Abstract
本研究では、我々は特定の突然変異背景に基づいて、薬物応答の予測を最適化するために、 シリコモデルで用いたin vitro 3D肺腫瘍モデルを組み合わせます。モデルは、基底膜を含む細胞外マトリックス組成物およびアーキテクチャに関する組織特異的特性を再現脱細胞化ブタの足場上に生成されます。私たちは、薬物治療の3日を含め14日以内に人工的な腫瘍組織の生成を可能にするプロトコルを標準化しました。私たちの記事では、読み出しの有効性を評価するための便利なツールである増殖指数Ki67染色の、M30-ELISAによって上清からアポトーシスと間葉転換 （EMT） に上皮の評価の決意のようなスクリーニング技術を、3Dのいくつかの詳細な説明を提供します治療用化合物。我々は、2D培養物にrelatある我々の3D腫瘍モデルにおける増殖の減少を比較し示すことができ臨床状況にエド。このより低い増殖のにもかかわらず、このモデルは、HCC827肺癌細胞株の比較によって示されるように正確にバイオマーカーの状態に応じてEGFR -targeted薬物応答を予測（EGFRは -mutated、KRAS野生型）およびA549（EGFR野生型KRAS -変異） チロシンキナーゼ阻害剤 （TKI）ゲフィチニブで処理しました。ビメンチン/パン - サイトケラチン免疫蛍光染色によって評価されるように、より高度の腫瘍細胞の薬物応答を調べるために、我々は、TGF-β-1との長期治療によりEMTを誘導しました。フローバイオリアクターは、組織の生成を改善し、生理的条件下に培養物を調整するために使用しました。アポトーシス、増殖指数とEMT - -ブール値へのシリコモデルではさらに、我々は、ゲフィチニブ治療またはTGF-β-1刺激の際に薬剤応答の統合を示しています。さらに、当社は、特定の突然変異背景とカウントを有する腫瘍細胞のどの薬物応答を説明します抵抗に対するerstrategiesを予測することができます。我々は、特にそのインシリコ拡大を用いたin vitroのアプローチで私たちの 3Dは2D細胞培養におけるよりもより現実的な条件での前臨床薬物検査のための付加価値を提供することを確信しています。
Introduction
製薬業界は、莫大なコスト1-5を引き起こす臨床段階における癌治療の分野で最大95％の高い離職率に直面しています。この赤字の1つの理由は、現在、潜在的な新規化合物の有効性は、癌細胞株の2D細胞培養でまたは動物モデルでの大規模スクリーニングで評価することです。動物モデルは、より高い複雑さを持っていますが、マウスと男性6,7間の決定的な違いがあります。 10年で、異なるアプローチを使用して3D癌モデルは、2D癌細胞株の培養およびインビボ腫瘍 6,8,9 における複合体との間のギャップを埋めるために生成されています。細胞分化にもシグナル伝達に対する3D環境の影響は数年前にいくつかの研究で示されている（ 例えば 、ミナザビッセルによって）10,11。今日では、多くの3D細胞培養モデルは、スフェロイド培養、ヒドロゲルまたはマイクロ流体チップ12-16として入手可能です。でもthesというかかわらずEモデルは、それらが主に腫瘍担持の効果と影響の薬効を有することが知られている組織の微小環境を欠いている、従来の2D培養システムと比較して複雑性を高めます。
この問題に対処するために、我々は、脱細胞化ブタ空腸に由来するSISmuc（ 小腸、粘膜下層+粘膜 ）と呼ばれる生物学的足場に基づいた3D腫瘍モデルを生成しました。これにより、組織構造や、異なるコラーゲンと同様に基底膜構造としてECMの重要な構成要素は、17を保持されます。このユニークな機能は、上皮から生じ、固形腫瘍の約80％を占める癌の腫瘍モデル生成のために重要です。さらに、我々の組織工学腫瘍モデルにおける増殖速度は、2D培養で達成され、人為的に高い速度に比べて低減されます。増殖が薬効を評価する上で重要なパラメータであるように、薬物検査は類似で我々のモデルで有効になっています17 in vivoでの腫瘍内への条件。
そのEGFRの -biomarker状態が異なる2つの異なる肺癌細胞株のための正常なバイオマーカー依存性薬物の有効性を予測するために我々のモデルの可能性を評価するために、ここで現在のデータ。この変異状態は、NSCLC患者に日常的に決定され始めています。例えば、白金ベースの化学療法18-21のものと比較して、活性化EGFR変異ショー優れた成果を保有する腫瘍に対するEGFR -inhibitorゲフィチニブなどのTKIとターゲットを絞った治療法。
我々は、化合物の有効性を評価するために関連するいくつかの読み出し技術を確立しました。さらに、TGF-β-1刺激後に、我々は、悪性形質転換22,23における重要なステップであると考えられ、薬物RESISTANに接続されたEMTプロセスを、開始した腫瘍細胞における化合物の作用を調査することができますCE 24。
3D腫瘍モデルは、良好なコントラストで標的治療、化学療法、または薬物の組み合わせに細胞特異的応答を監視することができます。さらに強化し、薬剤スクリーニングをスピードアップし、抵抗に遭遇するために、これはシリコシミュレーションにによって補完されます。いくつかの実験に基づいて、腫瘍反応は、薬物およびそれらの組み合わせの完全な範囲についての結果についてインシリコで予測することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.二次元（2D）細胞培養
- 商業的に腫瘍細胞株HCC827（DSMZ）を得ました。培養RPMI-1640で肺腺癌細胞株HCC827（変異したEGFR、KRAS野生型）、20％FCSを補充しました。 3日間 - すべての2培地に変更します。週に2回、細胞を分割します。通路20に到達するまで細胞が使用されます。
- 商業的に腫瘍細胞株A549（DSMZ）を得ました。培養物を10％FCSを補充したRPMI-1640中で肺癌細胞株A549（EGFR野生型KRASが変異）。上記のように文化を実行します。通路20に到達するまで細胞が使用されます。
- （ - 6週間ごとに4）このようなマイコプラズマ汚染などの汚染のために定期的に細胞をテストします。
- カバーガラス上A549またはHCC827細胞を培養します
- ピンセットを用いて、24ウェルプレートの各ウェルに1滅菌ガラスカバースリップを置きます。
- を含むウェル中500μlの容量で両方の細胞株の50,000腫瘍細胞を播種カバーガラス、それぞれ。
- 培養細胞は、標準的な培養条件下で70％の集密度に達するまで（37℃、5％CO 2）。 3日間の培養 - この間、すべての2パスツールピペットを使用して、古い培地を吸引し、500μlの新鮮な培地を追加します。
生物コラーゲン足場上の腫瘍試験システムの2世代
- 静的培養条件
- 脱細胞化小腸、粘膜下組織+粘膜（SISmuc）を生成し、前の出版物25で説明したように、二つの金属リング、いわゆる細胞冠の間にそれを修正。
- セル冠に固定された腸のかつての内腔の側面上に種子を500μlの総容積でHCC827またはA549細胞のいずれかの100,000個の細胞。
- 腫瘍細胞は、37℃、5％CO 2で2時間接着させます。外側の細胞クラウン内側培地1ミリリットルと1ミリリットルを追加します。
- 腫瘍文化14日間37℃で、インキュベーター中で5％CO 2で、静的条件下モデル。 3日間 - すべての2培地を変更します。 （：10％、HCC827：20％A549）細胞クラウン内側と外側同じ培地の1.5ミリリットルしたがって、パスツールピペットやピペットFCSの適切な量の1ミリリットルの新鮮なRPMIを使用して、培地を吸引除去します。
- 動的な培養条件
- 2.1.3にサブセクション2.1.1で説明したように、細胞クラウンおよび細胞播種内部の脱細胞化マトリックスと腫瘍テスト・システムを設定します。
- 培養静的条件下での腫瘍モデル、37℃、3日間インキュベーター中5％CO 2。
- オートクレーブ処理バイオリアクターを組み立て、以前25公開されているようシードのSISmucを挿入します。
- ピペットFCS適切な量の45 mlのRPMI（A549：10％、HCC827：20％）をフラスコへとバイオリアクターとの間の配管系に無針サンプリング装置を接続します培地をフラスコ。
- 37°C、5％CO 2で一定の媒体流（3 ml /分）で追加の14日間ポンプや文化腫瘍モデルに接続し、インキュベーターにバイオリアクターを配置します。
- 7日後に全体の培地を変更します。そのため、層流フードの下インキュベーターからバイオリアクターを移動します。パスツールピペットを使用してメディアフラスコに培地を吸引します。配管システム内の培地を取り除くために吸引しながらバイオリアクターを持ち上げます。フラスコにピペットで45ミリリットルの新鮮な培地。バックインキュベーターにバイオリアクターを配置し、ポンプに接続します。
ゲフィチニブによる静的腫瘍モデルの3治療
- 文化腫瘍モデル2.1節で説明したように。
- 文化の日11時、1μMゲフィチニブ（各セルの王冠のための2.5ミリリットル）を含むRPMI / FCSを準備します。パスツールピペットを用いてウェルから古い培地を吸引し、トンの内側に準備されたRPMI / FCSは/ゲフィチニブの1ミリリットルを追加彼セル王冠と外側の同じ培地の1.5ミリリットル。
注：解凍ゲフィチニブストック溶液を1週間4℃で保存することができます。 - サブセクション3.2で説明したように13日目で培地を変更します。
EMT誘導のためのTGF-β-1での静的腫瘍モデルの4刺激
- 文化腫瘍モデル2.1節で説明したように。
- 文化の3日目に、2 ngの/ mlのTGF-β-1キャリアと（各セルの王冠のための2.5ミリリットル）を含むRPMI / FCSを準備します。吸引し外部の古いパスツールピペットを用いて、ウェルから培地および細胞クラウン内側に準備されたRPMI / FCS / TGF-β-1の1ミリリットルを追加し、同じ培地の1.5ミリリットル。 4.2で説明したように、14日目まで3日 - 中TGF-β-1毎に2を補充して変化します。
5.リードアウト
- ELISA測定用のサンプルを採取
- 静的（セクション2.1）と動的（セクション2.2）の培養上清中からサンプルを取ります日図2に示すように、培養の11から14にゲフィチニブ（セクション3）を用いた治療。また、治療前（T0）にサンプルを取ります。
- 静的な培養条件下で、細胞クラウンの内側から100μlのサンプルを取ります。動的な培養条件の下では、サンプリング装置に注射器をネジ込み、バイオリアクターシステムのうち、1ミリリットルの媒体を取ります。 ELISAを行うまで-80℃で収集されたすべての上清を保管してください。
- アポトーシスの定量化のためのM30-ELISA
- 上清中のアポトーシスを定量化することは、製造業者の説明書に従って、細胞死アッセイを行います。すべての試薬は、アッセイを行う前に、RTに到達させます。
- ボルテックスすべての試薬。 500ミリリットル新鮮な脱イオン水で洗浄タブレットを溶解させます。コンジュゲート希釈バッファーの9.2ミリリットルでHRPコンジュゲートを希釈し、混合します。ピペットの標準またはサンプルウェルあたり25μlの。
- 希釈したHRP Conjuの75μLを追加ウェル当たりゲートソリューション。プレートを覆い、室温で4時間、シェーカー上でインキュベートします。準備された洗浄液250μlの、手動で5回プレートを洗浄します。
- 各ウェルに、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）基質3,3 'の200μLを加えます。室温で20分間暗闇の中でインキュベートします。各ウェルに50μlの停止溶液を加えます。 10秒間のマイクロプレートをシェイクし、吸光度を読み取る前に5分間、マイクロプレートを残します。マイクロプレートリーダーで450 nmの吸光度を決定します。このような原点としてELISAタイプのデータを処理するための適切なプログラムを使用して標準曲線とサンプル中の濃度を算出します。
- サンプル染色
- 固定、パラフィン包埋し、3Dモデルのセクションの準備
- 2時間細胞クラウン当たり2.5ミリリットルの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用してシードのSISmucを修正し、パラフィンにそれを埋め込みます
- 以前に公開されたように染色のために3μmの組織切片を準備25。
- 2D培養条件で増殖させた細胞の固定
- 70％コンフルエンスに達したとき、PBSで一度24ウェルプレート中のカバーガラス上で培養した細胞を洗浄し、500μlの4％で固定しPFA /ウェルで10分間。
- PFAを削除し、染色が行われるまで4℃でPBSで覆われたウェルプレート中のカバーガラスを格納します。
- H＆E染色
- 標準的なプロトコルに従って概要染色としてヘマトキシリン/エオシンで再水和したセクションを染色。
- 3Dモデルの免疫蛍光染色
- 免疫染色のために、20分間予熱したクエン酸緩衝液（pH 6.0）で蒸気調理器に脱パラフィンし、再水和したスライドを配置することにより、抗原の検索を行います。
注：クエン酸緩衝液を調製するための材料および機器のの表を参照してください。 - スライドを転送洗浄緩衝液（0.5 M PBS緩衝液+ 0.5％のTween）に、PAPペンで円のセクションでは、染色・ソリューションの必要量を最小限にするため、湿気チャンバー内でスライドを配置します。
- 室温で20分間、サブセクション5.3.4.6に使用される二次抗体の宿主種由来の5％血清を組織切片をブロックします。
- そっとティッシュペーパーにスライドをタップすることで、ブロッキング血清削除し、製造業者の指示に従って希釈で囲まれたセクションに一次抗体を適用します（ウサギ抗Ki67の1：100、ウサギ抗ビメンチン1：100、マウス抗パンサイトケラチン1 ：100）。 4℃でO / Nインキュベートします。二重染色のために、異なる宿主種からの一次抗体を使用する必要があります。
- 慎重に洗浄緩衝液で5分間3回、非結合抗体を洗い流します。
- セクション400及び室温で1時間インキュベート：特定の抗原 - 抗体結合の検出のために、希釈1に二次抗体を適用します。
- UNBを洗い流します洗浄バッファーでound抗体5分間3回洗浄しました。
- 核を対比染色し、乾燥O / NそれらをできるようにDAPIを含む水性媒体でスライドをマウントします。
- 免疫染色のために、20分間予熱したクエン酸緩衝液（pH 6.0）で蒸気調理器に脱パラフィンし、再水和したスライドを配置することにより、抗原の検索を行います。
- 2D培養細胞の免疫蛍光染色
- PBSを削除し、透過化のため5分間、PBS中の0.2％のTriton-X100でシードされたガラスカバースリップをカバーしています。ガラスカバーは、5分間、洗浄緩衝液（0.5 M PBS緩衝液+ 0.5％のTween）でスリップ洗います。
- 5.3.4.7へのステップ5.3.4.3を実行します。ロッキングプラットフォーム上でウェルプレートのすべてのステップを実行し、プレートを反転させることにより試薬を除去。
- 取り付けのために、コーティングされていないスライドガラス上に核を対比染色し、鉗子を用いた実装媒体との対向細胞とそれにカバースリップを転送するためにDAPIを含む水性媒体のドロップを見つけます。撮影前にそれが乾燥してみましょう。
- 固定、パラフィン包埋し、3Dモデルのセクションの準備
- 増殖指数の決意
- 免疫蛍光を行いますセクション5.3.4に従ったKi67に対して染色。または5.3 5。
- 倒立顕微鏡で組織切片または2D培養細胞の蛍光画像を撮ります。 DAPI染色のおよびKi67染色の画像を撮影するための異なるフィルタを使用してください。定量化のために、試料の非重複部分から各条件の3Dセクションの10画像または2D培養（倍率20X）の5イメージを使用しています。
- 核と2DでのKi67について陽性の核の数の数を決定
- ソフトウェアフィジー26のプラグインセルカウンタを使用して手動でのKi67陽性核を数えます。そのため、画像を開いて、「プラグイン」→「分析」→「セルカウンター」をクリックします。押して「初期化」とカウンタタイプを選択します。それぞれのKi67陽性の核をクリックします。クリック数は、選択したカウンタのタイプの横に示されています。
- 核の合計数の自動細胞計数のためにフィジー27,28を使用してマクロを作成します。 ADJ全ての染色および細胞株のためのマクロをUST。続いて、マクロを作成する方法の例を参照してください。
- マクロの記録を開始します。 DAPI-画像を開いて、「イメージ」→「タイプ」→「8ビット」をクリックすることで、8ビット形式に変換します。 「1」と「飽和」に設定し、「正規化」、「コントラストを強調」をクリックします。
- 画像をシャープにする「アンシャープマスク」を設定します。 「1」の「半径」と「0.60」の「マスク」を使用してください。 「自動しきい値」をクリックして、画像をbinariseするには「黒地に白のオブジェクトの持つメソッド "RenyiEntropy"を選択します。
- 細胞を分離する「5」の侵食半径「プラグイン」→「BioVoxxel」→「流域不規則な機能」をクリックしてください。 「粒子の分析」と「0.02 - インフィニティ」に「サイズ」を設定→「分析」をクリックします。
注：粒子/細胞の数がありますカウントとして集計表に示されています。 - さらに画像の分析のためにマクロを保存するために、「作成」をクリックします。
- サブセクション5.4.3.1に記載されているように、手動で3Dで核の数およびKi67について陽性の核の数を決定します。
- 次の式に従って平均増殖指数（PI）を計算します。
N =画像の数（3D：10、2D：5）
HCC827細胞における抗EGFR療法のシリコ腫瘍モデルの生成とシミュレーション6.
- ネットワーク世代ネットワーク解析ソフトウェアを使用して、
- 重要な実験的な読み出しパラメータとHCC827細胞株の突然変異背景に基づいて、腫瘍のネットワークを生成するために、異なる既知のデータベースを使用してください。
- 可視化するために、ネットワーク解析ソフトウェア21を開きネットワーク。
- 「ファイル」→「新規」→タイプ 'JoVE_tumorモデル」をクリック→新しいネットワークを生成するために、「OK」をクリックします。二重膜に受容体を可視化する「スクエアクローズアップ北」→「OK」をクリックしてください。長方形としてのノード（=タンパク質）を可視化する「ジェネリックプロテイン」をクリック→タイプ 'EGFR」→「OK」をクリックしてください。ネットワーク内の各ノードのためにこれを繰り返します。
- ネットワーク内のノードにラベルを付ける：右クリック→「色の変更＆Shapeを...」→ノードEGFRおよび（EGF-EGFR）カラーコード「255,0,0」（赤色）のために選択します。ノードのc-MET及び（c-MET）カラーコード「0,255,0」（緑色）のために。ゲフィチニブのカラーコードのための「255,255,0」（色黄色）。 PI3K-INHのカラーコード「204204204」（色ライトグレー）のために。 MEK-INHのカラーコード「102102102」（色ダークグレイ）のために。ネットワークセレクトカラーコード内の他のすべてのノードのために4; 255255255」（色ホワイト）。
- →タイプ「増殖」六角形などの読み出しパラメータを可視化するために、「表現型」をクリック→「OK」をクリック→右クリック→「色の変更＆Shapeを...」→カラーコード「255204204」（カラーサーモン）を選択します。セレクトカラーコード「255,51,204」（カラー紫）→パラメータのアポトーシスのためにこれを繰り返します。
- エッジ（=相互作用）可視化：阻害（平滑化矢印）のためにクリックして、アクティベーション（矢印）は、「状態遷移」をクリックして「阻害します」。ネットワーク内の各相互作用のためにこれを繰り返します。
- 「ファイル」→「名前を付けて保存...」→タイプ 'JoVE_tumorのmodels.xml」をクリック→.xml形式として生成されたシグナル伝達ネットワークを保存するために「保存」をクリックします。
- シリコシミュレーションで SQUADを使用して、
注：SQUADは目を表し、離散論理ブールシステム（AND、OR、NOT）、定常状態分析を実行するように、電子ネットワークトポロジ。定常状態の分析は、システムの平衡およびシグナリングの刺激の際に責任（ 例えば 、薬物適用または突然変異）を反映します。- オープンSQUAD 17ソフトウェア、アップロード→「ロード・ネットワーク」「JoVE_tumorのmodels.xml 'ファイルをクリックします。 「ファイル名を指定して実行分析」をクリックしてください：
注：次に、SQUADはブーリアンネットワーク接続を補間する指数関数を適用し、時間をかけてネットワーク動作の動的シミュレーションを可能にする（着色シグモイド活性曲線）。 - シミュレーションプロトコルを記述するために「詳細設定」→「摂動」をクリックしてください。抗EGFR抵抗をシミュレートする：クリックして「編集プロトコル」
- 「摂動」→標準使用「初期状態= SS-4」（定常状態4）→「新しい一定のパルス」を追加するために「追加」をクリック→セをクリックします択パラメータ「状態」→選択目標「FLIP」→選択時 "0"→選択値「0.4」→「OK」をクリックします。
- これを繰り返します。→選択したパラメータは、「状態」→選択ターゲット」のc-MET」→選択時 "0"→選択値「0.4」→「OK」をクリックし、「追加」をクリックします。 "0"→選択パラメータ「状態」→選択目標「ゲフィチニブ」→選択した時間を「追加」をクリック→選択値「1」→「OK」をクリックします。
- アクティブノード（EGF-EGFR）に状態値を設定します。「activenode」をクリック→「編集」をクリック→状態を選択して「0.8」→「OK」をクリックします。他のすべてのノードのために：「編集」をクリック→状態が "0"→ "OK"をクリックして選択します。プロトコルを保存するために「OK」をクリックしてください。
- 特定の曲線を表示します。パネルに移動し、「オプション」→「*（EGF-EGFR） "、" * MEK」、「カスパーゼ」、「（C-MET）」、「PI3K」」（EGF-EGFR）」を選択し、 「ゲフィチニブ」、「アポトーシス」、「増殖」、「MEK-INH」とグラフィック表現のための「PI3K-INH」。システムの応答の完全なシミュレーションを開始するには、「初期化」→「ファイル名を指定して実行」をクリックします。新しいシミュレーションを開始するには、「リセット」をクリックします。
- 組み合わせPI3KおよびMEK阻害剤治療をシミュレートする：クリックして「編集プロトコル」
- 6.2.2.3 - 6.2.2.1で説明したように同じノードのパラメータを使用します。 「摂動」をクリック→「0」→選択した値が「1」→「OK」をクリックしてください→「新しい一定のパルス」を追加するために「追加」→選択パラメータ「状態」→選択目標「PI3K-INH」を選択し、時間をクリックします。クリックして "追加"「新しい一定のパルス '→選択パラメータ "状態"→選択目標「MEK-INH」→選択時 "0"→選択値を追加するために「1」→「OK」をクリックします。
- プロトコルを保存するために「OK」をクリックしてください。 「オプション」パネルに移動します：6.2.2.4で説明したようにグラフィカルな表現のために同じノードを使用してください。システムの応答の完全なシミュレーションを開始するには、「初期化」→「ファイル名を指定して実行」をクリックします。シミュレーションを終了し、「リセット」をクリックします。
- オープンSQUAD 17ソフトウェア、アップロード→「ロード・ネットワーク」「JoVE_tumorのmodels.xml 'ファイルをクリックします。 「ファイル名を指定して実行分析」をクリックしてください：
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SISmuc足場（Cに図2A）に基づき、我々は3D腫瘍試験システム（ 図2D）の生成、刺激及び治療 のための標準化された操作手順を確立しました。それぞれ、 図1および図3に示すように、このモデルは、増殖指数及びM30-ELISAを使用して、アポトーシスの定量化の決意を可能にします。3に示すA549およびHCC827モデルの代表的なH＆E染色とゲフィチニブとの一つの代表アポトーシスの測定図 。ここに提示さモデルが正常に診療所における標的阻害剤で治療されているEGFR -mutated NSCLCの例を使用して設計されています。これに対応し、唯一のEGFRは HCC827細胞を-mutatedおよびA549細胞は、アポトーシスの増加によって評価されるように我々のモデルでTKIのゲフィチニブによるEGFR阻害に応答しない。 図4 図5C及びDに示されるように、動的な培養条件下で、ゲフィチニブは、EGFR -mutated HCC827（ 図5D）に強力な効果を有します。
図6は、ネットワーク・トポロジ（ 図6A）およびHCC827細胞（ 図6B、C）における抗EGFR療法抵抗性のシリコシミュレーションに詳細を示しています。シグナリングネットワークはCellDesignerソフトウェア26で可視化42ノードおよび55エッジのトポロジー、その結果、このようなHPRD、KEGGおよびQIAGEN（遺伝子＆経路）をとして知られている文献のデータベースを使用して生成されました。既知のドライバ変異EGFR（赤）およびc-MET共活性化のシミュレーション（緑、値では約0.7）増加prolを示していますiferation率（サーモン曲線）およびMEKおよびPI3K（ 図6B、ダークグリーン、シアン）の活性化に伴って行くHCC827細胞の抵抗（黄色）ゲフィチニブを反映して時間をかけて減少したアポトーシス率（紫色曲線）。組み合わせPI3KおよびMEK阻害剤（暗い部分と明るい灰色の曲線）のモデル化抗EGFR抵抗効果の復帰の結果は、増殖を減少させ、アポトーシス（ 図6C）を誘導します 。
図1増殖率は二次元細胞培養物に比べて3Dに低減される。のKi67陽性HCC827細胞（A赤及びB）は 、2D細胞培養物（A）とSISmucの三次元細胞培養物（B）で染色しました。 （C <HCC827細胞およびA549細胞を計数し、増殖指数（のKi67陽性細胞の割合）を測定しました。5のうちカウント/ strong>の、一つの代表）。 AとBにおけるスケールバー：100μmのは、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
TKIゲフィチニブ図2. SISmuc骨格形態と治療スケジュール細胞は、 小腸粘膜下組織 （SIS）で構成されていSISmuc +粘膜（Aに播種されています。明視野、B：SISmuc、Cの上DAPI染色細胞：オーバーレイAとBの）および治療 方式はDに示されている0日で細胞冠に固定されている：ミディアム変化（MC）は、2〜3日毎に行われています。 11日目に治療を開始します。上清を回収し、M30-ELIのために使用されます時間をかけてアポトーシスを定量化するために、SA（青矢印とボックス）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HCC827でSISmucおよびアポトーシスを誘導する上図3.ゲフィチニブ治療の変更の細胞成長ではなく、A549 3Dで腫瘍モデル。いずれの処置がなければ、両方の細胞株は、SISmuc（AとB）の上に単分子膜を形成し、また元のcrypt構造を解決します。 A549細胞の成長パターンはゲフィチニブ（C）で処理した後に変更されていないが、HCC827細胞の数は、細長いセル形状（D）への変化を伴って減少します。培養上清からのM30-ELISA測定により見られるように、アポトーシスは、E（HCC827モデルにおいてゲフィチニブによって誘導されますDでのスケールバー：Dに100ミクロンこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
SISmuc上HCC827細胞における図4. TGF-β-1を誘導するEMT。3Dで培養されたHCC827細胞汎サイトケラチン（PCK）の全体的な発現を示す（Aで緑、a1）は1つだけです細胞は、（Aで赤をビメンチンを表現A2）。 TGF-β-1刺激後、細胞は細長い形状にその形態を変更し、ビメンチンの発現が強く増加される（Bで赤を、b2）は、PCKの発現が維持されているのに対し、（Bで緑、B1）。 Bにおけるスケールバー：Aの100ミクロンB。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.動的な細胞培養は、組織の生成を強化。培養した場合、バイオリアクター（B）内の3D条件下では、静的モデル（A、H＆E染色）から単層の単層（A）から多層組織（C、H＆E染色への変更）。 HCC827細胞は、ゲフィチニブ治療（D、H＆E染色）の際に強力な薬剤応答を示しています。 Dでのスケールバー：A、C、およびDの100ミクロン、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。。
イチジク。 シリコ 腫瘍モデルの生成と抗EGFR療法抵抗。ネットワーク赤（EGFR経路）における重要なシグナルノードを持つ腫瘍細胞のトポロジーと緑（C-MET）とその下流のノードのシミュレーション 6.。特徴的な腫瘍（サケ）読み出したパラメータの増殖と（紫で）アポトーシスは、六角形として表されます。矢印は活性化、鈍化矢印阻害を示しています。治療標的は、暗い部分と明るい灰色の長方形で表され、ゲフィチニブによる阻害は黄色（A）に示されています。電子機能（着色曲線）による力学シミュレーションは、ブールネットワーク接続を補間する（AND、OR、NOT）増殖の増加（サケ曲線）と広告で示すようにEGFR及びc-METの共発現は、ゲフィチニブ耐性を引き起こします約任意の時点8（B）の後にアポトーシス（紫色曲線）のecrease。 PI3KおよびMEK阻害剤による（黄色の曲線下、同じ活性化、プロトコルを参照のこと）の両方の潜在的な治療タックル。（C）は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、バイオマーカー誘導の治療の予測のためのシリコ腫瘍試験システムのin vitro /で組み合わせ確立しています。 in vitroモデルは、また、 シリコ 17 でシミュレートすることができ、特定の突然変異背景に、腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスの変化などの化合物のアクションの異なる重要な側面を評価します。ここでは、3D腫瘍モデルの生成および増殖およびアポトーシスの定量化とシリコモデルで予測の確立を含む化合物試験のための標準化されたプロトコルを提示します。 3D腫瘍モデルは、特定の変異を有する腫瘍細胞株に基づいています。細胞は、細胞冠における脱細胞化組織マトリックス上で増殖させます。行列の脱細胞化、二つの金属リング（セルクラウン）、バイオリアクターシステムの組み立てとの固定だけでなく、足場の播種は25前にJoveの中で可視化されています。
試験管内で 3D腫瘍モデル
クリニックにここで達成された結果の翻訳は、選択した標的薬のためのバイオマーカーに応じて患者を分類するために、関心の変異を保有する適切な腫瘍細胞の慎重な選択が必要です。成層医学のために、次世代シーケンシングによってドラッガブルドライバ変異の同定は、特にNSCLCにおける主要な関心事であり、うまくいけば、将来29に新たな遺伝子マーカーを明らかにします。 in vitro試験のために、目的の化合物は、選択された細胞株または初代細胞で高活性な部位を標的とすべきです。ここで、細胞株HCC827およびA549は、EGFR突然変異状態での違いによる選択され、過敏症（HCC827細胞）および2D培養30-32におけるTKIゲフィチニブ向かっ中間感度（A549細胞）を報告しました。 3D腫瘍モデル生成の第1段階では、細胞数と選択された腫瘍細胞の培養期間はadjuでなければならここでいう異なるセルが使用されている場合STED。最適な化合物の濃度を見つけるためには、2Dで市販の生存率アッセイの助けを借りて、IC50値を決定することをお勧めします。このテストに基づき、化合物は、IC50濃度と3Dモデルの次に高い濃度で使用する必要があります。私たちは、2〜3週間以内に、他方では、2D腫瘍試験システムに容易に比較の結果を得るために、一方では、治療の3日間を選択しました。しかし、治療期間は、長期・効果を調査するために延長することができます。それにもかかわらず、長期治療または試験化合物の高投与量は、それによって、増殖または他の免疫組織化学的マーカーの評価を防止する完全な細胞の損失を引き起こす可能性があることを考慮すべきです。
信頼性のあるシグナル伝達ネットワークの解析のために、特定の化合物で処理すると、腫瘍応答は、増殖およびアポ区別分析されなければなりません眼瞼下垂。これらのリードアウトは、異なるシグナル伝達ネットワークに接続されています。このように、両方のパラメータの特徴的な分析は、薬物作用およびその後のターゲット予測のより良い理解を可能にします。前に述べたように、腫瘍細胞の増殖を、2D培養条件と比較して、我々の3Dモデルに低減され、従って、試験された細胞増殖抑制化合物の偽陽性の結果を減少させるべきです。増殖指数の決意について、核の総数とKi67染色のための陽性の核の数は、例えばソフトウェアフィジーを用いて定量化されなければなりません。これは、これは、核のより低い又はより高い数値になるように細胞が密な凝集体を形成する場合、それぞれ、しかし、不可能である腫瘍細胞の二次元培養におけるマクロの使用によって簡略化することができます。全ての場合において、マクロ設定は、各細胞株および染色のために慎重に調整しなければなりません。アポトーシスはWH、カスパーゼ切断サイトケラチン18を測定する上清から非侵襲的に定量化することができますICHは、M30-ELISAを使用して、上皮の特徴を有する細胞に限定されています。これはいくつかの利点を有する：I）それは経時治療効果を監視し、効果的な治療の開始点を識別することができます。 II）試料は破壊されず、他の読み出し技術のために使用することができます。 III）上皮細胞のアポトーシスは、共培養の設定で最適な間葉アポトーシス、区別することができます。この技術は、しかしながら、それによってそれらの上皮表現型を失って、EMTを受けた腫瘍細胞には不適切かもしれません。この技術が適用される前にこのように、使用された各腫瘍細胞株のサイトケラチン18の発現は、免疫組織化学的染色によって確認されるべきです。化合物の試験は、より腫瘍幹細胞様の表現型で行うことができます。通常、薬物検査で異なる侵襲のステージは、TKIのよう標的薬のほとんどは、より高度な腫瘍の段階で適用されていても無視されます。我々のモデルは、侵襲的または全くの調査を可能に細胞が侵入プロセスの間に横断する必要が原因で保存基底膜17のn型浸潤性腫瘍細胞。細胞の運動性および浸潤性に向けた重要なステップは、TGF-β-1 17,33刺激により異なる肺癌モデルに誘導することができるEMTです。これは、しかし、増殖及び足場上ことにより細胞数を減少させます。この負の副作用が強く、3Dモデルにおける腫瘍細胞密度を増加させる動的な培養条件を適用することによって回避することができます。バイオリアクターは、生理学的条件に培養物を調整するにもかかわらず、それは、電池特性及びシグナリングが応力25をせん断への暴露によって影響され得ることを考慮しなければなりません。
スピードアップするために シリコ シミュレーション で 使用した 細胞株に特異的薬物検査
唯一の半 定量的ものの、イベントのシーケンスを適切にケアすることによりシリコモデルで私たちによってモデル化され、完全に各特定の細胞株について知られている変異を考慮。これは、異なる受容体活性化レベルの細胞株特異的修飾、キナーゼが活性化したときに、どのように長い間、このようなアポトーシスまたは増殖などのネットワーク出力が期待されるされている関与する度合いが含まれています。例えば、人は、取得した抗EGFR療法抵抗30の約20％に起こると考えられている臨床的に既知のc-MET増幅を考慮することができます。その後、 インシリコモデルは、時間をかけて対応するネットワークの挙動を計算例えば 、ゲフィチニブ耐性の発達増殖の増加によって表されるとアポトーシスを減少させました。我々のモデルでは、我々は、最も有望な標的候補としてMEK及びPI3Kが同定されました。したがって、新しい潜在的な治療の組み合わせは、急速に、さらにin vitro試験のための基礎として機能する、in silicoで事前に評価することができます。また、in vitro実験からの出力データは、缶最良の実験結果に適合するネットワークの調整によってインシリコシステムで洗練するために使用されます。 インシリコ戦略の半定量的には（100、タンパク質-タンパク質相互作用を考慮することができる程度）ネットワークサイズに関するいくつかの制限を有します。また、現実的な結果を得るために、ネットワークトポロジにすべての主要なタンパク質のノードを統合することが重要です。 インシリコのモデルは、このように生きている腫瘍細胞内の既存のネットワークの唯一の近似を与えます。しかし、この集束されたビューは、関心のある特定の変化、 例えば 、細胞株内の異なる突然変異背景に薬物の組合せの効果をシミュレートすることを可能にします。これは、私たちは系統的に新しい治療戦略を導出するだけでなく、癌のシグナル伝達ネットワークの複雑さを理解するのに役立ちます。
結論として、我々は簡単にprecliに統合することができた試験管ツールにおいて操作役立つ組織を開発したと確信しています単一の薬物化合物およびそれらの組み合わせの有効性に関するnicalテスト。テストではコストと時間を削減するために、この腫瘍モデルは、さらにインシリコ予測ツールでクリニック指向標的療法または考慮すべき新しいプレーヤーなどの薬物および薬物併用効果の細胞型特異的予測に収集したデータを拡張することを可能にすることによって補完され（ 例えば 、miRNAは）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この研究は学際臨床ヴュルツブルクの大学病院の研究（IZKF、グラントBD247）及び（平家Wallesに付与された）バイエルンフィットプログラムのためのセンターが主催しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | This software was used for drawing the network. |
| Citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. | |
| Citrate buffer working solution | in house production | 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal Calf Serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4% (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37 °C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | - | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5 ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
References
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
- Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
- Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Hartung, T.
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
- Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
- Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
- Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
- Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
- Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
- Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
- Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
- Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
- Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
- Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
- Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
- Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
- Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
- BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
- Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
- Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
- Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
- Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
- Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).
