Abstract
본 연구는 특정 돌연변이 배경에 기초하여 약물 반응을 예측 최적화 실리 모델에서와 체외 3D 폐 종양 모델을 조합. 모델은 기저막을 포함한 세포 외 매트릭스 성분과 구조에 관한 조직 - 특이 적 특징을 재현 decellularized 돼지 지지체 상에 생성된다. 우리는 약물 치료 사흘 포함한 14 일 이내에 인공 종양 조직의 생성을 가능하게하는 프로토콜을 표준화. 우리의 기사는 3D의 몇 가지 자세한 설명은 판독 검사 기술의 효과를 평가하기위한 유용한 도구입니다 중간 엽 전이에 M30-ELISA에 의해 상층 액에서 확산 지수 사료된다 염색의, 세포 사멸의 결정 및 상피의 평가 (EMT)처럼 제공 치료 화합물. 우리는 2D 문화에 relat 우리의 3D 종양 모델에서 증식의 감소를 비교 보여줄 수임상 상황에 에드. 이 낮은 확산에도 불구하고, 모델 HCC827 폐 암종 세포주의 비교에 의해 도시 된 바와 같이 정확하게 바이오 마커의 상태에 따른 EGFR -targeted 약물 반응을 예측 (EGFR은 -mutated, KRAS 야생형)와 A549 (EGFR 야생형, KRAS - 티로신 키나제 억제제 (TKI) 피티 니브로 처리) 돌연변이. 멘틴 / 팬 사이토 케라틴 면역 형광 염색에 의해 평가 같은 고급 종양 세포의 약물 반응을 조사하기 위해, 우리는 TGF 베타 1 장기 치료에 의해 유도 EMT. 유동식 생물 반응기는 조직 생성을 향상 생리적 조건으로 배양을 조정하기 위해 사용되었다. 세포 사멸, 증식 지수 EMT - - 부울로 실리 모델 더욱이, 우리는 피티 니브 처리 또는 TGF 베타 1 자극시 약물 반응의 통합을 도시한다. 또한, 우리는 특정 돌연변이 배경 및 카운트를 갖는 종양 세포의 약물 반응 방법을 설명저항에 대한 erstrategies는 예측 될 수있다. 우리는 특히에 실리 확장과 체외 접근 방식에서 우리의 3D는 2 차원 세포 배양에서보다 더 현실적인 조건에서 임상 약물 테스트에 대한 부가 가치를 제공한다는 확신합니다.
Introduction
제약 산업은 막대한 비용 1-5 일으키는 임상 단계에서 암 치료의 분야에서 95 %까지의 높은 마모 속도를 향하게된다. 이 결핍 한 가지 이유는 현재 잠재적 인 새로운 화합물의 효능은 암 세포주의 2D 세포 배양 또는 동물 모델에서의 대규모 스크리닝에서 평가 된 사실이다. 동물 모델은 더 복잡하지만,이 마우스 및 인간 -6,7- 간의 중요한 차이가있다. 지난 10 년간, 다른 접근법을 사용하여 3 차원 암 모델 차원 암 세포주의 배양 및 생체 내의 종양 6,8,9 복잡한 간의 격차를 생성 하였다. 세포 분화에 또한 시그널링 3D 환경의 영향 년전 여러 연구에 도시되어있다 (예., 미나 BISSELL 의해) 10,11. 오늘날, 많은 3D 세포 배양 모델은 회전 타원체 문화, 하이드로 겔 또는 미세 유체 칩 12-16로 사용할 수 있습니다. 심지어 살전하지만전자 모델들은 주로 또한 종양지지 효과 및 영향 약효가 공지 된 미세 조직이없는 종래의 2 차원 배양 시스템에 비해 복잡도를 향상시킨다.
이 문제를 해결하기 위해, 우리는 decellularized 돼지의 소장에서 유래 SISmuc (소 소장 - 점막하 + 점막)라고하는 생물학적 골격에 기초하여 3D 종양 모델을 생성. 따라서, 조직 구조와 같은 다른 콜라겐과 기저막의 구조와 ECM의 중요한 구성 요소 (17)를 유지한다. 이러한 독특한 특징은 상피에서 발생하고 고형 종양의 약 80 %를 포함하는 암의 종양 모델 생성을 위해 중요하다. 또한, 우리의 조직 공학 종양 모델의 확산 속도는 2D 문화에 달성 인위적으로 높은 가격에 비해 감소된다. 확산은 약물 효능을 평가하는 중요한 매개 변수이기 때문에, 약물 검사는 더 비슷한 우리의 모델에서 사용 가능생체에 대한 조건은 17 종양이.
정확하게 자신의 EGFR -biomarker 상태 상이한 두 가지 폐암 세포주를 들어, 여기에서 본 데이터 바이오 마커 약물 의존적 효능을 예측하는 우리의 모델의 가능성을 평가하기 위해. 이 돌연변이 상태는 비소 세포 폐암 환자에서 일상적으로 결정하기 시작했다. 백금 기반 화학 요법 18-21 가진 사람에 비해 활성화 EGFR 돌연변이 쇼 우수한 결과를 베어링 종양에 대한 EGFR -inhibitor 피티 니브로 TKIs와 표적 치료.
우리는 화합물의 효능을 평가하기위한 관련이있는 여러 판독 기술을 설립했다. 또한, TGF 베타 1 자극 이후 우리는 악성 변형 22,23 중요한 단계로 생각되고 약물 resistan 접속되어되는 EMT 프로세스를 시작 암세포 복합 작업을 조사 할 수있다가전 24.
3 차원 종양 모델을 대상으로 치료, 화학 요법, 또는 좋은 대조와 약물의 조합에 세포 특이 반응을 모니터링 할 수 있습니다. 더욱 강화하고 약물 검사의 속도와 저항을 발생하기 위해이가 실리 시뮬레이션에 의해 보완됩니다. 몇몇 실험에 기초하여, 종양 반응 약물 그들의 조합의 전체 범위에 대한 결과에 대하여 인 실리코 예측 될 수있다.
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Protocol
1. 2 차원 세포 배양
- 상업적으로 종양 세포 라인 HCC827 (DSMZ)을 얻었다. 문화 RPMI-1640 폐 선암 세포주 HCC827 (돌연변이 EGFR, KRAS 야생형)을 20 % FCS로 보충. 삼일 - 매 2 중간 변경합니다. 일주일에 두 번 세포를 분할합니다. 통로 (20)에 도달 할 때까지 세포를 사용한다.
- 상업적 종양 세포주 A549 (DSMZ)을 얻었다. 문화 폐 암종 세포주 A549 (EGFR 야생형은 KRAS 변이) RPMI-1640에 10 % FCS로 보충. 전술 한 바와 같이 문화를 수행합니다. 통로 (20)에 도달 할 때까지 세포를 사용한다.
- (- 육주 모든 4) 마이코 플라즈마 오염 등 오염에 대한 정기적 세포를 테스트합니다.
- 커버 글라스에 A549 또는 HCC827 세포를 배양
- 트위터를 사용하여 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 멸균 유리 커버 슬립을 놓습니다.
- 웰을 500 ㎕의 부피로 두 세포주 시드 50,000 암세포유리 커버 슬립 각각.
- 배양 세포는 표준 배양 조건에서 70 % 컨 플루 언시에 도달 할 때까지 (37 ℃, 5 % CO 2). 이 기간 동안, 파스퇴르 피펫을 사용하여 기존의 매체를 대기음 모든 2 500 μL에게 신선한 매체를 추가 - 문화 3 일.
생물학적 콜라겐 비계에 종양 테스트 시스템의 2 세대
- 정적 문화 조건
- decellularized 작은 창자 - 점막하 + 점막 (SISmuc)를 생성하고 이전 출판 (25)에 기술 된 바와 같이, 두 개의 금속 반지, 소위 셀 크라운 사이에 고정합니다.
- 세포 크라운에 고정 장내의 전 루멘의 측면 상에 500 μL의 총 부피에 HCC827 또는 A549 세포 중 하나의 씨앗 100,000 세포.
- 종양 세포는 37 ° C, 5 % CO 2에서 2 시간 동안 부착 할 수있다. 셀 왕관 내부에 1 ml의 매체를 추가하고 외부 1ml를.
- 종양 문화37 ° C에서 정적 조건에서 모델 14 일 동안 인큐베이터에서 5 % CO 2. 삼일 - 매 2 배지를 변경합니다. (10 %, HCC827 20 % A549) 셀 크라운 내외 동일한 배지 150 ml를 따라서, 파스퇴르 피펫 및 피펫 FCS 적정량 1 mL의 신선한 RPMI를 사용하여 매체를 흡인.
- 동적 문화 조건
- 2.1.3에 항 2.1.1에 설명 된대로 셀 크라운 세포 파종 내부 decellularized 행렬 종양 테스트 시스템을 설정합니다.
- 정적 배양 조건 하에서 종양 모델을 37 ℃ 3 일 동안 인큐베이터에서 5 % CO 2.
- 멸균 생물 반응기를 조립하고 이전에 (25)이 공표 한 시드 SISmuc를 삽입합니다.
- 피펫 FCS 적당량 45 ml의 RPMI (A549 : 10 % HCC827 : 20 %)를 플라스크에 넣고 바이오 리액터와 사이의 배관 시스템에 무침 샘플링 장치를 연결할매체 플라스크.
- , 인큐베이터에있는 생물 반응기를 놓고 37 ° C, 5 % CO 2에서 일정한 매체 흐름 (3 ml / 분)와 펌프와 문화에 추가로 14 일 동안 종양 모델을 연결합니다.
- 7 일 후 전체 문화 매체를 변경합니다. 이를 위해 층류 후드 아래의 배양기에서 생물 반응기를 이동. 파스퇴르 피펫을 사용하여 미디어 플라스크에서 매체를 기음. 튜브 시스템에서 매체를 제거하는 흡입하면서 생물 반응기를 들어 올립니다. 플라스크에 피펫 45 ml의 신선한 매체. 다시 인큐베이터로 생물 반응기를 놓고 펌프에 연결합니다.
피티 니브와 정적 종양 모델 3. 치료
- 문화 2.1 절에 설명 된대로 종양 모델입니다.
- 문화의 날 11시, 1 μM의 피티 니브 (각 셀 왕관 2.5 ml)로 RPMI / FCS를 준비합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 우물에서 이전 미디어를 기음과 t 내부 준비 RPMI / FCS가 / 피티 니브 1 ㎖를 추가그는 세포 왕관과 외부 동일한 매체의 1.5 ml의.
주 : 해동 피티 니브 스톡 용액을 일주일 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. - 항 3.2에 설명 된대로 하루에 13에서 매체를 변경합니다.
EMT 유도에 대한 TGF-베타 1과 정적 종양 모델 4. 자극
- 문화 2.1 절에 설명 된대로 종양 모델입니다.
- 문화의 3 일에서 2 NG / ㎖ TGF 베타-1 캐리어 (각 셀 왕관 2.5 ml)로 RPMI / FCS를 준비합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 우물에서 기존의 미디어를 대기음 1 준비 RPMI / FCS / TGF 베타-1 세포 왕관 내부 ㎖의 외부 동일한 매체의 1.5 ml를 추가 할 수 있습니다. 4.2에 설명 된대로, 14 일까지 3 일 - 매체 TGF-베타 1 매 2 보충 변경합니다.
5. 읽기 아웃
- ELISA의 측정을위한 샘플을 채취
- 정적 (2.1) 및 동적 (2.2 절) 문화의 상층 액 중에서 샘플을 채취일 문화의 11-14 그림 2에 표시된대로에서 게 피티 니브 (섹션 3)으로 처리. 또한, 처리 (T0) 이전에 샘플을.
- 정적 인 배양 조건 하에서, 세포의 관 내부에서 100 μL 샘플을 취할. 동적 배양 조건에서 샘플링 장치 주사기 스크류 및 바이오 리액터에서 1 ml의 배지를 취할. 엘리사가 수행 될 때까지 -80 ° C에서 수집 된 모든 상층 액을 저장합니다.
- 세포 사멸의 정량화를위한 M30-ELISA
- 상등액은 제조업체의 지시에 따라 세포 사멸 분석을 수행에서 아폽토시스를 정량. 모든 시약은 분석을 수행하기 전에 RT에 도달 할 수 있습니다.
- 소용돌이 모든 시약. 500 ml의 신선한 탈 이온수 세척 태블릿을 녹인다. 복합체 희석 버퍼의 9.2 ml의 HRP 접합체를 희석 혼합한다. 피펫 표준 또는 샘플 당 잘 25 μL.
- 희석 된 HRP Conju의 75 μl를 추가물론 당 게이트 솔루션입니다. 접시를 덮고 실온에서 4 시간 동안 진탕에 품어. 접시를 씻으 수동으로 준비 세척 용액 250 ㎕를 5 번.
- 각 웰에, 5,5'- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기판 3,3 '200 μl를 추가합니다. 20 분 동안 실온에서 어둠 속에서 인큐베이션. 각 웰에 스톱 솔루션의 50 μl를 추가합니다. 10 초 동안 마이크로 플레이트를 흔들어 흡광도를 읽기 전에 5 분 동안 마이크로 둡니다. 마이크로 플레이트 리더에서 450 nm에서 흡광도를 결정합니다. 표준 곡선 및 원점 ELISA 타입의 데이터를 처리하기위한 적절한 프로그램을 이용하여 샘플의 농도를 계산한다.
- 샘플 염색
- 고정, 파라핀-포함하고 3D 모델 제의 제조
- 2 시간 동안 세포 크라운 당 2.5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 사용하여 시드 SISmuc을 수정하고 파라핀에 그것을 포함
- 이전에 발표 된 염색을 위해 3 μm의 조직 섹션을 준비25.
- 2D 문화 조건에서 자란 세포의 고정
- 70 %의 합류에 도달하면, PBS로 한번 24 웰 플레이트에 커버 글라스에 배양 된 세포를 씻어 500 μL 4 % PFA / 웰 10 분으로 그들을 해결.
- PFA를 제거하고 오염이 수행 될 때까지 4 ° C에서 PBS로 덮여 잘 판의 커버 글라스를 저장합니다.
- H & E 염색
- 표준 프로토콜에 따라 개요 염색으로 헤 마톡 실린 / 에오신으로 재수 섹션을 얼룩.
- 3 차원 모델의 면역 염색
- 면역 염색의 경우, 20 분 동안 예열 된 구연산 완충액 (pH 6.0)와 증기 밥솥에 탈 파라핀과 재수 슬라이드를 배치하여 항원 검색을 수행합니다.
참고 : 구연산 완충액의 제조 재료 및 장비의의 표를 참조하십시오. - 슬라이드로 이동세척 버퍼 (0.5 M PBS 버퍼 + 0.5 % 트윈)로하는 PAP 펜으로 동그라미 부분은 염색 솔루션에 필요한 볼륨을 최소화하고 수분 챔버에서 슬라이드를 배치합니다.
- RT에서 20 분 동안 항 5.3.4.6에 사용 된 이차 항체를 숙주 종에서 5 % 혈청으로 조직 절편을 차단.
- (100), 토끼 항 vimentin에 1 : 100, 마우스 항 범 사이토 케라틴 1 제조업체의 지시 (사료된다 1 항 토끼에 따른 희석에 둘러싸여 섹션에 차 항체를 부드럽게 용지 조직에 슬라이드를 눌러 차단 혈청을 제거하고 적용 : 100). 4 ° C에서 O / N을 품어. 이중 염색의 경우, 다른 호스트 종에서 일차 항체를 사용해야합니다.
- 5 분 동안 조심스럽게 세척 완충액으로 3 회 결합되지 않은 항체를 씻어.
- 섹션 400을 1 시간 동안 실온에서 품어 : 특정 항원 - 항체 바인딩의 검출을 위해, 희석 1 차 항체를 적용합니다.
- UNB 씻어세척 버퍼 운드, 항체 5 분 3 회.
- 핵을 Counterstain과 건조 O / N을 수 있도록 DAPI를 포함하는 수성 매체와 슬라이드를 탑재합니다.
- 면역 염색의 경우, 20 분 동안 예열 된 구연산 완충액 (pH 6.0)와 증기 밥솥에 탈 파라핀과 재수 슬라이드를 배치하여 항원 검색을 수행합니다.
- 2D 배양 세포의 면역 염색
- PBS를 제거하고 permeabilization 5 분 동안 PBS에서 0.2 % 트리톤 - X100과 시드 유리 커버 슬립 커버. 5 분 동안 세척 완충액 (0.5 M PBS 버퍼 + 0.5 % 트윈)와 유리 커버 슬립을 씻으십시오.
- 5.3.4.7에 단계 5.3.4.3를 수행합니다. 락 플랫폼에서 잘 플레이트의 모든 단계를 실행하고 판을 반전 시약을 제거합니다.
- 장착하기 위해, 코팅되지 않은 유리 슬라이드 상에 핵을 Counterstain과 겸자를 사용하여 장착 매체 대향 세포와 그것을 커버 슬립을 전송 DAPI를 포함하는 수성 매질의 드롭 자리. 이미징 전에 건조하자.
- 고정, 파라핀-포함하고 3D 모델 제의 제조
- 대량 살상 무기 확산 지수의 결정
- 면역를 수행섹션 5.3.4에 따라 사료된다 대하여 염색. 또는 5.3 5.
- 거꾸로 현미경으로 조직 섹션 또는 2D 배양 세포의 형광 이미지를 가져 가라. DAPI 염색에와 사료된다 염색에의 이미지를 복용에 대해 서로 다른 필터를 사용합니다. 정량화를 들어, 시료의 비 중첩 부분에서 각 조건의 3 차원의 섹션 (10)의 이미지 또는 2 차원 배양 (배율 20 배)를도 5의 이미지를 사용한다.
- 2D로 사료된다위한 핵의 수와 양의 핵의 수를 결정
- 사료된다에게 수동으로 소프트웨어 피지 (26)의 플러그인 셀 카운터를 사용하여 긍정적 인 핵을 계산합니다. 따라서, 이미지를 열고 "플러그인"→ "분석"→ "셀 카운터"를 클릭합니다. 보도는 "초기화"와 카운터 유형을 선택합니다. 각 사료된다 긍정적 인 핵을 클릭합니다. 클릭 수 선택된 대향 형 옆 나타낸다.
- 핵의 총수의 자동 셀 카운트 피지 27,28하여 매크로를 생성한다. 치UST 모든 염색 및 세포 라인에 대한 매크로입니다. 다음, 매크로를 만드는 방법을 예를 참조하십시오.
- 매크로 레코더를 시작합니다. DAPI 이미지를 열고 "이미지"→ "입력"→ "8 비트"를 클릭하여 8 비트 형식으로 변환합니다. 설정 "정상화" "1"로 '포화'와 "대비 강화"를 클릭합니다.
- 이미지를 선명하게 "언샵 마스크"를 설정합니다. "0.60"의 "1"과 '마스크'의 '반경'을 사용합니다. 이미지를 binarise하는 '검은 색 바탕에 흰색 물체'로 방법 "RenyiEntropy"을 선택, "자동 임계 값"을 클릭합니다.
- 세포를 분리하기 위해 "5"의 침식 반경 "플러그인"→ "BioVoxxel"→ "유역 불규칙한 기능"을 클릭합니다. → "분석"을 클릭 "입자를 분석"과 "0.02 무한대 '로'크기 '를 설정합니다.
주 : 입자 / 세포의 수가카운트로 요약 표에 표시된. - 또한 이미지의 분석을 위해 매크로를 저장합니다 "만들기"를 클릭합니다.
- 항 5.4.3.1에 설명 된대로 수동으로 3D로 핵의 수와 사료된다 양성 핵의 수를 결정합니다.
- 다음 식에 따라 평균 확산 지수 (PI)를 계산한다 :
n은 이미지의 수 (3D : 10, 2D : 5)
HCC827 세포에서 안티 EGFR 치료의 실리 종양 모델 생성 및 시뮬레이션 6.
- 네트워크 세대 네트워크 분석 소프트웨어를 사용하여
- 중요한 실험 판독 파라미터와 HCC827 세포주 돌연변이 배경에 기초하여 종양 네트워크를 생성하기 위해 다른 공지 된 데이터베이스를 사용한다.
- 시각화 네트워크 분석 소프트웨어 (21)를 열고네트워크.
- "파일"→ "새"→ 유형 'JoVE_tumor 모델'을 클릭 → 새로운 네트워크를 생성하기 위해 "OK"를 클릭합니다. 이중 막에 수용체를 시각화 "OK" "광장 근접 촬영 북한"→ 클릭합니다. 사각형 → 유형 'EGFR'→ '확인'을 클릭 개의 노드 (= 단백질)를 시각화하는 "일반 단백질"을 클릭; 네트워크의 각 노드에 대해이 작업을 반복합니다.
- 네트워크의 노드 레이블 : 마우스 오른쪽 클릭 → "변경 색상 및 모양은 ..."→ 노드 EGFR과 (EGF-EGFR) 색상 코드 "255,0,0"(붉은 색)에 대한 선택; 노드 C-MET 및 (c-MET) 색상 코드 "0, 255, 0"(색상 녹색)에 대한; 피티 니브 색상 코드 "255,255,0"(색 노란색); PI3K-Inh입니다 색상 코드 "204204204"(컬러 라이트 그레이) MEK-Inh입니다 색상 코드 "102102102"(색 어두운 회색) 네트워크 선택 색상 코드의 다른 모든 노드에 대한4, 255, 255, 255 "(색상 흰색).
- 육각형 → 유형 '확산'으로 판독 매개 변수를 시각화하기 위해 "표현형"를 클릭 → "확인"을 클릭 → 오른쪽 → "변경 색상 및 모양 ..."→ 선택 색상 코드 "255204204"(색상 연어)를 클릭; 선택 색상 코드 "255,51,204"(색 보라색) → 매개 세포 사멸에 대해이 작업을 반복합니다.
- 자제력을 위해 (무딘 화살표)을 "억제"를 클릭, 활성화 (화살표)은 "상태 전이"를 클릭; 가장자리 (= 상호 작용)를 시각화 네트워크의 각 상호 작용에 대해이 작업을 반복합니다.
- "파일"→ "다른 이름으로 저장 ..."→ 유형 'JoVE_tumor의 models.xml'를 클릭 → .XML 형식으로 생성 된 신호 네트워크를 저장하려면 "저장"을 클릭합니다.
