Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

A Tissue Combinada 3D Engineered Published: April 6, 2016 doi: 10.3791/53885
Automatic Translation
*1, *1, *3, 1, 1,4, 2, 3, 1,4, 1
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB
* These authors contributed equally

Abstract

No presente estudo, nós combinamos um modelo de tumor in vitro 3D pulmão com um modelo em silico para otimizar previsões de resposta à droga com base em um fundo mutacional específico. O modelo é gerado num andaime porcino descelularizado que reproduz as características específicas de tecidos em relação à composição da matriz extracelular e arquitectura, incluindo a membrana basal. Nós padronizado um protocolo que permite a geração de tecido tumoral artificial no prazo de 14 dias incluindo três dias de tratamento com fármaco. Nosso artigo fornece várias descrições detalhadas de 3D ​​leitura de técnicas de rastreio, como a determinação da do índice de proliferação Ki67 coloração, a apoptose a partir de sobrenadantes por M30-ELISA e avaliação de epitelial para mesenquimal (EMT), que são ferramentas úteis para avaliar a eficácia das compostos terapêuticos. Pudéssemos mostrar em relação à cultura 2D uma redução da proliferação em nosso modelo de tumor em 3D que é related com a situação clínica. Apesar desta proliferação inferior, o modelo previu EGFR de respostas ao fármaco -targeted correctamente de acordo com o estado biomarcador como se mostra por comparação das linhas de células de carcinoma de pulmão HCC827 (EGFR -mutated, KRAS do tipo selvagem) e A549 (EGFR de tipo selvagem, KRAS - mutado) tratados com o inibidor da tirosina-gefitinib cinase (TKI). Para investigar as respostas de drogas de células de tumor mais avançadas, EMT induzida por tratamento de longo prazo com TGF-beta-1, tal como avaliado por vimentina / imunofluorescência pan-citoqueratina. Um fluxo-biorreator foi empregado para ajustar a cultura às condições fisiológicas, o que melhorou a geração de tecido. Além disso, vamos mostrar a integração de respostas de drogas após tratamento gefitinib ou TGF-beta-1 de estimulação - a apoptose, índice de proliferação e EMT - em um booleano no modelo silico. Além disso, explicamos como respostas de drogas de células de tumor com um fundo mutacional específico e contagemerstrategies contra a resistência pode ser previsto. Estamos confiantes de que o nosso 3D abordagem in vitro especialmente com sua expansão in silico proporciona um valor adicional para testes de drogas pré-clínicos em condições mais realistas do que na cultura de células 2D.

Introduction

A indústria farmacêutica está de frente para altas taxas de desgaste de até 95% no domínio do tratamento do cancro em fase clínica provocando enormes custos 1-5. Uma razão para este défice é o facto de, actualmente eficácia de potenciais novos compostos é avaliada em rastreios de grande escala em culturas de células em 2D de linhas de células de cancro ou em modelos animais. Os modelos animais têm uma complexidade maior, mas existem diferenças cruciais entre ratos e homens 6,7. Na última década, modelos de cancro em 3D usando diferentes abordagens têm sido gerados para preencher a lacuna entre a cultura 2D de linhas celulares de cancro e um complexo de 6,8,9 tumor vivo. O impacto do ambiente 3D na diferenciação celular e também na sinalização tem sido demonstrado em vários estudos anos atrás (por ex., Por Mina Bissell) 10,11. Hoje em dia, muitos modelos de cultura de células estão disponíveis em 3D, tais como culturas de esferóides, hidrogéis ou chips de microfluidos 12-16. Mesmo que Tse modelos aumentarão a complexidade em relação aos sistemas convencionais de cultura 2D, que principalmente carecem de um microambiente tecido que é conhecido por ter efeitos apoiando-tumorais e também impactos eficácia da droga.

Para abordar esta questão, geramos um modelo de tumor 3D baseado em um andaime biológico chamado SISmuc (do intestino delgado-submucosa + mucosa), que é derivado de um jejuno porcinos descelularizados. Deste modo, a arquitectura do tecido e os componentes importantes da ECM, tais como diferentes colagénios, bem como a estrutura da membrana basal são preservados 17. Esta característica única é crucial para a geração modelo de tumor de carcinomas que surgem a partir do epitélio e compreendem cerca de 80% de tumores sólidos. Além disso, a taxa de proliferação no nosso modelo de tumor da engenharia de tecidos é reduzida em comparação com as elevadas taxas artificialmente alcançados na cultura 2D. Como a proliferação é um parâmetro importante para avaliar a eficácia dos medicamentos, testes de drogas está habilitado no nosso modelo em mais semelhantecondições para in vivo tumores 17.

A fim de avaliar o potencial do nosso modelo para prever a eficácia do fármaco-dependentes biomarcador corretamente, os dados aqui presentes para duas linhas de células de câncer de pulmão diferentes que diferem em seu estado EGFR -biomarker. Este estado mutacional começou a ser determinado rotineiramente em pacientes com NSCLC. Tratamentos direcionados com TKI como o EGFR -inhibitor gefitinib contra tumores que carregam uma mutação ativando mostra EGFR resultados superiores em comparação com aqueles com quimioterapia à base de platina 18-21.

Nós estabelecemos várias técnicas de leitura que são relevantes para avaliar a eficácia do composto. Além disso, após a TGF-beta-1 a estimulação somos capazes de investigar as acções de compostos em células tumorais que iniciou o processo de EMT, que se pensa ser uma etapa importante na transformação maligna 22,23 e que está ligado à droga resistance 24.

O modelo de tumor 3D permitem monitorar as respostas específicas de células para tratamentos dirigidos, quimioterapia, ou combinações de fármacos com boa contrastes. Para melhorar ainda mais e acelerar droga triagem e encontrar resistência, isto é complementado por uma simulação em silico. Com base em algumas experiências, a resposta do tumor pode ser previsto no silício em relação ao resultado de uma ampla gama de medicamentos e suas combinações.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bidimensional (2D) Cultura celular

  1. Comercialmente obter linha de células de tumor HCC827 (DSMZ). Cultura da linha celular de adenocarcinoma de pulmão HCC827 (EGFR mutante, KRAS do tipo selvagem) em meio RPMI-1640 suplementado com 20% de FCS. Alterar médio a cada 2 - 3 dias. Dividir as células duas vezes por semana. As células são usadas até que a passagem 20 seja atingido.
  2. Comercialmente obter tumor linha de células A549 (DSMZ). Cultura da linha celular de carcinoma do pulmão A549 (EGFR de tipo selvagem, KRAS mutado) em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FCS. Realizar a cultura tal como indicado acima. As células são usadas até que a passagem 20 seja atingido.
  3. Testar as células regularmente (de 4 - 6 semanas) por contaminações, tais como a contaminação por micoplasma.
  4. A cultura de células A549 ou em lamelas de vidro HCC827
    1. Coloque uma lamela de vidro esterilizada em cada poço de uma placa de 24 poços usando uma pinça.
    2. Semente 50.000 células tumorais de ambas as linhas celulares em um volume de 500 ul nos poços comas lamelas de vidro, respectivamente.
    3. Cultivar as células até atingirem uma confluência de 70% sob condições de cultura padrão (37 ° C; 5% de CO 2). Durante este tempo, Aspirar o meio de idade, utilizando uma pipeta Pasteur e adicionar 500 mL de meio fresco a cada 2 - 3 dias de cultura.

2. Geração de Sistemas de Teste Tumor em um Biológica colágeno andaime

  1. Condições de cultura estática
    1. Gerar o decelularizado do intestino delgado-submucosa + mucosa (SISmuc) e corrigi-lo entre dois anéis de metal, os chamados coroas celulares, conforme descrito na publicação anterior 25.
    2. Semear as células de ambos os 100.000 células A549 HCC827 ou em um volume total de 500 ul para o lado dos antigos lúmen do intestino fixo em coroas de células.
    3. Permitir que as células tumorais a aderir durante 2 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. Adicionar 1 ml de meio no interior da coroa de células e 1 ml de fora.
    4. Cultura do tumormodelo sob condições estáticas, a 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante 14 dias. Alterar meio de cultura a cada 2 - 3 dias. Portanto, Aspirar o meio com uma pipeta de Pasteur e pipeta de 1 ml fresco RPMI com a quantidade apropriada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) no interior da coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior.
  2. Condições cultura dinâmica
    1. Configure o sistema de teste de tumor com a matriz decelularizado dentro das coroas celulares e semeadura de células como descrito na subseção 2.1.1 a 2.1.3.
    2. Cultura o modelo de tumor, em condições estáticas 37 ° C, 5% de CO 2 na incubadora durante 3 dias.
    3. Monte o biorreator autoclavado e inserir o SISmuc semeado conforme publicado anteriormente 25.
    4. Pipetar 45 ml de RPMI com a quantidade apropriada de FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) para o balão e o dispositivo de amostragem se conectam sem agulha para o sistema de tubagem entre o biorreactor e abalão médio.
    5. Colocar o biorreactor na incubadora, ligá-lo à bomba e o modelo de tumor de cultura durante mais 14 dias, com uma constante de fluxo médio (3 ml / min) a 37 ° C, 5% de CO 2.
    6. Mudar o meio de cultura após 7 dias. Para isso, mover o bioreactor do incubador sob uma câmara de fluxo laminar. Aspirar o meio no frasco de suporte, utilizando uma pipeta de Pasteur. Levante o biorreator, enquanto a aspiração de se livrar do meio no sistema de tubulação. Pipetar 45 ml de meio fresco para o balão. Coloque o biorreator de volta para a incubadora e ligá-lo à bomba.

3. Tratamento do Modelo de tumor estáticas com gefitinib

  1. Cultura o modelo de tumor, como descrito na secção 2.1.
  2. No dia 11 de cultura, preparar RPMI / FCS com 1 gefitinib? M (2,5 ml para cada coroa celular). Aspirar a idade média dos poços usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 1 ml de meio RPMI preparado / FCS / gefitinib dentro tele coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior.
    NOTA: A solução de estoque descongelado gefitinib pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana.
  3. Alterar o meio no dia 13 como descrito na subsecção 3.2.

4. Estimulação do Modelo de tumor estáticas com FTC-beta-1 para indução de EMT

  1. Cultura o modelo de tumor, como descrito na secção 2.1.
  2. Pelo dia 3 de cultura, preparar RPMI / FCS com 2 ng / ml de TGF-beta 1 com o transportador (2,5 ml para cada coroa de células). Aspirar a idade média dos poços usando uma pipeta de Pasteur e adicionar 1 ml de meio RPMI preparado / FCS / FTC-beta-1 no interior da coroa de células e 1,5 ml do mesmo meio exterior. Mudança de meio suplementado com FTC-beta-1 a cada 2 - 3 dias até 14 dias, conforme descrito em 4.2.

5. Leia-outs

  1. Recolha de amostras para medições de ELISA
    1. Recolher amostras dos sobrenadantes de estática (seção 2.1) e cultura dinâmica (ponto 2.2) duranteo tratamento com gefitinib (secção 3) nos dias 11-14 da cultura, tal como indicado na Figura 2. Para além disso, tomar uma amostra antes do tratamento (T0).
    2. Sob condições de cultura estática, tomar amostra de 100 ul a partir do interior da célula coroa. Sob condições de cultura dinâmica, o parafuso de seringa no dispositivo de amostragem e levar 1 ml de meio para fora do sistema de biorreactor. Armazenar todos os sobrenadantes recolhidos a -80 ° C até o ensaio ELISA é realizado.
  2. M30-ELISA para a Quantificação de Apoptose
    1. Para quantificar a apoptose nos sobrenadantes de realizar o ensaio de morte celular de acordo com as instruções do fabricante. Todos os reagentes para atingir a TA antes de realizar o ensaio.
    2. Vortex todos os reagentes. Dissolva o comprimido de lavagem em água deionizada fresco 500 ml. Dilui-se conjugado de HRP com 9,2 ml de tampão de diluição de conjugado e misturar. Pipetar 25 ul de padrão ou de amostra por poço.
    3. Adicionar 75 ml da HRP Conju diluídasolução portão por poço. Cobrir a placa e incubar-lo num agitador durante 4 h à TA. Lava-se a placa manualmente, 5 vezes com 250 ul de solução de lavagem preparada.
    4. Adicionar 200 ul de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) a cada poço. Incubar no escuro a temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar 50 ul de solução de paragem a cada poço. Agitar a microplaca durante 10 segundos e deixar a microplaca durante 5 min antes de ler a absorvância. Determinar a absorvância a 450 nm num leitor de microplacas. Calcula-se a curva padrão e as concentrações nas amostras utilizando um programa adequado para lidar com dados do tipo de ELISA tais como a origem.
  3. coloração amostra
    1. Fixação, parafina-incorporação e Seção Preparação do modelo 3D
      1. Fixar o SISmuc semeado com 2,5 ml de paraformaldeído a 4% (PFA) por coroa celular para 2 horas e incorporá-lo em parafina
      2. Preparar 3 uM secções de tecido para a coloração, tal como publicado anteriormente25.
    2. Fixação de células cultivadas em 2D Condições Cultura
      1. Quando 70% de confluência é atingido, lavar as células cultivadas sobre lamelas de vidro em placas de 24 poços uma vez com PBS e corrigi-los com 500 ul de 4% PFA / poço, durante 10 min.
      2. Remover PFA e armazenar as lamelas de vidro para o bem-placa coberta com PBS a 4 ° C até a coloração é realizada.
    3. H & E coloração
      1. Corar as secções re-hidratadas com Hematoxilina / Eosina como uma coloração visão geral de acordo com protocolos padrão.
    4. Coloração de imunofluorescência do modelo 3D
      1. Para coloração por imunofluorescência, realizar uma recuperação de antigénios, colocando as lâminas desparafinizadas e re-hidratadas numa panela a vapor pré-aquecido com tampão citrato (pH 6,0) durante 20 min.
        NOTA: Consulte a tabela de materiais e equipamentos de para a preparação de tampão citrato.
      2. Transferir as lâminaspara o tampão de lavagem (tampão PBS, 0,5 M + Tween a 0,5%), as secções do círculo com uma caneta PAP para minimizar o volume necessário para as soluções de coloração e coloque as lâminas numa câmara de humidade.
      3. Bloquear as secções de tecido com 5% de soro a partir das espécies de hospedeiros dos anticorpos secundários utilizados na alínea 5.3.4.6 durante 20 min à TA.
      4. Remover o soro de bloqueio agitando ligeiramente as lâminas com um lenço de papel e aplicar o anticorpo primário às secções cercados numa diluição, de acordo com as instruções do fabricante (coelho anti Ki67 1: 100, de coelho anti vimentina 1: 100, de ratinho anti pan-citoqueratina 1 : 100). Incubar O / N a 4 ° C. Para double-coloração, devem ser utilizados anticorpos primários de diferentes espécies hospedeiras.
      5. Lavar cuidadosamente off anticorpo não ligado com tampão de lavagem três vezes por 5 min.
      6. Para a detecção de ligações específicas de antigénio-anticorpo, anticorpos secundários aplicar na diluição de 1: 400 para as secções e incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
      7. Lavar UnBanticorpo ound com tampão de lavagem três vezes durante 5 min.
      8. Montar as lâminas com um meio aquoso contendo DAPI para contracoloração núcleos e deixe-os secar O / N.
    5. Coloração por imunofluorescência de células cultivadas 2D
      1. Remover PBS e cobrir as lamelas de vidro semeada com 0,2% de Triton-X100 em PBS durante 5 min para a permeabilização. Lavam-se as lamelas de vidro com tampão de lavagem (tampão PBS, 0,5 M + Tween a 0,5%) durante 5 min.
      2. Execute as etapas de 5.3.4.3 a 5.3.4.7. Executar todos os passos do bem-placa sobre uma plataforma oscilante e remover os reagentes invertendo a placa.
      3. Para a montagem, detectar uma gota de meio aquoso contendo DAPI para contracoloração núcleos em uma lâmina de vidro revestido e não transferir a lamela a ele com as células de frente para o meio de montagem usando uma pinça. Deixe secar antes de imagem.
  4. Determinação do índice de proliferação
    1. execute imunofluorescênciamanchando contra Ki67 de acordo com a seção 5.3.4. ou 5,3 5.
    2. Tome imagens fluorescentes das secções de tecidos ou células cultivadas em 2D com um microscópio invertido. Use diferentes filtros para tirar imagens de colorações DAPI e de colorações Ki67. Para a quantificação, usar 10 imagens de secções 3D ou 5 imagens das culturas 2D (20x) de cada condição de partes não sobrepostas da amostra.
    3. Determinar o número de núcleos e o número de núcleos positivos para Ki67 em 2D
      1. Contagem Ki67 núcleos positivos manualmente usando o contador de células plug-in do software Fiji 26. Portanto, abra a imagem e clique em "Plugins" → "Analisar" → "Cell Contador". Pressione o botão "Iniciar" e selecione um tipo de contador. Clique em cada núcleo Ki67 positivo. O número de cliques é mostrado ao lado do tipo de contador selecionado.
      2. Para contagem de células automático do número total de núcleos criar uma macro usando Fiji 27,28. AdjUst a macro para cada linha de coloração e celular. A seguir, veja um exemplo de como criar uma macro.
        1. Comece gravador de macro. Abra uma imagem de DAPI e convertê-lo para o formato de 8 bits, clicando em "Imagem" → "Tipo" → "8-bit". Clique em "Melhore o contraste", definir "saturada" como "1" e "normalizar".
        2. Defina "máscara de nitidez" a nitidez da imagem. Usar um "raio" de "1" e uma "máscara" de "0,60". Clique em "limiar de auto", escolher o método de "RenyiEntropy" com "objetos brancos sobre fundo preto" para binarise a imagem.
        3. Clique em "Plugins" → "BioVoxxel" → "características irregulares divisor de águas" com um raio erosão do "5" para separar as células. Clique em "Analisar" → "Analisar Particles" e definir o "tamanho" para "0,02-Infinito".
          NOTA: O número de partículas / células émostrados na tabela de resumo como contagens.
        4. Clique em "Criar" para salvar macro para a análise de novas imagens.
    4. Determinar o número de núcleos e número de núcleos positivos para Ki67 em 3D manualmente, conforme descrito no subitem 5.4.3.1.
    5. Calcula-se a média índice de proliferação (PI), de acordo com a seguinte fórmula:
      equação1
      n = número de imagens (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico Geração Tumor Modelo e Simulação de terapia anti-EGFR em células HCC827

  1. Generation Network usando um software de análise de rede
    1. Use diferentes bases de dados conhecidos para gerar a rede de tumor com base nos parâmetros experimentais importantes de leitura e do fundo mutacional da linha de células HCC827.
    2. Abra o software de análise de rede 21 para visualizar arede.
      1. Clique → "Novo" → tipo 'modelos' JoVE_tumor "File" → clique em "OK" para gerar uma nova rede. Clique em "Praça do close up do Norte" → "OK" para visualizar o receptor em uma membrana dupla. Clique em "Protein genérico" para visualizar os nós (= proteínas) como retângulos → tipo 'EGFR "→ clique em" OK "; repetir este procedimento para cada nó na rede.
      2. Rotular os nós na rede: clique com o botão direito → "Shape Change Color & ..." → selecionar para nós EGFR e (EGF-EGFR) código de cor "255,0,0" (cor vermelha); Para nós de c-MET e (c-MET) código de cor "0,255,0" (cor verde); para código de cor gefitinib "255,255,0" (cor amarela); para código de cor PI3K-INH "204204204" (cor cinza claro); para código de cor MEK-INH "102102102" (cor cinza escuro); para todos os outros nós no seleto código de cor rede4; 255,255,255 "(cor branca).
      3. Clique em "Fenótipo" para visualizar parâmetros ler-out como hexágonos → tipo 'proliferação "→ clique em" OK "→ clique com o botão direito → → selecione o código de cor" 255204204 "(salmão cor)" mudar de forma ... Cor & "; repetir este para o parâmetro apoptose → selecione a cor do código "255,51,204" (cor violeta).
      4. Visualize Edges (= interações): Clique em "Estado de Transição" para ativações (setas), clique em "inibição" de inibições (flechas embotadas); repetir este procedimento para cada interacção na rede.
    3. Clique em "Arquivo" → "Salvar como ..." → tipo 'JoVE_tumor models.xml "→ clique em" Save "para salvar a rede de sinalização gerada como XML formato.
  2. In Silico Simulação usando SQUAD
    NOTA: SQUAD representa the topologia da rede como um sistema discreto lógico Booleano (AND, OR, NOT) e executa uma análise de estado estacionário. A análise estado estável reflete o equilíbrio do sistema e a responsabilidade sobre estímulos de sinalização (por exemplo., A aplicação de drogas ou mutação).
    1. Abrir software SQUAD 17, clique em "Network Load" → de upload 'JoVE_tumor models.xml' arquivo. Clique em "análise Run":
      NOTA: Em seguida, aplica-se SQUAD função exponencial para interpolar a conectividade de rede booleana, que permite a simulação dinâmica do comportamento da rede ao longo do tempo (coloridas curvas de atividade sigmóide).
    2. Clique em "Avançado" → "Perturbator" para escrever um protocolo de simulação. Simular a resistência anti-EGFR: Clique em "Editar Protocolo"
      1. Clique em "perturbação" → usar padrão "initialState = SS-4" (estado estacionário 4) → Clique em "Adicionar" para adicionar "novo pulso Constant → Select parâmetro "estado" → "FLIP" Selecionar destino → Select tempo "0" → Select valor "0,4" → Clique em "OK".
      2. Repita isso: Clique em "Adicionar" → Seleccionar o parâmetro "estado" → Selecionar destino "c-MET" → Select tempo "0" → Select valor "0,4" → Clique em "OK"; Clique em "Adicionar" → Seleccionar o parâmetro "estado" → "gefitinib" Selecionar destino → Select tempo "0" → Select valor "1" → Clique em "OK".
      3. Defina um valor de estado de nó ativo (EGF-EGFR): Clique em "activenode" → Clique em "Editar" → Selecione o estado "0.8" → Clique em "OK"; para todos os outros nós: Clique em "Editar" → Selecione estado "0" → Clique em "OK". Clique em "OK" para salvar o protocolo.
      4. Exibir curvas específicas: Vá para o painel "Opções" → Escolha "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "caspases", "(c-MET)", "PI3K", "gefitinib", "apoptose", "proliferação", "MEK-INH" e "PI3K-INH" para a representação gráfica. Clique em "Iniciar" → "Executar" para iniciar uma simulação completa de resposta do sistema. Clique em "Reset" para iniciar uma nova simulação.
    3. Simular PI3K combinada e tratamento inibidor MEK: Clique em "Editar Protocolo"
      1. Usar o mesmo parâmetro de nó, conforme descrito em 6.2.2.1 - 6.2.2.3. Clique em "perturbação" → Clique em "Adicionar" para adicionar "novo pulso Constant → Seleccionar o parâmetro" estado "→ Select target" PI3K-INH "→ Select tempo" 0 "→ Select valor" 1 "→ Clique em" OK "; Clique em "Adicionar"para adicionar "novo pulso Constant → Seleccionar o parâmetro" estado "→ Select target" MEK-INH "→ Select tempo" 0 "→ Select valor" 1 "→ Clique em" OK ".
      2. Clique em "OK" para salvar o protocolo. Vá para o painel "Opções": Use mesmos nós de representação gráfica conforme descrito em 6.2.2.4. Clique em "Iniciar" → "Executar" para iniciar uma simulação completa de resposta do sistema. Clique em "Reset" para terminar a simulação.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na base do andaime SISmuc (Figura 2A a C), foi estabelecido um protocolo de funcionamento normalizado para a geração, a estimulação e tratamento de um sistema de teste do tumor 3D (Figura 2D). Este modelo permite a determinação do índice de proliferação e a quantificação da apoptose utilizando M30-ELISA, como mostrado na Figura 1 e Figura 3, respectivamente. A Figura 3 mostra representativa H & E de coloração de modelos A549 e HCC827 e uma medição de apoptose representante com gefitinib. O modelo aqui apresentado é concebido usando o exemplo de EGFR NSCLC -mutated que é tratada com sucesso com inibidores alvejados na clínica. Correspondentemente, apenas o EGFR -mutated HCC827 células e não as células A549 respondem à inibição de EGFR gefitinib pelo TKI no nosso modelo, tal como avaliado pelo aumento da apoptose. Figura 4 Figura 5C e D. Além disso, sob condições de cultura dinâmicas gefitinib tem um forte efeito sobre o EGFR HCC827 -mutated (Figura 5D).

A Figura 6 mostra a topologia de rede (Figura 6A) e detalhadas em simulações in silico de resistência anti-EGFR em terapia HCC827 células (Figura 6B, C). A rede de sinalização foi gerado usando as bases de dados da literatura conhecidas, tais como HPRD, KEGG e QIAGEN (Genes & Pathways), resultando em uma topologia de nós 42 e 55 as bordas, visualizado com software CellDesigner 26. A simulação de driver conhecido EGFR mutação (em vermelho) e co-ativação c-MET (em verde, valor em torno de 0,7) mostra um aumento proltaxa de iferation (curva de salmão) e uma diminuição da taxa de apoptose (curva violeta) ao longo do tempo refletindo gefitinib (em amarelo) resistência no HCC827 células indo junto com uma ativação da MEK e PI3K (Figura 6B, verde escuro e ciano). Modelação da PI3K combinados e inibidor MEK (escuras e claras curvas cinza) resulta em uma reversão do efeito anti- resistência EGFR, reduz a proliferação e induz a apoptose (Figura 6C).

figura 1
Figura 1. Proliferação tarifa é reduzida em 3D em relação à cultura celular 2D. Células HCC827 Ki67-positivas (vermelho em A e B) foram coradas em cultura 2D de células (A) e de cultura de células 3D em SISmuc (B). HCC827 células A549 e as células foram contadas e foi determinado o índice de proliferação (percentagem de células positivas Ki67) (C </ Strong>, um representante contagem de cinco). Barras de escala em A e B:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Andaime SISmuc Morfologia e regime de tratamento com o TKI de Gefitinib As células são semeadas no SISmuc que consiste de submucosa de intestino delgado (SIS) + mucosa (R:. De campo claro, B: células coradas DAPI no topo do SISmuc, C: sobreposição de A e B) e é fixo em coroas de células no dia 0. O esquema de tratamento é mostrada em D: alterações médias (MC) são realizados a cada 2 a 3 dias. No dia 11, o tratamento é iniciado. Os sobrenadantes são recolhidos e utilizados para M30-ELISA a fim de quantificar a apoptose ao longo do tempo (setas e caixas azuis). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. O tratamento Gefitinib alterações no crescimento celular na SISmuc e induz a apoptose em HCC827, mas não em modelos de tumores A549 em 3D. Sem qualquer tratamento, ambas as linhas celulares formam uma monocamada no SISmuc (A e B) e também as estruturas anteriores resolver cripta. Embora o padrão de crescimento de células A549 não é alterada após o tratamento com gefitinib (C), o número de células é reduzida HCC827 acompanhada por uma mudança para uma célula forma alongada (D). A apoptose é induzida por gefitinib, em modelos HCC827 como visto por meio de medições M30-ELISA a partir de sobrenadantes de cultura (E D:. 100 mm para A a D Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. TGF-beta-1 induz EMT em HCC827 células no SISmuc. HCC827 células cultivadas em 3D mostram a expressão global do pan-citoqueratina (PCK) (verde em A, A1), mas apenas as células individuais expressam vimentina (vermelho em A, A2). Depois de FTC-beta-1 a estimulação, as células mudam de morfologia de uma forma alongada e a expressão de vimentina é fortemente aumentado (vermelho em B, B2), ao passo que a expressão de PCK é mantida (verde em B, B1). A barra de escala em B: 100 um para uma B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Cultura celular dinâmico Melhora Tissue geração. Quando em cultura em condições 3D num biorreactor (B), a monocamada de um modelo estático (A, H & E coloração) muda de uma monocamada (A) a um tecido de camadas múltiplas (C, H & E coloração ). HCC827 células mostram uma resposta forte droga após tratamento com gefitinib (D, H & E coloração). Barra de escala no D:. 100 mm para A, C, e D Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
FIG. 6. Geração de Tumor In Silico Modelo e Simulação de topologia Anti- EGFR Terapia Resistência. Rede de uma célula de tumor com os nós principais de sinalização em vermelho (via EGFR) e verde (c-Met) e os seus nodos jusante. O tumor característico proliferação de leitura para os parâmetros (de salmão) e apoptose (no violeta) são representados como hexágono. As setas indicam a activação, as setas embotadas inibição. Alvos terapêuticos são representados por rectângulos cinzentos claros e escuros, a inibição por gefitinib é mostrado em amarelo (A). Simulação dinâmica por e-funções (curvas coloridas) interpolar a conectividade de rede booleano (AND, OR, NOT). EGFR e co-expressão de c-MET causa resistência gefitinib como indicado por um aumento da proliferação (curva de salmão) e adecrease de apoptose (curva violeta) após cerca arbitrária tempo ponto 8 (B). Tackles potenciais terapia tanto PI3K e MEK por inibidores (sob a curva amarela; mesmo ativação, consulte Protocol). (C) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nós estabelecemos um combinado in vitro / in sistema de teste tumor silico para previsões de tratamento guiado por biomarcadores. O modelo in vitro avalia diferentes aspectos importantes de acções compostos, tais como mudanças de proliferação de células tumorais e a apoptose em um fundo mutacional específico, que também pode ser simulada in silico 17. Aqui, apresentamos o protocolo padronizado para 3D geração de modelo de tumor e teste composto incluindo a quantificação da proliferação e apoptose e o estabelecimento de uma previsão no modelo de silício. O modelo de tumor de 3D é baseado em linhas celulares de tumores portadores de mutações específicas. As células são cultivadas numa matriz de tecido descelularizada em coroas de células. Decellularization Matrix, a fixação entre os dois anéis de metal (coroas celulares), montagem do sistema de biorreator, bem como a semeadura do andaime foram visualizados em JoVE antes de 25.

Em vitro Tumor modelo 3D
A tradução dos resultados aqui obtidos na clínica requer uma cuidadosa selecção de células tumorais adequados que ostentam mutações de interesse, a fim de classificar os pacientes de acordo com biomarcadores para medicamentos direcionados selecionados. Para medicina estratificada, a identificação de mutações do controlador druggable por sequenciação próxima geração é uma grande preocupação especialmente em NSCLC e venha a revelar novos marcadores genéticos no futuro 29. Para os testes in vitro, o composto de interesse deve atingir um local que é altamente activo na linha celular escolhida ou em células primárias. Aqui, as linhas de células A549 e HCC827 foram escolhidos devido à sua diferença no estado de mutação do EGFR e relataram hipersensibilidade (HCC827 células) e sensibilidade intermediária (células A549) para a gefitinib TKI em cultura 2D 30-32. No primeiro passo da geração do modelo de tumor, o número de células e cultura 3D período do tumor selecionado células têm de ser Ajusted se forem utilizadas células diferentes do aqui mencionado. Para determinar a concentração de composto óptimo, é aconselhável para determinar o valor de IC50 com o auxílio de um ensaio de viabilidade disponível comercialmente em 2D. Com base neste teste, o composto deve ser utilizado na concentração de IC50 e a próxima concentração mais elevada nos modelos em 3D. Nós escolhemos três dias de tratamento, por um lado, a fim de obter resultados dentro de duas a três semanas, e para facilitar a comparação com os sistemas de teste do tumor 2D, por outro lado. No entanto, períodos de tratamento pode ser prolongado para investigar prazo em efeitos a longo. No entanto, deve considerar-se que o tratamento a longo prazo ou de doses elevadas do composto de teste pode causar a perda de célula completa evitando assim a avaliação da proliferação ou outros marcadores imuno-histoquímicos.

Para a análise fiável rede de sinalização, as respostas de tumor após tratamento com um determinado composto tem que ser analisados ​​distinguir entre a proliferação e a apoptose. Estes read-outs são diferentemente conectado na rede de sinalização. Assim, a análise distinta de ambos os parâmetros permite uma melhor compreensão da acção do fármaco e subsequente previsão alvo. Como mencionado antes, a proliferação de células tumorais é reduzido no nosso modelo 3D em comparação com as condições de cultura 2D e assim, devem reduzir a resultados falsos positivos de compostos citostáticos testados. Para a determinação do índice de proliferação, o número total de núcleos e o número de núcleos positivos para a coloração de Ki67 tem que ser quantificada utilizando o software Fiji, por exemplo. Isto pode ser simplificado pela utilização de macros em culturas 2D de células tumorais que é, no entanto, não é possível se as células formam agregados apertados como isto resulta em maiores ou menores números de núcleos, respectivamente. Em todos os casos, as definições de macro têm de ser ajustadas com cuidado para cada linha de células e a coloração. A apoptose pode ser quantificada de forma não invasiva a partir dos sobrenadantes medindo citoqueratina clivada da caspase-18, WHHIC é restrita a células com características epiteliais, usando M30-ELISA. Isto tem várias vantagens: i) permite para monitorizar a eficácia do tratamento ao longo do tempo e para identificar o ponto de partida de um tratamento eficaz. II) As amostras não são destruídas e podem ser usados ​​para outras técnicas de leitura. III) a apoptose de células epiteliais podem ser distinguidos de apoptose mesenquimais, que é óptima em configurações de co-cultura. Esta técnica, no entanto, pode ser inapropriado para células tumorais que se submeteram a EMT, perdendo assim o seu fenótipo epitelial. Assim, a expressão de citoqueratina 18 de cada linha celular tumoral utilizada deve ser verificada por meio de colorações imunohistoquímicas antes desta técnica é aplicada. Ensaios de compostos também pode ser realizada em um fenótipo de células estaminais mais semelhante a tumor. Geralmente em testes de drogas diferentes estágios invasivos são negligenciados, embora a maioria dos medicamentos direcionados, tais como inibidores da tirosina quinase, são aplicadas em estádios mais avançados. Nosso modelo permite a investigação de invasivo ou nenhumacélulas tumorais n-invasiva, devido à membrana basal preservada 17, que as células têm de atravessar durante o processo de invasão. Um passo fundamental para a mobilidade celular e capacidade invasiva é EMT que pode ser induzida em diferentes modelos de cancro pulmonar por estimulação com TGF-beta-1 17,33. Isso, no entanto, reduz o número de células de proliferação e, assim, no cadafalso. Este efeito lateral negativo pode ser contornada através da aplicação de condições de cultura dinâmicas que aumenta significativamente a densidade de células do tumor nos modelos em 3D. Mesmo que o biorreactor cultura ajusta às condições fisiológicas, tem que considerar-se que as propriedades das células e sinalização pode ser influenciada pela exposição a tensão de corte 25.

Drug Testing-específicos de células-line usando in silico simulações para acelerar
Embora apenas semi-quantitativa, a sequência de eventos é adequadamente modelada pelo nosso modelo em silico por cuidadosconsiderando-se totalmente as mutações conhecidas para cada linha celular específica. Isto inclui-linha celular de modificações específicas dos diferentes níveis de activação do receptor, na medida em que envolveu cinases são activadas e quando e como saída da rede de longa tais como apoptose ou proliferação é de se esperar. Por exemplo, pode-se considerar clinicamente conhecidos amplificações de c-met que se pensa ocorrer em cerca de 20% de anti-EGFR adquirido resistência a terapia 30. Posteriormente, o modelo in silico calcula o comportamento da rede correspondente ao longo do tempo, por exemplo., O desenvolvimento de resistência gefitinib representado por aumento da proliferação e diminuição da apoptose. Em nosso modelo, identificamos MEK e PI3K como os candidatos alvo mais promissores. Por conseguinte, a nova combinação terapêutica potencial pode ser rapidamente avaliada em pré-silício, que serve como uma base para mais testes in vitro. Além disso, os dados de saída a partir de experiências in vitro podeser utilizado para refinar o sistema em silico por ajustes de rede que se encaixam os resultados experimentais melhor. Semi-quantitativa em estratégias de silico têm algumas limitações em relação ao tamanho da rede (cerca de 100 interações proteína-proteína pode ser considerado). Além disso, é crítico para integrar todos os nós de proteína chave na topologia da rede, a fim de se obter resultados realistas. O modelo in silico dá, assim, apenas uma aproximação da rede existente na célula tumoral estar. No entanto, esta visão focada nos permite simular as mudanças específicas de interesse, por exemplo., O efeito de combinações de drogas em diferentes origens mutacionais no-line celular. Isto ajuda-nos a compreender sistematicamente a complexidade de tais redes de sinalização câncer, bem como derivar novas estratégias terapêuticas.

Em conclusão, estamos convencidos de que temos desenvolvido um tecido útil projetada na ferramenta vitro que pode ser facilmente integrado em preclitestes téc- sobre a eficácia de compostos de drogas individuais e suas combinações. Para reduzir custos e tempo em testes, este modelo de tumor é ainda complementado por uma na ferramenta de previsão silico permitindo estender os dados recolhidos para uma previsão de tipo específico de células de efeitos de drogas e combinação de drogas, incluindo terapias alvo orientada a clínica ou novos jogadores a considerar (por ex., miARNs).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi patrocinada pelo Centro Interdisciplinar de Investigação Clínica (IZKF, BD247 concessão) do Hospital Universitário de Wuerzburg eo programa Bayern Fit (concedido a Heike Walles).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
Cell crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) for static 3D culture
CellDesigner http://www.celldesigner.org/ - This software was used for drawing the network.
Citrate buffer stock solution (10x) in house production 42 g/L Citric acid monohydrate, 17.6 g/L Sodium hydroxide pellets in deionized water, pH 6.0, stored at RT. 
Citrate buffer working solution in house production 10% Citrate buffer stock solution in demineralized water, stored at RT.
Citric acid monohydrate VWR, Darmstadt (GER) 1002441000 used for the citrate buffer
Cover slips VWR, Darmstadt (GER) 631-1339
DAPI Fluoromount-GTM SouthernBiotech, Birmingham (USA) SBA-0100-20
Databases such as KEGG, HPRD and QIAGEN (Genes & Pathways) http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ - Different known literature databases were used for generating the network topology.
Female Luer Lug Style Tee Mednet, Münster (GER) FTLT-1 Bioreactor setup
Female Luer Thread Style with 5/16" Hex to 1/4-28 UNF Thread Mednet, Münster (GER) SFTLL-J1A  Bioreactor setup
Fetal Calf Serum Bio&SELL, Feucht (GER) FCS.ADD.0500 not heat-inactivated
Gefitinib Absource Diagnostics GmbH, München (GER) S1025-100 mg 100 mM stock solution with DMSO
Glas flask (Schott, GER) provided with glas hose connection Weckert, Kitzingen (GER) custom made
Histofix 4% (Paraformaldehyd) Carl Roth, Karlsruhe (GER) P087.1
Hose coupling Mednet, Münster (GER) CC-9 Bioreactor setup
Incubator for bioreactors Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Würzburg (GER) Bioreactor setup
M30 CytoDeathTM ELISA Peviva, Bromma (SWE) 10900
Male Luer Integral Lock Ring Mednet, Münster (GER) MTLL230-J1A Bioreactor setup
Moisture chamber custom made
Mouse anti Pan-Cytokeratin Sigma-Aldrich, Munich (GER)   C2562-2ML Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, used 1/100 for immunofluorescence
Needlefree Swabable Valve Female Luer Mednet, Münster (GER) NVFMLLPC Bioreactor setup, for sampling, gamma-sterilized
O-Ring MVQ 10 red 37 x 3 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 21444 O-ring large, Bioreactor setup
O-Ring MVQ 70 red 27 x 2.5 mm Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER) 19170 O-ring small, Bioreactor setup
PAP pen Dako, Hamburg (GER) S002
Paraffin Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6642.6
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) Bioreactor setup
Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
Pump tubing cassette Ismatec, Wertheim (GER) IS 3710 Bioreactor setup
Rabbit anti Ki67 Abcam, Cambridge (UK) ab16667 Clone SP6, used for 1/100 for IF
Rabbit anti Vimentin Abcam, Cambridge (UK) ab92547 used 1/100 for IF
RPMI-1640 medium Life technologies, Darmstadt (GER) 61870-044 warm in 37 °C waterbath before use
Silicone tube Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER) HC66.1 Bioreactor setup
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich, München (GER) 30620-1KG-R used for the citrate buffer
SQUAD http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm - This software was used for performing the semiquantitative simulations.
Sterile air filter, pore size 0.2 µm Sartorius Stedium Biotech, Göttlingen (GER) 16596-HYK Bioreactor setup
Syringe Luer Lok 5 ml BD Biosciences, Heidelberg (GER) 309649 for bioreactor sampling
Tissue culture test plates: 6-,      12-, 24-, 96- well TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER) 92006, 92012, 92024, 92048 
Transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) with carrier Cell Signaling, Frankfurt (GER) 8915LC stock solution in sterile citrate buffer pH 3.0
Triton X-100 Sigma-Aldrich, München (GER) X100-1L
Tween-20 Sigma-Aldrich, München (GER) P7949-500ml for washing buffer of immunofluorescent staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29 (2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87 (2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569 (2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170 (2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9 (2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277 (2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

Tags

Bioengenharia Edição 110 engenharia de tecidos modelo de tumor 3D Boolean o câncer de pulmão andaime biológico biorreator de fluxo índice de proliferação gefitinib apoptose TGF-beta-1 EMT
A Tissue Combinada 3D Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmão para prever a eficácia da droga em fundos específicos de mutação
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Göttlich, C., Müller, L.… More

Göttlich, C., Müller, L. C., Kunz, M., Schmitt, F., Walles, H., Walles, T., Dandekar, T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885, doi:10.3791/53885 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter