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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

एक संयुक्त 3 डी ऊतक इंजीनियर Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53885
Automatic Translation
*1, *1, *3, 1, 1,4, 2, 3, 1,4, 1
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
* These authors contributed equally

Abstract

वर्तमान अध्ययन में, हम एक विशिष्ट mutational पृष्ठभूमि के आधार पर दवा प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए अनुकूलन सिलिको मॉडल में एक साथ इन विट्रो 3 डी फेफड़ों के ट्यूमर मॉडल संयुक्त। मॉडल एक decellularized सुअर का पाड़ कि reproduces बाह्य मैट्रिक्स संरचना और तहखाने झिल्ली सहित वास्तुकला के बारे में ऊतक विशेष विशेषताओं पर उत्पन्न होता है। हम एक प्रोटोकॉल है कि नशीली दवाओं के उपचार के तीन दिन सहित 14 दिनों के भीतर कृत्रिम ट्यूमर के ऊतक पीढ़ी की अनुमति देता मानकीकृत। हमारा लेख 3 डी के कई विस्तृत विवरण M30-एलिसा द्वारा supernatants से प्रसार सूचकांक Ki67 धुंधला है, apoptosis के दृढ़ संकल्प और उपकला के आकलन mesenchymal संक्रमण के लिए (EMT), जो की प्रभावशीलता के मूल्यांकन के लिए उपयोगी उपकरण हैं की तरह पढ़ने के लिए बाहर स्क्रीनिंग तकनीक प्रदान करता है चिकित्सकीय यौगिकों। हम 2 डी संस्कृति की तुलना में हमारे 3 डी ट्यूमर मॉडल में प्रसार की कमी relat है कि दिखा सकता हैनैदानिक ​​स्थिति के लिए एड। यह कम प्रसार के बावजूद, मॉडल के रूप में फेफड़ों कार्सिनोमा सेल लाइनों HCC827 की तुलना द्वारा दिखाया सही ढंग से बायोमार्कर स्थिति के अनुसार भविष्यवाणी की EGFR -targeted दवा प्रतिक्रियाओं (EGFR -mutated, KRAS जंगली प्रकार) और A549 (EGFR जंगली प्रकार, KRAS - उत्परिवर्तित) tyrosine-kinase अवरोध (TKI) gefitinib साथ इलाज किया। और अधिक उन्नत ट्यूमर कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए, हम EMT लंबे समय तक इलाज से TGF-बीटा -1 के साथ के रूप में vimentin / अखिल cytokeratin immunofluorescence धुंधला द्वारा मूल्यांकन प्रेरित किया। एक प्रवाह बायोरिएक्टर शारीरिक स्थिति है, जो ऊतक पीढ़ी में सुधार करने के लिए संस्कृति को समायोजित करने के लिए नियुक्त किया गया था। सिलिको मॉडल में एक बूलियन में - apoptosis, प्रसार सूचकांक और EMT - इसके अलावा, हम gefitinib उपचार या TGF-बीटा -1 उत्तेजना पर दवा प्रतिक्रियाओं के एकीकरण दिखा। इसके अतिरिक्त, हम एक विशिष्ट mutational पृष्ठभूमि और गिनती के साथ ट्यूमर कोशिकाओं के कैसे दवा प्रतिक्रियाओं समझानेप्रतिरोध के खिलाफ erstrategies भविष्यवाणी की जा सकती है। हमें विश्वास है कि विशेष रूप से अपने में सिलिको विस्तार के साथ इन विट्रो दृष्टिकोण में हमारे 3 डी 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में अधिक यथार्थवादी परिस्थितियों में preclinical दवा के परीक्षण के लिए एक अतिरिक्त मूल्य प्रदान कर रहे हैं।

Introduction

दवा उद्योग उच्च संघर्षण दर भारी लागत 1-5 के कारण नैदानिक ​​चरण में कैंसर के इलाज के क्षेत्र में अप करने के लिए 95% की सामना करना पड़ रहा है। इस घाटे के लिए एक कारण यह तथ्य यह है कि वर्तमान में संभावित नए यौगिकों की प्रभावकारिता कैंसर कोशिका लाइनों के 2 डी सेल संस्कृतियों पर या पशु मॉडल में बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग में मूल्यांकन किया जाता है। पशु मॉडलों एक उच्च जटिलता है, लेकिन वहां चूहों और पुरुषों 6.7 के बीच महत्वपूर्ण मतभेद हैं। पिछले दशक में, अलग अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर 3 डी मॉडल कैंसर कैंसर कोशिका लाइनों के 2 डी और संस्कृति विवो ट्यूमर 6,8,9 में एक जटिल बीच की खाई को पाटने के लिए उत्पन्न किया गया है। सेल भेदभाव पर है और यह भी संकेत दे पर 3 डी वातावरण के प्रभाव साल पहले कई अध्ययनों में दिखाया गया है (जैसे।, मीना बिसेल) के द्वारा 10,11। आज, कई 3 ​​डी सेल संस्कृति मॉडल ऐसे अंडाकार आकृति संस्कृतियों, हाइड्रोजेल या microfluidic चिप्स 12-16 रूप में उपलब्ध हैं। यहाँ तक कि एचटीएमएल यद्यपिई मॉडल पारंपरिक 2D संस्कृति प्रणालियों की तुलना में जटिलता में वृद्धि, वे ज्यादातर एक ऊतक microenvironment कि ट्यूमर का समर्थन प्रभाव और भी प्रभावों दवा प्रभावकारिता के लिए जाना जाता है की कमी है।

इस मुद्दे के समाधान के लिए, हम एक जैविक पाड़ SISmuc (छोटे-आंत-submucosa + म्यूकोसा) नामक एक decellularized सुअर का सूखेपन से ली गई है उस पर आधारित एक 3 डी मॉडल ट्यूमर उत्पन्न। इस प्रकार, ऊतक वास्तुकला और इस तरह के अलग अलग कोलेजन के साथ ही तहखाने झिल्ली संरचना के रूप में ईसीएम के महत्वपूर्ण घटक 17 संरक्षित कर रहे हैं। इस अनूठी विशेषता कार्सिनोमा कि epithelia से पैदा होती है और ठोस ट्यूमर के बारे में 80% शामिल की ट्यूमर मॉडल पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, हमारे ऊतक इंजीनियर ट्यूमर मॉडल में प्रसार दर कृत्रिम रूप से उच्च 2 डी संस्कृति में हासिल की दरों की तुलना में कम है। प्रसार दवा प्रभावकारिता का आकलन करने में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, औषधि परीक्षण और अधिक समान में हमारे मॉडल में सक्षम हो जाता हैइन विवो करने की स्थिति 17 ट्यूमर।

आदेश में हमारे मॉडल सही ढंग से, हम दो अलग अलग फेफड़ों के कैंसर कोशिका लाइनों है कि उनके EGFR -biomarker स्थिति में मतभेद के लिए यहां उपस्थित डेटा बायोमार्कर निर्भर दवा प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए। इस mutational स्थिति NSCLC रोगियों में नियमित रूप से निर्धारित किया जा करने के लिए शुरू कर दिया है। ऐसे EGFR -inhibitor असर एक सक्रिय EGFR उत्परिवर्तन शो बेहतर परिणामों प्लैटिनम आधारित कीमोथेरेपी 18-21 के साथ उन लोगों की तुलना में ट्यूमर के खिलाफ gefitinib रूप TKIs साथ लक्षित उपचार।

हम कई पढ़ने के लिए बाहर तकनीकों है कि परिसर प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए प्रासंगिक हैं की स्थापना की। इसके अलावा, के बाद TGF-बीटा -1 उत्तेजना हम ट्यूमर कोशिकाओं में यौगिक क्रिया है कि EMT प्रक्रिया है, जो घातक परिवर्तन 22,23 में एक महत्वपूर्ण कदम माना जाता है और जो दवा resistan से जुड़ा है शुरू कर दिया की जांच करने में सक्षम हैंसीई 24।

3 डी मॉडल ट्यूमर लक्षित उपचार, रसायन चिकित्सा, या अच्छा विरोधाभासों के साथ नशीली दवाओं के संयोजन के लिए सेल विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति। आगे बढ़ाने के लिए और दवा स्क्रीनिंग में तेजी लाने और प्रतिरोध का सामना करने के लिए, इस सिलिको अनुकरण में एक से पूरित है। कुछ प्रयोगों के आधार पर, ट्यूमर प्रतिक्रिया दवाओं और उनके संयोजन की एक पूरी श्रृंखला के लिए परिणाम के बारे में सिलिको में भविष्यवाणी की जा सकती है।

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Protocol

1. दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति

  1. व्यावसायिक रूप से ट्यूमर सेल लाइन HCC827 (DSMZ) प्राप्त करते हैं। संस्कृति फेफड़ों adenocarcinoma सेल लाइन HCC827 RPMI 1640 में (EGFR उत्परिवर्तित, KRAS जंगली प्रकार) 20% एफसीएस के साथ पूरक। मध्यम बदलें हर 2 - 3 दिनों के लिए। एक सप्ताह में दो बार कोशिकाओं को विभाजित। कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है जब तक पारित होने के 20 तक पहुँच जाता है।
  2. व्यावसायिक रूप से ट्यूमर सेल लाइन A549 (DSMZ) प्राप्त करते हैं। संस्कृति फेफड़ों कार्सिनोमा सेल लाइन A549 (EGFR जंगली प्रकार, KRAS उत्परिवर्तित) RPMI 1640 में 10% एफसीएस के साथ पूरक। जैसा कि ऊपर कहा संस्कृति का प्रदर्शन। कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है जब तक पारित होने के 20 तक पहुँच जाता है।
  3. (- 6 सप्ताह के हर 4) ऐसे माइकोप्लाज्मा संदूषण के रूप में संदूषण के लिए नियमित रूप से कोशिकाओं का परीक्षण करें।
  4. कांच coverslips पर A549 या HCC827 संवर्धन कोशिकाओं
    1. 24 अच्छी तरह से थाली एक चिमटी से नोचना का उपयोग कर के प्रत्येक कुएं में 1 बाँझ गिलास coverslip रखें।
    2. साथ कुओं में 500 μl के एक मात्रा में दोनों सेल लाइनों के बीज 50,000 ट्यूमर कोशिकाओंकांच coverslips, क्रमशः।
    3. संस्कृति कोशिकाओं जब तक वे मानक संस्कृति की शर्तों के तहत 70% की एक confluency तक पहुँचने (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)। इस समय के दौरान, एक पाश्चर विंदुक का उपयोग पुराने मध्यम aspirate और 500 μl ताजा मध्यम हर 2 जोड़ - संस्कृति के 3 दिनों के लिए।

एक जैविक कोलेजन पाड़ पर ट्यूमर परीक्षण प्रणाली के 2. जनरेशन

  1. स्टेटिक संस्कृति की स्थिति
    1. Decellularized छोटे आंत-submucosa + म्यूकोसा (SISmuc) पैदा करते हैं और पिछले एक प्रकाशन 25 में वर्णित के रूप में दो धातु के छल्ले, तथाकथित सेल मुकुट के बीच यह तय कर लो।
    2. पेट सेल मुकुट में तय की पूर्व लुमेन के किनारे पर 500 μl की कुल मात्रा में या तो HCC827 या A549 कोशिकाओं के बीज 100,000 कोशिकाओं।
    3. ट्यूमर कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 2 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति दें। 1 मिलीलीटर मध्यम सेल ताज के अंदर और बाहर के जोड़े 1 मिलीलीटर।
    4. संस्कृति ट्यूमर37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर शर्तों के तहत मॉडल, 14 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2। संस्कृति के माध्यम से परिवर्तन हर 2 - 3 दिनों के लिए। सेल ताज के अंदर और बाहर एक ही माध्यम के 1.5 मिलीलीटर (20%: 10%, HCC827 A549) इसलिए, मध्यम पाश्चर विंदुक और पिपेट एफसीएस की उचित राशि के साथ 1 मिलीलीटर ताजा RPMI का उपयोग कर aspirate।
  2. गतिशील संस्कृति की स्थिति
    1. 2.1.3 करने के लिए उपधारा 2.1.1 के तहत वर्णित के रूप में decellularized मैट्रिक्स सेल मुकुट और सेल बोने के अंदर के साथ ट्यूमर परीक्षा प्रणाली की स्थापना की।
    2. संस्कृति स्थिर शर्तों के तहत ट्यूमर मॉडल 37 डिग्री सेल्सियस, 3 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2।
    3. Autoclaved बायोरिएक्टर इकट्ठा और के रूप में पहले 25 में प्रकाशित वरीयता प्राप्त SISmuc डालें।
    4. पिपेट उचित एफसीएस की राशि के साथ 45 मिलीलीटर RPMI (A549: 10%, HCC827: 20%) फ्लास्क में और बायोरिएक्टर और बीच ट्यूबिंग प्रणाली को सुई से मुक्त नमूना डिवाइस से कनेक्टमध्यम कुप्पी।
    5. इनक्यूबेटर में बायोरिएक्टर की जगह, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक निरंतर प्रवाह मध्यम (3 मिलीग्राम / मिनट) के साथ पंप और संस्कृति से कनेक्ट अतिरिक्त 14 दिनों के लिए ट्यूमर मॉडल।
    6. 7 दिनों के बाद पूरे संस्कृति के माध्यम से बदलें। उस के लिए, एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत इनक्यूबेटर से बायोरिएक्टर चलते हैं। एक पाश्चर विंदुक का उपयोग कर मीडिया फ्लास्क में मध्यम aspirate। बायोरिएक्टर लिफ्ट श्वास जबकि ट्यूबिंग प्रणाली में मध्यम से छुटकारा पाने के लिए। पिपेट 45 मिलीलीटर कुप्पी में ताजा माध्यम। बायोरिएक्टर इनक्यूबेटर में वापस प्लेस और यह पंप से कनेक्ट।

3. Gefitinib साथ स्टेटिक ट्यूमर मॉडल का उपचार

  1. संस्कृति ट्यूमर मॉडल धारा 2.1 में वर्णित है।
  2. संस्कृति के 11 दिन में 1 माइक्रोन gefitinib (प्रत्येक कोशिका ताज के लिए 2.5 एमएल) के साथ RPMI / एफसीएस तैयार करते हैं। एक पाश्चर विंदुक का उपयोग कुओं से पुराने मध्यम Aspirate और टी के अंदर तैयार RPMI / एफसीएस / gefitinib के 1 मिलीलीटर जोड़ेंवह सेल मुकुट और बाहर एक ही माध्यम के 1.5 मिलीलीटर।
    नोट: thawed gefitinib शेयर समाधान एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  3. उपधारा 3.2 के तहत वर्णित के रूप में 13 दिन में मध्यम बदलें।

4. EMT शामिल करने के लिए TGF-बीटा-1 के साथ स्टेटिक ट्यूमर मॉडल की उत्तेजना

  1. संस्कृति ट्यूमर मॉडल धारा 2.1 में वर्णित है।
  2. संस्कृति के 3 दिन में 2 एनजी / एमएल वाहक के साथ TGF-बीटा -1 (प्रत्येक कोशिका ताज के लिए 2.5 एमएल) के साथ RPMI / एफसीएस तैयार करते हैं। एक पाश्चर विंदुक का उपयोग कुओं से पुराने मध्यम Aspirate और तैयार RPMI / एफसीएस / TGF-बीटा -1 सेल ताज के अंदर के 1 मिलीलीटर और बाहर एक ही माध्यम के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें। 4.2 के तहत वर्णित के रूप में, 14 दिन तक 3 दिन - मध्यम TGF-बीटा -1 हर 2 के साथ पूरक बदलें।

5. पढ़ें बहिष्कार

  1. एलिसा माप के लिए नमूने लेने
    1. के दौरान स्थिर (धारा 2.1) और गतिशील (धारा 2.2) संस्कृति के supernatants से नमूने ले लोदिन संस्कृति के 11-14 के रूप में चित्रा 2 में संकेत पर gefitinib (धारा 3) के साथ इलाज। इसके अतिरिक्त, एक नमूना उपचार (T0) करने से पहले ले।
    2. स्थिर संस्कृति शर्तों के तहत, सेल ताज के अंदर से 100 μl नमूना ले। गतिशील संस्कृति शर्तों के तहत, नमूना डिवाइस पर सिरिंज पेंच और बायोरिएक्टर सिस्टम से बाहर 1 मिलीलीटर मध्यम ले। -80 डिग्री सेल्सियस पर सभी एकत्र supernatants स्टोर जब तक एलिसा किया जाता है।
  2. Apoptosis मात्रा के लिए M30-एलिसा
    1. apoptosis यों में supernatants निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिका मृत्यु परख करते हैं। सभी अभिकर्मकों परख प्रदर्शन से पहले आरटी तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं।
    2. भंवर सभी अभिकर्मकों। 500 मिलीलीटर ताजा विआयनीकृत पानी में धो गोली भंग। संयुग्मी कमजोर पड़ने बफर के 9.2 मिलीलीटर के साथ एचआरपी संयुग्मी पतला और मिश्रण। पिपेट मानक या नमूना प्रति अच्छी तरह से 25 μl।
    3. पतला एचआरपी Conju के 75 μl जोड़ेअच्छी तरह से प्रति गेट समाधान। प्लेट कवर और आरटी पर 4 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर यह सेते हैं। थाली धो मैन्युअल तैयार धोने के समाधान के 250 μl के साथ 5 बार।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से 3,3 की ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) सब्सट्रेट 200 μl जोड़ें। 20 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में सेते हैं। प्रत्येक अच्छी तरह से रोकने के समाधान के 50 μl जोड़ें। 10 सेकंड के लिए microplate हिला और absorbance के पढ़ने से पहले 5 मिनट के लिए microplate छोड़ दें। एक microplate रीडर में 450 एनएम पर absorbance निर्धारित करते हैं। मानक वक्र और इस तरह के मूल के रूप में एलिसा प्रकार के डेटा से निपटने के लिए एक उपयुक्त कार्यक्रम का उपयोग कर नमूने में सांद्रता की गणना।
  3. नमूना धुंधला
    1. फिक्सिंग, आयल embedding और 3 डी मॉडल की धारा तैयारी
      1. 2 घंटे के लिए वरीयता प्राप्त SISmuc सेल मुकुट प्रति 2.5 मिलीलीटर 4% paraformaldehyde (पीएफए) का उपयोग फिक्स और आयल में एम्बेड
      2. के रूप में पहले प्रकाशित धुंधला के लिए 3 माइक्रोन ऊतक वर्गों को तैयार25।
    2. 2 डी संस्कृति की स्थिति में विकसित कोशिकाओं की फिक्सिंग
      1. जब 70% संगम तक पहुँच जाता है, पीबीएस के साथ एक बार 24 अच्छी तरह से थाली में कांच coverslips पर संवर्धित कोशिकाओं को धोने और 500 μl 4% पीएफए ​​/ अच्छी तरह से करने के लिए 10 मिनट के साथ उन्हें ठीक।
      2. पीएफए ​​निकालें और जब तक धुंधला किया जाता है 4 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से थाली पीबीएस के साथ कवर में कांच coverslips की दुकान।
    3. एच एंड ई धुंधला
      1. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एक सिंहावलोकन धुंधला रूप Hematoxylin / Eosin साथ rehydrated वर्गों दाग।
    4. 3 डी मॉडल की Immunofluorescent धुंधला
      1. immunofluorescent धुंधला के लिए, 20 मिनट के लिए preheated साइट्रेट बफर (6.0 पीएच) के साथ एक स्टीम कुकर में deparaffinized और rehydrated स्लाइड रखकर एक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रदर्शन करते हैं।
        नोट: साइट्रेट बफर के तैयार करने के लिए सामग्री और उपकरण के की तालिका देखें।
      2. स्लाइड स्थानांतरणकपड़े धोने बफर (0.5 एम पीबीएस बफर + 0.5% के बीच) के लिए, एक पैप कलम के साथ सर्कल वर्गों धुंधला समाधान के लिए आवश्यक मात्रा को कम करने और एक नमी कक्ष में स्लाइड जगह है।
      3. आरटी पर 20 मिनट के लिए उपधारा 5.3.4.6 में इस्तेमाल माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान प्रजातियों से 5% सीरम के साथ ऊतक वर्गों ब्लॉक।
      4. एक कमजोर पड़ने में घेर लिया वर्गों के लिए धीरे से एक कागज के ऊतकों को स्लाइड दोहन से अवरुद्ध सीरम निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी लागू निर्माता के अनुदेश (खरगोश विरोधी Ki67 1 के अनुसार: 100, खरगोश विरोधी vimentin 1: 100, माउस विरोधी अखिल cytokeratin 1 : 100)। 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन। डबल-धुंधला के लिए, अलग-अलग मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
      5. ध्यान से बंद अनबाउंड एंटीबॉडी धोने बफर के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
      6. विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षी बाइंडिंग का पता लगाने के लिए, कमजोर पड़ने 1 में माध्यमिक एंटीबॉडी लागू होते हैं: वर्गों के लिए 400 और 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
      7. से धो लें UNBकपड़े धोने बफर के साथ ound एंटीबॉडी 5 मिनट के लिए तीन बार।
      8. DAPI युक्त नाभिक counterstain और उन्हें दो सूखी हे / एन करने के लिए एक जलीय माध्यम के साथ स्लाइड माउंट।
    5. 2 डी संवर्धित कोशिकाओं के Immunofluorescent धुंधला
      1. पीबीएस निकालें और permeabilization के लिए 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.2% ट्राइटन-X100 के साथ वरीयता प्राप्त कांच कवर फिसल जाता है को कवर किया। 5 मिनट के लिए कपड़े धोने बफर (0.5 एम पीबीएस बफर + 0.5% के बीच) के साथ कांच कवर फिसल जाता है धो लें।
      2. 5.3.4.7 करने के लिए कदम 5.3.4.3 प्रदर्शन करना। एक कमाल मंच पर अच्छी तरह से थाली में सभी चरणों निष्पादित और inverting थाली से अभिकर्मकों को हटा दें।
      3. बढ़ते के लिए, जलीय DAPI युक्त एक uncoated गिलास स्लाइड पर नाभिक counterstain और संदंश का उपयोग बढ़ते मध्यम सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ यह करने के लिए कवर पर्ची के लिए स्थानांतरण करने के लिए माध्यम की एक बूंद हाजिर। यह इमेजिंग से पहले सूखी।
  4. प्रसार सूचकांक का निर्धारण
    1. immunofluorescent प्रदर्शन करनाधारा 5.3.4 के अनुसार Ki67 के खिलाफ धुंधला हो जाना। या 5.3 5।
    2. ऊतक वर्गों या 2 डी संवर्धित कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट छवियों एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ ले लो। DAPI stainings की और Ki67 stainings की छवियों को लेने के लिए अलग अलग फिल्टर का प्रयोग करें। मात्रा का ठहराव के लिए, नमूना के गैर अतिव्यापी भागों से हर हालत के 3 डी वर्गों के 10 छवियों या 2 डी संस्कृतियों (बढ़ाई 20X) के 5 छवियों का उपयोग करें।
    3. 2 डी में Ki67 के लिए और नाभिक की संख्या सकारात्मक नाभिक की संख्या का निर्धारण
      1. Ki67 गणना सकारात्मक नाभिक मैन्युअल सॉफ्टवेयर फिजी 26 के प्लगइन सेल काउंटर का उपयोग कर। इसलिए, छवि को खोलने और "प्लगइन्स" → "विश्लेषण" → "सेल काउंटर" पर क्लिक करें। प्रेस "आरंभ करना" और एक काउंटर प्रकार का चयन करें। प्रत्येक Ki67 सकारात्मक नाभिक पर क्लिक करें। क्लिक्स की संख्या का चयन किया काउंटर प्रकार के बगल में दिखाया गया है।
      2. नाभिक की कुल संख्या का स्वत: सेल गिनती के लिए एक मैक्रो फिजी 27,28 का उपयोग कर बना। adjअस्ट हर धुंधला और सेल लाइन के लिए मैक्रो। के बाद, एक मैक्रो बनाने के लिए कैसे एक उदाहरण देखें।
        1. मैक्रो रिकॉर्डर शुरू करो। एक DAPI छवि खोलें और 8 बिट प्रारूप करने के लिए इसे क्लिक "छवि" → "प्रकार" → "8 बिट" द्वारा परिवर्तित। "विपरीत बढ़ाने" क्लिक करें, सेट के रूप में "1" 'संतृप्त' और 'को सामान्य "।
        2. "Unsharp मुखौटा" सेट छवि पैनापन करने के लिए। एक "1" और एक "0.60" की 'मुखौटा' के 'त्रिज्या' का प्रयोग करें। , "ऑटो सीमा" पर क्लिक करें 'काले रंग की पृष्ठभूमि पर सफेद वस्तुओं' के साथ छवि binarise के लिए चुन विधि "RenyiEntropy"।
        3. "5" का क्षरण त्रिज्या के साथ "प्लगइन्स" → "BioVoxxel" → "जल अनियमित सुविधाओं" पर क्लिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए। "विश्लेषण" पर क्लिक करें → "कण का विश्लेषण करें" और "0.02-इन्फिनिटी" करने के लिए 'आकार' की स्थापना की।
          ध्यान दें: कणों / कोशिकाओं की संख्या हैमायने रखता है के रूप में सारांश तालिका में दिखाया गया है।
        4. आगे छवियों के विश्लेषण के लिए मैक्रो को बचाने के लिए "बनाएँ" पर क्लिक करें।
    4. मैन्युअल 3 डी में और नाभिक की संख्या Ki67 के लिए सकारात्मक नाभिक की संख्या का निर्धारण उपधारा 5.4.3.1 में वर्णित है।
    5. मतलब प्रसार सूचकांक (पीआई) की गणना निम्न सूत्र के अनुसार:
      Equation1
      एन = छवियों की संख्या (3 डी: 10, 2 डी: 5)

6. HCC827 प्रकोष्ठों में सिलिको ट्यूमर मॉडल जनरेशन और विरोधी EGFR थेरेपी के अनुकरण में

  1. नेटवर्क पीढ़ी का उपयोग कर एक नेटवर्क विश्लेषण सॉफ्टवेयर
    1. महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक पढ़ने के लिए बाहर मानकों और HCC827 सेल लाइन के mutational पृष्ठभूमि पर आधारित ट्यूमर नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए अलग-अलग नाम से जाना डेटाबेस का प्रयोग करें।
    2. नेटवर्क विश्लेषण सॉफ्टवेयर 21 ओपन कल्पना करने के लिएनेटवर्क।
      1. "फाइल" → "नई" → प्रकार 'JoVE_tumor मॉडल' पर क्लिक करें → "ठीक" पर क्लिक करें एक नया नेटवर्क उत्पन्न करने के लिए। एक डबल झिल्ली में रिसेप्टर कल्पना करने के लिए "स्क्वायर Closeup उत्तर" → "ठीक" पर क्लिक करें। "सामान्य प्रोटीन" आयतों → प्रकार 'EGFR' → क्लिक करें "ठीक" के रूप में नोड्स (= प्रोटीन) कल्पना करने के लिए क्लिक करें; नेटवर्क में प्रत्येक नोड के लिए इस दोहराएँ।
      2. नेटवर्क में नोड्स लेबल: राइट क्लिक करें → "बदलें रंग और आकार ..." → नोड्स EGFR और (EGF-EGFR) रंग कोड "255,0,0" (लाल रंग) के लिए चयन करें; नोड्स सी मुलाकात की और (सी-एमईटी) रंग कोड "0,255,0" (रंग हरा) के लिए; gefitinib रंग कोड के लिए "255,255,0" (रंग पीला); PI3K-Inh रंग कोड के लिए "204204204" (रंग हल्के भूरे रंग); खल्क-Inh रंग कोड के लिए "102102102" (रंग अंधेरे ग्रे); नेटवर्क रंग का चयन करें कोड में अन्य सभी नोड्स के लिए4; 255255255 "(सफेद रंग)।
      3. hexagons → प्रकार 'प्रसार' के रूप में पढ़ने के लिए बाहर मानकों को कल्पना करने के लिए "phenotype" पर क्लिक करें → "ठीक" पर क्लिक → ठीक क्लिक करें → "रंग और आकार ... बदलें" → रंग का चयन करें कोड "255204204" (रंग सामन); पैरामीटर apoptosis → रंग का चयन करें कोड "255,51,204" (रंग बैंगनी) के लिए इस दोहराएँ।
      4. किनारों (= बातचीत) कल्पना: सक्रियण (तीर) के लिए "राज्य संक्रमण" क्लिक करें, "निषेध" संकोच के लिए क्लिक करें (पा तीर); नेटवर्क में प्रत्येक बातचीत के लिए इस दोहराएँ।
    3. "फाइल" → "इस रूप में सहेजें ..." → प्रकार 'JoVE_tumor models.xml' पर क्लिक करें → .xml प्रारूप के रूप में उत्पन्न संकेत नेटवर्क को बचाने के लिए "सहेजें" पर क्लिक करें।
  2. सिलिको अनुकरण में दस्ते का उपयोग कर
    नोट: दस्ते वीं का प्रतिनिधित्व करता हैएक असतत तार्किक बूलियन प्रणाली (और, या, नहीं) के रूप में ई नेटवर्क टोपोलॉजी और एक स्थिर राज्य विश्लेषण करता है। स्थिर राज्य विश्लेषण प्रणाली संतुलन और संकेत उत्तेजनाओं पर जिम्मेदारी (जैसे।, दवा आवेदन या उत्परिवर्तन) को दर्शाता है।
    1. ओपन दस्ते 17 सॉफ्टवेयर, क्लिक करें "लोड नेटवर्क" अपलोड → 'JoVE_tumor models.xml' फ़ाइल। क्लिक करें "भागो विश्लेषण":
      नोट: अगली टीम बूलियन नेटवर्क कनेक्टिविटी, जो समय के साथ नेटवर्क व्यवहार के गतिशील सिमुलेशन (रंग अवग्रह गतिविधि घटता) की अनुमति देता है बैठाना घातीय समारोह लागू होता है।
    2. एक सिमुलेशन प्रोटोकॉल लिखने के लिए "उन्नत" → "Perturbator" पर क्लिक करें। अनुकरण विरोधी EGFR प्रतिरोध: क्लिक करें "प्रोटोकॉल संपादित करें"
      1. "गड़बड़ी" → मानक का उपयोग करें "initialstate = एस एस -4" (स्थिर अवस्था 4) → "जोड़ें" 'नए लगातार पल्स' जोड़ने के लिए क्लिक → Se क्लिक करेंlect पैरामीटर "राज्य" समय का चयन → → लक्ष्य का चयन करें "फ्लिप" "0" → मूल्य का चयन करें "0.4" → क्लिक करें "ठीक है"।
      2. इस दोहराएँ: क्लिक करें → पैरामीटर का चयन करें "राज्य" → लक्ष्य का चयन करें "सी मुलाकात" → चयन समय "0" → मूल्य का चयन करें "0.4" → "ठीक" क्लिक "जोड़ें"; "जोड़ें" पर क्लिक करें समय का चयन → → पैरामीटर का चयन करें "राज्य" → लक्ष्य का चयन करें "gefitinib" "0" → मूल्य का चयन करें "1" → क्लिक करें "ठीक है"।
      3. सक्रिय नोड (EGF-EGFR) के लिए एक राज्य मान सेट करें: "activenode" पर क्लिक → "संपादित करें" → राज्य का चयन करें "0.8" → क्लिक करें "ठीक" पर क्लिक करें; अन्य सभी नोड्स के लिए: "संपादित करें" पर क्लिक करें → राज्य "0" → "ठीक" पर क्लिक करें का चयन करें। प्रोटोकॉल को बचाने के लिए "ठीक" पर क्लिक करें।
      4. "विकल्प" → चयन पैनल के पास जाओ "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* खल्क", "caspases", "(सी-एमईटी)", "PI3K",: विशिष्ट घटता प्रदर्शन "gefitinib", "apoptosis", "प्रसार", "खल्क-Inh" और ग्राफिकल प्रतिनिधित्व के लिए "PI3K-Inh"। प्रणाली की प्रतिक्रिया का एक पूरा अनुकरण शुरू करने के लिए "प्रारंभ" → "भागो" पर क्लिक करें। "रीसेट" पर क्लिक करें एक नया अनुकरण शुरू करने के लिए।
    3. अनुकरण संयुक्त PI3K और खल्क अवरोध उपचार: क्लिक करें "प्रोटोकॉल संपादित करें"
      1. 6.2.2.3 - 6.2.2.1 के तहत वर्णित के रूप में एक ही नोड पैरामीटर का प्रयोग करें। "गड़बड़ी" → "जोड़ें" 'नए लगातार पल्स' → पैरामीटर का चयन करें "राज्य" → लक्ष्य का चयन करें "PI3K-Inh" → समय चुनें "0" → मूल्य का चयन करें "1" → क्लिक करें "ठीक" जोड़ने के लिए क्लिक करें क्लिक करें; क्लिक करें "जोड़ें"समय का चयन → 'नए लगातार पल्स' → पैरामीटर का चयन करें "राज्य" → चयन लक्ष्य 'खल्क-Inh "जोड़ने के लिए" 0 "→ मूल्य का चयन करें" 1 "→ क्लिक करें" ठीक है "।
      2. प्रोटोकॉल को बचाने के लिए "ठीक" पर क्लिक करें। पैनल के लिए "विकल्प" के लिए जाओ: 6.2.2.4 के तहत वर्णित के रूप में चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए एक ही नोड्स का प्रयोग करें। प्रणाली की प्रतिक्रिया का एक पूरा अनुकरण शुरू करने के लिए "प्रारंभ" → "भागो" पर क्लिक करें। "रीसेट" अनुकरण खत्म करने के लिए क्लिक करें।

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Representative Results

SISmuc पाड़ (सी को 2A चित्रा) के आधार पर, हम पीढ़ी, उत्तेजना और एक 3 डी ट्यूमर परीक्षा प्रणाली (चित्रा 2 डी) के उपचार के लिए एक मानकीकृत ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल की स्थापना की। यह मॉडल प्रसार सूचकांक और M30-एलिसा का उपयोग कर के रूप में चित्रा 1 और 3 चित्र में दिखाया गया है, क्रमशः apoptosis की मात्रा का ठहराव के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है। 3 से पता चलता प्रतिनिधि एच ई A549 और HCC827 मॉडल का धुंधला और gefitinib के साथ एक प्रतिनिधि apoptosis माप चित्रा। यहाँ प्रस्तुत मॉडल EGFR -mutated NSCLC जो सफलतापूर्वक क्लिनिक में लक्षित अवरोधकों के साथ व्यवहार किया जाता है के उदाहरण का उपयोग बनाया गया है। तदनुसार, केवल EGFR HCC827 कोशिकाओं -mutated और न A549 कोशिकाओं हमारे मॉडल के रूप में apoptosis की वृद्धि द्वारा मूल्यांकन में TKI gefitinib द्वारा EGFR निषेध का जवाब। चित्रा 4 चित्रा 5C और डी में दिखाया गया है। EGFR -mutated HCC827 (चित्रा 5 डी) पर एक मजबूत प्रभाव पड़ता है।

चित्रा 6 नेटवर्क टोपोलॉजी (चित्रा 6A) और HCC827 कोशिकाओं (चित्रा 6B, सी) में विरोधी EGFR चिकित्सा प्रतिरोध की सिलिको सिमुलेशन में विस्तृत पता चलता है। संकेतन नेटवर्क ऐसे HPRD, KEGG और QIAGEN (जीन और रास्ते) के रूप में जाना जाता है साहित्य डेटाबेस का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था, 42 नोड्स और 55 किनारों की एक टोपोलॉजी, CellDesigner सॉफ्टवेयर 26 के साथ कल्पना में जिसके परिणामस्वरूप। ज्ञात चालक उत्परिवर्तन EGFR (लाल रंग में) और सी-एमईटी सह सक्रियण का अनुकरण (हरे, मूल्य में करीब 0.7) एक वृद्धि prol चलताiferation दर (सामन वक्र) और एक कम apoptosis HCC827 कोशिकाओं में gefitinib दर्शाती दर (बैंगनी वक्र) समय के साथ प्रतिरोध (पीले रंग में) खल्क और PI3K (चित्रा 6B, काले, हरे और सियान) के एक सक्रियण के साथ-साथ चल रहा है। संयुक्त PI3K और खल्क अवरोध (अंधेरे और प्रकाश ग्रे घटता) विरोधी EGFR प्रतिरोध प्रभाव का एक प्रत्यावर्तन में परिणाम की मॉडलिंग प्रसार कम कर देता है और लाती apoptosis (चित्रा 6C)।

आकृति 1
चित्रा 1. प्रसार की दर Ki67 पॉजिटिव HCC827 कोशिकाओं (ए और बी में लाल) SISmuc (बी) पर 2 डी सेल संस्कृति (ए) और 3 डी सेल संस्कृति में दाग थे 3 डी में कम हो जाता है 2 डी सेल संस्कृति की तुलना में।। HCC827 कोशिकाओं और A549 कोशिकाओं गिना रहे थे और प्रसार सूचकांक (Ki67 सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत) निर्धारित किया गया था (सी </ Strong>, एक प्रतिनिधि पांच में से गिनती)। एक में स्केल सलाखों और बी:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. SISmuc पाड़ आकृति विज्ञान और उपचार अनुसूची TKI Gefitinib के साथ कोशिकाओं SISmuc छोटी आंत submucosa (एसआईएस) + म्यूकोसा (ए के होते हैं जिस पर वरीयता प्राप्त कर रहे:। SISmuc, सी के शीर्ष पर DAPI दाग कोशिकाओं: brightfield, बी ओवरले ए और बी) और 0. दिन पर सेल मुकुट में तय हो गई है की उपचार योजना के विकास में दिखाया गया है: मध्यम परिवर्तन (एमसी) हर 2 से 3 दिन प्रदर्शन कर रहे हैं। 11 दिन में इलाज शुरू होता है। Supernatants एकत्र की है और M30-एली के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंआदेश में समय के साथ apoptosis यों के लिए एसए (नीले तीर और बॉक्स)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. SISmuc और HCC827 में लाती Apoptosis पर Gefitinib उपचार परिवर्तन सेल के विकास, लेकिन नहीं A549 3D ट्यूमर मॉडल में। किसी भी उपचार के बिना, दोनों सेल लाइनों SISmuc (ए और बी) पर एक monolayer फार्म और भी पूर्व तहखाना संरचनाओं बसा। जबकि A549 कोशिकाओं के विकास पैटर्न gefitinib (सी) के साथ इलाज के बाद भी नहीं बदला है, HCC827 कोशिकाओं की संख्या एक लम्बी सेल आकार (डी) के लिए एक बदलाव के साथ कम हो जाता है। Apoptosis ई के रूप में संस्कृति supernatants से M30-एलिसा माप द्वारा देखा HCC827 मॉडल में gefitinib से प्रेरित है ( विकास में स्केल पट्टी:। डी करने के लिए एक के लिए 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. TGF-बीटा -1 लाती SISmuc पर HCC827 प्रकोष्ठों में EMT। HCC827 कोशिकाओं 3 डी में सुसंस्कृत अखिल cytokeratin (PCK) के समग्र अभिव्यक्ति शो (एक में हरे, A1) लेकिन केवल एकल कक्षों vimentin ए, एक्सप्रेस (लाल A2)। बाद TGF-बीटा -1 उत्तेजना, कोशिकाओं को एक लम्बी आकार के लिए उनकी आकृति विज्ञान बदलने के लिए और vimentin की अभिव्यक्ति जोरदार वृद्धि हुई है (बी में लाल, बी 2), जबकि PCK की अभिव्यक्ति बनाए रखा है (बी में हरे, बी 1)। बी में स्केल पट्टी: एक के लिए 100 माइक्रोन बी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. गतिशील सेल संस्कृति को बढ़ाता है ऊतक जनरेशन। जब एक बायोरिएक्टर में 3 डी की स्थिति (बी), स्थिर मॉडल (ए, एच एंड ई धुंधला) एक बहुपरती ऊतकों को एक monolayer (ए) से परिवर्तन (सी, एच एंड ई धुंधला से monolayer के तहत सुसंस्कृत )। HCC827 कोशिकाओं gefitinib उपचार (डी, एच एंड ई धुंधला) पर एक मजबूत दवा प्रतिक्रिया दिखाते हैं। विकास में स्केल पट्टी:। ए, सी और डी के लिए 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
अंजीर। 6. सिलिको ट्यूमर मॉडल जनरेशन और लाल (EGFR मार्ग) में महत्वपूर्ण संकेत दे नोड्स के साथ एक ट्यूमर सेल के विरोधी EGFR थेरेपी प्रतिरोध। नेटवर्क टोपोलॉजी और हरे रंग (सी-एमईटी) और उनके नीचे की ओर नोड्स के अनुकरण में। विशेषता ट्यूमर पढ़ने के लिए बाहर मापदंडों के प्रसार (सामन में) और apoptosis (बैंगनी) में षट्भुज के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। तीर से संकेत मिलता सक्रियण, पा तीर निषेध। चिकित्सीय लक्ष्यों को अंधेरे और प्रकाश ग्रे आयत द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, gefitinib द्वारा निषेध पीला (ए) में दिखाया गया है। ई-कार्यों (रंग का घटता) बूलियन नेटवर्क कनेक्टिविटी बैठाना (और, या, नहीं) द्वारा Dynamical अनुकरण। EGFR और सी-एमईटी सह अभिव्यक्ति के रूप में प्रसार (सामन वक्र) और विज्ञापन की वृद्धि ने संकेत दिया gefitinib प्रतिरोध का कारण बनता हैके बारे में मनमाने ढंग से समय बिंदु 8 (बी) के बाद apoptosis (बैंगनी वक्र) की ecrease। संभावित चिकित्सा tackles दोनों PI3K और खल्क अवरोधकों से (पीला वक्र के तहत, एक ही सक्रियण, प्रोटोकॉल देखें)। (सी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हम की स्थापना की है एक विट्रो में संयुक्त / बायोमार्कर निर्देशित उपचार के पूर्वानुमान के लिए सिलिको ट्यूमर परीक्षा प्रणाली में। इन विट्रो मॉडल इस तरह के एक विशिष्ट mutational पृष्ठभूमि पर ट्यूमर सेल प्रसार और apoptosis के परिवर्तन है कि यह भी सिलिको 17 में प्रेरित किया जा सकता है के रूप में यौगिक क्रियाओं के विभिन्न महत्वपूर्ण पहलुओं का मूल्यांकन करता है। यहाँ, हम 3 डी मॉडल ट्यूमर पीढ़ी और प्रसार और apoptosis की मात्रा का ठहराव और सिलिको मॉडल में एक भविष्य कहनेवाला की स्थापना सहित परिसर के परीक्षण के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। 3 डी मॉडल ट्यूमर असर विशिष्ट म्यूटेशन ट्यूमर सेल लाइनों पर आधारित है। प्रकोष्ठों सेल मुकुट में एक decellularized ऊतक मैट्रिक्स पर हो रहे हैं। मैट्रिक्स decellularization, दो धातु के छल्ले (सेल मुकुट) के बीच निर्धारण, बायोरिएक्टर प्रणाली के कोडांतरण के साथ ही बोने पाड़ के 25 से पहले जौव में कल्पना की गई है।

कृत्रिम परिवेशीय 3 डी मॉडल ट्यूमर
क्लिनिक में यहाँ प्राप्त परिणामों का अनुवाद चयनित लक्षित दवाओं के लिए बायोमार्कर के अनुसार रोगियों को वर्गीकृत करने में असर ब्याज की म्यूटेशन उपयुक्त ट्यूमर कोशिकाओं के एक सावधान चयन की आवश्यकता है। स्तरीकृत चिकित्सा के लिए, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा druggable चालक म्यूटेशन की पहचान के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय विशेष रूप से NSCLC में है और उम्मीद है कि भविष्य में 29 नए आनुवंशिक मार्करों प्रकट होगा। इन विट्रो में परीक्षण के लिए ब्याज के परिसर में एक साइट है कि चुने हुए सेल लाइन में या प्राथमिक कोशिकाओं में अत्यधिक सक्रिय है लक्ष्य होना चाहिए। इधर, सेल लाइनों HCC827 और A549 EGFR उत्परिवर्तन की स्थिति में उनके अंतर की वजह से चुना और अतिसंवेदनशीलता (HCC827 कोशिकाओं) और 2 डी संस्कृति 30-32 में TKI gefitinib की ओर मध्यवर्ती संवेदनशीलता (A549 सेल) की सूचना मिली। चुने गए ट्यूमर का 3 डी मॉडल ट्यूमर पीढ़ी, सेल नंबर और संस्कृति की अवधि के पहले चरण में कोशिकाओं adju किया जाना हैsted यदि कोशिकाओं को यहां उल्लेख से अलग किया जाता है। इष्टतम यौगिक एकाग्रता मिल जाए, यह 2 डी में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध व्यवहार्यता परख की मदद से IC50 मूल्य निर्धारित करने के लिए सलाह दी जाती है। इस परीक्षा के आधार पर, यौगिक IC50 एकाग्रता और 3 डी मॉडल में अगले उच्च एकाग्रता में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हम आदेश दो से तीन सप्ताह के भीतर और दूसरी तरफ 2 डी ट्यूमर परीक्षा प्रणाली को आसान तुलना के लिए परिणाम पाने के लिए एक हाथ पर उपचार के तीन दिनों के लिए चुना है। हालांकि, उपचार की अवधि के लिए लंबी अवधि के प्रभाव की जांच करने के लिए लंबे समय तक किया जा सकता है। फिर भी, यह माना जाना चाहिए कि लंबे समय तक इलाज या परीक्षण परिसर के उच्च dosages जिससे प्रसार या अन्य प्रतिरक्षाऊतकरसायन मार्कर के मूल्यांकन को रोकने पूरा सेल नुकसान हो सकता है।

विश्वसनीय संकेतन नेटवर्क विश्लेषण के लिए, एक निश्चित परिसर के साथ इलाज पर ट्यूमर प्रतिक्रियाओं प्रसार और एपीओ के बीच भेद का विश्लेषण किया जाना हैवर्त्मपात। ये पढ़ बहिष्कार अलग ढंग से संकेतन नेटवर्क में जुड़े हुए हैं। इस प्रकार, दोनों मापदंडों के विशिष्ट विश्लेषण दवा कार्रवाई और बाद में लक्ष्य भविष्यवाणी की एक बेहतर समझ के लिए सक्षम बनाता है। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार को 2 डी संस्कृति की स्थिति की तुलना में हमारे 3 डी मॉडल में कम हो जाता है और इस प्रकार, का परीक्षण किया cytostatic यौगिकों की झूठी सकारात्मक परिणामों को कम करना चाहिए। प्रसार सूचकांक के निर्धारण के लिए, नाभिक की कुल संख्या और Ki67 धुंधला के लिए सकारात्मक नाभिक की संख्या उदाहरण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा फिजी किया जाना है। यह ट्यूमर कोशिकाओं के 2 डी संस्कृतियों में मैक्रो का उपयोग करके सरल किया जा सकता है जो क्रमश: संभव है, लेकिन नहीं, के रूप में इस नाभिक के कम या अधिक संख्या में परिणाम है अगर कोशिकाओं तंग समुच्चय के रूप में। सभी मामलों में, मैक्रो सेटिंग्स प्रत्येक कोशिका लाइन और धुंधला के लिए ध्यान से समायोजित किया जाना है। Apoptosis, मापने कस्पासे cleaved cytokeratin 18 supernatants से गैर invasively मात्रा निर्धारित किया जा सकता है कआईसीएच, उपकला विशेषताओं के साथ कोशिकाओं के लिए प्रतिबंधित है M30-एलिसा का उपयोग कर। यह कई फायदे हैं: i) यह समय के साथ उपचार प्रभावकारिता पर नजर रखने के लिए और प्रभावी उपचार के शुरुआती बिंदु की पहचान करने की अनुमति देता है। द्वितीय) नमूनों को नष्ट नहीं कर रहे हैं और अन्य पढ़ने के लिए बाहर की तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। तृतीय) उपकला कोशिका apoptosis mesenchymal apoptosis, जो सह संस्कृति सेटिंग्स में इष्टतम है से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इस तकनीक, हालांकि, ट्यूमर कोशिकाओं है कि EMT कराना पड़ा, जिससे उनके उपकला phenotype खोने के लिए अनुपयुक्त हो सकती है। इस प्रकार, प्रत्येक ट्यूमर सेल का इस्तेमाल किया लाइन के cytokeratin 18 की अभिव्यक्ति प्रतिरक्षाऊतकरसायन stainings द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए इससे पहले इस तकनीक को लागू किया जाता है। यौगिकों का परीक्षण भी एक और अधिक ट्यूमर स्टेम सेल की तरह phenotype में किया जा सकता है। दवा परीक्षण में आमतौर पर अलग अलग चरणों आक्रामक भले ही इस तरह के TKIs के रूप में लक्षित दवाओं के सबसे अधिक उन्नत ट्यूमर चरणों में लागू कर रहे हैं उपेक्षा कर रहे हैं। हमारे मॉडल आक्रामक या की जांच के लिए सक्षम बनाता है कोईn इनवेसिव ट्यूमर कोशिकाओं, संरक्षित बेसल झिल्ली 17 के कारण जो कोशिकाओं आक्रमण की प्रक्रिया के दौरान पार करना पड़ता है। सेल गतिशीलता और invasiveness की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है कि TGF-बीटा -1 17,33 के साथ उत्तेजना से अलग फेफड़ों के कैंसर के मॉडल में प्रेरित किया जा सकता EMT है। यह, हालांकि, पाड़ पर प्रसार और इस तरह की सेल नंबर कम कर देता है। यह नकारात्मक पक्ष प्रभाव है कि दृढ़ता से 3 डी मॉडल में ट्यूमर सेल घनत्व बढ़ जाती है गतिशील संस्कृति की स्थिति के आवेदन के द्वारा धोखा दिया जा सकता है। हालांकि बायोरिएक्टर शारीरिक शर्तों को संस्कृति समायोजित कर देता है, यह है कि सेल के गुण और संकेतन जोखिम से प्रभावित किया जा सकता है तनाव 25 कतरने के लिए विचार किया जाना है।

स्पीड अप करने के लिए सिलिको सिमुलेशन में उपयोग करते हुए सेल लाइन विशेष औषधि परीक्षण
हालांकि केवल अर्द्ध मात्रात्मक, घटनाओं के अनुक्रम ठीक से हमारे द्वारा सिलिको मॉडल में ख्याल से मॉडलिंग की हैपूरी तरह से प्रत्येक विशेष सेल लाइन के लिए जाना जाता म्यूटेशन पर विचार। यह सेल लाइन अलग रिसेप्टर सक्रियण के स्तर के विशिष्ट संशोधन भी शामिल है, किस हद तक kinases शामिल करने के लिए सक्रिय कर रहे हैं और कब और कितनी देर तक नेटवर्क उत्पादन apoptosis या प्रसार उम्मीद की जा रही है इस तरह के रूप में। उदाहरण के लिए, एक चिकित्सकीय जाना जाता सी-एमईटी amplifications कि अधिग्रहीत विरोधी EGFR चिकित्सा प्रतिरोध 30 के बारे में 20% में होने के लिए लगा रहे हैं पर विचार कर सकते हैं। इसके बाद में सिलिको मॉडल, समय के साथ इसी नेटवर्क व्यवहार की गणना करता है जैसे।, Gefitinib प्रतिरोध विकास में वृद्धि हुई प्रसार द्वारा प्रतिनिधित्व और apoptosis कमी आई है। हमारे मॉडल में, हम सबसे होनहार लक्ष्य उम्मीदवार के रूप में खल्क और PI3K की पहचान की। नतीजतन, नए संभावित चिकित्सीय संयोजन तेजी से सिलिको में पूर्व मूल्यांकन किया जा सकता है, जो आगे इन विट्रो में परीक्षण के लिए एक आधार के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, इन विट्रो प्रयोगों से उत्पादन डेटा कर सकते हैंनेटवर्क समायोजन है कि प्रयोगात्मक परिणाम सबसे अच्छा फिट द्वारा सिलिको प्रणाली में परिष्कृत करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। सिलिको रणनीतियों में अर्द्ध मात्रात्मक नेटवर्क का आकार (लगभग 100 प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पर विचार किया जा सकता है) के बारे में कुछ सीमाएं हैं। इसके अलावा, यह आदेश यथार्थवादी परिणाम उपज में नेटवर्क टोपोलॉजी में सभी प्रमुख प्रोटीन नोड्स को एकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है। में सिलिको मॉडल इस प्रकार ही रहने वाले ट्यूमर सेल में मौजूदा नेटवर्क की एक सन्निकटन देता है। हालांकि, इस केंद्रित दृश्य हित के विशिष्ट परिवर्तन, उदाहरण के लिए।, सेल लाइन में विभिन्न mutational पृष्ठभूमि पर दवा संयोजन के प्रभाव का अनुकरण करने के लिए हमें की अनुमति देता है। यह मदद करता है हमें योजनाबद्ध तरीके से इस तरह के कैंसर संकेतन नेटवर्क की जटिलता को समझने के लिए नए चिकित्सकीय रणनीति पाने के साथ ही।

अंत में, हम आश्वस्त हैं कि हम एक उपयोगी ऊतक विट्रो उपकरण में इंजीनियर है कि आसानी से precli में एकीकृत किया जा सकता है विकसित किया हैएकल दवा यौगिकों और उनके संयोजन की प्रभावकारिता पर nical परीक्षण। परीक्षण में लागत और समय को कम करने के लिए, इस ट्यूमर मॉडल इसके अलावा सिलिको भविष्यवाणी उपकरण में एक डेटा क्लिनिक उन्मुख लक्षित चिकित्सा या नए खिलाड़ियों पर विचार करने सहित दवा और दवा संयोजन प्रभाव की एक सेल प्रकार विशिष्ट भविष्यवाणी करने के लिए एकत्र विस्तार करने की अनुमति देकर पूरित है (जैसे।, miRNAs)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध अंतःविषय क्लीनिकल रिसर्च Wuerzburg के विश्वविद्यालय अस्पताल की (IZKF, अनुदान BD247) के लिए केंद्र और बायर्न फ़िट कार्यक्रम (Heike Walles करने के लिए दी गई) द्वारा प्रायोजित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

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References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

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जैव अभियांत्रिकी अंक 110 ऊतक इंजीनियरिंग 3 डी मॉडल ट्यूमर बूलियन फेफड़ों के कैंसर जैविक पाड़ प्रवाह बायोरिएक्टर प्रसार सूचकांक gefitinib apoptosis TGF-बीटा -1 EMT
एक संयुक्त 3 डी ऊतक इंजीनियर<em&gt; इन विट्रो</em&gt; /<em&gt; सिलिको</emविशिष्ट mutational पृष्ठभूमि में ड्रग प्रभावशीलता की भविष्यवाणी के लिए&gt; फेफड़े ट्यूमर मॉडल
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Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

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