Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53885
Automatic Translation
*1, *1, *3, 1, 1,4, 2, 3, 1,4, 1
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
* These authors contributed equally

Abstract

במחקר הנוכחי, שילבנו מודל גידול במבחנת 3D ריאות עם במודל סיליקון כדי לייעל תחזיות תגובת תרופה המבוססת על רקע מוטציה ספציפי. המודל שנוצר על פיגום חזירי decellularized שמעתיק מאפיינים רקמות ספציפיות לגבי הרכב תאי מטריקס ואדריכלות כולל קרום המרתף. קבענו סטנדרט פרוטוקול המאפשר דור רקמת גידול מלאכותי תוך 14 ימים, כולל שלושה ימים של טיפול תרופתי. המאמר שלנו מספק כמה תיאורים מפורטים של 3D לקריאה החוצה טכניקות הקרנה כמו הקביעה של מכתים Ki67 מדד התפשטות, אפופטוזיס מן supernatants ידי M30-ELISA והערכת אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), אשר הם כלים שימושיים עבור הערכה האפקטיבית תרכובות טיפוליות. נוכל להראות לעומת תרבות 2D הפחתה של התפשטות במודל הגידול 3D שלנו כי הוא relatאד למצב הקליני. למרות התפשטות נמוכה זה, המודל ניבא EGFR תגובות סמי -targeted כראוי בהתאם למצב הסמן הביולוגי, כפי שמוצג על ידי השוואה של שורות תאי סרטן הריאות HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) ו- A549 (wild-type EGFR, KRAS - מוטציה) שטופלו במעכבי קינאז-טירוזין (gefitinib TKI). כדי לחקור תגובות תרופה של תאים סרטניים מתקדמים יותר, אנו מושרה EMT על ידי טיפול ארוך טווח עם TGF-beta-1 לפי הערכת vimentin / פאן-cytokeratin מכתים immunofluorescence. A-bioreactor תזרים הועסק להתאים תרבות לתנאים פיסיולוגיים, אשר שפרו דור רקמות. יתר על כן, אנו מציגים שילוב של תגובות התרופה על טיפול gefitinib או גירוי TGF-beta-1 - אפופטוזיס, מדד התפשטות EMT - לתוך בוליאני במודל סיליקון. בנוסף, אנו מסבירים כיצד תגובות תרופה של תאים סרטניים עם רקע מוטציה ספציפי וספירהerstrategies כנגד התנגדות ניתן לחזות. אנו בטוחים כי 3D שלנו בגישה במבחנה במיוחד עם צמיחתה סיליקון מספק ערך מוסף עבור בדיקות סמים פרה-קליניות בתנאים מציאותיים יותר מאשר תרבית תאי 2D.

Introduction

תעשיית התרופות ניצבת בפני שיעורי תשה גבוהים של עד 95% בתחום הטיפול בסרטן בשלב הקליני גרימת עלויות עצומות 1-5. אחת הסיבות לגירעון זה היא העובדה כי כיום יעילות של תרכובות חדשות הפוטנציאל נבחנת בהקרנות בקנה מידה גדול על תרביות תאים 2D של שורות תאים סרטניים או במודלים של בעלי חיים. במודלים של בעלי החיים יש מורכבות גבוהות אבל יש הבדלים מכריעים בין עכברים ואנשים 6,7. בעשור האחרון, מודלים סרטן 3D באמצעות גישות שונות נוצרו כדי לגשר על הפער בין תרבות 2D של שורות תאים סרטניים מתחם 6,8,9 הגידול vivo. ההשפעה של סביבת 3D על התמיינות תאים וגם על איתות הוכחה במספר מחקרים שנים (למשל., על ידי מינה ביסל) 10,11. היום, מודלים 3D תרבית תאים רבים זמינים כתרביות אליפטית, הידרוג או שבבי microfluidic 12-16. למרות thesמודלי דואר לשפר מורכבים לעומת מערכות תרבות 2D קונבנציונליות, הוא בעיקר חסר microenvironment רקמות כי הוא ידוע כבעל השפעות תומכות גידול וגם יעילות תרופה משפיעה.

כדי לטפל בבעיה זו, יצרנו מודל הגידול 3D מבוסס על פיגום ביולוגי הנקרא SISmuc (קטן-המעי-submucosa + רירית) כי נגזר מְעִי צָם חזירי decellularized. ובכך, ארכיטקטורת רקמות מרכיבים חשובים של ECM כגון collagens השונה, כמו גם את מבנה הקרום במרתף נשמרות 17. תכונה ייחודית זו היא קריטית עבור דור מודל גידול של קרצינומות העולות epithelia ומהווים כ -80% של גידולים מוצקים. יתר על כן, קצב התפשטות במודל גידול רקמות מהונדסות שלנו מצטמצם לעומת שיעור גבוה באופן מלאכותי מושגת בתרבות 2D. כמו התפשטות הוא פרמטר חשוב בהערכת יעילות התרופה, בדיקות סמים מופעלת במודל שלנו יותר דומהתנאי in vivo גידולי 17.

על מנת להעריך את הפוטנציאל של המודל שלנו לחזות יעילות התרופה תלויי סמן ביולוגי כראוי, אנחנו כאן מוצגים נתונים עבור שתי שורות תאים שונות ריאות סרטן שונים במעמד -biomarker EGFR שלהם. מצב מוטציוני זו החל שייקבע באופן שיגרתי בחולי NSCLC. טיפולים ממוקדים עם TKIs כגון EGFR -inhibitor gefitinib נגד גידולים הנושאים תוצאות טובות יותר צג מוטציה ב- EGFR הפעיל בהשוואה לאלו עם כימותרפיה על בסיס פלטינה 18-21.

הקמנו כמה טכניקות לקריאה החוצה שרלוונטיות להערכת יעילות מתחמת. יתר על כן, לאחר גירוי TGF-beta-1 אנו מסוגלים לחקור פעולות מתחמות בתאי גידול שהחלו בתהליך EMT, אשר נחשב צעד חשוב שינוי ממאיר 22,23 ואשר מחובר סמים ההתנגדce 24.

מודל גידול 3D לאפשר ניטור תגובות תא ספציפי לטיפולים ממוקדים, כימותרפיה, או שילובי תרופות עם ניגודים טובים. כדי לשפר עוד יותר ולהאיץ הקרנת סמים להיתקל בהתנגדות, זה הוא השלים ידי סימולציה סיליקון. בהתבסס על כמה ניסויים, תגובת הגידול ניתן לחזות ב סיליקו לגבי התוצאות עבור מגוון רחב של תרופות ושילובים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

דו מימדי 1. (2D) תרבית תאים

  1. מסחרי להשיג קו תאים סרטניים HCC827 (DSMZ). תרבות הקו הסלולרי אדנוקרצינומה ריאות HCC827 (EGFR מוטנטי, wild-type KRAS) ב RPMI-1640 השלימו עם 20% FCS. שנה בינונית כל 2 - 3 ימים. פיצול התאים פעמיים בשבוע. תאים משמשים עד חלוף 20 הוא הגיע.
  2. מסחרית להשיג A549 קו תאים סרטניים (DSMZ). תרבות A549 שורת תאי ריאות קרצינומה (wild-type EGFR, KRAS מוטציה) ב RPMI-1640 בתוספת 10% FCS. בצעו את התרבות כאמור לעיל. תאים משמשים עד חלוף 20 הוא הגיע.
  3. בדוק את התאים באופן קבוע (כל 4 - 6 שבועות) עבור זיהומים כגון זיהומי mycoplasma.
  4. Culturing תאים A549 או HCC827 על coverslips זכוכית
    1. מקום 1 coverslip זכוכית סטרילית היטב בכל צלחת 24 גם באמצעות פינצטה.
    2. זרע 50,000 תאים סרטניים של שני שורות תאים בנפח של 500 μl בבארות עםהזכוכית coverslips, בהתאמה.
    3. תאי התרבות עד שהם מגיעים confluency של 70% בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C; 5% CO 2). במהלך תקופה זו, לשאוב את המדיום הישן בעזרת פיפטה פסטר ולהוסיף 500 μl בינוני טרי כל 2 - 3 ימים של תרבות.

2. דור של מערכות בדיקת גידול על פיגום קולגן ביולוגי

  1. תנאי תרבות סטטי
    1. צור את קטן המעי-submucosa + רירית decellularized (SISmuc) ולתקן אותה בין שתי טבעות מתכת, כתרי תא שנקראו, כמתואר בפרסום קודם 25.
    2. זרע 100,000 תאים מהאחד HCC827 או תאי A549 בנפח כולל של 500 μl על הצד של לומן לשעבר של המעי קבוע כתרי תא.
    3. אפשר תאים סרטניים לדבוק עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הוסף 1 מ"ל בינוני בתוך הכתר התא 1 מ"ל בחוץ.
    4. תרבות הגידולמודל בתנאים סטטי על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה במשך 14 ימים. שנה בינונית תרבות כל 2 - 3 ימים. לכן, לשאוב את המדיום בעזרת פיפטה פסטר פיפטה 1 מ"ל טרי RPMI עם כמות מתאימה של FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) בתוך הכתר התא 1.5 מ"ל של אותו מדיום בחוץ.
  2. תנאי התרבות דינמי
    1. הגדר את מערכת בדיקת גידול עם מטריקס decellularized בתוך כתרי תא זריעת תאים כמתואר לפי סעיף קטן 2.1.1 כדי 2.1.3.
    2. תרבות מודל הגידול בתנאים סטטיים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בחממה במשך 3 ימים.
    3. להרכיב את bioreactor autoclaved והכנס את SISmuc זרע כפי שפורסם בעבר 25.
    4. פיפטה 45 מ"ל RPMI עם כמות מתאימה של FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) לתוך הבקבוק וחברו את המכשיר דגימה ללא מחט למערכת צינורות בין bioreactor ואתבקבוק בינוני.
    5. מניחים את bioreactor בחממה, לחבר אותו המשאבה ותרבות המודל הגידול במשך 14 ימים נוספים עם זרימה בינונית קבועה (3 מ"ל / דקה) על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    6. שינוי מדיום התרבות השלם לאחר 7 ימים. בשביל זה, להעביר את bioreactor מן החממה מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. לשאוב את המדיום בבקבוק התקשורת בעזרת פיפטה פסטר. הרם את bioreactor בעוד aspirating להיפטר המדיום במערכת צינורות. בינוני טרי 45 מ"ל פיפטה לתוך הבקבוק. מניחים את bioreactor בחזרה לתוך החממה ולחבר אותו המשאבה.

טיפול 3. דגם גידול סטטי עם gefitinib

  1. תרבות מודל הגידול כמתואר בסעיף 2.1.
  2. באותו יום 11 של תרבות, להכין RPMI / FCS עם 1 gefitinib מיקרומטר (2.5 מ"ל לכל כתר התא). לשאוב את המדיום הישן מבארות בעזרת פיפטה פסטר להוסיף 1 מ"ל של gefitinib RPMI / FCS / מוכן בתוך tהוא כתר תא 1.5 מיליליטר של אותו המדיום בחוץ.
    הערה: פתרון gefitinib המניות המופשרת יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד.
  3. שינוי המדיום ביום 13 כמתואר לפי סעיף קטן 3.2.

גירוי 4. של דגם גידול סטטי עם בטא TGF-1 עבור אינדוקציה EMT

  1. תרבות מודל הגידול כמתואר בסעיף 2.1.
  2. ביום 3 של תרבות, להכין RPMI / FCS עם 2 ng / ml TGF-beta-1 עם הספק (2.5 מ"ל לכל כתר התא). לשאוב את המדיום הישן מבארות בעזרת פיפטה פסטר להוסיף 1 מ"ל של מוכן RPMI / FCS / TGF-beta-1 בתוך הכתר התא 1.5 מ"ל של אותו מדיום בחוץ. החלף בתוספת בינוני עם בטא TGF-1 כל 2 - 3 ימים עד יום 14, כמתואר תחת 4.2.

5.-outs קרא

  1. לקיחת דגימות עבור מדידות ELISA
    1. קח דגימות מן supernatants של סטטי (סעיף 2.1) ודינמי (סעיף 2.2) תרבות במהלךטיפול עם gefitinib (סעיף 3) ב ימים 11-14 התרבות כמצוין באיור 2. בנוסף, לקחת דגימה לפני הטיפול (T0).
    2. בתנאי תרבות סטטי, לקחת 100 מדגם μl מהחלק הפנימי של כתר התא. בתנאי תרבות דינמיים, להבריג את המזרק בהתקן הדגימה ולקחת 1 מיליליטר בינוני מחוץ למערכת bioreactor. אחסן את כל supernatants שנאספו ב -80 מעלות צלזיוס עד ELISA מתבצע.
  2. M30-ELISA עבור כימות אפופטוזיס
    1. כדי לכמת את אפופטוזיס את supernatants לבצע את assay מוות של תאים על פי הוראות היצרן. אפשר את כל ריאגנטים להגיע RT לפני ביצוע assay.
    2. ריאגנטים כל וורטקס. ממיסים את לוח לשטוף במים deionized טריים מ"ל 500. לדלל המצומד HRP עם 9.2 מ"ל של המצומד דילול מאגר ומערבבים. פיפטה 25 μl של תקן או מדגם לכל טוב.
    3. הוסף 75 μl של בדילול HRP Conjuפתרון שער לכל טוב. מכסים את הצלחת דגירה אותו על שייקר במשך 4 שעות ב RT. לשטוף את הצלחת באופן ידני, 5 פעמים עם 250 μl של פתרון לשטוף מוכן.
    4. הוסף 200 μl של 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) המצע היטב כל אחד. דגירה בחושך ב RT במשך 20 דקות. הוסף 50 μl של פתרון להפסיק היטב כל אחד. לנער את microplate במשך 10 שניות ולהשאיר את microplate למשך 5 דקות לפני שתקראו את הסעיף ספיגת. קבע את הספיגה ב 450 ננומטר קורא microplate. חשב את עקומת סטנדרט ועל ריכוזי בדגימות באמצעות תוכנית מתאימה לטיפול נתונים מסוג ELISA כגון מוצא.
  3. מכתים לדוגמא
    1. תיקון, פרפין הטבעה וסעיף הכנת דגם 3D
      1. תקן את SISmuc זורעים באמצעות 2.5 מ"ל paraformaldehyde 4% (PFA) לכל כתר התא עבור שעה 2 ו להטביע אותו לתוך פרפין
      2. כן 3 מיקרומטר סעיפי רקמות מכתימים כפי שפורסם בעבר25.
    2. תיקון של תאים שגודלו בתנאי 2D תרבות
      1. כאשר 70% המפגש הוא הגיע, לשטוף תאים בתרבית על coverslips זכוכית ב 24 גם צלחת אחת עם PBS ולתקן אותם עם 500 μl 4% PFA / היטב במשך 10 דקות.
      2. הסר PFA ולאחסן את coverslips זכוכית בצלחת-מכוסה היטב עם PBS ב 4 ° C עד מתבצע מכתים.
    3. H & E מכתימה
      1. הכתם בסעיפים rehydrated עם Hematoxylin / Eosin בתור מכתים סקירה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    4. מכתים Immunofluorescent של דגם 3D
      1. עבור מכתים immunofluorescent, לבצע אחזור אנטיגן על ידי הצבת את השקופיות deparaffinized ו rehydrated לסיר אדים עם חיץ ציטראט שחומם מראש (pH 6.0) במשך 20 דקות.
        הערה: ראה טבלת חומרים והציוד דרוש של להכנה של חיץ ציטראט.
      2. העברת שקופיותלמאגר הכביסה (0.5 M PBS חיץ + 0.5% Tween), סעיפים מעגלים עם עט PAP כדי למזער את הנפח הנדרש עבור פתרונות מכתימים במקום שקופיות בתא לחות.
      3. חסום סעיפי רקמה עם סרום 5% מן המין המארח של נוגדנים משני המשמשים קטנים 5.3.4.6 עבור 20 דקות ב RT.
      4. הסר בסרום חסימת ידי הקשה על השקופיות בעדינות ממחטת נייר ולהחיל את הנוגדן הראשוני בסעיפים כיתרו ב דילול פי הוראה של היצרן (ארנב נגד Ki67 1: 100, vimentin 1 נגד ארנב: 100, אנטי עכבר הפאן cytokeratin 1 : 100). דגירה O / N ב 4 ° C. עבור מכתים כפול, נוגדנים ראשוניים ממינים שונים מארח חייבים לשמש.
      5. בזהירות לשטוף נוגדן מאוגד עם כביסה חיץ שלוש פעמים במשך 5 דקות.
      6. לגילוי של איגודים ספציפיים-נוגדן אנטיגן, להחיל נוגדנים משני הדילול 1: 400 סדר הסעיפים לדגור על RT במשך שעה 1.
      7. לשטוף UNBנוגדן ound עם כביסה חיץ שלוש פעמים במשך 5 דקות.
      8. הר שקופיות עם בתווך מימי המכיל DAPI כדי counterstain גרעינים ולתת להם O / N יבש.
    5. מכתים Immunofluorescent של תאים בתרבית 2D
      1. הסר PBS לכסות את מכסה זכוכית תלושי זורעים עם 0.2% Triton-X100 ב PBS במשך 5 דקות עבור permeabilization. שטוף את מכסה זכוכית תלוש עם כביסת חיץ (0.5 Tween M PBS חיץ + 0.5%) במשך 5 דקות.
      2. בצע שלבים 5.3.4.3 כדי 5.3.4.7. לבצע את כל הפעולות בצלחת היטב על פלטפורמת נדנדה ולהסיר ריאגנטים על ידי היפוך לצלחת.
      3. עבור הרכבה, במקום ירידה של מדיום מימי המכיל DAPI כדי counterstain גרעינים על שקופית זכוכית ללא ציפוי ולהעביר את התלוש לכסות אליו עם התאים מול ההרכבה הבינונית באמצעות מלקחיים. תן לו להתייבש לפני ההדמיה.
  4. קביעת מדד הפצת נשק
    1. בצע immunofluorescentמכתים נגד Ki67 לפי סעיף 5.3.4. או 5.3 5.
    2. קח תמונות הניאון של קטעי רקמה או תאים בתרבית 2D עם מיקרוסקופ הפוכה. השתמש במסננים שונים לקחת תמונות של stainings DAPI ושל Ki67 stainings. עבור כימות, השתמש 10 תמונות סעיפי 3D או 5 תמונות של תרבויות 2D (20X גדלה) של כל תנאים מחלקים שאינם חופף של הדגימה.
    3. לקבוע מספר הגרעינים ומספר הגרעינים חיובי עבור Ki67 ב 2D
      1. רוזן Ki67 גרעינים חיוביים באופן ידני באמצעות דלפק תא תוסף של התוכנה 26 פיג'י. לכן, פתח את התמונה ולחץ על "תוספים" → "לנתח" → "מונה Cell". לחץ "אתחול" ובחר סוג הדלפק. לחץ על כל גרעין Ki67 חיובי. מספר הקליקים מוצג לצד סוג הדלפק שנבחר.
      2. עבור ספירת תאים אוטומטית של המספר הכולל של גרעינים ליצור מאקרו באמצעות פיג'י 27,28. adjust המאקרו עבור כל שורת מכתים התא. בעקבות, לראות דוגמה כיצד ליצור מאקרו.
        1. התחל מאקרו מקליט. פתח דימוי DAPI ולהמיר אותו לפורמט 8 סיבי על ידי לחיצה על "תמונה" → "סוג" → "8-bit". לחץ "שפר ניגודיות", להגדיר 'רווי' כמו "1" ו "לנרמל".
        2. הגדר "טשטש את המסווה" כדי לחדד את התמונה. השתמש 'רדיוס' של "1" ו "מסכה" של "0.60". לחץ על "סף אוטומטי", לבחור שיטה "RenyiEntropy" עם "אובייקטים לבנים על רקע שחור 'כדי binarise התמונה.
        3. לחץ על "התוספים" → "BioVoxxel" → "תכונות לא סדירות קו פרשת מים" עם רדיוס שחיקה "5" להפריד בין התאים. לחץ על "נתח" → "נתח חלקיקים" ולהגדיר את "גודל" כדי "0.02-אינפיניטי".
          הערה: מספר חלקיקים / תאיםמוצג בטבלת הסיכום כמו ספירה.
        4. לחץ על "צור" כדי לשמור מאקרו לניתוח תמונות נוספות.
    4. לקבוע מספר הגרעינים ומספר הגרעינים חיוביים עבור Ki67 ב -3 D באופן ידני כמתואר בסעיף קטן 5.4.3.1.
    5. חישוב המדד התפשטות הממוצע (PI) על פי הנוסחה הבאה:
      Equation1
      n = מספר התמונות (3D: 10, 2D: 5)

6. בדור סימולציה דגם גידול Silico לריפוי Anti- EGFR בתאי HCC827

  1. דור רשת באמצעות ניתוח תוכנת רשת
    1. להשתמש במסדי נתונים שונים ומוכרים כדי ליצור את רשת הגידול מבוססת על הפרמטרים של ניסוי לקריאה החוצה החשובים ורקע מוטאציות של הקו הסלולרי HCC827.
    2. פתח את תוכנת ניתוח הרשת 21 כדי להמחיש אתרֶשֶׁת.
      1. לחץ על "קובץ" → "חדש" סוג → 'מודלים JoVE_tumor' → ולחץ על "אישור" כדי ליצור רשת חדשה. לחץ על "צפון Closeup כיכר" → "אישור" כדי להמחיש את קולטן קרום כפול. לחץ על "חלבון גנרי" לדמיין צמתים (= חלבונים) כמל → סוג 'EGFR' → ולחץ על "אישור"; חוזר על זה כל צומת ברשת.
      2. לייבל צומת ברשת: קליק ימני → "שינוי צבע & בצורה ..." → לבחור עבור EGFR צמתים (EGF-EGFR) קוד צבע "255,0,0" (צבע אדום); עבור הצמתים c-MET ו- (ג-MET) קוד צבע "0,255,0" (צבע ירוק); עבור קוד צבע gefitinib "255,255,0" (צבע צהוב); עבור קוד צבע PI3K-Inh "204,204,204" (אפור בהיר צבע); עבור קוד צבע MEK-Inh "102,102,102" (אפור כהה צבע); עבור כל צומת האחרים בקוד צבע הרשת בוחר4; 255,255,255 "(צבע לבן).
      3. לחץ "הפנוטיפ" לדמיין הפרמטרים לקריאה בתור משושים → סוג 'התפשטות' → ולחץ על "אישור" → קליק ימני → "שינוי צבע & בצורת ..." → קוד צבע בחר "255,204,204" (סלמון צבע); חוזר על זה אפופטוזיס פרמטר → קוד צבע בוחר "255,51,204" (צבע סגול).
      4. דמיינו קצוות (= אינטראקציות): לחץ על "מעבר למדינה" עבור הפעלות (חיצים), לחץ על "עיכוב" עבור עכבות (חיצים קהים); חוזר זה עבור כל אינטראקציה ברשת.
    3. לחץ על "קובץ" → "שמירה בשם ..." → סוג 'JoVE_tumor models.xml' → לחץ על "שמור" כדי לשמור את רשת איתות שנוצר כפי .xml בפורמט.
  2. בסימולציה Silico באמצעות SQUAD
    הערה: SQUAD מייצג הטופולוגיה דואר רשת כמערכת בוליאני דיסקרטית לוגית (AND, OR, NOT) ומבצעת ניתוח מצב יציב. ניתוח המצב היציב משקף את שיווי המשקל של מערכת ואת האחריות על גירויי איתות (למשל., יישום סמים או מוטציה).
    1. 17 תוכנות SQUAD להרחיב, לחץ על "רשת טען" → העלאה 'JoVE_tumor models.xml' קובץ. לחץ על "ניתוח מפעיל":
      הערה: בשלב הבא, SQUAD חל פונקציה מעריכית לשרבב את הקישוריות לרשת בוליאני, המאפשר סימולציה דינמית של התנהגות הרשת לאורך זמן (עקומות הפעילות סיגמואיד צבעוני).
    2. לחץ על "מתקדם" → "Perturbator" כדי לכתוב פרוטוקול סימולציה. לדמות התנגדות EGFR אנטי: לחץ על "פרוטוקול ערוך"
      1. לחץ "הפרעות" → להשתמש תקן "initialstate = SS-4" (מצב יציב 4) → לחץ על "הוסף" כדי להוסיף "דופק קבוע חדש" → Select פרמטר "המדינה" → היעד בחר "להעיף" → הזמן בחר "0" → ערך בחר "0.4" → לחץ על "אישור".
      2. חזור על פעולה זו: לחץ על "הוסף" → פרמטר בחר "מדינה" → היעד בחר "c-MET" → בחר זמן "0" → ערך בחר "0.4" → לחץ על "אישור"; לחץ על "הוסף" → פרמטר בחר "מדינה" → היעד בחר "gefitinib" → הזמן בחר "0" → ערך בחר "1" → לחץ על "אישור".
      3. גדר ערכי מדינת צומת פעילה (EGF-EGFR): לחץ על "activenode" → לחץ על "ערוך" → מצב בוחר "0.8" → לחץ על "אישור"; עבור כל הצמתים אחרים: לחץ על "ערוך" → בחר מדינה "0" → לחץ על "אישור". לחץ על "אישור" כדי לשמור את הפרוטוקול.
      4. הצגת עקומות ספציפיים: לכו ללוח "אפשרויות" → בחר "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspases", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "אפופטוזיס", "התפשטות", "MEK-Inh" ו "PI3K-Inh" עבור ייצוג גרפי. לחץ על "אתחול" → "הפעל" כדי להתחיל סימולציה מלאה של תגובת המערכת. לחץ על "אפס" על מנת להתחיל סימולציה חדשה.
    3. לדמות PI3K בשילוב וטיפול מעכב MEK: לחץ על "פרוטוקול ערוך"
      1. השתמש באותו פרמטר צומת כמתואר תחת 6.2.2.1 - 6.2.2.3. לחץ "ההפרעות" → לחץ על "הוסף" כדי להוסיף "דופק קבוע חדש" → פרמטר בחר "מדינה" → היעד בחר "PI3K-Inh" → הזמן בחר "0" → ערך בחר "1" → לחץ על "אישור"; לחץ על "הוסף"להוסיף 'דופק קבוע חדש "→ פרמטר בחר" מדינה "→ היעד בחר" MEK-Inh "→ הזמן בחר" 0 "→ ערך בחר" 1 "→ לחץ על" אישור ".
      2. לחץ על "אישור" כדי לשמור את הפרוטוקול. לך ללוח "אפשרויות": השתמש באותו צומת עבור ייצוג גרפי כמתואר תחת 6.2.2.4. לחץ על "אתחול" → "הפעל" כדי להתחיל סימולציה מלאה של תגובת המערכת. לחץ על "אפס" על מנת לסיים את הסימולציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על בסיס פיגום SISmuc (איור 2 א ל C), הקמנו פרוטוקול הפעלה סטנדרטי עבור הדור, הגירוי והטיפול של מערכת בדיקת גידול 3D (איור 2 ד). מודל זה מאפשר קביעת מדד התפשטות כימות של אפופטוזיס באמצעות M30-ELISA כפי שמוצג באיור 1 ואיור 3, בהתאמה. איור 3 מראה נציג H & E מכתים של דגמי A549 ו HCC827 ומדידת אפופטוזיס נציג אחד עם gefitinib. המודל המוצג כאן נועד באמצעות הדוגמא של NSCLC -mutated EGFR אשר מטופל בהצלחה עם מעכבים ממוקדים במרפאת. במקביל, רק EGFR -mutated HCC827 התאים ולא התאים A549 להגיב עיכוב EGFR ידי gefitinib TKI במודל שלנו כפי שהוערך על ידי גידול של אפופטוזיס. איור 4 באיור 5 ג ו-ד '. כמו כן תחת gefitinib תנאי התרבות דינאמי הוא בעל השפעה חזקה על HCC827 EGFR -mutated (האיור 5D).

איור 6 מציג את טופולוגיית הרשת (איור 6 א) ומפורט בסימולציות סיליקון התנגדות טיפול EGFR אנטי HCC827 תאים (איור 6, C). רשת האיתות נוצרה באמצעות מסדי נתונים בספרות ידועים כגון HPRD, KEGG ו QIAGEN (גנים וג'ינס מסלולים), וכתוצאה מכך הטופולוגיה של 42 צומת ו -55 קצוות, דמיינו עם תוכנת CellDesigner 26. הסימולציה של EGFR מוטציה הנהג ידוע (באדום) ו- c-MET שיתוף הפעלה (בירוק, ערך סביב 0.7) מראה prol גדלשיעור iferation (עקומת סלמון) ושיעור אפופטוזיס ירד (עקומה סגולה) לאורך זמן המשקף gefitinib (בצהוב) התנגדות HCC827 תאים הולכים יחד עם הפעלה של MEK ו PI3K (איור 6, ירוקים ציאן כהים). מידול של PI3K משולב במעכבים MEK (כהים ועקומות אפורות בהירות) תוצאות נטילה של השפעת התנגדות EGFR אנטי, מפחיתת התפשטות ומשרת אפופטוזיס (איור 6 ג).

איור 1
איור 1. הפצת הדרג מצטמצם ב -3 D לעומת 2D תא תרבות. תאי HCC827 חיובי-Ki67 (אדום ב A ו- B) הוכתמו תרבית תאי 2D (א) ו תרבית תאי 3D על SISmuc (B). תאים HCC827 ותאי A549 נספרו ומדד התפשטות (אחוז התאים החיוביים Ki67) נקבע (C </ Strong>, נציג אחד לספור מתוך חמישה). ברי סולם ב A ו- B:. 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. SISmuc הפיגום מורפולוגיה וטיפול לוח זמנים עם gefitinib TKI תאים הם זורעים על SISmuc אשר מורכב submucosa המעי הדק (SIS) + רירית (א:. Brightfield, B: התאים מוכתם DAPI על גבי SISmuc, C: כיסוי של A ו- B) והוא קבוע כתרי תא ביום 0. הסכימה הטיפולית מוצגת D: שינויים בינוניים (MC) מבוצעים כל 2 עד 3 ימים. באותו יום 11 הטיפול מתחיל. Supernatants נאסף ומשומש עבור M30-ELISA על מנת לכמת אפופטוזיס לאורך זמן (חיצים ותיבות הכחולים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. gefitinib טיפול שינויים צמיחת תאים על SISmuc ומשרה אפופטוזיס HCC827, אבל לא מודלים גידול A549 3D. ללא כל טיפול, שורות תאים שניהם מקיימים בשכבה על SISmuc (A ו- B) וכן להסדיר מבנים הקריפטה לשעבר. בעוד דפוס הצמיחה של תאי A549 הוא לא השתנה לאחר טיפול עם gefitinib (C), מספר HCC827 תאים מצטמצם מלווה שינוי על צורת תא מוארכת (D). אפופטוזיס מושרה על ידי gefitinib ב HCC827 מודלים כפי שניתן לראות על ידי מדידות M30-ELISA מן supernatants תרבות (E D:. 100 מיקרומטר עבור א 'עד ד נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. TGF-beta-1 EMT גורם ב HCC827 תאים על SISmuc. HCC827 תאים בתרבית 3D מראים ביטוי הכולל של cytokeratin פאן (PCK) (ירוק A, A1) אבל תאים בודדים בלבד להביע vimentin (אדום A, א 2). לאחר גירוי TGF-beta-1, תאים לשנות המורפולוגיה שלהם צורה מוארכת והביטוי של vimentin הוא גדל מאוד (אדום B, B2), ואילו הביטוי של PCK נשמר (ירוק B, B1). בר סולם ב ': 100 מיקרומטר עבור A B. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. תרבית תאים דינמית משפרת רקמות הדורות. כאשר בתרבית בתנאי 3D בתוך bioreactor (B), בשכבה ממודל סטטי (A, H & E מכתים) משתנה מיום בשכבה (א) על רקמות רבות שכבתיות (C, צביעת H & E ). HCC827 תאים להראות תגובה תרופה חזקה על טיפול gefitinib (D, צביעת H & E). בר סולם ב D:. 100 מיקרומטר עבור A, C, ו- D אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
תאנה. 6. בדור סימולציה דגם גידול Silico של ההתנגדות תרפיה אנטי EGFR. טופולוגיית רשת של תאים סרטניים עם בלוטות איתות מפתח (מסלול EGFR) אדום וירוק (c-MET) ובלוטות הזרם שלהם. גידול מאפיין התפשטות פרמטרים לקריאה החוצה (סלמון) אפופטוזיס (בסגול) מיוצג משושה. החצים מצביעים על הפעלה, עיכוב חיצים קהה. מטרות טיפוליות מיוצגות על ידי מלבנים אפורים כהים ובהירים, העיכוב על ידי gefitinib מוצג בצהוב (א). סימולציה דינמית באמצעות דואר פונקציות (עקומות צבעוניות) לשרבב את הקישוריות לרשת בוליאני (AND, OR, NOT). EGFR ו- c-MET שיתוף ביטוי גורם התנגדות gefitinib כפי שצוינו על ידי גידול של התפשטות (עקומת סלמון) ומודעהecrease של אפופטוזיס (עקומה סגולה) לאחר 8 נקודת הזמן השרירותי על (B). מתמודד טיפול פוטנציאלי הוא PI3K ו- MEK ידי מעכבים (תחת עקומה צהובה; באותו הפעלה, ראה פרוטוקול). (ג) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הקמנו בשילוב במבחנה / במערכת מבחן הגידול סיליקון לתחזיות טיפול מונחה סמן ביולוגי. המודל במבחנת מעריכת היבטים חשובים שונים של פעולות תרכובת כגון שינויים של ריבוי תאים סרטניים אפופטוזיס על רקע מוטציה ספציפי שיכול לעבור סימולצית סיליקו 17. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי עבור הדור מודל הגידול 3D ובדיקה המתחם כולל כימות של שגשוג אפופטוזיס ואת הקמתה של מידע צופה פני מודל סיליקון. המודל הגידול 3D מבוסס על שורות תאים סרטניים נושאות מוטציות ספציפיות. תאים גדלים על מטריצת רקמות decellularized ב כתרי תא. Decellularization מטריקס, קיבעון בין (כתרי תא) שתי טבעות מתכת, רכבת של מערכת bioreactor וכן זריעה של הפיגום כבר דמיין יופיטר לפני 25.

בַּמַבחֵנָה גידול 3D דגם
התרגום של התוצאות שהושגו כאן למרפאת דורש בחירה זהירה של תאים סרטניים המתאימים נושאות מוטציות של עניין על מנת לסווג חולים על פי סמנים ביולוגיים עבור תרופות ממוקדות נבחרות. לרפואת מרובדת, זיהוי של מוטציות נהג druggable ידי רצף הדור הבא הוא חשש עיקרי במיוחד NSCLC ובתקווה יגלה סמנים גנטיים חדשים 29 בעתיד. עבור בדיקות במבחנה, במתחם של עניין צריך למקד אתר מעורבות רבה הקו הסלולרי נבחר או תאים ראשוניים. כאן, בתא קווי HCC827 ו A549 נבחרו בשל שונותם במעמד מוטציה ב- EGFR ודיווח רגישות יתר (HCC827 תאים) ורגישות ביניים (תאים A549) לקראת gefitinib TKI בתרבות 2D 30-32. בשלב הראשון של דור מודל גידול 3D, שיעורם ותקופת תרבית תאים של הגידול שנבחר יהיו תאים להיות adjusted אם תאים שונים שהוזכר כאן משמשים. כדי למצוא את הריכוז האופטימלי המתחם, רצוי לקבוע את ערך IC50 עם העזרה של assay הכדאיות למסחרית 2D. בהתבסס על בדיקה זו, המתחם אמור לשמש בריכוז IC50 ואת הריכוז הגבוה יותר ליד במודלי 3D. בחרנו שלושה ימי טיפול מצד אחד על מנת לקבל תוצאות בתוך שבועיים עד שלושה שבועות לצורך השוואה קל מערכות הבדיקה הגידול 2D מצד שני. עם זאת, תקופות הטיפול יכול להיות ממושך לחקור תופעות לטווח ארוך. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי טיפול לטווח ארוך או מינונים גבוהים של המתחם נבדק יכול לגרום לאובדן תא מלא ובכך למנוע את הערכה של התפשטות או סמני immunohistochemical אחרים.

עבור ניתוח רשתות איתות אמין, תגובות הגידול על טיפול עם תרכובת מסוימת צריכות להיות מנותחות הבחנה בין התפשטות apoפטוזיס. פסקי-לקרוא אלה מחוברים באופן שונה ברשת איתות. לפיכך, ניתוח ייחודי של שני הפרמטרים מאפשר הבנה טובה יותר של פעולת תרופה וחיזוי היעד הבא. כפי שהוזכר קודם לכן, ההתפשטות של תאים סרטניים מצטמצמת במודל 3D שלנו לעומת תנאי תרבות 2D וכך, צריך לצמצם תוצאות חיוביות שגויות של תרכובות cytostatic נבדקו. לקביעת מדד ההתפשטות, המספר הכולל של גרעינים ומספר הגרעינים חיוביים מכתים Ki67 צריכים לכמת באמצעות התוכנה פיג'י למשל. זה יכול להיות פשוט יותר על ידי השימוש של פקודות מאקרו בתרבויות 2D של תאים סרטניים אשר, עם זאת, לא ניתן אם התאים ליצור אגרגטים חזקים כמו זה תוצאות במספרים נמוכים או גבוהים של גרעינים, בהתאמה. בכל המקרים, את הגדרות המאקרו צריך להיות מותאם בקפידה עבור כל קו התא מכתים. אפופטוזיס ניתן לכמת הלא פולשני מן supernatants מדידת cytokeratin ביקע-caspase 18, WHich מוגבלת תאים בעלי מאפיינים אפיתל, באמצעות M30-ELISA. לפעולה זו מספר יתרונות: I) היא מאפשרת לעקוב אחר יעילות הטיפול לאורך זמן כדי לזהות את נקודת המוצא של טיפול יעיל. II) דוגמאות לא נהרסות והוא יכול לשמש טכניקות לקריאה החוצה אחרות. III) אפופטוזיס תא אפיתל ניתן להבחין בין אפופטוזיס mesenchymal, אשר הוא אופטימלי במסגרות שיתוף תרבות. טכניקה זו, לעומת זאת, יכולה להיות מתאימה תאים סרטניים שעברו EMT, ובכך לאבד פנוטיפ אפיתל שלהם. לפיכך, הביטוי של cytokeratin 18 של כל קו תאים סרטניים בשימוש צריך להיות מאומת על ידי stainings immunohistochemical לפני טכניקה זו מיושמת. בדיקה של תרכובות יכולה גם להתבצע פנוטיפ דמוי תא גזע סרטני יותר. בדרך כלל בבדיקת סמים בשלבי פולשנית שונים מוזנחים למרות שרוב התרופות הממוקדות, כגון TKIs, מוחלים בשלבי גידול מתקדמים יותר. המודל שלנו מאפשר חקירת פולשני או לאn-פולשני תאים סרטניים, עקב קרום הבסיס נשמר 17 אשר התאים צריכים לחצות במהלך תהליך פלישה. צעד מכריע לקראת תנועתיות תא הפולשנות הוא EMT שיכול להיגרם במודלי סרטן הריאות שונים על ידי גירוי עם TGF-beta-1 17,33. עם זאת, מפחית את מספר הנייד התפשטות ובכך על הפיגום. תופעת לוואי שלילית זו ניתן לעקוף על ידי היישום של תנאי תרבות דינמיים מגבירים משמעותיים בצפיפות תאים סרטניים במודלי 3D. למרות bioreactor מתאים תרבות לתנאים פיזיולוגיים, זה חייב להיחשב כי מאפייני התא איתות יכולים להיות מושפעים החשיפה גזירה מתח 25.

שימוש בהדמיות ממוחשבות Speed-up בדיקות סמי Cell-קו ספציפי
למרות שרק חצי כמותית, את השתלשלות האירועים היא מודל כראוי על ידי שלנו במודל סיליקון ידי טיפולמלא בהתחשב המוטציות ידועות לכל קו תאים ספציפי. זה כולל שינויים מסוימים שורת התאים של רמות הפעלת קולטן שונים, המידה שבה מעורב קינאזות מופעלים מתי וכמה זמן פלט רשת כגון אפופטוזיס או התפשטות צפוי. למשל, אפשר לשקול רחבות ידועות קליני c-MET כי הם חשבו להתרחש כ -20% של התנגדות טיפול EGFR אנטי רכש 30. בהמשך לכך, המודל סיליקון מחשב את התנהגות הרשת המתאימה לאורך זמן, למשל., פיתוח התנגדות gefitinib מיוצג על ידי התפשטות מוגברת וירידת אפופטוזיס. במודל שלנו, זיהינו MEK ו PI3K כמו המועמדים היעד המבטיחים ביותר. כתוצאה מכך, שילוב טיפולי פוטנציאלי חדש ניתן מראש העריך במהירות סיליקון, המשמש כבסיס לבדיקה נוספת במבחנה. בנוסף, נתוני התפוקה מניסויים במבחנה יכוליםלשמש כדי לחדד את במערכת סיליקון ידי התאמות רשת התואמות את תוצאות הניסוי הטוב ביותר. יש וכמותיות באסטרטגיות סיליקון כמה מגבלות לגבי גודל הרשת (כ -100 אינטראקציות חלבון-חלבון יכולה להיחשב). יתר על כן, חשוב לשלב את כל צומת חלבון המפתח לתוך טופולוגיית הרשת על מנת להניב תוצאות מציאותיות. המודל סיליקון ב ובכך נותן רק קירוב של הרשת הקיימת של תאים סרטניים החיים. עם זאת, מבט ממוקד זה מאפשר לנו לדמות שינויים ספציפיים של עניין, למשל., השפעת שילובי תרופות על רקע מוטאציות שונה שורת התאים. זה עוזר לנו להבין את המורכבות שיטתיות של רשתות איתות הסרטן כגון היטב כנובעים אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

לסיכום, אנו משוכנעים כי פתחנו רקמה מועילה מהונדסת כלי במבחנה שאפשר לשלב בקלות לתוך precliבדיקות nical על היעילות של תרכובות תרופה אחת ושילובים שלהם. כדי להפחית את העלויות וזמן בדיקות, מודל הגידול הזה יתר על כן הוא השלים ידי בכלי חיזוי סיליקון המאפשר להאריך את הנתונים שנאספו על חיזוי תא ספציפי מסוג של תופעות שילוב תרופות וסמים כוללים טיפולים במרפאת מוכווני ממוקדים או שחקנים חדשים לשקול (למשל., miRNAs).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה מומן על ידי המרכז למחקר קליני הבינתחומי (IZKF, BD247 מהענק) של בית החולים האוניברסיטאי של וירצבורג ותכנית Fit באיירן (שהוענקה היקה וואלס).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Tags

Bioengineering גיליון 110 הנדסת רקמות מודל גידול 3D בוליאני סרטן הריאות פיגום ביולוגי bioreactor זרימה מדד התפשטות gefitinib אפופטוזיס TGF-beta-1 EMT
רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Göttlich, C., Müller, L.… More

Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter