Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En Kombinert 3D Tissue Konstruert Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53885
Automatic Translation
*1, *1, *3, 1, 1,4, 2, 3, 1,4, 1
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
* These authors contributed equally

Abstract

I denne studien har vi samlet en in vitro 3D lungetumoren modell med en in silico modell for å optimalisere spådommer om narkotika respons basert på en bestemt mutasjons bakgrunn. Modellen blir generert på en decellularized porcint stillas som gjengir vevsspesifikke egenskaper når det gjelder ekstracellulær matriks sammensetning og arkitektur, inkludert basalmembranen. Vi standardisert en protokoll som tillater kunstig svulstvev generasjon innen 14 dager inkludert tre dager med behandling. Vår artikkel gir flere detaljerte beskrivelser av 3D leses ut screeningteknikker som fastsettelse av spredning indeksen Ki67 flekker tallet, apoptose fra supernatanter av M30-ELISA og vurdering av epitelial til mesenchymale overgang (EMT), som er nyttige verktøy for å evaluere effekten av terapeutiske forbindelser. Vi kunne vise i forhold til 2D kultur en reduksjon av spredning i vår 3D-tumor modell som er related til den kliniske situasjonen. På tross av denne nedre spredning, forutsagt av modellen EGFR -targeted stoffresponser på riktig måte i henhold til biomarkør status som vist ved sammenligning av de lunge karsinom-cellelinjer HCC827 (EGFR -mutated, KRAS villtype) og A549 (EGFR villtype, KRAS - muterte) behandlet med tyrosin-kinase-inhibitor (TKI) gefitinib. For å undersøke narkotika reaksjoner fra mer avanserte kreftceller, vi indusert EMT ved langtidsbehandling med TGF-beta-1 som vurderes av vimentin / pan-cytokeratin immunfluorescens farging. En strømnings-reaktor ble anvendt for å justere kultur til fysiologiske betingelser, noe som forbedret vev generasjon. Videre viser vi integrering av narkotika respons på gefitinib behandling eller TGF-beta-en stimulering - apoptose, spredning indeks og EMT - inn i en boolsk i silico modell. I tillegg forklarer vi hvordan stoffet svarene av tumorceller med et spesifikt mutasjons bakgrunn og tellingerstrategies mot motstand kan forutsies. Vi er sikre på at vår 3D in vitro tilnærming spesielt med sin i silico utvidelsen gir en ekstra verdi for prekliniske narkotika testing i mer realistiske forhold enn i 2D cellekultur.

Introduction

Legemiddelindustrien står overfor høye frafallsrater på opp til 95% innen kreftbehandling i den kliniske fase forårsaker enorme kostnader 1-5. En årsak til dette underskuddet er det faktum at i dag effekten av eventuelle nye forbindelser vurderes i storskala screenings på 2D cellekulturer av kreft cellelinjer eller i dyremodeller. Dyremodeller har høyere kompleksitet, men det er viktige forskjeller mellom mus og menn 6,7. I det siste tiåret, har 3D-kreft modeller med ulike tilnærminger blitt generert for å bygge bro over gapet mellom 2D kultur av kreftcellelinjer og en kompleks in vivo tumor 6,8,9. Virkningen av 3D-miljø på celledifferensiering og også på signal har vært vist i flere studier år siden (f.eks. Ved Mina Bissell) 10,11. I dag er mange 3D cellekultur modeller er tilgjengelige for eksempel sfæroide kulturer, hydrogeler eller microfluidic chips 12-16. Selv om These modeller forbedre kompleksitet i forhold til konvensjonelle 2D kultur-systemer, de mangler det meste en vev mikromiljø som er kjent for å ha kreftbærende effekter, og også påvirker narkotika effekt.

For å løse dette problemet, vi generert en 3D-tumor modell basert på en biologisk stillas kalt SISmuc (små-tarm-submucosa + slimhinnen) som er avledet fra en decellularized svin jejunum. Derved blir det vevsarkitektur og viktige komponenter i ECM slik som forskjellige kollagener samt basalmembranen struktur bevares 17. Denne unike funksjonen er avgjørende for svulst modell generasjon av karsinomer som oppstår fra epitel og utgjør ca 80% av solide svulster. Videre er formeringshastigheten i vår vev-konstruert tumormodell redusert i forhold til den kunstig høye priser oppnådd i 2D kultur. Som spredning er en viktig parameter for å vurdere legemidlets effekt, er narkotika testing aktivert i vår modell i mer likforhold til in vivo svulster 17.

For å vurdere potensialet for vår modell for å forutsi biomarkør-avhengig legemidlets effekt på riktig måte, vi her angir data for to forskjellige lungecancer cellelinjer som skiller seg i sin EGFR -biomarker status. Denne mutasjonsstatus har begynt å bli bestemt rutinemessig i NSCLC pasienter. Målrettede behandlinger med TKI som EGFR -hemmer gefitinib mot svulster som bærer en aktiverende EGFR mutasjon viser overlegne resultater i forhold til de med platina-basert kjemoterapi 18-21.

Vi etablerte flere avlesnings teknikker som er relevante for vurdering av sammensatte effekt. Videre, etter TGF-beta-en stimulering vi er i stand til å undersøke sammensatte handlinger i kreftceller som startet EMT prosessen, som er tenkt å være et viktig skritt i ondartet transformasjon 22,23 og som er koblet til narkotika resistance 24.

3D-tumor modell tillater overvåking celle-spesifikke responser til målrettede behandlinger, kjemoterapi eller medikamentkombinasjoner med gode kontraster. For ytterligere å forbedre og øke hastigheten på narkotika-screening og for å møte motstand, er dette supplert med en in silico simulering. Basert på noen eksperimenter, kan tumorrespons bli spådd i silico om utfallet for et bredt spekter av legemidler og kombinasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. To-dimensjonale (2D) Cell Culture

  1. Kommersielt få tumorcellelinje HCC827 (DSMZ). Kultur lunge adenokarsinom-cellelinje HCC827 (EGFR muterte, KRAS villtype) i RPMI-1640 supplert med 20% FCS. Endre medium hver 2 - 3 dager. Splitte cellene to ganger i uken. Celler blir brukt til passasjen 20 er nådd.
  2. Kommersielt få tumorcellelinje A549 (DSMZ). Kultur lunge carcinoma-cellelinjen A549 (EGFR villtype, KRAS mutert) i RPMI-1640 supplert med 10% FCS. Utfør kulturen som nevnt ovenfor. Celler blir brukt til passasjen 20 er nådd.
  3. Test cellene regelmessig (hver 4 - 6 uker) for forurensninger som mycoplasma forurensninger.
  4. Dyrking A549 eller HCC827 celler på dekkglass
    1. Plassere en steril glass dekkglass i hver brønn i en 24-brønners plate ved anvendelse av en pinsett.
    2. Seed 50000 tumorceller av begge cellelinjer i et volum på 500 ul i brønnene medpå dekkglass, respektivt.
    3. Kultur av cellene inntil de når en sammenflytning på 70% i henhold til standard dyrkningsbetingelser (37 ° C; 5% CO2). I løpet av denne tiden, aspirer gamle medium med en Pasteur pipette og tilsett 500 mL ferskt medium hver 2 - 3 dager av kultur.

2. Generering av Tumor Test Systems på en biologisk Kollagen Stillas

  1. Statiske Kultur betingelser
    1. Generere decellularized små-tarm-submucosa + slimhinnen (SISmuc) og fest den mellom to metallringer, de såkalte celle kroner, som beskrevet i en tidligere publikasjon 25.
    2. Seed 100000 celler av enten HCC827 eller A549-celler i et totalvolum på 500 ul på siden av de tidligere lumen i tarmen fast i celle kroner.
    3. Tillat tumorceller å følge i 2 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Tilsett 1 ml medium inne i cellen krone og 1 ml utenfor.
    4. Culture tumorenmodellen under statiske betingelser ved 37 ° C, 5% CO2 i inkubatoren i 14 dager. Endre dyrkingsmedium hver 2 - 3 dager. Derfor aspireres mediet ved hjelp av en Pasteur-pipette og pipette 1 ml frisk RPMI med den passende mengde av FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) inne i cellen kronen og 1,5 ml av det samme medium utenfor.
  2. Dynamiske Kultur betingelser
    1. Sett opp svulsten testsystem med decellularized matrise inne i cellen kroner og celle seeding som beskrevet under punkt 2.1.1 til 2.1.3.
    2. Kultur tumormodellen under statiske betingelser 37 ° C, 5% CO2 i inkubatoren i 3 dager.
    3. Monter autoklaveres bioreaktor og sett seeded SISmuc som publisert tidligere 25.
    4. Pipetter 45 ml RPMI med den passende mengde av FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) i kolben, og koble den nål-fri prøveinnretningen til rørsystemet mellom bioreaktoren ogmedium kolbe.
    5. Plasser bioreaktor i kuvøse, koble den til pumpen og kultur svulsten modell for ytterligere 14 dager med en konstant mediestrømmen (3 ml / min) ved 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Endre hele dyrkningsmediet etter 7 dager. For det, flytter bioreaktor fra inkubatoren under en laminær hette. Aspireres mediet i media kolben ved hjelp av en Pasteur-pipette. Løft opp bioreaktor mens aspirere til å kvitte seg med mediet i rør system. Pipetter 45 ml friskt medium i kolben. Sett bioreaktor tilbake i inkubatoren og koble den til pumpen.

3. Behandling av statisk Tumor Model med Gefitinib

  1. Kultur svulsten modell som beskrevet i kapittel 2.1.
  2. På dag 11 av kultur, forberede RPMI / FCS med en mikrometer gefitinib (2,5 ml for hver celle krone). Aspirer gamle medium fra brønnene ved hjelp av en Pasteur pipette og tilsett 1 ml forberedt RPMI / FCS / gefitinib inne than celle krone og 1,5 ml av det samme medium utenfor.
    MERK: tint gefitinib stamløsningen kan lagres ved 4 ° C i en uke.
  3. Endre medium på dag 13 som beskrevet under punkt 3.2.

4. Stimulering av statisk tumormodell med TGF-beta-1 for induksjon EMT

  1. Kultur svulsten modell som beskrevet i kapittel 2.1.
  2. På dag tre av kultur, forberede RPMI / FCS med 2 ng / ml TGF-beta-en med carrier (2,5 ml for hver celle krone). Aspirer gamle mediet fra brønnene ved bruk av en Pasteur-pipette og tilsett 1 ml klare RPMI / FCS / TGF-beta-1 inne i cellen kronen og 1,5 ml av det samme medium utenfor. Endres medium supplert med TGF-beta-1 hver 2 - 3 dager inntil dag 14, som beskrevet under 4.2.

5. Les-outs

  1. Tar prøver for ELISA-målinger
    1. Ta prøver fra supernatantene av statisk (avsnitt 2.1) og dynamisk (punkt 2.2) kultur underbehandling med gefitinib (§ 3) på dager 11-14 av kultur som vist i figur 2. I tillegg ta en prøve før behandling (T0).
    2. Under statiske betingelser kultur, ta 100 ul prøver fra innsiden av cellen kronen. Under dynamiske dyrkningsbetingelser, skruen sprøyten på prøvetakeren og ta 1 ml medium ut av bioreaktoren systemet. Lagre alle oppsamlede supernatanter ved -80 ° C inntil ELISA er utført.
  2. M30-ELISA for apoptose Kvantifisering
    1. For å kvantifisere apoptose i supernatantene utføre celledød assay i henhold til produsentens instruksjoner. La alle reagenser nå romtemperatur før du utfører analysen.
    2. Vortex alle reagenser. Oppløs i vaskebrettet i 500 ml friskt deionisert vann. Fortynn HRP Conjugate med 9,2 ml av konjugert fortynningsbuffer og bland. Pipetter 25 ul av standard eller prøve per brønn.
    3. Legg 75 mL av den fortynnede HRP Conjugate løsning per brønn. Dekk platen og inkuber det på en ryster i 4 timer ved RT. Vask platen manuelt, 5 ganger med 250 ul forberedt vaskeløsning.
    4. Tilsett 200 ul av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) substrat til hver brønn. Inkuberes i mørke ved RT i 20 min. Tilsett 50 mL av stoppløsning til hver brønn. Rist mikro i 10 sek og la mikro i 5 min før lesing av absorbansen. Bestem absorbansen ved 450 nm i en mikroplateleser. Beregn standardkurve og konsentrasjonene i prøvene ved hjelp av et egnet program for håndtering av ELISA typedata slik som Origin.
  3. Eksempel Farging
    1. Fikse, Parafin-embedding og § Utarbeidelse av 3D-modell
      1. Fest seeded SISmuc med 2,5 ml 4% paraformaldehyde (PFA) per celle krone for 2 timer og legge det inn i parafin
      2. Forbered 3 mikrometer vevssnitt for flekker som er publisert tidligere25.
    2. Reparasjon av celler dyrket i 2D kultur betingelser
      1. Ved 70% konfluens er nådd, vask celler dyrket på dekkglass i 24-brønns plate en gang med PBS og feste dem med 500 ul 4% PFA / brønn i 10 min.
      2. Fjern PFA og lagre dekkglass i brønnen-plate dekket med PBS ved 4 ° C inntil fargingen er utført.
    3. H & E Farging
      1. Flekk rehydrated seksjoner med Hematoxylin / eosin som en oversikt flekker i henhold til standard protokoller.
    4. Immunofluorescent Farging av 3D-modell
      1. For immunfluorescens farging, utføre et antigen gjenfinning ved å plassere deparaffinized og rehydrated lysbilder i en dampkoker med forvarmet citratbuffer (pH 6,0) i 20 min.
        MERK: Se oversikt over materiell og utstyr er for tilbereding av citratbuffer.
      2. Overfør lysbildenetil vaskebuffer (0,5 M PBS buffer + 0,5% Tween), for å sirkel seksjoner med en PAP penn minimal nødvendig volum for flekker løsninger og legg lysbildene i fuktkammeret.
      3. Blokk vevssnitt med 5% serum fra verts arter av de sekundære antistoffer som brukes i avsnittet 5.3.4.6 i 20 minutter ved RT.
      4. Fjern blokkering serum ved å banke lysbilder til et papirlommetørkle og bruke den primære antistoff til omkranset seksjoner i en fortynning i henhold til produsentens instruksjoner (kanin anti Ki67 1: 100, kanin anti vimentin 1: 100, mus anti pan-cytokeratin 1 : 100). Inkuber O / N ved 4 ° C. For dobbelt-farging, må primære antistoffer fra forskjellige vertsarter anvendes.
      5. Vask forsiktig av ubundet antistoff med vaskebuffer tre ganger i 5 min.
      6. For påvisning av spesifikke antigen-antistoff-bindinger, gjelder sekundære antistoffer i fortynningen 1: 400 til seksjonene og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
      7. Vask av almound antistoff med vaskebuffer tre ganger i 5 min.
      8. Monter skinnene med en vandig medium som inneholder DAPI til counterstain kjerner og la dem tørke O / N.
    5. Immunofluorescent Farging av 2D dyrkede celler
      1. Fjern PBS og dekke seeded glass dekkglass med 0,2% Triton-X100 i PBS i 5 min for permeabilization. Vask glass dekkglass med vaskebuffer (0,5 M PBS + 0,5% Tween) i 5 minutter.
      2. Utfør trinn 5.3.4.3 til 5.3.4.7. Utføre alle trinnene i brønnen-plate på en gyngende plattform og fjerne reagenser ved å snu platen.
      3. For montering, spot en dråpe vandig medium som inneholder DAPI å counterstain kjerner på en ubestrøket glass lysbilde og overføre dekkglass til den med cellene vender monteringsmedium med tang. La det tørke før bildebehandling.
  4. Fastsettelse av Proliferation Index
    1. Utfør immunofluorescentbeising mot Ki67 i henhold til kapittel 5.3.4. eller 5,3 5.
    2. Ta fluorescerende bilder av vevssnitt eller 2D dyrkede celler med en invertert mikroskop. Bruk forskjellige filtre for å ta bilder av DAPI stainings og av Ki67 stainings. For kvantifiseringen ved å bruke 10 bilder av 3D-seksjoner eller 5 bilder av 2D-kulturer (forstørrelse 20X) av hver tilstand fra ikke-overlappende deler av prøven.
    3. Bestem antall kjerner og antall kjerner positivt for Ki67 i 2D
      1. Count Ki67 positive kjerner manuelt ved hjelp av plugin celleteller av programvaren Fiji 26. Derfor åpne bildet og klikk "Plugins" → "Analyze" → "celleteller". Trykk "Initial" og velg en teller type. Klikk på hver Ki67 positive kjerne. Antall klikk vises ved siden av den valgte disken type.
      2. For automatisk celle telling av det totale antall kjerner skape en makro ved hjelp Fiji 27,28. adjust makroen for enhver farging og cellelinje. Følgende, se et eksempel hvordan du oppretter en makro.
        1. Begynn makro opptaker. Åpne et DAPI-bilde og konvertere den til 8 bits format ved å klikke på "Image" → "Type" → "8-bit". Klikk på «Forbedre kontrast", sett "mettet" som "1" og "normalisere".
        2. Sett "unsharp mask" å gjøre bildet skarpere. Bruke en "radius" av "1" og en "maske" av "0,60". Klikk "auto terskel", velge metode "RenyiEntropy" med "hvite gjenstander på svart bakgrunn 'til binarise bildet.
        3. Klikk på "Plugins" → "BioVoxxel" → "vannskille uregelmessige funksjoner" med en erosjon radius av "5" for å skille cellene. Klikk på "Analyze" → "Analyze Particles" og sett «størrelse» til «0.02-Infinity".
          MERK: Antallet partikler / celler ervist i sammendragstabellen som teller.
        4. Klikk på "Create" for å lagre makroen for analyse av ytterligere bilder.
    4. Bestem antall kjerner og antall kjerner positive for Ki67 i 3D manuelt som beskrevet i punkt 5.4.3.1.
    5. Beregn middelverdien spredningsindeksen (PI) i henhold til følgende formel:
      Equation1
      n = antall bilder (3D: 10, 2D: 5)

6. I Silico Tumor Model Generation og simulering av Anti EGFR terapi i HCC827 Cells

  1. Network Generation bruker et nettverk Analysis Software
    1. Bruke forskjellige kjente databaser for å generere tumoren nett basert på de viktige eksperimentelle avlesnings parametere og mutasjons bakgrunn av den HCC827 cellelinje.
    2. Åpne nettverk analyse programvare 21 for å visualiserenettverk.
      1. Klikk på "File" → "New" → typen 'JoVE_tumor modeller "→ klikk" OK "for å generere et nytt nettverk. Klikk "Square Closeup Nord" → "OK" for å visualisere reseptoren i en dobbel membran. Klikk "Generic Protein" for å visualisere noder (= proteiner) som rektangler → type 'EGFR' → klikk "OK"; gjenta dette for hver node i nettverket.
      2. Merk nodene i nettverket: Høyreklikk → "Change Farge & Shape ..." → velg for noder EGFR og (EGF-EGFR) fargekode "255,0,0" (farge rød); etter noder c-MET og (c-MET) fargekode "0,255,0" (farge grønn); for gefitinib fargekode "255,255,0" (farge gul); for PI3K-Inh fargekode "204204204" (lys grå); for MEK-Inh fargekode "102102102" (farge mørk grå); for alle andre noder i nettverket ved å velge fargekoden4, 255255255 "(hvit).
      3. Klikk "Phenotype" for å visualisere avlesnings parametre som sekskanter → type 'spredning' → klikk "OK" → Høyreklikk → "Change Farge & Shape ..." → velg fargekode "255204204" (farge laks); gjenta dette for parameter apoptose → velg fargekode "255,51,204" (farge fiolett).
      4. Visualiser Edges (= interaksjoner): Klikk på "State Transition" for aktiveringer (piler), Klikk "Hemming" for hemninger (blunted piler); gjenta dette for hver samhandling i nettverket.
    3. Klikk på "File" → "Lagre som ..." → skriv 'JoVE_tumor models.xml' → klikk "Lagre" for å lagre den genererte signale nettverket som XML-format.
  2. I Silico Simulering hjelp SQUAD
    MERK: SQUAD representerer the nettverkstopologi som en diskret logisk boolsk system (AND, OR, NOT) og utfører en stabil tilstand analyse. Steady state analyse reflekterer systemet likevekt og ansvar på signal stimuli (f.eks., Narkotika søknad eller mutasjon).
    1. Åpne SQUAD 17 programvaren, klikk på "Load Network" → upload 'JoVE_tumor models.xml' fil. Klikk "Run analyse":
      MERK: Deretter gjelder SQUAD eksponentiell funksjon for å interpolere boolsk nettverkstilkobling, som gjør dynamisk simulering av nettverket atferd over tid (fargede sigmoid virkningskurver).
    2. Klikk på "Advanced" → "Perturbator" for å skrive en simulering protokoll. Simulere anti- EGFR motstand: Klikk "Edit Protocol"
      1. Klikk "forstyrrelse" → bruke standard "initialstate = SS-4" (steady state 4) → Klikk "Legg til" for å legge til "nye Constant Pulse '→ Sepå Velg parameter "stat" → Velg target "Flip" → Velg tid "0" → Velg en verdi for "0,4" → Klikk "OK".
      2. Gjenta dette: Klikk på "Legg til" → Velg parameter "stat" → Velg target "c-MET" → Velg tid "0" → Velg en verdi for "0,4" → Klikk "OK"; Klikk "Legg til" → Velg parameter "stat" → Velg target "gefitinib" → Velg tid "0" → Velg verdien "1" → Klikk "OK".
      3. Sett en tilstandsverdi til aktiv node (EGF-EGFR): Klikk på "activenode" → Klikk "Edit" → Velg state "0,8" → Klikk "OK"; for alle andre noder: Klikk "Edit" → Velg tilstand "0" → Klikk "OK". Klikk "OK" for å lagre protokollen.
      4. Vis spesifikke kurver: Gå til panel "Options" → Velg "(EGF-EGFR)", "(EGF-EGFR)", "* MEK", "caspases", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptose", "spredning", "MEK-Inh" og "PI3K-Inh" for grafisk representasjon. Klikk "Initialize" → "Kjør" for å starte en fullstendig simulering av systemets respons. Klikk på "Reset" for å starte en ny simulering.
    3. Simulere kombinert PI3K og MEK hemmer behandling: Klikk "Edit Protocol"
      1. Bruk samme node parameter som beskrevet under 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Klikk "forstyrrelse" → Klikk "Legg til" for å legge til "nye Constant Pulse '→ Velg parameter" stat "→ Velg target" PI3K-Inh "→ Velg tid" 0 "→ Velg verdien" 1 "→ Klikk" OK "; Klikk "Legg til"for å legge til "nye Constant Pulse '→ Velg parameter" stat "→ Velg target" MEK-Inh "→ Velg tid" 0 "→ Velg verdien" 1 "→ Klikk" OK ".
      2. Klikk "OK" for å lagre protokollen. Gå til panel "Options": Bruk samme nodene for grafisk representasjon som beskrevet under 6.2.2.4. Klikk "Initialize" → "Kjør" for å starte en fullstendig simulering av systemets respons. Klikk "Reset" for å avslutte simuleringen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grunnlag av den SISmuc stillaset (figur 2A-C), etablert vi en standardisert operasjonsprotokoll for generering, stimulering og behandling av en 3D-tumor testsystem (figur 2D). Denne modellen gjør det mulig å bestemme spredning indeksen og kvantifisering av apoptose ved hjelp av M30-ELISA som vist i figur 1 og figur 3, henholdsvis. Figur 3 viser representative H & E farging av A549 og HCC827 modeller og en representant apoptose måling med gefitinib. Den her presenteres modellen er designet med eksempel på EGFR -mutated NSCLC som er vellykket behandlet med målrettede hemmere i klinikken. På tilsvarende måte, bare den EGFR -mutated HCC827 celler og ikke de A549 celler reagerer på EGFR TKI inhibering av gefitinib i vår modell som evaluert ved økning av apoptose. Figur 4 figur 5C og D. Også under dynamiske kulturbetingelser gefitinib har en sterk effekt på EGFR -mutated HCC827 (figur 5D).

Figur 6 viser nettverkstopologi (figur 6A), og detaljert i silikoaluminofosfater simuleringer av anti- EGFR-terapi motstand i HCC827 celler (figur 6B, C). Den signaleringsnett ble generert ved å bruke kjente litteratur databaser som HPRD, KEGG og QIAGEN (Genes & Pathways), noe som resulterer i en topologi av 42 noder og kanter 55, visualisert med CellDesigner programvare 26. Simulering av kjent driver mutasjon EGFR (i rødt) og c-MET co-aktivering (i grønt, verdi rundt 0,7) viser en økt Proliferation rate (laks kurve) og en redusert apoptose rate (fiolett kurve) over tid reflekterer gefitinib (i gult) motstand i HCC827 celler går sammen med en aktivering av MEK og PI3K (figur 6B, mørk grønn og cyan). Modellering av kombinert PI3K og MEK-inhibitor (mørk og lys grå kurver) resulterer i en reversering av den anti- EGFR motstand effekt, reduserer proliferasjonen og induserer apoptose (figur 6C).

Figur 1
Figur 1. Spredning prisen er redusert i 3D Sammenlignet med 2D Cell Culture. Ki67-positive HCC827 celler (rød i A og B) ble farget i 2D cellekultur (A) og 3D cellekultur på SISmuc (B). HCC827 celler og A549-celler ble tellet og spredning indeksen (prosentandel av Ki67-positive celler) ble bestemt (C </ Strong>, en representant teller ut av fem). Skala barer i A og B:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. SISmuc Stillas Morfologi og behandlingsplanen med den TKI Gefitinib Cellene blir sådd på SISmuc som består av tynntarmen submucosa (SIS) + mucosa (A:. Lysfelt, B: DAPI farget celler på toppen av SISmuc, C: overlay av A og B) og er fast i celle kroner på dag 0. behandlingsregime som vist i D: medium endringer (MC) utføres hver 2 til 3 dager. På dag 11 behandlingen starter. Supernatanter ble oppsamlet og anvendt for M30-ELISA for å kvantifisere apoptose over tid (blå piler og bokser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Gefitinib Behandling Endringer cellevekst på SISmuc og induserer apoptose i HCC827, men ikke i A549 3D tumormodeller. Uten behandling, begge cellelinjene danner et monolag på SISmuc (A og B) og også avgjøre tidligere krypten strukturer. Mens vekstmønster av A549 celler ikke blir endret etter behandling med gefitinib (C), blir antall celler HCC827 redusert ledsaget av en endring til en langstrakt celleform (D). Apoptose induseres ved gefitinib i HCC827 modeller som sett av M30-ELISA-målinger fra kultursupernatanter (E D:. 100 mikrometer for A til D Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. TGF-beta-1 induserer EMT i HCC827 Cells på SISmuc. HCC827 celler dyrket i 3D viser samlet uttrykk for pan-cytokeratin (PCK) (grønn i A, A1), men bare enkeltceller uttrykker vimentin (rød i A, a2). Etter TGF-beta-1 stimulering ble celler endre sin morfologi til en langstrakt form og ekspresjon av vimentin sterkt øket (rød i B, b2), mens ekspresjonen av PCK er opprettholdt (grønn i b, b1). Scale bar i B: 100 mikrometer for A B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Dynamisk Cell Culture Forbedrer Tissue Generation. Når dyrket under 3D-forhold i en bioreaktor (B), den monolaget fra den statiske modellen (A, H & E-farging) endres fra et monolag (A) til en flerlags vev (C, H & E farging ). HCC827 celler viser en sterk narkotika respons på gefitinib behandling (D, H & E flekker). Scale bar i D:. 100 mikrometer for A, C og D Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Fig. 6. I Silico Tumor Model Generation og simulering av Anti-EGFR terapi Resistance. Nettverkstopologien av en svulst celle med viktige signal noder i rødt (EGFR sti) og grønn (c-MET) og deres nedstrøms noder. Den karakteristiske svulst lese ut parametre spredning (i laks) og apoptose (fiolett) er representert som sekskant. Piler indikerer aktivering, avstumpet piler hemming. Terapeutiske mål er representert ved mørke og lyse grå rektangler, er hemmingen av gefitinib er vist i gult (A). Dynamisk simulering av e-funksjoner (fargede kurver) interpolere boolsk nettverkstilkobling (AND, OR, NOT). EGFR og c-MET co-uttrykk fører gefitinib motstand som indikert ved en økning av spredning (laks kurve) og annonseecrease av apoptose (fiolett kurve) etter ca vilkårlig tidspunkt 8 (B). Potensielle terapi taklinger både PI3K og MEK av hemmere (under gul kurve, samme aktivering, se protokoll). (C) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har etablert en kombinert in vitro / in silico svulst testsystem for biomarkør styrt behandling spådommer. Den in vitro modell evaluerer forskjellige viktige aspekter ved sammensatte handlinger, for eksempel endringer i tumorcelle-proliferasjon og apoptose på en spesifikk mutasjons bakgrunn som også kan simuleres i silico 17. Her presenterer vi den standardiserte protokollen for 3D-tumor modell generasjon og sammensatte testing inkludert kvantifisering av spredning og apoptose og etablering av en prediktiv i silico modell. 3D-tumor-modellen er basert på tumorcellelinjer som bærer spesifikke mutasjoner. Celler blir dyrket på en decellularized vev matrise i celle kroner. Matrix decellularization, fiksering mellom de to metallringer (celle kroner), montering av bioreaktor system samt seeding av stillaset er visualisert i Jove før 25.

in vitro 3D Tumor Model
Oversettelsen av de her oppnådde resultater i klinikken krever en nøye utvelgelse av egnede tumorceller som bærer mutasjoner av interesse for å klassifisere pasienter i henhold til biomarkører for utvalgte målrettede medikamenter. For stratifisert medisin, er identifisering av druggable driver mutasjoner av neste generasjons sekvense et stort problem, spesielt i NSCLC og vil forhåpentligvis avdekke nye genetiske markører i fremtiden 29. For in vitro testing, bør forbindelsen av interesse rettet mot et område som er svært aktive i det valgte cellelinje eller i primærceller. Her ble den cellelinjer HCC827 og A549 valgt på grunn av deres forskjell i EGFR mutasjonstatus og rapporterte hypersensitivitet (HCC827 celler) og mellomprodukt følsomhet (A549-celler) mot TKI gefitinib i 2D kultur 30-32. I det første trinn av 3D-tumormodell generasjon, celletall og dyrkningsperiode av den valgte tumorceller må juSTED hvis celler forskjellig fra her er nevnt er brukt. For å finne den optimale konsentrasjon av forbindelsen, er det tilrådelig å bestemme IC50-verdien ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig levedyktighet analyse i 2D. Basert på denne test, bør forbindelsen anvendes i IC50-konsentrasjonen og den neste høyere konsentrasjon i 3D-modeller. Vi har valgt tre dagers behandling på den ene side for å få resultater innen to til tre uker, og for enkel sammenlignet med 2D-tumor testsystemer på den annen side. Imidlertid kan behandlingsperioder bli forlenget til å undersøke langvarige effekter. Ikke desto mindre bør det tas i betraktning at langvarig behandling eller høy dosering av testforbindelsen kan føre til fullstendig celle tap for derved å hindre en evaluering av spredning eller andre immunhistokjemi markører.

For pålitelig signaleringsnettverksanalyse, tumorresponser ved behandling med en viss forbindelse må analyseres skille mellom spredning og apoptose. Disse avlesinger er ulikt koplet i signaleringsnettet. Således karakteristiske analyse av begge parametere muliggjør en bedre forståelse av legemiddelvirkning og påfølgende mål prediksjon. Som nevnt før, er spredning av tumorceller redusert i vårt 3D-modellen sammenliknet med 2D-dyrkningsforhold og derfor bør redusere falske positive resultater av testede cytostatiske forbindelser. For bestemmelse av indeksen spredning, det totale antall kjerner og antall kjerner som var positive for Ki67-merking må kvantifiseres ved hjelp av programvaren Fiji f.eks. Dette kan forenkles ved bruk av makroer i 2D kulturer av tumorceller som er imidlertid ikke mulig hvis cellene danner tette aggregater, da dette resulterer i lavere eller høyere antall kjerner, respektivt. I alle tilfeller, de makro innstillinger må justeres omhyggelig for hver cellelinje og farging. Apoptose kan kvantifiseres ikke-invasiv fra supernatantene måling caspase-kløyvde cytokeratin 18, which er begrenset til celler med epithelial egenskaper, ved hjelp av M30-ELISA. Dette har flere fordeler: I) Den gjør det mulig å overvåke behandlingseffekt over tid, og for å identifisere startpunktet for effektiv behandling. II) Prøver blir ikke ødelagt, og kan brukes til andre avlesningsmetoder. III) epithelial cell apoptosis kan skilles fra mesenchymale apoptose, som er optimalt i ko-kultur innstillinger. Denne teknikken, men kan være upassende for tumorceller som gjennomgikk EMT, og derved miste sin epithelial fenotype. Således bør ekspresjon av cytokeratin 18 av hver tumor cellelinje som brukes verifiseres ved immunhistokjemiske stainings før denne teknikken er brukt. Testing av forbindelser kan også utføres på en mer tumor stamcelle-lignende fenotype. Vanligvis i dopingprøver ulike invasive stadier er neglisjert, selv om de fleste av de målrettede legemidler, slik som TKI, er brukt i mer avanserte kreft stadier. Vår modell gjør at etterforskningen av invasiv eller ingenn-invasiv tumorceller, på grunn av den konserverte basalmembranen 17 som cellene har til å krysse under invasjon prosessen. Et viktig skritt mot cellemotilitet og invasivitet er EMT som kan bli indusert i forskjellige lungekreft modeller ved stimulering med TGF-beta-1 17,33. Dette er imidlertid reduserer spredning og derved celletallet på stillaset. Denne negative bivirkning kan omgås ved anvendelse av dynamiske dyrkningsforhold som kraftig øker tumorcelletetthet i 3D-modeller. Selv om bioreaktoren justerer kultur til fysiologiske betingelser, må det tas i betraktning at celleegenskaper og signalering kan påvirkes ved eksponering mot skjærspenninger 25.

Bruke I Silico Simuleringer å få fart opp Cell-line-spesifikke Drug Testing
Selv om bare halv kvantitative, er hendelsesforløpet korrekt modellert etter vår i silico modell av omsorgfullt ut med tanke på mutasjonene som er kjent for hvert enkelt cellelinje. Dette inkluderer cellelinje spesifikke modifikasjoner av de forskjellige reseptor aktiveringsnivåer, i hvilken grad involvert kinaser aktiveres og når og hvor lenge nettverk output som apoptose eller proliferasjon er å forvente. For eksempel kan en vurdere klinisk kjente c-MET amplifikasjoner som antas å forekomme i omtrent 20% av ervervet anti- EGFR-terapi motstand 30. Deretter beregner i silico modell tilsvarende nettverk atferd over tid, f.eks., Gefitinib resistensutvikling representert ved økt spredning og redusert apoptose. I vår modell har vi identifisert MEK og PI3K som de mest lovende målet kandidater. Derfor ny potensiell terapeutisk kombinasjonen kan raskt forhånds evaluert i silico, som fungerer som et grunnlag for videre in vitro testing. I tillegg er utgangsdata fra in vitro eksperimenter kanbrukes til å avgrense den i silico systemet ved nettverks justeringer som passer de eksperimentelle resultatene beste. Semi-kvantitativ i silikoaluminofosfater strategier har noen begrensninger når det gjelder nettverk størrelse (rundt 100 protein-protein interaksjoner kan bli vurdert). Videre er det avgjørende å integrere alle viktige protein noder inn i nettverkstopologi for å gi realistiske resultater. Den in silico modellen gir dermed bare en tilnærming av eksisterende nett i levende kreftceller. Men gjør dette fokusert syn oss å simulere konkrete endringer av interesse, f.eks., Effekten av medikamentkombinasjoner på ulike mutasjons bakgrunn i cellen nett. Dette hjelper oss til å systematisk forstå kompleksiteten i slike kreft signalnettverk samt å utlede nye terapeutiske strategier.

I konklusjonen, er vi overbevist om at vi har utviklet et nyttig vev konstruert in vitro verktøy som lett kan integreres i precliisk testing på effekt av enkelt narkotika forbindelser og deres kombinasjoner. For å redusere kostnader og tid i testing, er denne svulsten modellen videre suppleres av en in silico prediksjon verktøyet tillater å utvide de innsamlede dataene til en celle-type spesifikke prediksjon av narkotika og narkotika kombinasjon effekter inkludert klinikken orientert målrettet behandling eller nye aktører å vurdere (f.eks., miRNAs).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble sponset av Senter for tverrfaglig klinisk forskning (IZKF, tilskudd BD247) ved Universitetssykehuset i Wuerzburg og Bayern Fit-programmet (gitt til Heike Walles).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Tags

Bioteknologi Tissue Engineering 3D tumormodell boolsk lungekreft biologisk stillas strømnings bioreactor proliferasjon indeks gefitinib apoptose TGF-beta-1 EMT
En Kombinert 3D Tissue Konstruert<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; I Silico</em&gt; Lung Tumor modell for å forutsi Drug Effective i Spesifikke mutasjons bakgrunner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Göttlich, C., Müller, L.… More

Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter