Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En kombinerad 3D vävnadstekniska Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53885
Automatic Translation
*1, *1, *3, 1, 1,4, 2, 3, 1,4, 1
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
* These authors contributed equally

Abstract

I den aktuella studien, vi kombinerat ett in vitro 3D lungtumör modell med en in silico modell för att optimera förutsägelser om läkemedelssvar baserat på en specifik mutations bakgrund. Modellen genereras på en decellulariserad svinbyggnadsställning som återger vävnadsspecifika egenskaper avseende extracellulärt matriskomposition och arkitektur, inklusive basalmembranet. Vi standardiserat ett protokoll som gör konstgjord tumörvävnad generation inom 14 dagar inklusive tre dagars läkemedelsbehandling. Vår artikel ger flera detaljerade beskrivningar av 3D utläsning screeningstekniker som fastställandet av spridningen index Ki67 färgning talet, apoptos från supernatanter av M30-ELISA och bedömning av epitelceller till mesenkymala övergång (EMT), som är användbara verktyg för att utvärdera effektiviteten i terapeutiska föreningar. Vi kunde visa jämfört med 2D kultur en minskning av proliferation i vår 3D tumörmodell som är related till den kliniska situationen. Trots detta lägre spridning, förutspådde modellen EGFR -targeted läkemedelssvar korrekt enligt biomarkör status som visas genom jämförelse av lungkarcinom cellinjerna HCC827 (EGFR -mutated, KRAS vildtyp) och A549 (EGFR vildtyp, KRAS - muterad) behandlades med tyrosin-kinashämmare (TKI) gefitinib. För att undersöka läkemedelssvar på mer avancerade tumörceller, vi inducerad EMT av långtidsbehandling med TGF-beta-1 som bedöms av vimentin / pan-cytokeratin immunofluorescensfärgning. En flödes bioreaktor användes för att justera kultur till fysiologiska förhållanden, vilket förbättrade vävnad generation. Dessutom visar vi integrationen av svaren drog på gefitinib behandling eller TGF-beta-1-stimulering - apoptos, proliferation index och EMT - till ett logiskt in silico modell. Dessutom förklarar vi hur läkemedels svar tumörceller med en specifik mutations bakgrund och räknaerstrategies mot motstånd kan förutsägas. Vi är övertygade om att vår 3D in vitro metod speciellt med in silico expansionen ger ytterligare värde för preklinisk drogtestning i mer realistiska förhållanden än i 2D cellodling.

Introduction

Läkemedelsindustrin står inför höga personalomsättning på upp till 95% när det gäller cancerbehandling i klinisk fas orsakar enorma kostnader 1-5. En orsak till denna brist är det faktum att för närvarande effekten av potentiella nya föreningar bedöms i storskaliga visningar på 2D cellkulturer av cancercellinjer eller i djurmodeller. Djurmodeller har en högre komplexitet, men det finns avgörande skillnader mellan möss och män 6,7. Under det senaste decenniet, har 3D-cancermodeller med olika metoder tagits fram för att överbrygga klyftan mellan 2D kultur av cancercellinjer och en komplex in vivo tumör 6,8,9. Effekterna av 3D-miljö på celldifferentiering och även om signalering har visats i flera studier år sedan (eg., Genom Mina Bissell) 10,11. Idag är många 3D cellodlingsmodeller finns såsom sfäroida kulturer, hydrogeler eller mikroflödes chips 12-16. Även om thesE-modellerna ökar komplexiteten jämfört med konventionella 2D odlingssystem, de oftast saknar en vävnadsmikro som är känd för att ha tumörbärande effekter samt effekter läkemedlets effektivitet.

För att lösa detta problem, vi genererade en 3D-tumörmodell baserad på en biologisk byggnadsställning som kallas SISmuc (liten tarm-submukosa + slemhinna) som härrör från en decellulariserad svin jejunum. Därigenom är vävnaden arkitektur och viktiga komponenter i ECM såsom olika gener liksom källaren membranstrukturen bevaras 17. Denna unika egenskap är avgörande för tumörmodell generation karcinom som uppstår från epitel och utgör ca 80% av solida tumörer. Vidare är proliferationshastigheten i vårt vävnadstekniska tumörmodell reducerad jämfört med de artificiellt höga hastigheter som uppnås i 2D kultur. Som spridning är en viktig parameter i bedömningen av läkemedlets effektivitet, är drogtestning aktiverat i vår modell mer liknarvillkor för in vivo tumörer 17.

För att utvärdera potentialen hos vår modell för att förutsäga biomarkör beroende läkemedelseffektivitet korrekt, här presenterar vi data för två olika lungcancercellinjer som skiljer sig i deras EGFR -biomarker status. Denna mutationsstatus har börjat bestämmas rutinmässigt i icke-småcellig lungcancer patienter. Riktade behandlingar med TKI såsom EGFR -hämmare gefitinib mot tumörer som bär en aktiverande EGFR-mutation visar överlägsna resultat jämfört med dem med platinabaserad kemoterapi 18-21.

Vi etablerade flera avläsnings tekniker som är relevanta för att utvärdera förening effekt. Vidare efter TGF-beta-1-stimulering har vi möjlighet att undersöka sammansatta insatser i tumörceller som startade EMT processen, som tros vara ett viktigt steg i malign transformation 22,23 och som är ansluten till läkemedels resistance 24.

3D-tumörmodellen möjligt att övervaka cellspecifika svar på riktade behandlingar, kemoterapi eller läkemedelskombinationer med bra kontraster. För att ytterligare förbättra och påskynda läkemedelsscreening och att möta motstånd, detta kompletteras med en in silico simulering. Baserat på några experiment, kan tumörsvar förutsägas in silico om resultatet för ett komplett utbud av läkemedel och kombinationer av dessa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tvådimensionell (2D) Cell Culture

  1. Kommersiellt få tumörcellinjen HCC827 (DSMZ). Kultur lungan adenokarcinomcellinje HCC827 (EGFR muterade, KRAS vildtyp) i RPMI-1640 kompletterat med 20% FCS. Byt medium var 2 - 3 dagar. Dela upp cellerna två gånger i veckan. Cellerna används till passage 20 har uppnåtts.
  2. Kommersiellt få tumörcellinjen A549 (DSMZ). Kultur lungan karcinomcellinje A549 (EGFR vildtyp, KRAS muterade) i RPMI-1640 kompletterat med 10% FCS. Utföra odlingen enligt ovan. Cellerna används till passage 20 har uppnåtts.
  3. Testa cellerna regelbundet (var 4 - 6 veckor) för föroreningar såsom mykoplasma föroreningar.
  4. Odling av A549 eller HCC827 celler på täckglas av glas
    1. Placera en steril glastäckglas i varje brunn på en 24-brunnsplatta med hjälp av en pincett.
    2. Seed 50000 tumörceller av båda cellinjerna i en volym av 500 | il i brunnarna medde glas täckglas, respektive.
    3. Odla cellerna tills de når en sammanflytning av 70% under standardodlingsbetingelser (37 ° C; 5% CO2). Under denna tid, aspirera gamla mediet med användning av en Pasteur-pipett och tillsätt 500 | il färskt medium var 2 - 3 dagars odling.

2. Framställning av tumör testsystem på en biologisk Collagen Scaffold

  1. Statiska odlingsbetingelser
    1. Generera den decellulariserade liten tarm-submukosa + slemhinna (SISmuc) och fixa det mellan två metallringar, de så kallade cell kronor, som beskrivs i en tidigare publikation 25.
    2. Seed 100000 celler av antingen HCC827 eller A549-celler i en total volym av 500 | j, l på sidan av de tidigare lumen i tarmen fixerad i cellkronor.
    3. Tillåter tumörceller att vidhäfta under 2 h vid 37 ° C, 5% CO2. Tillsätt 1 ml medium inuti cellen krona och 1 ml utanför.
    4. Kultur tumörenmodell under statiska betingelser vid 37 ° C, 5% CO2 i inkubatorn under 14 dagar. Ändra odlingsmedium var 2 - 3 dagar. Därför aspirera mediet med användning av en Pasteur-pipett och pipettera 1 ml färsk RPMI med den lämpliga mängden av FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) inuti cellen kronan och 1,5 ml av samma medium utanför.
  2. Dynamiska odlingsbetingelser
    1. Ställ in tumörtestsystemet med den decellulariserade matrisen inuti cellen kronor och cellsådd som beskrivs i avsnitt 2.1.1 till 2.1.3.
    2. Kultur tumörmodellen under statiska förhållanden 37 ° C, 5% CO2 i inkubatorn under 3 dagar.
    3. Montera autoklave bioreaktorn och infoga seedade SISmuc som tidigare 25 publicerade.
    4. Pipettera 45 ml RPMI med den lämpliga mängden av FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) i kolven och ansluta nålfri provtagningsanordning till rörsystemet mellan bioreaktom ochmedel kolv.
    5. Placera bioreaktorn i inkubatorn, anslut den till pumpen och kulturen tumörmodell för ytterligare 14 dagar med ett konstant mediumflöde (3 ml / min) vid 37 ° C, 5% CO2.
    6. Ändra hela odlingsmedium efter 7 dagar. För det, flytta bioreaktorn från inkubatorn under ett dragskåp med laminärt flöde. Aspirera mediet i media kolv med användning av en pasteurpipett. Lyft upp bioreaktorn medan aspire att bli av med mediet i rörsystemet. Pipettera 45 ml färskt medium i kolven. Placera bioreaktor tillbaka i inkubatorn och ansluta den till pumpen.

3. Behandling av statisk tumörmodell med Gefitinib

  1. Kultur tumörmodellen som beskrivs i avsnitt 2.1.
  2. Vid dag 11 av kultur, förbereda RPMI / FCS med ett iM gefitinib (2,5 ml för varje cell krona). Aspirera gamla mediet från brunnarna med en pasteurpipett och tillsätt 1 ml av beredd RPMI / FCS / gefitinib i than cell krona och 1,5 ml av samma medium utanför.
    OBS: Den tinade gefitinib stamlösningen kan lagras vid 4 ° C under en vecka.
  3. Ändra mediet på dag 13 som beskrivs i avsnitt 3.2.

4. Stimulering av statisk tumörmodell med TGF-beta-1 för EMT Induction

  1. Kultur tumörmodellen som beskrivs i avsnitt 2.1.
  2. Vid dag tre av kultur, förbereda RPMI / FCS med 2 ng / ml TGF-beta-1 med bärare (2,5 ml för varje cell krona). Aspirera gamla mediet från brunnarna med användning av en Pasteur-pipett och tillsätt 1 ml av beredd RPMI / FCS / TGF-beta-1 inuti cellen kronan och 1,5 ml av samma medium utanför. Ändra medium kompletterat med TGF-beta-1 var 2 - 3 dagar till dag 14, som beskrivs under 4.2.

5. Läs-outs

  1. Provtagning för ELISA Mätningar
    1. Ta prover från supernatanterna av statisk (avsnitt 2.1) och dynamisk (avsnitt 2.2) kultur underbehandling med gefitinib (avsnitt 3) på dagarna 11-14 av kulturen som visas i figur 2. Dessutom ta ett prov före behandling (T0).
    2. Under statiska odlingsbetingelser, ta 100 | j, l prov från insidan av cellen kronan. Under dynamiska odlingsbetingelser, skruva sprutan på provtagningsanordningen och ta en ml medium ut ur bioreaktorn systemet. Lagra alla insamlade supernatanterna vid -80 ° C till dess att ELISA utförs.
  2. M30-ELISA för apoptos Kvantifiering
    1. Att kvantifiera apoptos i supernatanterna utföra celldöd analys enligt tillverkarens instruktioner. Låt alla reagenser nå rumstemperatur innan analysen utförs.
    2. Vortex alla reagenser. Lös upp tvätt tabletten i 500 ml färskt avjoniserat vatten. Späd HRP-konjugat med 9,2 ml av konjugat spädningsbuffert och blanda. Pipettera 25 pl standard eller prov per brunn.
    3. Lägg 75 pl av den utspädda HRP Conjugate lösning per brunn. Täck plattan och inkubera den på en skakare under 4 h vid RT. Tvätta plattan manuellt 5 gånger med 250 pl beredd tvättlösning.
    4. Tillsätt 200 pl av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB) substrat till varje brunn. Inkubera i mörker vid RT i 20 min. Tillsätt 50 pl stopplösning till varje brunn. Skaka mikro under 10 sekunder och lämna mikro i 5 minuter innan avläsning av absorbansen. Bestämma absorbansen vid 450 nm i en mikroplattläsare. Beräkna standardkurva och koncentrationen i prover med ett lämpligt program för hantering av ELISA datatyp som ursprung.
  3. prov Färgning
    1. Fastställande, Paraffin-inbäddning och avsnitt Beredning av 3D-modell
      1. Fäst seedade SISmuc med användning av 2,5 ml 4% paraformaldehyd (PFA) per cell krona under 2 timmar och bädda in den i paraffin
      2. Förbereda 3 | im vävnadssnitt för färgning som tidigare publicerats25.
    2. Fastställande av celler odlade i 2D odlingsbetingelser
      1. När 70% sammanflytning har uppnåtts, tvätta celler odlade på täckglas av glas i 24-brunnar en gång med PBS och fixera dem med 500 | j, l 4% PFA / brunn under 10 min.
      2. Ta bort PFA och lagra glastäckglas i brunnen-platta täckt med PBS vid 4 ° C tills färgning utförs.
    3. H & E-färgning
      1. Färga rehydrerade sektioner med hematoxylin / eosin en översikt färgning enligt standardprotokoll.
    4. Immunofluorescerande färgning av 3D-modell
      1. För immunofluorescerande färgning, utföra en antigenåtervinning genom att placera avparaffinerade och rehydratiserade glider in en ångkokare med förvärmd citratbuffert (pH 6,0) under 20 minuter.
        OBS: Se tabell av material och utrustning är för att förbereda citratbuffert.
      2. Överför objektglasentill tvättbuffert (0,5 M PBS-buffert + 0,5% Tween), till cirkel sektioner med en PAP penna minimera den erforderliga volymen för färgningslösningar och placera glasen i en fuktkammare.
      3. Blockera vävnadssnitt med 5% serum från värdarten av de sekundära antikropparna som användes i moment 5.3.4.6 under 20 min vid RT.
      4. Ta bort blockerande serum genom att försiktigt knacka bilderna till en pappersnäsduk och applicera den primära antikroppen till de inringade delarna i en utspädning enligt tillverkarens anvisningar (kanin anti Ki67 1: 100, kanin anti vimentin 1: 100, mus anti pan-cytokeratin 1 : 100). Inkubera O / N vid 4 ° C. Vid användning av dubbelfärgning, måste primära antikroppar från olika värdarter användas.
      5. tvätta försiktigt av obunden antikropp med tvättbuffert tre gånger under 5 min.
      6. För detektion av specifika antigen-antikropps bindningar, applicera sekundära antikroppar i utspädnings 1: 400 till sektionerna och inkubera vid RT i 1 h.
      7. Tvätta UNBound antikropp med tvättbuffert tre gånger under 5 min.
      8. Mount objektglasen med ett vattenhaltigt medium innehållande DAPI för att motfärga kärnor och låt dem torka O / N.
    5. Immunofluorescerande färgning av 2D odlade celler
      1. Ta bort PBS och täcka seedade täckglas med 0,2% Triton-X100 i PBS under 5 min för permeabilization. Tvätta täckglas med tvättbuffert (0,5 M PBS-buffert + 0,5% Tween) under 5 min.
      2. Utför steg 5.3.4.3 till 5.3.4.7. Utföra alla stegen i väl-plattan på en gungande plattform och avlägsna reagens genom att vända plattan.
      3. För montering, ser en droppe vattenhaltigt medium innehållande DAPI att Motfärga kärnor på en obelagd glasskiva och överföra täckglas till den med cellerna inför monteringsmedel med pincett. Låt torka innan avbildning.
  4. Fastställande av spridning index
    1. utför immunofluorescentfärgning mot Ki67 enligt avsnitt 5.3.4. eller 5,3 5.
    2. Ta fluorescerande bilder av vävnadssektioner eller 2D odlade celler med ett inverterat mikroskop. Använd olika filter för att ta bilder av DAPI färgningar och av Ki67 färgningar. För kvantifiering, använder 10 bilder av 3D-sektioner eller 5 bilder i 2D kulturer (förstoring 20X) för varje tillstånd från icke-överlappande delar av provet.
    3. Bestämma antalet kärnor och antalet kärnor positivt för Ki67 i 2D
      1. Räkna Ki67 positiva kärnor manuellt med hjälp av plugin celltalsräknare av programvaran Fiji 26. Därför öppna bilden och klicka på "Plugins" → "Analysera" → "Cell Counter". Tryck på "Initiera" och välj en räknare typ. Klicka på varje Ki67 positiv kärna. Antalet klick visas bredvid den valda räknartypen.
      2. För automatisk cellräkning av det totala antalet kärnor skapa ett makro med hjälp av Fiji 27,28. Adjust makrot för varje färgning och cellinje. Efter se ett exempel hur man skapar ett makro.
        1. Starta makro-inspelaren. Öppna en DAPI-bild och omvandla den till 8-bitars format genom att klicka på "Bild" → "Typ" → "8-bitars". Klicka på "Förbättra kontrast", ställ in "mättad" som "ett" och "normalisera".
        2. Ställ in "Oskarp mask" att skärpa bilden. Använd en "radie" av "1" och en "mask" av "0,60". Klicka på "Auto Threshold", välj metod "RenyiEntropy" med "vita objekt på svart bakgrund" för att binarise bilden.
        3. Klicka på "Plugins" → "BioVoxxel" → "vattendelare oregelbundna egenskaper" med en urholkning radie av "5" för att separera cellerna. Klicka på "Analysera" → "analysera partiklar" och ställ in "storlek" till "0,02-Infinity".
          OBS: antalet partiklar / celler ärvisas i översiktstabellen som räknas.
        4. Klicka på "Skapa" för att spara makrot för analys av ytterligare bilder.
    4. Bestämma antalet kärnor och antalet kärnor positiva för Ki67 i 3D manuellt enligt beskrivningen i avsnitt 5.4.3.1.
    5. Beräkna medelproliferationsindex (PI) i enlighet med följande formel:
      Equation1
      n = antal bilder (3D: 10, 2D: 5)

6. in silico tumörmodell Generation och simulering av anti- EGFR terapi i HCC827 celler

  1. Nätverks Generation använder en nätverks Analysis Software
    1. Använd olika kända databaser för att generera tumör nätverk baserat på de viktiga experimentella utlästa parametrar och mutations bakgrund av HCC827 cellinje.
    2. Öppna nätverksanalys programvara 21 att visualiseranätverk.
      1. Klicka på "File" → "Ny" → typ "JoVE_tumor modeller" → klicka på "OK" för att generera ett nytt nätverk. Klicka på "Square Närbild North" → "OK" för att visualisera receptorn i en dubbel membran. Klicka på "Generic Protein" att visualisera noder (= proteiner) som rektanglar → typ "EGFR" → klicka på "OK"; Upprepa detta för varje nod i nätverket.
      2. Märk noderna i nätverket: Högerklicka → "Byt färg & form ..." → välj för noder EGFR och (EGF-EGFR) färgkod "255,0,0" (röd färg); för noder c-MET och (c-MET) färgkod "0,255,0" (grön färg); för gefitinib färgkod "255,255,0" (gul färg); för PI3K-Inh färgkod "204.204.204" (färg ljusgrå); för MEK-Inh färgkod "102.102.102" (färg mörkgrå); för alla andra noder i nätverket väljer färgkod4; 255.255.255 "(vit färg).
      3. Klicka på "Fenotyp" att visualisera utlästa parametrar som hexagoner → typ "spridning" → klicka på "OK" → Högerklicka → "Byt färg & form ..." → välj färgkod "255.204.204" (färg lax); upprepa detta för parameter apoptos → välj färgkod "255,51,204" (färg violett).
      4. Visualisera Kanter (= interaktioner): Klicka på "State Transition" för aktiveringar (pilar), Klicka på "Hämning" för hämningar (trubbiga pilar); Upprepa detta för varje interaktion i nätet.
    3. Klicka på "Arkiv" → "Spara som ..." → typ "JoVE_tumor models.xml" → klicka på "Spara" för att spara den genererade signalera nätverket som xml-format.
  2. In silico Simulation använder SQUAD
    OBS: SQUAD representerar the nätverkstopologi som en diskret logiskt Boolean systemet (AND, OR, NOT) och utför en steady state analys. Steady state analys avspeglar systemets jämvikt och ansvaret på signalerings stimuli (eg., Ansökan läkemedel eller mutation).
    1. Öppen SQUAD 17 programvara, Klicka på "Load Network" → uppladdning "JoVE_tumor models.xml" fil. Klicka på "Kör analys":
      OBS: Nästa, SQUAD gäller exponentiell funktion för att interpolera Boolean nätverksanslutning, vilket möjliggör dynamisk simulering av nätverk beteende över tid (färgade sigmoid aktivitetskurvor).
    2. Klicka på "Avancerat" → "Perturbator" att skriva en simulering protokoll. Simulera anti- EGFR motstånd: Klicka på "Redigera Protocol"
      1. Klicka på "störning" → använda standard "initialstate = SS-4" (steady state 4) → Klicka på "Add" för att lägga till "nya konstant puls" → Select parametern "tillstånd" → Välj mål "FLIP" → Välj tid "0" → Välj värde "0,4" → Klicka på "OK".
      2. Upprepa detta: Klicka på "Lägg till" → Välj parameter "stat" → Välj mål "c-MET" → Välj tid "0" → Välj värde "0,4" → Klicka på "OK"; Klicka på "Lägg till" → Välj parameter "stat" → Välj mål "gefitinib" → Välj tid "0" → Välj värde "1" → Klicka på "OK".
      3. Ställ in ett tillståndsvärde för aktiv nod (EGF-EGFR): Klicka på "activenode" → Klicka på "Redigera" → Välj tillstånd "0,8" → Klicka på "OK"; för alla andra noder: Klicka på "Edit" → Välj tillstånd "0" → Klicka på "OK". Klicka på "OK" för att spara protokollet.
      4. Visa specifika kurvor: Gå till panelen "Alternativ" → Välj "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "kaspaser", "(c-MET)", "PI3K" "gefitinib", "apoptos", "spridning", "MEK-Inh" och "PI3K-Inh" för grafisk återgivning. Klicka på "Initiera" → "Kör" för att starta en fullständig simulering av systemets svar. Klicka på "Reset" för att starta en ny simulering.
    3. Simulera kombinerad PI3K och behandling MEK-hämmare: Klicka på "Redigera Protocol"
      1. Använd samma nod parameter som beskrivs i 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Klicka på "störning" → Klicka på "Add" för att lägga till "nya konstant puls" → Välj parameter "stat" → Välj mål "PI3K-Inh" → Välj tid "0" → Välj värde "1" → Klicka på "OK"; Klicka på "Lägg till"att lägga till nya konstant puls "→ Välj parameter" stat "→ Välj mål" MEK-Inh "→ Välj tid" 0 "→ Välj värde" 1 "→ Klicka på" OK ".
      2. Klicka på "OK" för att spara protokollet. Gå till panelen "Alternativ": Använd samma noder för grafisk representation som beskrivs i 6.2.2.4. Klicka på "Initiera" → "Kör" för att starta en fullständig simulering av systemets svar. Klicka på "Reset" för att avsluta simuleringen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grundval av den SISmuc ställningen (Figur 2A till C), har vi etablerat ett standardiserat driftsprotokoll för generering, stimulans och behandling av en 3D-tumör testsystem (figur 2D). Denna modell möjliggör bestämning av proliferationsindex och kvantifiering av apoptos med användning av M30-ELISA såsom visas i figur 1 och figur 3, respektive. Figur 3 visar representativa H & E-färgning av A549 och HCC827 modeller och en representativ apoptos mätning med gefitinib. Den här presenterade modellen är utformad med hjälp av exempel på EGFR -mutated NSCLC som framgångsrikt behandlas med riktade inhibitorer i kliniken. På motsvarande sätt, -mutated endast EGFR HCC827 celler och inte de A549-celler svarar på EGFR hämning av TKI gefitinib i vår modell som utvärderats av en ökning av apoptos. Figur 4 figur 5C och D. Även under dynamiska odlingsbetingelser gefitinib har en stark effekt på EGFR -mutated HCC827 (figur 5D).

Figur 6 visar nätverkstopologin (figur 6A) och detaljerad in silico simuleringar av anti- EGFR terapi resistens i HCC827 celler (Figur 6B, C). Signaleringsnätet genererades med användning av kända litteraturdatabaser såsom HPRD, KEGG och QIAGEN (Genes & Pathways), vilket resulterar i en topologi av 42 noder och 55 kanter, visualiserades med CellDesigner programvara 26. Simuleringen av kända förare mutation EGFR (i rött) och c-MET co-aktivering (i grönt, värde ca 0,7) visar en ökad proliferation hastighet (lax kurva) och en minskad apoptos hastighet (violett kurva) över tiden återspeglar gefitinib (i gult) motstånd i HCC827 celler går tillsammans med en aktivering av MEK och PI3K (Figur 6B, mörkgrön och cyan). Modellering av kombinerad PI3K och MEK-hämmare (mörk och ljusgrå kurvor) resulterar i en återgång av anti- EGFR motstånd effekt, minskar proliferation och inducerar apoptos (Figur 6C).

Figur 1
Figur 1. Proliferation sänks i 3D jämfört med 2D Cell Culture. Ki67-positiva HCC827 celler (röd i A och B) färgades i 2D cellkultur (A) och 3D-cellodling på SISmuc (B). HCC827 celler och A549-celler räknades och proliferationsindex (i procent av Ki67-positiva celler) bestämdes (C </ Strong>, en representant räkna av fem). Skala barer i A och B:. 100 um klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. SISmuc Scaffold Morfologi och Schema Behandling med TKI Gefitinib Celler sås på SISmuc som består av tunntarmen submucosa (SIS) + slemhinna (A:. Bright, B: DAPI stained celler ovanpå SISmuc, C: överlagring av A och B) och är fixerad i cellkronor på dag 0. behandlings~~POS=TRUNC schemat~~POS=HEADCOMP visas i D: Medium förändringar (MC) utförs varje 2 till 3 dagar. Vid dag 11 börjar behandlingen. Supernatanter samlas in och används för M30-ELISA för att kvantifiera apoptos över tid (blå pilar och rutor). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Gefitinib Behandling Förändringar celltillväxt på SISmuc och inducerar apoptos i HCC827, men inte i A549 3D tumörmodeller. Utan behandling, båda cellinjerna bildar ett monolager på SISmuc (A och B) och även lösa tidigare crypt strukturer. Medan tillväxtmönstret för A549-celler inte förändras efter behandling med gefitinib (C), är antalet HCC827 celler minskas åtföljs av en ändring av en långsträckt cellform (D). Apoptos induceras av gefitinib i HCC827 modeller som ses av M30-ELISA mätningar från odlingssupematanter (E D:. 100 pm för A till D Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. TGF-beta-1 inducerar EMT i HCC827 Celler på SISmuc. HCC827 celler odlade i 3D visar övergripande uttryck av pan-cytokeratin (PCK) (grön A, A1) men bara enstaka celler uttrycker vimentin (röd i A, a2). Efter TGF-beta-1-stimulering, celler ändra sin morfologi till en långsträckt form och uttrycket av vimentin är starkt förhöjd (rött i B, b2), medan uttrycket av PCK bibehålls (grönt i B, b1). Skalstrecket i B: 100 | j, m för A B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Dynamisk Cell Culture Förbättrar Tissue Generation. När odlas under 3D betingelser i en bioreaktor (B), monoskiktet från den statiska modellen (A, H & E-färgning) ändras från ett monoskikt (A) till en flerskiktad vävnad (C, H & E-färgning ). HCC827 celler visar en stark drog svar på gefitinib behandling (D, H & E-färgning). Skala bar i D:. 100 pm för A, C och D Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Fikon. 6. in silico tumörmodell Generation och simulering av anti- EGFR terapi Resistance. Nätverkstopologi av en tumörcell med viktiga signalnoder i rött (EGFR väg) och grön (c-MET) och deras nedströmsnoder. Den karakteristiska tumör utlästa parametrar spridning (i lax) och apoptos (violett) representeras som hexagon. Pilar indikerar aktivering, trubbiga pilar hämning. Terapeutiska mål representeras av mörka och ljusa grå rektanglar, är hämningen av gefitinib visas i gult (A). Dynamisk simulering av e-funktioner (färgade kurvor) interpolera Boolean nätverksanslutning (AND, OR, NOT). EGFR och c-MET samexpression orsakar gefitinib motstånd som indikeras av en ökning av proliferation (lax kurva) och adecrease av apoptos (violett kurva) efter ca godtycklig tidpunkt 8 (B). Potentiella terapi tacklar både PI3K och MEK av hämmare (under gula kurvan, samma aktivering, se protokollet). (C) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har etablerat en kombinerad in vitro / in silico tumör testsystem för biomarkörer styrd behandlings förutsägelser. Den in vitro-modell utvärderar olika viktiga aspekter av sammansatta åtgärder såsom förändringar av tumörcellproliferation och apoptos på ett specifikt mutations bakgrund som även kan simuleras in silico 17. Här presenterar vi det standardiserade protokoll för 3D-tumörmodellen generation och förening testning inklusive kvantifiering av proliferation och apoptos och inrättandet av en prediktiv in silico modell. 3D-tumörmodellen bygger på tumörcellinjer som bär specifika mutationer. Cellerna odlas på en cellbefriade vävnadsmatrisen i cell kronor. Matris decellularisering, fixering mellan de två metallringar (cellkronor), montering av bioreaktorn systemet samt sådd av ställningen har visualiseras i JUPITER före 25.

in vitro 3D tumörmodell
Översättningen av de här uppnådda resultat i kliniken kräver ett noggrant urval av lämpliga tumörceller som bär mutationer av intresse för att klassificera patienter enligt biomarkörer för utvalda riktade läkemedel. För stratifierat medicin, är identifiering av druggable förare mutationer av nästa generations sekvensering ett stort problem, särskilt i icke-småcellig lungcancer och kommer förhoppningsvis att avslöja nya genetiska markörer i framtiden 29. För in vitro-tester, bör föreningen av intresse rikta en webbplats som är mycket aktiva i den valda cellinjen eller i primära celler. Här var det cellinjer HCC827 och A549 väljs på grund av deras skillnad i EGFR-mutationsstatus och rapporterade överkänslighet (HCC827 celler) och mellan känslighet (A549-celler) mot TKI gefitinib i 2D kultur 30-32. I det första steget av 3D-tumörmodellen generation, antalet celler och odlingsperioden för den valda tumörceller måste justerbasted om celler som skiljer sig från den här nämnts används. För att hitta den optimala föreningskoncentrationen, är det lämpligt att bestämma IC50-värdet med hjälp av en kommersiellt tillgänglig viabilitetsanalys i 2D. Baserat på detta test bör förening användas i IC50 koncentrationen och nästa högre koncentration i de 3D-modeller. Vi har valt tre dagars behandling å ena sidan för att få resultat inom två till tre veckor och för enkel jämförelse med 2D-tumör testsystem på andra sidan. Däremot kan behandlingsperioder förlängas för att undersöka långtidseffekter. Det bör dock beaktas att långtidsbehandling eller höga doser av den testade föreningen kan orsaka total cellförlust därigenom förhindra utvärderingen av spridning eller andra immunohistokemiska markörer.

För tillförlitlig signalering nätverksanalys, tumörsvar vid behandling med en viss förening måste analyseras skilja mellan spridning och apoptos. Dessa avläsningar är ansluten på annat sätt i signaleringsnätet. Således, särskiljande analys av båda parametrarna möjliggör en bättre förståelse av läkemedlets verkan och efterföljande mål förutsägelse. Som tidigare nämnts, är spridningen av tumörceller minskas i vår 3D-modell jämfört med 2D odlingsbetingelser och därmed bör minska falskt positiva resultat av testade cytostatiska föreningar. För bestämningen av proliferationsindex, det totala antalet kärnor och antalet kärnor positiva för Ki67 färgning måste kvantifieras med hjälp av programmet Fiji till exempel. Detta kan förenklas genom användningen av makron i 2D kulturer av tumörceller som är dock inte möjligt om cellerna bildar täta aggregat som detta resulterar i lägre eller högre antal kärnor, respektive. I samtliga fall makro inställningar måste justeras noggrant för varje cellinje och färgning. Apoptos kan kvantifieras icke-invasivt från supernatanterna mäter kaspas-klyvs cytokeratin 18, WHich är begränsad till celler med epiteliala egenskaper, med hjälp av M30-ELISA. Detta har flera fördelar: I) Den gör det möjligt att övervaka behandlingseffektivitet över tiden och att identifiera utgångspunkten för effektiv behandling. II) Prover inte förstörs och kan användas för andra utlästa tekniker. III) Epitelcellsproliferation apoptos kan skiljas från mesenkymala apoptos, som är optimal i samodling inställningar. Denna teknik kan dock vara olämpligt för tumörceller som genomgick EMT och därmed förlora sin epiteliala fenotyp. Således bör kontrolleras uttryck av cytokeratin 18 av varje tumör cellinje som används av immunhistokemiska färgningar innan denna teknik används. Testning av föreningar kan även utföras på ett mer tumörstamcellsliknande fenotyp. Vanligtvis i drogtestning olika invasiva stadier försummas även om de flesta av de riktade läkemedel, såsom TKI, tillämpas i mer avancerade tumörstadier. Vår modell möjliggör undersökning av invasiv eller ingenn-invasiv tumörceller, på grund av bevarade basala membranet 17 som cellerna måste passera under invasionsprocessen. Ett viktigt steg mot cellrörlighet och invasions är EMT som kan induceras i olika lungcancermodeller genom stimulering med TGF-beta-1 17,33. Detta minskar emellertid proliferation och därigenom cellantalet på ställningen. Denna negativa bieffekt kan kringgås genom applicering av dynamiska odlingsbetingelser som starkt ökar tumörcelltätheten i 3D-modeller. Även om bioreaktorn justerar kulturen till fysiologiska förhållanden, måste det anses att egenskaperna och signaleringscellen kan påverkas av exponering för skjuvspänning 25.

Använda in silico simuleringar att påskynda cellinje specifika drogtestning
Men bara halvkvantitativ, är händelseförloppet ordentligt modelleras av vår in silico modell av vårdfullt med tanke på mutationer kända för varje specifik cellinje. Detta inkluderar cellinje specifika modifieringar av de olika receptoraktiveringsnivåer, i vilken utsträckning deltar kinaser aktiveras och när och hur länge nätverksutgång såsom apoptos eller spridning är att vänta. Till exempel kan man tänka kliniskt kända c-MET amplifieringar som är tänkt att ske i ca 20% av förvärvad anti- EGFR terapi motstånd 30. Därefter beräknar in silico modell motsvarande nätverk beteende över tiden, t ex., Gefitinib resistensutveckling representeras av ökad spridning och minskad apoptos. I vår modell, identifierade vi MEK och PI3K som de mest lovande mål kandidater. Följaktligen ny potentiell terapeutisk kombination kan snabbt förväg utvärderas in silico, som ligger till grund för ytterligare tester in vitro. Dessutom utdata från in vitro-experiment kananvändas för att förfina in silico systemet genom justeringar nätverks som passar de experimentella resultaten bäst. Semi-kvantitativ in silico strategier har vissa begränsningar när det gäller nätverksstorlek (cirka kan anses 100 protein-proteininteraktioner). Vidare är det viktigt att integrera alla viktiga proteinnoder till nätverkstopologin, för att ge realistiska resultat. In silico-modellen ger således endast en approximation av det befintliga nätet i vardagstumörcellen. Men ger detta fokuserade visa oss att simulera specifika förändringar av intresse, till exempel., Effekten av läkemedelskombinationer på olika mutations bakgrunder i cellinje. Detta hjälper oss att systematiskt förstå komplexiteten i sådana cancersignaleringsnätverk samt härleda nya terapeutiska strategier.

Sammanfattningsvis, vi är övertygade om att vi har utvecklat en hjälpsam vävnadsteknisk in vitro verktyg som enkelt kan integreras i precliniska tester på effekten av enskilda läkemedelssubstanser och deras kombinationer. För att minska kostnaderna och tiden i tester, är denna tumörmodell dessutom kompletteras med en in silico verktyget gör det möjligt att förlänga de data som samlas till en cell-typ specifik förutsägelse av drog- och läkemedelskombinationseffekter inklusive klinikorienterade inriktade terapier eller nya spelare att överväga (t ex., miRNA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Denna forskning sponsrades av Centrum för tvärvetenskaplig Clinical Research (IZKF, bidrags BD247) av Universitetssjukhuset i Würzburg och Bayern Fit-programmet (som beviljats ​​Heike Walles).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Tags

Bioteknik Tissue Engineering 3D-tumörmodellen Boolean lungcancer biologisk byggnadsställning flöde bioreaktor proliferationsindex gefitinib apoptos TGF-beta-1 EMT
En kombinerad 3D vävnadstekniska<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Lungtumör modell för att förutsäga läkemedelseffektivitet i specifika Mutations bakgrunder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Göttlich, C., Müller, L.… More

Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter