne kassett og fortsette med film utvikle process.
- Plasser lysbildene i skuffene etter hverandre; utvikler i 2 minutter, vann som inneholder 5% iseddik i 30 sekunder, og fikser i 5 minutter. Filmene er den plassert i et brett med rennende vann i 20 minutter, deretter plassert i Photoflo for ikke mer enn 10 sek, og hengt.
Merk: Eksponeringstiden bestemmes empirisk og kan innebære flere filmer med forskjellige eksponeringstider: lenge nok til å få målbare signaler fra områder med lav binding, men ikke så lenge som å mette film av områder med høy binding. Når akseptable eksponeringer oppnås, går du videre til neste trinn.
- Plasser lysbildene i skuffene etter hverandre; utvikler i 2 minutter, vann som inneholder 5% iseddik i 30 sekunder, og fikser i 5 minutter. Filmene er den plassert i et brett med rennende vann i 20 minutter, deretter plassert i Photoflo for ikke mer enn 10 sek, og hengt.
4. Histologi
- Klargjør thionin flekken og Fargingsreagensmidlene (tabell 2, figur 7).
- Plasser "-3" glir i sleiden stativet, og overføring i sekvensiell rekkefølge som begynner med avionisert vann i 1 minutt, deretter thionin fargende oppløsning i 10 minutter etterfulgt av tre fall i Deionized vann, og en 30 sek vaske i deionisert vann.
- Etter vann, plasser glidestativ til etanol vasker som følger; 50%, 70% og 90% i 30 sekunder, etterfulgt av to vaskinger etanol ved 100% 1 min hver gang. Til slutt, plassere glidestativet inn i xylen i 3 minutter, og deretter overføre over til en annen xylen-løsning i 5 minutter.
- Fjerne en lysbilde om gangen fra den siste xylen bad, og dekker den øvre kant av sleiden med en harpiks base i organisk løsningsmiddel monteringsmedium, og sette inn en 24 mm x 60 mm dekkglass på objektglasset. Tillat lysbilder til tørr nok for ~ 48 timer og deretter skanne inn i datamaskinen på 2400 gråtoner dpi.
5. Densitometrisk bildeanalyse
- Plasser filmen blanke siden ned, med taggete kant nederst i venstre hjørne og skanne med en proprietær skanner stand til å overføre informasjon filmen tetthet uten forvrengning i bildesystemet datamaskin.
- Åpne proprietære bilde system og utnytte kalibrerings barer å etablere kalibreringsstandarder for fremtidig densitometrisk analyse av bildene på filmen (figur 9 - 12).
- Mål områder av interesse enten ved å etablere en mal eller empirisk beskriver de områder av interesse. Data som samles inn og separert basert på film, enten kontroll eller villtype (§), og region. Sørg for å inkludere tetthet (fmol / g), skanneområdet, og total målområdet i målingene (figur 9).
- Juster skanne området barer ved å sikre at regionen av interesse faller mellom parametre for å fremheve (figur 10).
- Eksportere data i et regneark (tabell 4). Multipliser tetthets ganger den samlede målområdet, deretter dele av skanneområdet for å få verdien for binding av det bestemte området. Når dette er gjort for alle verdier målt, substrat den etablerte ikke-spesifikk fra total for å gi den spesifikke binding pmisliker. Gjennomsnitt kan også bli utført for disse verdiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversikten over den metabolske veien til renin-angiotensin-systemet er vist i figur 1 og den direkte fokus på angiotensin-II-reseptor-subtyper (AT 1 R og AT 2R) er beskrevet i figur 2. Figur 3 viser overføringen av koronale hjerne seksjoner bort på objektglass, som deretter kjøres gjennom en reseptor autoradiografi prosedyre ved bruk av et forhåndsbestemt 125 i-Siang ll-konsentrasjonen som vist i fig 4 fig. 5 viser tørketrinnet for lysbildene i reseptoren autoradiografi som deretter blir festet på en kartong som vist i figur 6, og senere utviklet. Tabell 2 viser de reagenser som ble brukt for den thionin fargeprosedyre for glidemontert vevssnitt som er beskrevet i figur 7. kalibreringsstandard for kvantifisering heter bestemmes based på datoen for analysen som vist i tabell 3. Figur 8 viser etablering av en standardkurve som relaterer 125 I-konsentrasjonen (fmol / g vev) på filmeksponering (relativ optometrisk densitet). Figur 11 viser forskjellen mellom 'NSP' og "total" grupper, samt etiketter vevet, mens Figur 10 beskriver innstillingen av terskelen til en nær null verdi å få en nøyaktig gjennomsnittsverdi for hele skannede området (Scan area-pixel). Tabell 4 viser kvantifisering prosessen med å skaffe spesifikk binding basert på å trekke den "uspesifikke" fra totale verdier. 'Ikke-spesifikk "binding som inneholder losartan og / eller PD123319 er skapt av mengden av radioligand bundet til ikke-AT 1 eller AT-2-reseptorer. Samtlige av radioligand bundet til AT-1-reseptorer i nærvær av PD123319 gir den "totale" binding. F igur 11 viser de endelige målte områder av PVN totalt kontra ikke-spesifikk binding tilknytning til en thionin farget seksjon for anatomisk bekreftelse av PVN.
Fig. 1: Metabolsk Pathway av renin-angiotensinsystemet (RAS) i legemet Leveren frigjør zymogen angiotensinogen, som spaltes ved nyre-renin utskilt, danner angiotensin I. Angiotensin-omdannende enzym (ACE) omdanner Ang I til angiotensin II ( Ang II), den viktigste forløper for kardiovaskulær sykdom. Ang II fører til vasokonstriksjon, og øker blodtrykket, blodsirkulasjon, salt appetitt, tørst og væskeansamlinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Funksjoner av Angiotensin type 1 og 2 reseptorer (AT 1 R, 2 R) 1 R patologisk påvirker hjerte- og karsykdommer, virker direkte for å øke tørst og salt appetitt, og utøver mange andre perifere cellulære aktiviteter samt sentrale psykologiske effekter. AT 2 R er en fysiologisk antagonist av AT 1 reseptoren, bistå i effekten av AT 1 R-antagonister 36 og dermed har gunstige effekter på vaskulær struktur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Cryosectioning av hjernen på objektglass ved 20 um tykkelse. Avhengig av temperaturen av kryostaten vil seksjonene til tider viser folder, sprekker, krøller, eller bli sammenpresset på mikrotomen bladet eller knivholderen. I slike tilfeller seksjonen er forkastet og et notat er gjort for å vise at en ekstra 20 mikrometer vil skille denne delen fra forrige avsnitt. Seksjoner bør samles på lysbilder i en vertikal retning for å maksimere det totale arealet som trengs for å fylle opp et lysbilde og derfor samle den største mengden av seksjoner på hvert bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Sample of Experimental Design & Protokoll for Receptor Autoradiografi differensiertasjon av "total" (-2) og "ikke-spesifikk" (-1) direkte relatert til nærvær og fravær av reseptor-subtype-antagonist. Protokoll kan variere basert på antall lysbilder, og vil øke med trinn på 2 for hvert par av totale og uspesifikke lysbilder. Radioligand konsentrasjon, tidligere bestemt blir oppnådd ved fortynning av massen inn i AM5. Denne oppløsning blir så jevnt fordelt til ruge beholdere. Direkte teller er tatt før og etter inkubasjon for å etablere den nøyaktige konsentrasjonen av radioliganden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Konfigurasjon for tørkestasjonen i reseptoren autoradiografi Tørretider vil variere basert på effektiviteten av slagettørketromler samt evnen til å utslette bort overflødig vann etter de siste skyllinger. Lysbilder blir tørket når seksjonen svinger fra klar til hvitt. Hvis lysbildene ikke er helt tørket så radioliganden kan diffundere vekk fra reseptoren produsere en uklar bilde som ikke er spesifikke for reseptoren bindingssteder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:.. Slide oppsett anbefales å følge et mønster hvor sammenligning av begge grupper er tilrettelagt Utsette behandlet lysbilder til x-ray film ved hjelp av en spesialisert kassett Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Sette opp for Thionin farging. Slides er lastet inn i en lysbildeholderen og nedsenket i sekvensielle løsninger. Timing muliggjør effektiv farging av Nissl stoff (grov endoplasmatiske retikulum) av nerveceller. En monterings medium søknad til lysbildene følgende dehydrering muliggjør feste av dekkglass til raset, bevare seksjoner for komparativ analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 8: Innstilling av kalibreringsstandard Hver film inneholder de individuelle kalibreringsstandarder, basert på hjernen pastaen og det tidspunkt forsøket ble gjort . En regresjon linje som beskriver de best tilpassede verdiene er generert av et proprietært avbildningssystem program for de målte hjerne pastastandarder. Dette omdanner den relative optometrisk tetthet (ROD) verdi fra kalibreringsstandardene (cal seksuelt overførbare sykdommer, i rødt oval) til enheter av radioligand binding, i dette eksempel enhetene (fmol / g, merket med rødt) er fmole radioligand bundet per gram våt vev vekt (fmol / g). Målingen av hjernen lime standarder er gjort med den sirkulære verktøy og plassert i midten av prøven som vises til høyre i pseudocolor bruke ikonet bildevisningen (merket med rødt). Sirkelen å måle kalibreringsstandard trenger ikke å dekke hele prøven, men heller måle en enda område av standarden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/53866fig9.jpg "/>
Fig. 9: Identifisering av grupper med prøvenummer, ikke-spesifikk / totalt, og regioner for prøveavlesninger på grunn av flere hjerner, hjerneregioner, og flere eksperimentelle grupper er kvantifisert sammen, er det viktig å skille mellom alle faktorene. Emnet angir hjernen prøven og kan også indikere gruppe; delen angir om det er ikke-spesifikk (NSP) eller total, mens regionen tillater identifikasjon av flere hjerneregioner som blir samplet. Prøven verktøylinjen (rød firkant) beskriver forskjellige prøvetakings verktøy, for eksempel, sirkel, firkant, mal, frihånd, viskelær; som kan brukes for å avgrense området som skal måles. Stangen verdiene oppnådd innenfor området prøvetakingsverktøyet er spilt inn på regnearket som konverterte enheter av binding, fmol / g (markert med rødt). I tillegg blir det totale skanneområdet innenfor prøvetakingsverktøyet registrert i "Scan område-bildeelement" -kolonnen mens det totale tArget området (antall piksler som overstiger terskelverdi (beskrevet i figur 10 legende) registreres i "Total Tgt Area-pixel" kolonnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Bestemmelse av terskelen for prøver som skal måles basert på standarder Skanningen området er unikt for hver film, og avhenger av standardene som er satt.. Bruke thresholding verktøyet (markert med rødt) for å sette grenseverdier for tetthetsområdet for skanneområdet i fmol / g vil gi rom for de områdene som måles (angitt med diagonale piler) for å falle mellom en rekke 0, opp til et punkt der kalibreringskurven begynner å asymptoten som indikerer at filmen er nærmer seg en maksimal eksponering, utover hvilken ytterligere
Figur 11: Representative bilder av reseptor autoradiografi binding til koronale deler av en kvinnelig spontant hypertensive rotter (SHR) på ~ 1,8 mm kaudal til Bregma, viser den paraventricular kjernen av hypothalamus (PVN) og sengen kjernen av tilbehøret olfactory tarmkanalen (BAOT ). (A </ strong>) Total binding av AT 1 R binding (Rød-PVN, gul-BAOT). (B) Ikke-spesifikk binding med losartan (AT1R antagonist) og PD123319 (AT2R antagonist). (C) Total binding av AT-1 R-binding med en vilkårlig terskelinnstilling, for eksempel for å avgrense formen på PVN (sorte fyll) som overstiger den terskelverdi innenfor skanneområdet som er ført som Total Tgt område). (D) Thionin farget seksjon for anatomisk bekreftelse av strukturene viser høy total binding, og for sammenligning med andre områder av hjernen eller andre eksperimentelle grupper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| reagenser | Beløp |
| NaCl | 8.76g |
| Na2EDTA | 1,86 g |
| bacitracin | 141 mg |
| 500 mM Dibasic Na 2 PO 4 | 100 ml |
| Destillert deionisert vann | 900 ml |
| Juster pH til 7,1 til 7,2 med NaOH eller HCl | |
Tabell 1: prøvemedium (AM5) Kjemiske komponenter i bufferen anvendt i vev fremstillingen..
Tabell 2:. Thionin Flekk Reagenser Den thionin flekken består av destillert vann, 1,0 M natriumacetat og 1,0 M iseddikoppløsning, titrert til en pH-verdi på 4,3 før tilsetning av en 0,5% oppløsning thionin.
| Dager tidligere referansedato | |||||||||
| Parti | fmol / g våtvekt | ref Dato | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Standard | nCi / mg | fmol / g | dpm / g | fmol / g | fom / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g |
| Antall | 30-May | 30-May | 30-May | 30-May | 31-May | 1-Jun | 2 av juni | 3 av juni | 4 av juni |
| 1 | 9706 | 4463 | 21547320 | 4463 | 4411 | 4361 | 4311 | 4261 | 4212 |
| 2 | 5838 | 2684 | 12960360 | 2684 | 2653 | 2623 | 2593 | 2563 | 2533 |
| 3 | 2798 | 1286 | 6211560 | 1286 | 1272 | 1257 | 1243 | 1228 | 1214 |
| 4 | 1451 | 667 | 3221220 | 667 | 659 | 652 | 644 | 637 | 630 |
| 5 | 787 | 362 | 1747140 | 362 | 358 | 354 | 350 | 345 | 342 |
| 6 | 385 | 177 | 854700 | 177 | 174 | 173 | 171 | 169 | 167 |
Tabell 3:. Daglig Decay Rate Beregninger for kalibreringsstandarder En daglig dempefaktor regneark for kalibreringsstandardene må lages basert på datoene da forsøket ble utført. Dette regnearket er basert på den første ordens hastighetskonstant med et halv-liv (halveringstid) i 60 dager. N = N-0 * e kt, hvor N = den konsentrasjon av 125 I, ved tidspunktet t i forhold til konsentrasjonen ved tid 0 (N 0), og k = ln2 / t 1/2.
| Paraventricular Nucleous av Hypothalamus | Mål | Tetthet-fmol / g | Scan-området | Total målområde | Total* | |
| Total | 1 | 996 | 4383 | 4383 | 996 | |
| Total | 2 | 921 | 3362 | 3362 | 921 | |
| Total | 3 | 818 | 3445 | 3445 | 818 | spesifikk binding |
| Total | 4 | 710 | 2906 | 2906 | 710 | 967 |
| GJENNOMSNITT | 861 | 3524 | 3524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ Tr>||||||
| Seksjon | Mål | Tetthet-fmol / g | Scan-området | Total målområde | Uspesifikk * | 678 |
| NSP | 1 | 53 | 3072 | 1737 | 30 | 826 |
| NSP | 2 | 52 | 2959 | 1455 | 26 | |
| NSP | 3 | 86 | 3180 | 2035 | 55 | |
| NSP | 4 | 53 | 3293 | 1995 | 32 | |
| GJENNOMSNITT | 61 | 3126 | 1,805.5 | 36 | ||
| Bed Nucleus av tilbehør Olfactory Tract | ||||||
| Seksjon | Mål | Dens-fmol / g | Scan-området | Total målområde | Total* | |
| Total | 1 | 439 | 3632 | 3632 | 439 | |
| Total | 2 | 435 | 3632 | 3632 | 435 | |
| Total | 3 | 355 | 3632 | 3620 | 354 | |
| Total | 4 | 435 | 3632 | 3631 | 435 | spesifikk binding |
| Total | 5 | 342 | 3632 | 3630 | 342 | 414 |
| Total | 6 | 334 | 3632 | 3606 | 331 | 393 |
| GJENNOMSNITT | 390 | 3632 | 3625 | 389 | 321 | |
| 394 | ||||||
| 315 | ||||||
| Seksjon | Mål | Dens-fmol / g | Scan-området | Total målområde | Uspesifikk * | 320 |
| NSP | 1 | 49 | 3632 | 1846 | 25 | 360 |
| NSP | 2 | 64 | 3632 | 2362 | 42 | |
| NSP | 3 | 53 | 3632 | 2275 | 33 | |
| NSP | 4 | 64 | 3632 | 2339 | 41 | |
| NSP | 5 | 51 | 3632 | 1879 | 26 | |
| NSP | 6 | 41 | 3632 | 966 | 11 | |
| GJENNOMSNITT | 54 | 3632 | 1945 | 30 | ||
| * Total og ikke-speciic er tetthet enheter av fmol / g. | ||||||
| Total = tetthet * total målområdet / skanneområde | ||||||
| Ikke-spesifikk = tetthet * total målområdet / skanneområde | ||||||
| Total målområde er piksler som oversteg terskelverdien, satt så nær 0,00 fmol / g som mulig. | ||||||
| Piksler som ikke overstiger terskelenverdi får en verdi fra 0 til vurdering av total tetthet. | ||||||
| Piksler som ikke overstiger terskelverdien motta en verdi fra 0 til vurdering av ikke-spesifikk tetthet. | ||||||
| Spesifikk binding er totalt minus ikke-spesifikk binding uttrykkes som tetthet enheter av fmol / g. | ||||||
Tabell 4: Kvantitativ analyse av paraventricular kjernen av hypothalamus og seng kjernen av tilbehøret olfactory kanalen bildebehandlingsprogrammer eksport av data som et regneark i fmol / g, skanneområdet, og total målområdet i piksler.. 'Ikke-spesifikk "binding blir subtrahert fra" total "binding for å oppnå den spesifikke AT en kvantitativ binding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet identifiserer visualiseringen av "total" og "ikke-spesifikk" binding av radioliganden i tilstøtende seksjoner av koronale seksjoner av en gnagerhjerne tidligere høstet og lagret ved -80 ° C, og kan lett anvendes på praktisk talt alle vev som har anatomisk løst understell som viser differensial mengder av reseptorer eller radioligandbindingsstudier bindingssteder. De prosedyrer som er beskrevet i protokollen er enkle og analysen er kritisk for korrekt tolking av resultatene. Den 20 mikrometer tykkelse ble bestemt til å være optimal; om seksjonen er for tykk til ikke-spesifikk binding vil øke, noe som gjør det vanskelig å løse bindingen av radioliganden til dens mål. Dersom seksjonen er kuttet tynnere, blir det vanskelig å lykkes klippe og lagre sekvensielle seksjoner uten forvrengning. Den optimale skjære temperatur vil variere noe på grunn av beskaffenheten av vevet og tykkelsen av seksjonene og jeger vanligvis bestemmes empirisk. Når kontakten er gjort mellom bladet og vev, kan retningen på prøven gjennomgås, og realigned ved å flytte vevsprøve tilbake bort fra bladet, og snu monterings ballen. Når du kutter en gnager hjernen er det avgjørende å sikre venstre og høyre side av hjernen er i samme Antero-Postero koordinater, og at dorso-ventral aksen er vinkelrett på brukte hjerne atlas. Slide sett er pre-merket for å gjennomføre studier på tilstøtende deler av vev. De første settene med 5 lysbilder er merket 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, og 1-5. Den første cut delen går på lysbildet 1-1 i øvre venstre hjørne (dette er øvre høyre hjørne av lysbildet når det er frostet siden ned); den andre kutt delen går på lysbildet 1-2, etc. Den femte kutt delen går på lysbildet 1-5. Den sjette kutt delen går på lysbildet 1-1 til venstre for den første delen. Etter det første settet med lysbilder er fylt, starter et annet sett med 5 gledes, merket 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, og 2-5. Denne syklusen fortsettes så langt tilbake inn i hjernen etter behov. Den "-4" og "-5" lysbilder holdes som en backup eller for å radiomerke en annen reseptor.
Reseptoren autoradiografi protokollen avhenger av radioligand og egenskapene til de reseptorene som blir undersøkt for å bestemme konsentrasjoner av buffere, salter og inhibitorer. For måling av AT1 subtype av Ang II-reseptorer i denne fremgangsmåten, et høy-affinitet Jod-125 merket ligand, 125 I-Sar Ile 1 8 -Ang II (125 I-SI-Ang II); radiomerket av Robert C. Speth, Ph.D. (Peptide Radiojodering delt ressurs, Georgetown University), som også er kommersielt tilgjengelig) oppløses i AM5 buffer (tabell 1); en natriumfosfatbuffer med natriumklorid, EDTA og bacitracin. AM5 gir god beskyttelse av radioliganden fra metallopeptidases og bacitracin-sensitive peptidases som gir en fysiologisk pH-verdi, og NaCl-konsentrasjonen for å optimalisere bindingskarakteristika. Pre-inkubasjon i AM5 utsetter vevsdelene å peptidaseinhibitorer å minimere radioligand degradering, og også dissosierer endogen Ang II fra Ang II-reseptorer. Losartan og PD123319, AT1R og AT2R antagonister, henholdsvis, som mette deres mål-reseptorer ble tilsatt ved konsentrasjoner (10 uM) for å hindre at radioliganden fra binding til disse reseptorene for å vurdere ikke-spesifikk binding og begrense spesifikk binding til AT1-reseptoren, respektive. Den ønskede konsentrasjon av 125 I-SI-Ang II for analysen blir bestemt og den nødvendige fortynning av stamløsningen blir bestemt fra et regneark av radioisotopen reduksjonshastigheten (se protokoll tabell 3). Optimalt en konsentrasjon av radioligand som er tilnærmet K-D anvendes som ville oppta 50% av reseptorene som er tilstede. Imidlertid, fordi radioligandene kan være kostbart lavere konsentrasjoner e.eks. 10-20% av K-D-konsentrasjonen kan anvendes. Dette har en potensiell fordel for å øke signal-til-støy-forholdet ved å redusere ikke-spesifikk binding mer enn spesifikk binding. Imidlertid er lengre eksponeringstider som kreves for å utvikle et bilde av bindingen. Som bemerket ovenfor (avsnitt 3.4), dersom den oppnådde eksponeringen er over- og undereksponert, lysbildene kan re-eksponeres for en ny film for en kortere og / eller lengre tid for å oppnå den ønskede eksponering.
Densitometrisk bildeanalyse kan gjøres ved en proprietær imaging system som gir en omfattende samling av applikasjoner for autoradiografi samt andre applikasjoner. Kalibreringsstandarder er i fmol / g våt vev vekt (forutsatt en spesifikk vekt på en for vev). Hvert standardsett, sammen med en bakgrunn vil generere en standardkurve. Det er flere kurvetilpasning algoritmer med og uten vekting tilgjengelig for å generere en standardkurve fra den relative optometrisk density (ROD) -verdier for de forskjellige kalibreringsstandardene. Valg av den kurve som best representerer dataene gjøres empirisk som subrutinen for kurvetilpasning ikke gir relative feil verdier for de forskjellige standardkurver. På stenger opp til ~ 0,6, er standardkurven pseudolinear. Imidlertid begynner filmen å mette utover dette punktet danner en kurve som asymptoter omkring 0,8 til 0,9 enheter ROD. Dersom de standarder som er bracketing prøvene er over 0,9 ROD heter, er det anbefalt å re-eksponere filmen for et kortere tidsrom for å oppnå mer pålitelige verdier av fmol / g binding av prøvene nærmere pseudolinear rekke standard kurve. Verdiene er avledet på denne ekstreme av standardkurven vil føre til små forskjeller i ROD for betydelig større forskjeller i radioligand binding. Derav evnen til å oppdage forandringer i bindings avtar ettersom filmen nærmer seg metningspunktet.
For målinger av spesifikke regioneranbefalte tiltak er "Tetthet" i fmol / g, «Let område" i piksler, og "Total Target Area" i piksler (figur 9). Det er viktig å sette en terskelverdi så nær null som mulig (figur 10), fordi variasjoner i tetthet film eller vilkårlig del av standardkurven utledet fra kalibreringsstandardene kan noen ganger gi verdier som er mindre enn null. Dersom slike verdier er gjennomsnitt for alle pikslene i skanneområdet det ville utlede en kunstig lav verdi. Kriteriene som brukes for å identifisere områder med binding kan være svært subjektive, så det er best å nøye pare kontroll og eksperimentelle hjernen så mye som mulig for å redusere forekomsten av subjektive feil. En annen utfordring er å bestemme hvor mange deler til gjennomsnittlig å få en endelig lesing. En god indikasjon på seksjoner for å analysere kan bestemmes ved å følge en akseptert rottehjerne atlas, sammen med farget histologiske lysbilder. Størrelsen av samplingsområdet kan også være enproblem. For å kompensere, kan etableres en mal for å korrigere for alle størrelser avvik. Behandlingen av seksjonene kan også påvirke et område av strukturen som har høy binding og er å betrakte i løpet av analysen. Dette krever en alternativ anvendelse av den "terskel" verktøy i den proprietære avbildningssystemet for å sette en tetthetsområde som overskrider en vilkårlig verdi, slik som å representere de anatomiske egenskapene til hjerneområdet som samples som paraventrikulære kjerne av hypothalamus innenfor et prøvetakingsverktøy som omfatter regionen av interesse (figur 11, panel C). Det er også mulig å inkludere i området målingen til å bestemme mengden av binding. Dette kan gjøres ved å multiplisere verdien for spesifikke bindingstider antall piksler som er målt. Piksler kan konverteres til metriske enheter av tenkelig en linjal i to plan, eller et rektangel av kjente dimensjoner. Antallet bildeelementer som svarer til denlengde eller område av rektangelet kan deretter bli uttrykt i metriske enheter. På 2400 dpi oppløsning, ~ 9000 piksler = 1 mm 2 i vårt system.
Selv om bruken av radioaktive ligander er ikke lenger er en mye brukt teknikk; Det er en av de få måter å visualisere den fysiske fordeling av reseptorer i vevsprøver seg som funksjonelle (i stand til å binde dets ligand medfødt). I tillegg kan det kvantifisere antall reseptorer for å kunne vurdere endringer i funksjonell reseptor uttrykk mellom behandlingsgruppene, mellom ulike områder av hjernen eller andre konstruksjoner, mellom ulike stammer av dyr, eller dyr i ulike aldre, etc. Alternative metoder er tilgjengelige for å karakterisere nevroanatomi aspekter av AT-1-reseptoren ekspresjon, men de har begrenset verdi. In situ hybridisering av mRNA for AT 1 reseptorer ikke alltid stemmer overens med AT 1 reseptoren uttrykk eller distribusjon ihjerne. Mens immunologiske teknikker kan omtrentlige forskjeller i reseptorekspresjon basert på intensiteten til farging av vevssnitt, er det ikke mulig å generere en standardkurve for farging for å tillate en numerisk bestemmelse av reseptorekspresjon. Receptor autoradiografi tilveiebringer også en grad av spesifisitet for reseptorer (eller andre mål som spesifikt binder radioligandene), som ikke kan garanteres ved hjelp av immunologiske teknikker. I 2009 ble en serie artikler publisert 37-43 som stilte spørsmål ved gyldigheten av 49 antistoffer som ble brukt for å vurdere 18 forskjellige G protein-koblede reseptorer og en forbigående reseptor potensial (TRP) kanal. I hovedsak antistoffer merket identiske band på vestlige blotter fra villtype og knockout mus for reseptorene i spørsmålet. Senere har flere grupper gjort lignende observasjoner ved hjelp av kommersielt tilgjengelige AT 1 og 2 reseptor antistoffer 44-49. Bruken av en bacterial kunstig kromosom som genererer et reportermolekyl, f.eks, grønt fluorescerende protein, drevet av AT 1-promotoren er en indirekte middel for bestemmelse av nærvær eller fravær av AT 1-reseptor-uttrykkende celler i mus (men ikke rotte) hjerne basert på deres måtte en funksjonell AT 1 reseptoren promoter 50. Det er mulig å telle "positive celler" i mikroskopisk identifiserte hjerneregioner, men ikke for å kvantifisere endringer i intensiteten av ekspresjonen av AT-1-reseptoren i disse regionene. Dermed på denne tiden bare validerte teknikker som er tilgjengelig for direkte måle Ang II reseptor uttrykk er radioligand bindende metoder. Og, hvis anatomisk oppløsning av funksjonell AT 1-reseptor-protein som er nødvendig på et mikroskopisk nivå, er reseptor autoradiografi den eneste teknikk som er tilgjengelig for en slik direkte måling.
Receptor autoradiografi er ikke uten begrensninger. Den store concern er at for å møte kravene til å bruke radioaktivt materiale i et forskningsprosjekt setting. Det er nødvendig å ha en strålingssikkerhet program med strenge retningslinjer på plass for å ivareta sikkerheten til forskere som arbeider med radioaktive materialer og trygg disponering av radioaktivt materiale. Dette trappes opp kostnadene for forskning ved hjelp av radioaktivt materiale til et punkt som utelukker deres bruk i mange forsknings innstillinger. I tillegg kan kostnaden av radioligander være betydelige. Således kan en reseptor autoradiografi eksperiment hvor et stort antall glidemontert vevssnitt blir inkubert i beholdere av radioligand kan bruke flere hundre om ikke tusener av dollar av radioligand. En annen begrensning er at vev skal fryses før seksjonering på en kryostat, som er lagret i en periode av tid, og raskt skylt og tørket etter inkubasjon med radioliganden, som alle kan svekke evnen av reseptorene eller protein av interesse til å binde radioliganden . For ligander som har rask association / dissosiasjon kinetikk, kan det ikke være mulig å opprettholde bindingen av radioliganden til reseptoren i løpet av den tiden som er nødvendig for å skylle vekk ikke-spesifikt bundet radioligand. Også, med små mengder av radioligandbinding lange perioder med eksponering film - en måned eller mer - kan være nødvendig før en målbar bilde kan dannes på filmen. En annen utfordring er at tilsetning av jod-125 til en ligand kan påvirke evnen av liganden til å binde til dets mål-reseptor-protein eller på grunn av sterisk hindring. Bruken av et mindre molekyl, for eksempel tritium (3H) eliminerer problemet med sterisk hindring, men tritium har en så lav energi og lav spesifikk aktivitet (i forhold til jod-125) at det er ekstremt vanskelig å generere et filmbilde for det meste reseptor populasjoner. I lys av disse problemene, er det mange situasjoner hvor reseptoren autoradiografi ikke er i stand til å identifisere reseptorer eller andre molekylære strukturer av interesse.
Til tross for sin limitations, kan reseptoren autoradiografi identifisere spesifikke strukturer i et vev, f.eks hjerneregioner endret som reaksjon på eksperimentelle variabler sammenlignet med en normal kontroll hjerne. Denne kunnskapen kan bidra til å bestemme hvilken rolle AT 1 R for Ang II eller annen reseptor eller enzymer i patologi av sykdommen. Denne kunnskapen har verdifulle farmakologiske konsekvenser, da det indikerer områder for å målrette for potensielle behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S.
- Ganten, D., et al.
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D.
- Speth, R., Giese, M.
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R.
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).