- 실리 시뮬레이션에서 SQUAD를 사용하여
참고 : SQUAD는 일을 나타냅니다즉 네트워크 이산 논리 부울 시스템 (AND, OR, NOT)과 같은 토폴로지와 정상 상태 분석을 수행한다. 정상 상태 분석 시스템 평형 및 신호 자극시 책임 (예., 약물 애플리케이션 또는 변이)를 반영한다.- 열기 SQUAD 17 소프트웨어, 업로드 → "로드 네트워크" 'JoVE_tumor의 models.xml'파일을 클릭합니다. "실행 분석"을 클릭합니다 :
주 : 다음 SQUAD 시간 이상의 네트워크 동작의 동적 시뮬레이션 (컬러 S 자형 곡선을 활성) 수 부울 네트워크 연결을 보간, 지수 함수를 적용한다. - 시뮬레이션 프로토콜을 작성하는 "고급"→ "Perturbator"을 클릭합니다. 안티 EGFR 저항을 시뮬레이션 : 클릭 "편집 프로토콜"
- "섭동"→ 표준 사용 "초기 상태 (Initial) = SS-4"(정상 상태 4) → '새 정수 펄스'를 추가하려면 "추가"를 클릭 → 괜찮다을 클릭[선택] 매개 변수 "상태"를 선택 시간 → → 선택 대상 "FLIP"는 "0"→ 선택 값 "0.4"→ "확인"을 클릭합니다.
- 이 과정을 반복합니다 : → 선택 매개 변수가 "상태"→ 선택 대상 "C-MET"→ 선택 시간 "0"→ 선택 값 "0.4"→ "확인"을 클릭하여 "추가"를 클릭; 클릭 선택 시간 → → 선택 매개 변수 "상태"→ 선택 대상 "피티 니브"를 "추가"를 "0"→ 선택 값은 "1"→ "확인"을 클릭합니다.
- 활성 노드 (EGF-EGFR)에 상태 값을 설정합니다 "activenode"를 클릭 → "편집"→ 선택 상태가 "0.8"→ "확인"을 클릭합니다; 다른 모든 노드에 대해 "편집"을 클릭 → 상태가 "0"→ "확인"을 클릭하여 선택합니다. 프로토콜을 저장하려면 "OK"를 클릭합니다.
- 특정 곡선을 표시합니다 패널로 이동 "옵션"→ "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "카스파", "(C-MET)", "PI3K" "(EGF-EGFR)"을 선택, "피티 니브", "고사", "확산", "MEK-Inh입니다"와 그래픽 표현을위한 "PI3K-Inh입니다." 시스템의 응답의 전체 시뮬레이션을 시작합니다 "초기화"→ "실행"을 클릭합니다. "재설정"을 클릭 새로운 시뮬레이션을 시작합니다.
- 결합 PI3K 및 MEK 억제제 치료를 시뮬레이션 : 클릭 "편집 프로토콜"
- 6.2.2.3 - 6.2.2.1에 설명 된대로 동일한 노드 매개 변수를 사용합니다. → "추가"를 클릭하여 '새 정수 펄스'→ 선택 매개 변수 "상태"→ 선택 대상 "PI3K-Inh입니다"→ 선택 시간이 "0"→ 선택 값이 "1"→ "확인"을 클릭을 추가하는 "동요"를 클릭; "추가"를 클릭선택 시간 → '새 정수 펄스'→ 선택 매개 변수 "상태"→ 선택 대상 "MEK-Inh입니다"를 추가하려면 "0"→ 선택 값은 "1"→ "확인"을 클릭합니다.
- 프로토콜을 저장하려면 "OK"를 클릭합니다. "옵션"패널로 이동 6.2.2.4에 설명 된대로 그래픽 표현에 대해 같은 노드를 사용합니다. 시스템의 응답의 전체 시뮬레이션을 시작합니다 "초기화"→ "실행"을 클릭합니다. 시뮬레이션을 완료하려면 "재설정"을 클릭합니다.
- 열기 SQUAD 17 소프트웨어, 업로드 → "로드 네트워크" 'JoVE_tumor의 models.xml'파일을 클릭합니다. "실행 분석"을 클릭합니다 :
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Representative Results
SISmuc 지지체 (C로도 2A)에 기초하여, 우리는 3D 종양 테스트 시스템 (도 2D)의 생성을 자극하고 치료를위한 표준 운영 프로토콜을 세웠다. 이 모델은 확산 지수는 각각도 1 및도 3에 도시 된 바와 같이, M30-ELISA를 사용하여 아폽토시스를 정량의 결정을 가능하게한다.도 3 A549 및 HCC827 모델 나타내는 H & E 염색 및 게 피티 니브 한 대표적인 아폽토시스 측정도. 여기에 제시된 모델은 성공적으로 병원에서 대상 억제제로 치료 EGFR -mutated 비소 세포 폐암의 예를 사용하여 설계되었습니다. 대응하여, 단지 EGFR은 HCC827 -mutated 세포 및 A549 세포 아폽토시스의 증가에 의해 평가 우리의 모델에서 TKI 피티 닙 의한 EGFR 억제에 반응하지.도 4 도 5c 및 D와 같이. 또한 동적 문화 조건 피티 니브 아래의 흐름 생물 반응기 강화 된 조직 생성에 동적 배양 조건은 EGFR -mutated HCC827 (그림 5D)에 강한 영향을 미친다.
도 6은 네트워크 토폴로지 (도 6A) 및 세포 HCC827 (도 6b, c)에 항 EGFR 치료 내성 실리 모의 상세를 나타낸다. 시그널링 네트워크는 CellDesigner 소프트웨어 (26)과 시각 (42) 노드와 55 가장자리의 토폴로지, 결과 등 HPRD, KEGG 및 QIAGEN (유전자 및 진학)를 공지 된 문헌 데이터베이스를 사용하여 생성되었다. 알려진 드라이버 돌연변이 EGFR (빨간색)와 C-MET 공동 활성화의 시뮬레이션 (녹색, 값은 약 0.7) 증가 prol를 보여줍니다iferation 속도 (연어 곡선) 및 MEK 및 PI3K (그림 6B, 어두운 녹색과 시안)의 활성화와 함께가는 HCC827 세포에서의 저항 (노란색) 피티 닙을 반영 시간이 지남에 따라 감소 된 세포 사멸 율 (바이올렛 곡선). 결합 PI3K 및 MEK 억제제 (어둡고 밝은 회색 곡선)을 방지 EGFR 저항 효과의 반전 결과의 모델링 증식을 감소시키고 세포 사멸 (그림 6C)를 유도한다.
도 1 확산 레이트. 차원 세포 배양에 비해 3D 저감 사료된다 양성 HCC827 세포 (적색 및 B) SISmuc (B)에 2 차원 세포 배양 물 (A) 및 3D 세포 배양에서 염색된다. HCC827 세포 및 A549 세포를 C (계산하고, 확산 지수 (사료된다 양성 세포의 비율)을 측정 하였다 </ strong>을, 한 대표는) 오에서 계산. 스케일 A의 바, B :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
TKI 피티 니브 그림 2. SISmuc 비계 형태와 처리 일정 세포가 소장 점막하 (SIS) + 점막 (A 구성되어 SISmuc에 시드됩니다. 시야, B : DAPI 염색 된 세포를 SISmuc, C의 위에 : 오버레이 A와 B)와 일 0에서 세포 크라운에서 해결의 치료 방식은 D에 표시됩니다 : 중간 변경 (MC)가 매 2 ~ 3 일을 수행한다. 하루에 11에서 처리가 시작됩니다. 상청액을 수집하고 M30-ELI에 사용시간이 지남에 따라 세포 사멸을 정량화하기 위해 SA (파란색 화살표와 상자). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 A549 3D 종양 모델 3. 피티 니브 치료 변경 셀 HCC827에서 SISmuc 및 유도 세포 사멸에 성장, 그러나되지 않음. 어떤 치료를하지 않으면, 두 세포주는 SISmuc (A와 B)의 단층을 형성하고, 또한 전 토굴 구조를 정착. A549 세포의 성장 패턴은 게 피티 닙 (C)로 처리 한 후 변경되지 않지만, HCC827 세포의 수는 신장 세포 형태 (D)에 대한 변경과 함께 감소된다. 배양 상층 액에서 M30-ELISA 측정에 의해 본 고사가 E (HCC827 모델 피티 닙에 의해 유도된다 D의 스케일 바 :. D에 대한 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SISmuc에 HCC827 세포에서 그림 4. TGF-베타 1 유도의 EMT. 3D에서 배양 HCC827 세포가 팬 - 사이토 케라틴 (PCK)의 전체 표현 표시 (A 녹색은 A1) 만 단일 세포는 (A)에 (빨간색 멘틴을 표현 A2). TGF 베타 1 자극 후에 세포가 긴 형상으로 그들의 형태를 변경하고 멘틴의 발현이 크게 증가된다 (B에서 빨간색, B2) PCK의 발현이 유지되는 반면, (B 녹색, B1). B의 스케일 바 : A에 대한 100 μm의 B. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 동적 세포 배양은 향상 조직 생성. 생물 반응기에서 3D 조건 (B), 정적 모델 (A, H & E 염색) 다층 조직에 단층 (A)의 변경 (C, H & E 염색에서 단일 층에서 배양 할 때 ). HCC827 세포는 게 피티 니브 처리 (D, H & E 염색)에 따라 강한 약물 반응을 보여줍니다. D의 스케일 바 :. A, C 및 D 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
무화과. 실리 종양 모델 생성 및 안티 EGFR 치료 내성. 네트워크 적색 (EGFR 경로) 키 신호 노드 종양 세포의 토폴로지 및 녹색 (c-MET) 및 다운 스트림 노드의 시뮬레이션 제. 특징 종양 판독 매개 변수 (연어)에 증식과 (바이올렛) 세포 사멸은 육각형로 표시됩니다. 화살표 활성화, 무딘 화살표 억제를 나타냅니다. 치료 대상이 어둡고 밝은 회색 사각형으로 표시됩니다, 피티 닙에 의해 억제는 노란색 (A)에 표시됩니다. 확산 (연어 곡선) 및 광고의 증가로 표시된 바와 같이 전자 기능 (컬러 곡선 (), NOT AND, OR) 부울 네트워크 연결을 보간에 의해 동적 시뮬레이션. EGFR 및 C-MET 공동 발현은 피티 니브 저항을 발생에 대한 임의의 시점 (8) (B) 후 세포 사멸 (바이올렛 곡선)의 ecrease. (노란색 곡선 아래, 같은 활성화, 프로토콜 참조) 잠재적 인 치료 태클 억제제로 PI3K 및 MEK 모두. (C) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 시험 관내 결합 확립 / 바이오 마커 유도 치료를위한 예측 실리 종양 테스트 시스템이다. 시험 관내 모델은 또한 실리코 (17)에서 시뮬레이션 될 수있는 특정 돌연변이 배경에서 종양 세포 증식 및 아폽토시스의 변화와 같은 복합 작업의 다른 중요한 측면을 평가한다. 여기서는 3D 종양 모델 생성 및 증식 및 아폽토시스의 정량 및 실리코 모델 예측의 확립을 포함하여 화합물을 시험하기위한 표준 프로토콜을 제안한다. 3 차원 모델은 종양 특이 돌연변이를 담지 종양 세포주에 기초한다. 세포는 세포 크라운에 decellularized 조직 매트릭스에서 재배된다. 발판의 매트릭스 생물 반응기 시스템의 조립 탈세 포화, 두 개의 금속 링 (셀 크라운) 사이에 고정뿐만 아니라 시드 25 전에 조브에서 가시화되고있다.
체외에서 3D 종양 모델
병원에 여기에 달성 결과의 번역은 선택된 대상 의약품에 대한 바이오 마커에 따라 환자를 분류하기 위해 관심의 돌연변이 베어링에 적합 종양 세포의 신중한 선택이 필요합니다. 층화 의학, 차세대 시퀀싱에 의해 druggable 드라이버 돌연변이의 식별 특히 비소 세포 폐암의 주요 관심사입니다 희망 미래 (29)의 새로운 유전자 마커를 공개합니다. 시험 관내 시험을 위해, 관심있는 화합물은 선택된 세포주 또는 일차 세포에서 높은 활성 사이트 타겟팅한다. 여기서, 세포주 HCC827 및 A549는 EGFR 돌연변이 상태에서의 차이에 의한 선택 및 과민성 (HCC827 세포) 및 2D 배양 30-32에서 TKI 피티 닙쪽으로 중간 감도 (A549 세포)에보고되었다. 선택된 종양 3D 종양 모델 생성, 세포 수 및 배양 기간의 제 1 단계에서 세포 adju 할 필요여기에 언급 된 다른 세포가 사용되는 경우 STED. 최적의 화합물 농도를 찾기 위해서, 2D에서 시판 생존 분석의 도움으로 IC50 값을 결정하는 것이 바람직하다. 이 시험에 기초하여, 상기 화합물은 IC50 농도 및 3D 모델의 다음 높은 농도로 사용되어야한다. 우리는 2 ~ 3 주 이내에 다른 한편 2D 종양 테스트 시스템에 쉽게 비교 결과를 얻기 위해 한 손으로 치료 사흘 선택했다. 그러나, 치료 기간은 장기 효과를 조사하기 위해 연장 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 장기 처리 또는 시험 화합물의 높은 투여함으로써 증식 또는 다른 면역 마커의 평가를 방지하는 완전한 세포 손실을 야기 할 수 있음을 고려해야한다.
신뢰성 시그널링 네트워크 분석을 위해, 특정 화합물과 처리시 종양 반응은 증식 및 아포 구별 분석 할안검 하수. 이러한 판독 아웃 다르게 시그널링 네트워크에 접속된다. 따라서, 두 변수의 특징적인 분석은 약물 작용 및 후속 목표 예측을 더 잘 이해할 수있다. 앞서 언급 된 바와 같이, 종양 세포의 증식이 2 차원 배양 조건에 비해 우리 3D 모델에서 감소되고, 따라서, 테스트 화합물의 증식 억제 위양성을 감소한다. 확산 지수를 결정하기위한, 핵의 총수 및 사료된다 염색 양성 핵의 수는 예를 들어 소프트웨어 피지하여 정량한다. 이는 이것이 핵이 낮거나 높은 수치 결과로 세포가 꽉 응집체를 형성하는 경우, 각각 그러나 가능하지 않은 종양 세포의 배양 2D 매크로의 사용으로 단순화 될 수있다. 모든 경우에, 매크로 설정은 각 세포주 및 염색주의 깊게 조절되어야한다. 아폽토시스 WH, 카스파 제 절단 사이토 케라틴 18 측정 상청액에서 비 침습적으로 정량화 할 수있다무형 문화 유산은 M30-ELISA를 사용하여, 상피 특성을 가진 세포로 제한됩니다. 이것은 몇 가지 장점이있다 : I) 이것은 시간이 지남에 따라 치료 효과를 모니터하고 치료 효과의 시점을 식별 할 수있다. II) 샘플이 파괴되지 않고, 다른 판독 기술에 사용될 수있다. III) 상피 세포 아폽토시스는 공동 배양 설정에서 최적 간엽 세포 사멸로부터 구별 될 수있다. 이 기술은, 그러나, 이에 의해 그 상피 표현형 달리기 EMT을받은 종양 세포 부적절 할 수있다. 이 기술을 적용하기 전에 따라서, 사용 된 각각의 종양 세포주의 사이토 케라틴 (18)의 발현이 면역 조직 화학 염색에 의해 확인되어야한다. 시험 화합물은보다 종양 줄기 세포와 유사한 표현형 수행 될 수있다. 일반적으로 약물 검사에서 다른 침략 단계는 TKIs으로 대상 약물의 대부분은, 고급 종양 단계에서 적용되는 경우에도 무시한다. 우리의 모델은 더 침습적 또는 조사를 할 수 있습니다세포 침윤 과정 건너야 인해 보존 기저막 (17) N-침윤성 종양 세포. 세포 운동성 및 침입 향해 중요한 단계는 TGF 베타 1 17,33으로 자극 다른 폐암 모델에서 유도 될 수 EMT이다. 그러나, 이것은 발판을함으로써 증식 세포 수를 감소시킨다. 이러한 부정적인 부작용은 강한 3 차원 모델에서 종양 세포 밀도를 증가 동적 배양 조건을 적용함으로써 회피 될 수있다. 생물 반응기는 생리 학적 조건으로 배양을 조정하더라도, 이는 세포 성 및 시그널링 응력 전단 (25), 노광에 의해 영향을받을 수 있음을 고려하여야한다.
실리 시뮬레이션에서 사용하면 속도 업하는 세포 라인을 특정 약물 테스트
단지 반 정량적이지만, 이벤트의 순서는 적절하게 관리하여 실리 우리 모델에 의해 모델링되고완전히 각 특정 세포주 알려진 돌연변이를 고려. 이 세포주를 다양한 수용체 활성화 수준의 특정 변형을 포함하는 범위는 키나제 활성화 관여 때 얼마나 네트워크 출력 사멸 또는 증식 예상 될 등한다. 예를 들어, 하나의 취득 항 EGFR 치료 저항 (30)의 약 20 %에서 발생하는 것으로 생각되는 임상 공지 C-MET의 증폭을 고려할 수있다. 이어서, 실리코의 모델은, 시간 경과에 대응하는 네트워크 동작을 계산 예., 게 피티 니브 내성 발달 증식 증가로 표시하고 아폽토시스를 감소시켰다. 이 모델에서는, 가장 유망한 표적 후보로서 MEK 및 PI3K을 확인 하였다. 따라서, 새로운 잠재적 인 치료의 조합이 더 빠르게 시험 관내 시험을위한 기초로서 작용하는, 인 실리코 미리 평가할 수있다. 또한, 시험 관내 실험에서 출력 데이터 수가장 실험 결과에 맞게 조정하여 네트워크 실리 시스템에서 정제를 위해 이용 될 수있다. 실리 전략에 반 정량적는 (100 단백질 - 단백질 상호 작용이 고려 될 수있다 주위) 네트워크 크기에 대한 몇 가지 제한이있다. 또한, 실제적인 결과를 산출하기 위해 네트워크 토폴로지에 모든 키 단백질 노드를 통합하는 것이 중요하다. 에 실리 모델 따라서 살아있는 종양 세포에서 기존의 네트워크의 근사값을 제공한다. 그러나이 집중보기 관심의 특정 변경, 예. 셀 라인에서 서로 다른 돌연변이 배경에 약물 조합의 효과를 시뮬레이션하기 위해 우리가 할 수 있습니다. 이것은 우리가 체계적 새로운 치료 전략을 도출뿐만 아니라 암 시그널링 네트워크의 복잡도를 이해하는 것을 돕는다.
우리가 쉽게 precli에 통합 될 수 시험관 도구의 설계 도움이 조직을 개발했다고 결론적으로, 우리는 확신단일 약물 화합물 및 이들의 조합의 효능에 nical 테스트. 테스트 비용 및 시간을 줄이기 위해,이 종양 모델은 또한 실리코 예측 도구에서이 병원 중심 표적 치료하거나 고려할 수있는 새로운 플레이어를 포함한 약물 및 약물 조합 효과 세포 형 특정 예측에 수집 된 데이터를 확장시킴으로써 보완 (예.,의 miRNAs).
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 연구는 뷔르츠부르크 대학 병원의 학제 임상 연구 (IZKF, 보조금 BD247) 센터와 (헤이 케 Walles 부여) 바이에른 맞춤 프로그램에 의해 후원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell crowns | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | for static 3D culture | |
| CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | This software was used for drawing the network. |
| Citrate buffer stock solution (10x) | in house production | 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. | |
| Citrate buffer working solution | in house production | 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT. | |
| Citric acid monohydrate | VWR, Darmstadt (GER) | 1002441000 | used for the citrate buffer |
| Cover slips | VWR, Darmstadt (GER) | 631-1339 | |
| DAPI Fluoromount-GTM | SouthernBiotech, Birmingham (USA) | SBA-0100-20 | |
| Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | Different known literature databases were used for generating the network topology. |
| Female Luer Lug Style Tee | Mednet, Münster (GER) | FTLT-1 | Bioreactor setup |
| Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread | Mednet, Münster (GER) | SFTLL-J1A | Bioreactor setup |
| Fetal Calf Serum | Bio&SELL, Feucht (GER) | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH, München (GER) | S1025-100 mg | 100 mM stock solution with DMSO |
| Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection | Weckert, Kitzingen (GER) | custom made | |
| Histofix 4% (Paraformaldehyd) | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| Hose coupling | Mednet, Münster (GER) | CC-9 | Bioreactor setup |
| Incubator for bioreactors | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) | Bioreactor setup | |
| M30 CytoDeathTM ELISA | Peviva, Bromma (SWE) | 10900 | |
| Male Luer Integral Lock Ring | Mednet, Münster (GER) | MTLL230-J1A | Bioreactor setup |
| Moisture chamber | custom made | ||
| Mouse anti Pan-Cytokeratin | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | C2562-2ML | Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence |
| Needlefree Swabable Valve Female Luer | Mednet, Münster (GER) | NVFMLLPC | Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized |
| O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 21444 | O-ring large, Bioreactor setup |
| O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm | Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) | 19170 | O-ring small, Bioreactor setup |
| PAP pen | Dako, Hamburg (GER) | S002 | |
| Paraffin | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| Peristaltic pump | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | Bioreactor setup | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| Pump tubing cassette | Ismatec, Wertheim (GER) | IS 3710 | Bioreactor setup |
| Rabbit anti Ki67 | Abcam, Cambridge (UK) | ab16667 | Clone SP6, used for 1/100 for IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam, Cambridge (UK) | ab92547 | used 1/100 for IF |
| RPMI-1640 medium | Life technologies, Darmstadt (GER) | 61870-044 | warm in 37 °C waterbath before use |
| Silicone tube | Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) | HC66.1 | Bioreactor setup |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich, München (GER) | 30620-1KG-R | used for the citrate buffer |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm | - | This software was used for performing the semiquantitative simulations. |
| Sterile air filter, pore size 0.2 µm | Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) | 16596-HYK | Bioreactor setup |
| Syringe Luer Lok 5 ml | BD Biosciences, Heidelberg (GER) | 309649 | for bioreactor sampling |
| Tissue culture test plates: 6-, 12-, 24-, 96- well | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) | 92006, 92012, 92024, 92048 | |
| Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier | Cell Signaling, Frankfurt (GER) | 8915LC | stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, München (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, München (GER) | P7949-500ml | for washing buffer of immunofluorescent staining |
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