Abstract
Detta protokoll beskriver receptorbindnings mönster för angiotensin II (Ang II) i råtthjärna med hjälp av en radioligand specifik för Ang Il-receptorer för att utföra receptorautoradiografisk kartläggning.
Vävnadsprov skördas och lagras vid -80 ° C. En kryostat används för att koronalt avsnitt vävnaden (hjärnan) och tina-montera sektionerna på laddade objektglas. Glidmonterade vävnadssnitt inkuberas i 125 I-SI-Ang II för radioaktiv märkning av Ang II-receptorer. Intilliggande diabilder är separerade i två uppsättningar: "icke-specifik bindning" (NSP) i närvaro av en receptormättande koncentration av icke-radiomärkt Ang II, eller en AT 1 Ang II receptorsubtypen (AT 1 R) selektiv Ang II receptorantagonist och "total bindning" utan AT 1R antagonist. En mättande koncentration av AT 2 Ang II receptorsubtypen (AT 2 R) antagonist (PD123319, 10 ^ M) är också närvarande i incubatipå buffert att begränsa 125I-SI-Ang II bindning till AT 1 R subtyp. Under en 30 min förinkubation vid ~ 22 ° C, NSP glasen exponeras för 10 iM PD123319 och losartan, medan "total bindning" diabilder utsätts för 10 iM PD123319. Diabilder inkuberas sedan med 125 I-SI-Ang II i närvaro av PD123319 för "total bindning", och PD123319 och losartan för NSP i analysbuffert, följt av flera "tvättar" i buffert, och vatten för att avlägsna salt och icke- specifikt bunden radioligand. Det får torka med användning av blow-torkar, därefter utsätts för autoradiografifilm under användning av en specialiserad film och kassett. Filmen utvecklas och bilderna har skannats in i en dator för visuell och kvantitativ densitometri med hjälp av en egenutvecklad bildsystem och ett kalkylprogram. En extra uppsättning av objektglas tionin-färgas för histologiska jämförelser.
Fördelen med att använda receptorautoradiografi är förmågan att visualiseraAng Il-receptorer in situ, inom en sektion av ett vävnadsprov, och anatomiskt identifiera regionen av vävnaden genom att jämföra den med en intilliggande histologisk referenssektion.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdom är fortfarande den vanligaste dödsorsaken och funktionshinder i USA, vilket leder till mer än 30% av dödsfallen i USA under 2011 en. Den senaste statistiken från American Heart Association visar att mer än en person i tre har en eller flera typer av hjärt-kärlsjukdom. Kardiovaskulär forskning fortsätter att göra framsteg mot att förstå denna sjukdom, men som generationer börjar bli äldre är det nödvändigt att fortsätta dessa ansträngningar. Renin-angiotensin-systemet (RAS) spelar en central roll i regleringen av det kardiovaskulära systemet i första hand genom att främja ateroskleros, inflammation, systemisk kärlsammandragning, och aktivering av det sympatiska nervsystemet (figur 1) 2-8.
RAS är en hormonsystem som aktiveras när juxtaglomerulära celler i njuren utsöndrar renin i blodet som svar på sänkt blodtryck, ökad sympathetic stimulering eller minskat natrium flöde av macula densa. Renin metaboliserar angiotensinogen (syntetiserad i levern) för att bilda angiotensin I (Ang I). Ang I därefter metaboliseras av angiotensin converting enzyme (ACE), ett ectoenzyme på den luminala sidan av vaskulära endotelceller, främst i lungorna och njurarna, för att bilda angiotensin II (Ang II), den viktigaste effektor peptid med RAS. Ang II är kapabel att aktivera två receptorsubtyper; typ 1-receptorn (AT 1 R) och den typ 2-receptorn (AT 2 R), såväl som reglerar det kardiovaskulära systemet, upprätthålla vätske- och elektrolyt-homeostas och är nu anses påverka kognitiv funktion och neurodegenerativ sjukdomsprocesser 8,9. En lokal, hjärna specifika RAS rapporteras att självständigt syntetisera Ang II. I hjärnan, är prekursorproteinet angiotensinogen syntetiserats i astroglia 10 omvandlas till Ang I genom en renin-liknande enzym 3, möjligen prorenin bunden till prorenin-receptorn11, och därefter omvandlas till Ang II av angiotensin-konverterande enzym, som rikligt uttrycks på den extracellulära ytan av nervceller i hjärnan 12. Denna intrabrain genereras Ang II är agonisten för hjärnan AT 1 och AT 2-receptorer som är isolerade från blodburen Ang II.
Medan AT 1 R spelar en viktig fysiologisk roll, är det bättre känd för sina patofysiologiska effekter i hela kroppen, framförallt påverkar hjärt-kärlsystemet och njurarna (Figur 2). När Ang II binder till AT 1 R, orsakar det vasokonstriktion; ökande motståndet mot blodflödet och höja blodtrycket. Det främjar också syntes och utsöndring av aldosteron och vasopressin, vilket leder till ökad natrium och vätskeretention. Dessa effekter kan också inducera ischemisk hjärnskada och kognitiva försämringar och är kopplad till Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, och hjärtes, samt är nyligen identifierats att påverka inlärning och minne 13-15. Det finns en återkopplingsslinga i RAS i att AT ett R på de juxtaglomerulära cellerna i njuren hämmar reninutsöndring. Intressant, AT 2 R i allmänhet kontra reglerar verkan av AT 1 R, vilket vasodilatation, neuritutväxt, axonal regenerering, anti-spridning, och cerebroprotection bland många andra 16-20. AT 2 R har också identifierats som ett mål för anti-hypertoni och nyligen, läkemedel mot cancer 21. Fastställande av lokaliseringen och densiteten av Ang II-receptorer inom olika vävnader och hur de påverkas av olika behandlingar och sjukdomstillstånd med hjälp av kvantitativ densitometriska receptorautoradiografi kan avslöja roll RAS spelar i specifika sjukdomar.
Receptorautoradiografi har använts i över 30 år som en effektiv metod för att indikera närvaron av angiotensin II receptorer och andra komponenter i de RAS i hjärnan och andra vävnader i råtta, mus, marsvin, hund och människa under en mängd olika experimentella förhållanden 22-34. Betydelsen av att lokalisera Ang II-receptorer i hjärnan är att man kan tillämpa funktionell neuroanatomi de åtgärder av Ang II i hjärnan, till exempel, föreslår närvaron av AT 1 R i paraventrikulära kärnan av hypotalamus (PVN) en funktion av Ang II i hjärnan för att stimulera vasopressin, oxytocin eller kortikotropinfrisättande hormon (CRH) frisättning, eller aktivering av det sympatiska nervsystemet. Således kan läkemedel som blockerar AT1 R minska en del av dessa PVN-medierade effekter i samband med överaktivitet av hjärn RAS. Pågående arbeten tyder på att användningen av AT 1 R-antagonister kan minska Posttraumatiskt stressyndrom (PTSD) inducerad frisättning av CRH och lindra symptomen av PTSD (Hurt et al., Lämnades för offentliggörande). PVN, subfornicalorgan (SFO), och amygdala är kända för att reglera homeostas, aptit / törst, sömn, minne, emotionella reaktioner, och är målområdena i denna demonstration studie. Dessa regioner undersöktes genom att samla koronalt delar av en hjärna på objektglas, och behandla avsnitt med specifika hämmare tillsammans med en specifik radioligand för Ang II-receptorer. I denna studie, alla material och reagens tillsammans med förslag på leverantörer listas, jod-125 användes för att radiomärka en Ang II-receptorantagonist, sarkosin en, isoleucin 8 Ang II (SI Ang II), som sedan renades som mono 125I Si Ang II med hjälp av HPLC-metoder som beskrivits tidigare 35. Användning av denna hög specifik aktivitet radioligand medger visualisering av områden med låg, måttlig och hög receptortäthet efter exponering av de radioaktivt märkta sektionerna för röntgenfilm. Genom att kalibrera filmen med hjärn klistra standardlösningar som innehåller kända mängder av jod-125, det specifika beloppav Ang II receptorbindning i ett område kan kvantifieras. I experimentella studier kan Ang II receptorbindning i hjärnan hos försökspersoner att jämfört med den i hjärnan hos kontrollindivider. Detta kan indikera om agerande Ang II ändras som svar på en genetisk sjukdom, fenotypisk abnormitet, sjukdomstillstånd eller läkemedelsbehandling. Denna kunskap kan sedan användas till att utveckla behandlingar för att behandla sjukdomar som förknippas med dysreglering av RAS. Alternativa tekniker som identifierar receptorbindningsställen, men med reducerad anatomisk upplösning, är bindningsanalyser som använder vävnadsmembranpreparat härledda från vävnadshomogenat, som inkuberas med radioligand över ett intervall av koncentrationer för att bedöma radioligand bindningsaffinitet som dissociationskonstanten (K D ) och maximal bindningskapacitet (Bmax) av vävnaden av intresse.
Protokollet som beskrivs här kan delas upp i fem större samarbetemponents: Förbereda vävnadssnitt för Receptor Autoradiografi; Receptor Autoradiografi; Film Exponering och utveckling; Histologi; och Densitometrisk bildanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs för denna studie har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Nova Southeastern University i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur, 8: e upplagan (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ).
1. Förbereda Vävnadssektioner Receptor Autoradiografi
- Vid offer, skörd färska hjärnvävnader, och linda in i aluminiumfolie och lägg i en -20 ° C frys så snart som möjligt. För att bibehålla den korrekta formen, placera hjärnor i en hjärna mögel som simulerar insidan av skallen, linda in i aluminiumfolie och placera i en - 20 ° C frys. Efter 30 minuter, placera vävnader i en förslutningsbar frysförvaringsväska och flytta till en -80 ° C frys för långtidslagring.
- Skaffa fryst vävnadsprov av intresse från -80 ° C frys och överföring till en kryostat inställd på minst -10 ° C och högst -18 ° C, för att undvika upptining. Placera objektet laddats in i vävnaden Fäste med en glykol och hartsbaserad inbäddningsmedium, endast bädda in en liten del av provet i mediet. För hjärnan, är hjärnan monteras vertikalt för att möjliggöra sektionering i frontalplanet.
- Placera vävnaden montera på mikrotomen i kryostaten och dra åt på plats. Se till att vänster och höger sida av hjärnan är i samma antero-postero koordinater och att dorso-ventrala axeln är vinkelrät mot vanligen använda hjärnan atlaser.
- Börjar såga vid den önskade tjockleken (20 | j, m rekommenderas) och tina montera delarna till objektglas i en vertikal riktning för att ha en större ytarea av rymden i sliden. Samla delar på diabilder i sekventiella uppsättningar av fem, det vill säga den första uppsättningen av bilder är märkta 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, och 1-5 (Figur 3).
- Efter att ha fyllt en uppsättning bilder med sektioner, tillåter glider lufttorka för upp till en timme, sedan placera slides i en plastglidlåda i en självtätande frysförvaringsväska och förvara vid -20 ° C.
2. Receptorautoradiografi
VARNING: Radioaktivitet. Använd skyddande klädsel för att hantera radioaktivitet. Bortskaffande berodde på etablering, och måste följa riktlinjer för att på rätt sätt avklinga (halveringstid 60 dagar) eller plockas upp av ett certifierat företag.
- Ta bort "-1" och "-2" glider av intresse från -20 ° C frys och montera in glidgrepp (Figur 5). Montera "-1" glider ihop för "icke-specifik" behandling, och "-2" diabilder för "total" behandling. "Icke-specifika" burkar kommer att innehålla 10 iM slutliga koncentrationer av PD123319 en AT 2 R-antagonist, och losartan en AT 1R antagonist, i analysmedium buffert (AM5) (tabell 1), den "totala" bindande burkar kommer endast att innehålla 10 iM PD123319 i AM5.
- Vänd bildengrepp för att placera bilderna i pre-inkubation Coplin burkar fyllda med 35-40 ml AM5 och respektive hämmare under 30 minuter vid rumstemperatur. Börja efterföljande apparater i deras förinkubation bad vid 4 minuters intervall.
- Överför omedelbart objektglasen från pre inkubation lösning på de inkubation glid sändare, som innehåller 10 ml AM5, plus en förutbestämd koncentration av 125 I-SI-Ang II (beräknat i figur 4) med de respektive inhibitorer, t 60-90 min vid rums- temperatur. Om det finns tillräckligt radioligand kan 10 diabilder placeras (rygg mot rygg) i modifierade glid grepp och inkuberades med 125 I-SI-Ang II i Coplin burkar.
- Placera objektglasen tillbaka in glid grepp (om det behövs), blot, och skölj genom att försiktigt virvlande för 1-2 sek i 400 ml destillerat vatten i två separata behållare.
- Överför bilderna sekventiellt i fyra Coplin burkar innehållande 35-40 ml AM5 för exakt en minut vardera (som visas i figur 4 </ Strong>).
- Efter den sista 1 minut skölj försiktigt snurra sektionerna för 1-2 sek i fyra byten av iskallt destillerat vatten.
- Föna glasen med kall luft (Varning: varmluft volatizes det radioaktiva ämnet) med fyra hårtork som upp från olika vinklar för 4 min (Figur 5), tills alla sektioner är torra, placera sedan på en pappershandduk.
- Mount glider med vävnader vänd upp på en kartong för apposition till röntgenfilm med användning av dubbelhäftande tejp.
- Montera åtminstone en, 125 Jod kalibreringsstandard glida på varje kartong (Figur 6).
Obs: Kalibreringsstandarder består av hjärnan pasta blandas ordentligt med 125 Jod bunden till en förening som innehåller en fenolring, kompakteras genom centrifugering i en 1 ml tuberkulinspruta, som är kryostaten sektionerad vid samma tjocklek som de hjärnsektioner och tina-monterades på mikroskop diabilder. Alternativt, 125 Jag kalibreringsstandarder iplastharts sektione vid 20 um tjocklek kan erhållas kommersiellt. Plast hartset i dessa normer skyddar delvis filmen från strålningen så att en vävnads likvärdighet av ~ 40% bör vägas in i kalibreringen.
3. Film exponering och utveckling
- Vidare till ett mörkrum med en rem-back röntgenkassett och autoradiografi-film. Öppna kassetten och placera kartong med bilder inuti (Figur 6).
- Släcker belysningen och slå på skyddsljus. Öppna försiktigt rutan X-Ray film, ta bort en film, och placera filmen blanka sidan uppåt (med taggiga kanten på det nedre högra hörnet) ovanpå bilderna i kassetten. Stäng försiktigt kassetten och vrid låsstängerna att stänga ute ljus (Figur 6). Exponera objektglasen i flera dagar till flera veckor vid -20 ° C.
- I mörkrummet, öppna kassetten och fortsätta med filmen utvecklar process.
- Placera glasen i facken i följd; utvecklare i 2 min, vatten innehållande 5% isättika under 30 sekunder, och fixer under 5 min. Filmerna den placeras i en bricka med rinnande vatten under 20 min, placerades därefter i Photoflo för inte mer än 10 sek och hängt.
Obs: Exponeringstiden bestäms empiriskt och kan involvera flera filmer med olika exponeringstider: tillräckligt länge för att få mätbara signaler från områden med låg bindnings, men inte så länge att mätta filmen genom områden med hög bindnings. När acceptabla exponeringar erhålls, sedan gå vidare till nästa steg.
- Placera glasen i facken i följd; utvecklare i 2 min, vatten innehållande 5% isättika under 30 sekunder, och fixer under 5 min. Filmerna den placeras i en bricka med rinnande vatten under 20 min, placerades därefter i Photoflo för inte mer än 10 sek och hängt.
4. Histologi
- Förbered tionin fläcken och färgningsreagens (Tabell 2, Figur 7).
- Placera de "-3" glider i glidställ, och överföring i sekventiell ordning som börjar med avjoniserat vatten under 1 min och därefter tionin färglösning under 10 min följt av tre doppningar in i Deionized vatten, och en 30 sek tvättning i avjoniserat vatten.
- Efter vatten, placera bilden rack i etanol tvättar enligt följande; 50%, 70% och 90% under 30 sekunder, följt av två etanoltvättningar vid 100% under vardera 1 min. Slutligen, placera bilden rack in i xylen under 3 min, sedan överföra över till en andra xylenlösning under 5 min.
- Avlägsna ett objektglas åt gången från den senaste xylenbad, och täcka den övre kanten av bilden med en harts bas i organiskt lösningsmedel monteringsmedium och placera en 24 mm x 60 mm täckglas på bilden. Låt objektglasen tillräckligt torr för ~ 48 timmar och sedan scanna in i datorn på 2400 dpi gråskala.
5. Densitometrisk bildanalys
- Placera filmen blanka sidan nedåt, med den taggiga kanten på det nedre vänstra hörnet och skanna med en egen scanner som kan överföra information filmtätheten utan någon distorsion i avbildningssystemet dator.
- Öppna egna avbildnings sysTEM och utnyttjar kalibrerings barer att etablera kalibreringsstandarder för framtida densitometrisk analys av bilderna på filmen (Figurerna 9 - 12).
- Mät intresseområden genom att antingen fastställande av en mall eller empiriskt beskriver de intresseområden. Data insamlade och separeras baserat på film, vare sig kontroll eller vild typ (avsnitt), och region. Se till att inkludera densitet (fmol / g), skanningsområdet, och totalt målområde i mätningarna (figur 9).
- Justera skannings barer området genom att säkerställa att regionen av intresse faller mellan parametrar för att belysa (Figur 10).
- Exportera data till ett kalkylblad (tabell 4). Multiplicera densitets gånger den totala målområdet, sedan dividera med skanningsområdet för att erhålla värdet för bindningen av det specifika området. När detta är gjort med alla andra värden som uppmätts, substrat etablerade ospecifik från total att ge specifik bindning pharmas över. Medelvärden kan även utföras för dessa värden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikten över metabolism av renin-angiotensinsystemet visas i figur 1 och den direkta fokus på angiotensin II-receptorundertyper (AT 1 R och AT 2 R) beskrivs i figur 2. Figur 3 visar överföring av koronala hjärnan sektioner på objektglas, som sedan körs genom en receptorautoradiografi förfarande med användning av en förutbestämd 125 i-Siang II koncentration såsom framgår av fig 4, fig. 5 illustrerar torkningssteget för bilderna i receptorautoradiografi, som sedan är fästa på en kartong som ses i figur 6, och därefter utvecklas. Tabell 2 listar de reagenser som används för tionin färgningsproceduren för glidmonterade vävnadssnitt som beskrivs i figur 7. Kalibreringsstandardenheter för kvantifiering bestäms based vid tidpunkten för analysen som visas i tabell 3. Figur 8 visar upprättandet av en standardkurva avseende 125I koncentration (fmol / g vävnad) för att filma exponering (relativ optometric densitet). Figur 11 illustrerar skillnaden mellan "NSP" och "total grupper, samt vävnads etiketter, medan figur 10 beskriver inställningen av tröskeln till ett nära nollvärde att få en exakt medelvärde för hela skannade området (Scan area-pixel). Tabell 4 visar kvantifieringen processen för att erhålla specifik bindning bygger på att subtrahera icke-specifik "från" totalt "värden. 'Icke-specifik "bindning vilken innehåller losartan och / eller PD123319 skapas av mängden radioligand bunden till icke-AT 1, eller AT 2-receptorer. Alla av radioliganden bunden till AT 1-receptorer i närvaro av PD123319 ger den "totala" bindning. F igure 11 visar de slutliga uppmätta områden i PVN totalt kontra icke-specifik bindning intill en tionin färgade avsnitt för anatomiska bekräftelse av PVN.
Figur 1:. Metabolisk Pathway av renin-angiotensinsystemet (RAS) i kroppen Levern släpper zymogenet angiotensinogen, som klyvs av njur-utsöndrade renin, som bildar Angiotensin I. Angiotensin converting enzyme (ACE) omvandlar Ang I till angiotensin II ( Ang II), den viktigaste föregångare till hjärt-kärlsjukdom. Ang II orsakar vasokonstriktion och ökar blodtryck, hjärtminutvolym, salt aptit, törst, och vätskeansamlingar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Funktioner i Angiotensin typ 1 och 2-receptorer (vid 1 R, AT 2 R) AT 1R påverkar patologiskt hjärt-kärlsjukdom, verkar direkt för att öka törst och salt aptit, och utövar många andra perifera cellulära aktiviteter samt central psykologiska effekter. AT 2 R är en fysiologisk antagonist av AT1-receptorn, hjälpa till effekten av AT 1 R antagonister 36 därigenom har positiva effekter på kärlstruktur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cryosectioning av hjärnan på objektglas vid 20 um tjocklek. Beroende på temperaturen i kryostaten kommer sektionerna ibland visa veck, sprickor, curling, eller bli packad på mikrotomen bladet eller knivhållaren. I sådana fall avsnittet kastas och en anteckning görs för att indikera att en extra 20 pm kommer att skilja det här avsnittet från föregående avsnitt. Sektioner ska samlas på objektglas i en vertikal riktning för att maximera den totala ytan som krävs för att fylla upp en bild och därmed samla den största mängden avsnitt om varje bild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Exempel på experimentell design & protokoll för Receptor Autoradiografi Differentiation av "total" (-2) och "icke-specifik" (-1) är direkt relaterad till närvaro och frånvaro av receptorsubtyp antagonist. Protokoll kan variera beroende på antalet bilder, och kommer att öka i steg om två för varje par av den totala och icke-specifika bilder. Radioligand koncentration, som tidigare bestämts erhålls genom utspädning av beståndet i AM5. Denna lösning sätts sedan jämnt fördelat till inkubationstid behållarna. Direkta räkningar tas före och efter inkubation för att fastställa den exakta koncentrationen av radioliganden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Konfiguration för torkningsstation i receptorautoradiografi Torktiderna varierar beroende på effektiviteten hos blåstorktumlare samt förmågan att sudda bort överflödigt vatten efter de sista sköljningar. Diabilder kommer att torkas när avsnittet vänder sig från klar till vit. Om glider inte torkas fullständigt då radioliganden kan diffundera bort från receptorn producerar en suddig bild som inte är specifik för receptorbindningsställen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6:.. Exponera behandlade bilder till röntgenfilm med hjälp av en specialiserad kassett Slide set-up rekommenderas att följa ett mönster där jämförelse av båda grupperna underlättas Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Set-up för tionin färgning. Diabilder placeras i en glashållare och nedsänkt i sekventiella lösningar. Timing möjliggör effektiv färgning av Nissl ämne (grov endoplasmatiska retiklet) av nervceller. En monteringsmedel ansökan till bilderna efter uttorkning gör det möjligt att fastställa av täck till bilden, bevara sektioner för jämförande analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8:. Inställning av kalibreringsstandard Varje film innehåller dess enskilda kalibreringsstandarder, baserade på hjärnan pastan och den tidpunkt vid vilken experimentet utfördes . En regressionslinje som beskriver de bästa passningsvärdena genereras genom en patentskyddad bildsystem program för de uppmätta hjärnan klistra standarder. Detta omvandlar den relativa optometric densitet (ROD) värde från kalibreringsstandarder (ka stds, i röd oval) till enheter av radioligandbindning, i detta exempel enheterna (fmol / g, inringad i rött) är fmol radioligand bunden per gram våt vävnadsvikt (fmol / g). Mätningen av hjärnan klistra standarder sker med den cirkulära verktyget och placeras i mitten av provet visas till höger i pseudo med ikonen bildvisning (inringad i rött). Cirkeln att mäta kalibreringsstandarden behöver inte täcka hela provet, utan snarare mäta en jämn yta av standarden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/53866fig9.jpg "/>
Figur 9:. Identifiera grupper av provnummer, ospecifik / totalt, och regioner för provavläsningar Eftersom flera hjärnor, hjärnregioner, och flera experimentella grupper kvantifieras tillsammans, är det viktigt att skilja mellan alla de faktorer. Ämnet visar hjärnan provet och kan också indikera grupp; sektionen visar om det är icke-specifik (NSP) eller total, medan regionen möjliggör identifiering av flera områden i hjärnan som är under urvalet. Provet verktygsfältet (röd rektangel) beskriver olika provtagningsverktyg, till exempel, cirkel, fyrkant, mall, fria händer, suddgummi; som kan användas för att avgränsa området som skall mätas. Stången värden som erhölls inom området provtagningsverktyget registreras på kalkylbladet som konverterade enheter bindning, fmol / g (inringad i rött). Dessutom är den totala scanningsområdet inom provtagningsverktyg registreras i "Scan område-pixel" kolumnen medan den totala tArget område (antalet pixlar som överskrider tröskelvärdet (som beskrivs i figur 10 legend) registreras i "Total Tgt Area-pixel" kolumnen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Fastställande av tröskeln för prover som ska mätas utifrån de standarder scanningsområdet är unik för varje film, och beror på den standard som.. Med hjälp av tröskelverktyget (inringad i rött) för att ställa tröskelvärden för densitetsintervallet för scanningsområdet i fmol / g gör det möjligt för de områden som mäts (avgränsas av diagonala pilarna) att falla mellan en rad 0, upp till en punkt där kalibreringskurvan börjar asymptot vilket indikerar att filmen närmar sig en maximal exponering, bortom vilken ytterligare
Figur 11: Bilderna av receptorautoradiografi bindning till koronala sektioner av en kvinnlig spontant hypertensiv råtta (SHR) vid ~ 1,8 mm caudal till bregma, uppvisar paraventrikulära kärnan av hypotalamus (PVN) och sängen kärnan i tillbehörsluktorganen (baot ). (A </ strong>) Totalt bindning av AT en R-bindning (Röda PVN, Gul- baot). (B) Icke-specifik bindning med losartan (AT1R antagonist) och PD123319 (AT2R antagonist). (C) Total bindning av AT 1R bindning med en godtycklig tröskel inställning som att beskriva formen på PVN (svart fyllning) överstiger tröskelvärdet inom skanningsområdet som registreras som Total Tgt Area). (D) tionin färgade avsnitt för anatomisk bekräftelse av strukturerna uppvisar hög total bindning, och för jämförelse med andra områden i hjärnan eller andra experimentella grupper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| reagens | Belopp |
| NaCl | 8,76g |
| Na2EDTA | 1,86 g |
| bacitracin | 141 mg |
| 500 mM Dibasiskt Na 2 PO 4 | 100 ml |
| Destillerat, avjoniserat vatten | 900 ml |
| Justera pH till 7,1 till 7,2 med NaOH eller HCl | |
Tabell 1: Analys Medium (AM5) Kemiska komponenter i den buffert som används i vävnad förberedelse..
Tabell 2:. Tionin Fläck Reagenser Den tionin fläcken består av destillerat vatten, 1,0 M natriumacetat och 1,0 M Isättika lösning, titrerat till pH 4,3 före tillsats av en 0,5% tionin lösning.
| Dagar efter referensdatum | |||||||||
| Sats | fmol / g våtvikt | ref Datum | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Standard | nCi / mg | fmol / g | dpm / g | fmol / g | fom / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g | fmol / g |
| antal | 30-May | 30-May | 30-May | 30-May | 31-May | 1-juni | 2-juni | 3-juni | 4-juni |
| 1 | 9706 | 4463 | 21547320 | 4463 | 4411 | 4361 | 4311 | 4261 | 4212 |
| 2 | 5838 | 2684 | 12960360 | 2684 | 2653 | 2623 | 2593 | 2563 | 2533 |
| 3 | 2798 | 1286 | 6211560 | 1286 | 1272 | 1257 | 1243 | 1228 | 1214 |
| 4 | 1451 | 667 | 3221220 | 667 | 659 | 652 | 644 | 637 | 630 |
| 5 | 787 | 362 | 1747140 | 362 | 358 | 354 | 350 | 345 | 342 |
| 6 | 385 | 177 | 854700 | 177 | 174 | 173 | 171 | 169 | 167 |
Tabell 3:. Daily dämpfaktor Beräkningar för kalibreringsstandarder En daglig dämpfaktorn kalkylblad för kalibreringsstandarder måste skapas utifrån de datum då experimentet genomfördes. Detta kalkylblad är baserad på den första ordningens hastighetskonstant med en halveringstid (t ½) på 60 dagar. N = N 0 * e kt, där N = koncentrationen av 125 I, vid tiden t i förhållande till koncentrationen vid tiden 0 (N 0), och k = ln2 / t 1/2.
| Paraventrikulära Nucleous i hypothalamus | Mål | Densitets fmol / g | Scan Area | Totalt målområde | Total* | |
| Total | 1 | 996 | 4383 | 4383 | 996 | |
| Total | 2 | 921 | 3362 | 3362 | 921 | |
| Total | 3 | 818 | 3445 | 3445 | 818 | specifik bindning |
| Total | 4 | 710 | 2906 | 2906 | 710 | 967 |
| GENOMSNITT | 861 | 3524 | 3524 | 861 | 895 | |
| 763 | </ Tr>||||||
| Sektion | Mål | Densitets fmol / g | Scan Area | Totalt målområde | Icke-specifik * | 678 |
| NSP | 1 | 53 | 3072 | 1737 | 30 | 826 |
| NSP | 2 | 52 | 2959 | 1455 | 26 | |
| NSP | 3 | 86 | 3180 | 2035 | 55 | |
| NSP | 4 | 53 | 3293 | 1995 | 32 | |
| GENOMSNITT | 61 | 3126 | 1,805.5 | 36 | ||
| Bed Nucleus av tillbehörs Olfactory Tract | ||||||
| Sektion | Mål | Dens-fmol / g | Scan Area | Totalt målområde | Total* | |
| Total | 1 | 439 | 3632 | 3632 | 439 | |
| Total | 2 | 435 | 3632 | 3632 | 435 | |
| Total | 3 | 355 | 3632 | 3620 | 354 | |
| Total | 4 | 435 | 3632 | 3631 | 435 | specifik bindning |
| Total | 5 | 342 | 3632 | 3630 | 342 | 414 |
| Total | 6 | 334 | 3632 | 3606 | 331 | 393 |
| GENOMSNITT | 390 | 3632 | 3625 | 389 | 321 | |
| 394 | ||||||
| 315 | ||||||
| Sektion | Mål | Dens-fmol / g | Scan Area | Totalt målområde | Icke-specifik * | 320 |
| NSP | 1 | 49 | 3632 | 1846 | 25 | 360 |
| NSP | 2 | 64 | 3632 | 2362 | 42 | |
| NSP | 3 | 53 | 3632 | 2275 | 33 | |
| NSP | 4 | 64 | 3632 | 2339 | 41 | |
| NSP | 5 | 51 | 3632 | 1879 | 26 | |
| NSP | 6 | 41 | 3632 | 966 | 11 | |
| GENOMSNITT | 54 | 3632 | 1945 | 30 | ||
| * Total och icke-speciic är densitetsenheter fmol / g. | ||||||
| Totalt = densitet * totala målområdet / skanningsområde | ||||||
| Ospecifik = densitet * totala målområdet / skanningsområde | ||||||
| Totalt målområdet pixlar som överskred tröskelvärdet, som så nära 0,00 fmol / g som möjligt. | ||||||
| Pixlarna inte överstiger tröskelvärdetvärde får värdet 0 för bedömning av den totala densitet. | ||||||
| Pixlar som inte överstiger tröskelvärdet får ett värde av 0 för bedömning av icke-specifik densitet. | ||||||
| Specifik bindning är total minus icke-specifik bindning, uttryckt som densitetsenheter av fmol / g. | ||||||
Tabell 4: Kvantitativ analys av paraventricular kärnan i hypotalamus och sängen kärna tillbehöret luktorganen Imaging programvara export uppgifter som ett kalkylblad i fmol / g, skanningsområdet, och totalt målområde i pixlar.. "Icke-specifik" bindning subtraheras från "total" bindning för att erhålla den specifika AT en kvantitativ bindning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivits identifierar visualisering av "total" och "icke-specifik" bindning av radioliganden i angränsande delar av koronala sektioner av en gnagare hjärna tidigare skördas och förvaras vid -80 ° C, och kan lätt tillämpas på så gott som alla vävnader som har anatomiskt löst strukturer som visar differensbelopp av receptorer eller radioligand bindningsställen. De förfaranden som beskrivs i protokollet är enkla och analysen är avgörande för korrekt tolkning av resultaten. Den 20 um tjocklek bestämdes vara optimal; om sektionen är för tjock den icke-specifika bindningen kommer att öka, vilket gör det svårt att lösa bindningen av radioliganden till sitt mål. Om sektionen skärs tunnare, blir det svårt att framgångsrikt klippa och spara sekventiella sektioner utan distorsion. Den optimala skär temperaturen varierar något beroende på vilken typ av vävnad och tjockleken av sektionerna och iär vanligtvis empiriskt. När kontakt görs mellan bladet och vävnaden, kan orienteringen av provet ses över, och omgrupperade genom att flytta vävnadsprov tillbaka bort från bladet, och omorientera monterings bollen. Vid skärning en gnagare hjärnan är det viktigt att se till vänster och höger sida av hjärnan är i samma antero-postero koordinater och att dorso-ventrala axeln är vinkelrät mot vanligen använda hjärnan atlaser. Glid uppsättningar pre-märkta för att genomföra studier på intilliggande sektioner av vävnader. De första uppsättningarna av 5 diabilder är märkta 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, och 1-5. Den första skuren sektion går på bild 1-1 i det övre vänstra hörnet (detta är den övre högra hörnet av bilden när det är frostat nedåt); den andra skuren sektion går på bild 1-2, etc. Den femte snitt avsnittet går på bild 1-5. Den sjätte skuren sektion går på bild 1-1 till vänster om det första avsnittet. Efter den första uppsättningen av diabilder är fyllt, börjar en annan uppsättning av fem gledes, märkt 2-1, 2-2, 2-3, 2-4, och 2-5. Denna cykel fortsätter så långt tillbaka in i hjärnan efter behov. Den "-4" och "-5" glider hålls som en säkerhetskopia eller att radiomärka en annan receptor.
Receptorautoradiografi-protokollet beror på den radioligand som används och egenskaperna hos de receptorer som övervakas för att bestämma koncentrationerna av buffertar, salter och inhibitorer. För mätning av AT1-subtypen av Ang II-receptorer i detta förfarande, en hög affinitet Jod-125 märkt ligand, 125 I-Sar en Ile 8 -Ang II (125 I-SI-Ang II); radiomärkt av Robert C. Speth, Ph.D. (Peptid radiojodering delad resurs, Georgetown University), som också är kommersiellt tillgänglig) löses i AM5-buffert (Tabell 1); en natriumfosfatbuffert med natriumklorid, EDTA och bacitracin. AM5 ger ett bra skydd av radioligand från metallopeptidases och bacitracin känsliga peptidaSES tillhandahåller ett fysiologiskt pH och NaCl-koncentrationen för att optimera bindningskarakteristika. Pre-inkubation i AM5 exponerar vävnadssnitt att peptidasinhibitorer att minimera radioligand nedbrytning, och även sönder endogena Ang II från Ang II-receptorer. Losartan och PD123319, AT1R och AT2R antagonister respektive mätta att deras målreceptorer läggs vid koncentrationer (10 ^ M) för att förhindra radioliganden från att binda till dessa receptorer för att bedöma icke-specifik bindning och begränsa specifik bindning till AT1-receptorn, respektive. Den önskade koncentrationen av 125 I-SI-Ang II för analysen bestäms och den erforderliga utspädningen av förrådslösningen bestäms från ett kalkylark av radioisotopen dämpfaktorn (se protokoll Tabell 3). Optimalt en koncentration av radioligand approximera K D används som skulle ockupera 50% av receptorerna är närvarande. Men eftersom radioligander kan vara kostsamt lägre koncentrationer e.ex. kan användas 10-20% av K D-koncentrationen. Detta har en potentiell fördel med att öka signalbrusförhållandet genom att minska icke-specifik bindning mer än specifik bindning. Emellertid är längre exponeringstider krävs för att utveckla en bild av bindning. Såsom angivits ovan (avsnitt 3.4), om exponeringen erhålls är över eller under utsatt, objektglasen kan åter exponeras för en ny film för en kortare och / eller längre tid för att uppnå önskad exponering.
Densitometrisk bildanalys kan göras med en patentskyddad bildsystem som ger en omfattande sammanställning av ansökningar om autoradiografi samt andra applikationer. Kalibreringsstandarder är i fmol / g våt vävnadsvikt (under antagande av en specifik vikt av en för vävnad). Varje standarduppsättning, tillsammans med en bakgrund kommer att generera en standardkurva. Det finns flera kurvanpassningsalgoritmer med och utan viktning tillgänglig för att generera en standardkurva från den relativa optometric density (ROD) värden för de olika kalibreringsstandarder. Val av kurva som bäst representerar data görs empiriskt som underprogrammet för kurvanpassning inte ger relativa felvärden för de olika standardkurvor. Vid stavar upp till ~ 0,6, är standardkurvan pseudolinear. Men börjar filmen att mätta bortom denna punkt bildar en kurva som asymptoter cirka 0,8 till 0,9 ROD heter. Om de standarder som bracketing proven är över 0,9 ROD heter, är det rekommenderat att återexponera filmen under en kortare tidsperiod för att få mer tillförlitliga värden på fmol / g bindning av proverna närmare pseudolinear utbud av standard kurva. Värden som erhållits vid denna extrema av standardkurvan kommer att resultera i små skillnader i ROD om avsevärt större skillnader i radioligandbindning. Därmed förmåga att detektera förändringar i bindning minskar när filmen närmar sig sin mättnadspunkt.
För mätningar av specifika regioner,rekommenderade åtgärder är "Density" i fmol / g, "Scan område" i pixlar, och "Total målområde" i pixlar (Figur 9). Det är viktigt att ställa in ett tröskelvärde så nära noll som möjligt (fig 10), eftersom variationer i filmtäthet eller den godtyckliga aspekten av standardkurvan som härrör från de kalibreringsstandarder ibland kan ge värden mindre än noll. Om sådana värden i genomsnitt för alla pixlar i skanningsområdet inte skulle få ett artificiellt lågt värde. De kriterier som används för att identifiera områden med bindning kan vara mycket subjektivt, så det är bäst att noga ihop kontroll- och experiment hjärnor så mycket som möjligt för att minska förekomsten av subjektiva fel. En annan utmaning är att bestämma hur många sektioner i genomsnitt att få ett slutligt värde. En god indikation på sektioner för att analysera kan bestämmas genom att följa en accepterad råtthjärna atlas, tillsammans med de färgade histologiska diabilder. Storleken på provytan kan också vara enproblem. För att kompensera, kan fastställas en mall för att korrigera för alla storlekar avvikelser. Behandling av sektionerna kan också påverka ett område av den struktur som hög har bindande och är att betrakta under analysen. Detta kräver en alternativ användning av den "tröskling" verktyget i det proprietära avbildningssystemet för att ställa in ett densitetsintervall som överstiger ett godtyckligt värde för att representera de anatomiska egenskaperna hos den hjärnregion som samplas såsom paraventrikulära kärnan av hypotalamus inom ett provtagningsverktyg som omfattar regionen av intresse (Figur 11, panel C). Det är också möjligt att innefatta mätningen området till fastställandet av mängden bindning. Detta kan göras genom att multiplicera värdet för specifika bindnings gånger antalet pixlar som mättes. Pixlar kan omvandlas till metriska enheter genom att avbilda en linjal i två plan, eller en rektangel med kända dimensioner. Antalet pixlar som svarar motlängd eller rektangelns area kan sedan uttryckas i metriska enheter. Vid dpi upplösning 2400, ~ 9000 pixlar = 1 mm 2 i vårt system.
Även om användningen av radioaktiva ligander är inte längre en allmänt använd teknik; Det är ett av de få sätt att visualisera den fysiska distributionen av receptorer i vävnadsprover sig som funktionell (förmåga att binda sin inneboende ligand). Dessutom kan det kvantifiera antalet receptorer för att möjliggöra utvärdering av förändringar i funktionell receptor expression mellan behandlingsgrupperna, mellan olika områden i hjärnan eller andra strukturer, mellan olika stammar av djur eller djur i olika åldrar, etc. Alternativa metoder finns tillgängliga för att karakterisera neuroanatomiska aspekter av AT 1-receptorexpression, men de har begränsat värde. In situ hybridisering av mRNA för AT 1 receptorerna inte alltid överensstämmer med AT en receptor expression eller distribueras ihjärna. Medan immunologiska tekniker kan approximera skillnader i receptorexpression baserat på intensiteten av färgning av vävnadssektioner, är det inte möjligt att generera en standardkurva för färgning för att möjliggöra för en numerisk bestämning av receptoruttryck. Receptorautoradiografi tillhandahåller också en nivå av specificitet för receptorer (eller andra mål som specifikt binder radioligander) som inte kan garanteras med hjälp av immunologiska tekniker. Under 2009 genomfördes en serie artiklar publicerade 37-43 som ifrågasatte giltigheten av 49 antikroppar som används för att bedöma 18 olika G-proteinkopplade receptorer och en övergående receptor potential (TRP) kanal. I huvudsak antikroppar märkta identiska band på western blöts från vildtyp och knockoutmöss för receptorerna i fråga. Därefter har flera grupper gjort liknande iakttagelser med hjälp av kommersiellt tillgängliga AT 1 och AT 2 receptorantikroppar 44-49. Användningen av en bacterial artificiell kromosom, som genererar en reportermolekyl, t.ex., grönt fluorescerande protein, som drivs av AT 1 promotorn är ett indirekt sätt att bestämma närvaron eller frånvaron av AT 1-receptoruttryckande celler i mus (men inte råtta) hjärnor baserat på deras med en funktionell AT 1-receptorpromotorn 50. Det är möjligt att räkna "positiva celler" i mikroskopiskt identifierade hjärnregioner, men inte för att kvantifiera förändringar i intensiteten i uttryck av AT1-receptorn i dessa regioner. Således endast godkända tekniker som finns för att direkt mäta Ang II receptoruttryck vid denna tidpunkt är radioligandbindning metoder. Och om det behövs anatomiska upplösning av funktionell AT 1-receptorproteinet på en mikroskopisk nivå, är receptorautoradiografi den enda teknik som finns tillgänglig för en sådan direkt mätning.
Receptorautoradiografi är inte utan begränsningar. Den stora concern är att uppfylla kraven för att använda radioaktivt material i en miljö forskning. Det är nödvändigt att ha ett strålskyddsprogram med strikta riktlinjer på plats för att garantera säkerheten för forskare som arbetar med radioaktivt material och säker disposition av radioaktivt material. Detta eskalerar kostnaderna för forskning med hjälp av radioaktivt material till en punkt som utesluter deras användning i många forsknings inställningar. Dessutom kan kostnaden för radioligander vara betydande. Således en receptor autoradiografi experiment där ett stort antal glidmonterade vävnadssnitt inkuberas i behållare av radioligand kan använda hundratals om inte tusentals dollar i radioligand. En annan begränsning är att vävnader skall frysas före snitt på en kryostat, lagras under en tidsperiod, och snabbt sköljs och torkas efter inkubering med radioligand, som alla kan försämra förmågan av receptorerna eller proteinet av intresse för att binda radioliganden . För ligander som har snabb association / dissociationskinetik, kan det inte vara möjligt att bibehålla bindningen av radioliganden till receptom under den tid som behövs för att skölja bort icke-specifikt bundna radioliganden. Dessutom, med låga mängder av radioligandbindning långa perioder av filmexponering - en månad eller mer - kan krävas innan en mätbar bild kan bildas på filmen. En annan utmaning är att tillsats av jod-125 till en ligand kan försämra förmågan hos liganden att binda till sin målreceptor eller protein på grund av steriskt hinder. Användningen av en mindre molekyl, t.ex., tritium (3 H) eliminerar problemet med steriskt hinder, men tritium har sådan låg energi och låg specifik aktivitet (i förhållande till jod-125) att det är extremt svårt att generera en filmbild för de flesta receptorpopulationer. I ljuset av dessa frågor, finns det många situationer i vilka receptorautoradiografi är oförmögen att identifiera receptorer eller andra molekylära strukturer av intresse.
Trots sin limitations kan receptorautoradiografi identifiera specifika strukturer i en vävnad, till exempel hjärnregioner förändras som svar på experimentella variabler jämfört med en normal kontroll hjärna. Denna kunskap kan bidra till att avgöra vilken roll AT 1 R för Ang II eller annan receptor eller enzymer i patologin av sjukdomar. Denna kunskap har värdefulla farmakologiska konsekvenser, eftersom det indikerar områden att rikta potentiella terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24 mm x 60 mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24 mm x 30 cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8 x 11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep/OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides, Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
- Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
- Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).
