Summary
השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח איבר עוברי דג הזברה באמצעות הקרינה מיקרוסקופ לנתח מסוגל לבצע חתך אופטיים אסטרטגיות פשוטות של הסתגלות לתקן להיסחף מוקדי מישוריים.
Abstract
על מנת להבין organogenesis, תיקונים במרחב ובזמן המתרחשות במהלך ההתפתחות של רקמות צריכים להיות מוקלטים. השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של פיתוח כלייתי תקין ולקויי עוברי דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ לנתח פלואורסצנטי מצויד לתאורת מובנים ורכישת Z- מחסנית. כדי להמחיש nephrogenesis, דג הזברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)) עם מבנים כליות שכותרתו fluorescently היו בשימוש. פגמי כליות היו מופעלים על ידי הזרקה של oligonucleotide morpholino antisense נגד wt1a גן הגידול ע"ש ווילם, גורם ידוע להיות חיוני לפיתוח כליות.
היתרון של הגדרת הניסוי הוא שילוב של מיקרוסקופ זום עם אסטרטגיות פשוטות עבור תנועות התאמת מחדש ב x, y או z בכיוון ללא ציוד נוסף. כדי לעקוף מוקדים להיסחף כי הוא מושרה על ידי הפרשי טמפרטורות ותנודות מכני, אסטרטגית פוקוס אוטומטית יושמה במקום ניצול תא סביבתי הנדרש בדרך כלל. כדי להתאים מחדש את השינויים שנרשמו במיקום בשל XY להיסחף, תאי הדמיה עם רשתות רילוקיישן מוטבעות הועסקו.
בהשוואת setups מורכב יותר להקלטת הזמן לשגות עם חתך אופטי כגון סריקת ליזר confocal או מיקרוסקופי גיליון אור, מיקרוסקופ זום קל לטפל. חוץ מזה, היא מציעה לנתח יתרונות ספציפי מיקרוסקופ כגון עומק שדה גדול יותר וכן מרחק עבודה ממושך.
השיטה ללמוד organogenesis המוצגת כאן יכולה לשמש גם עם מיקרוסקופי סטריאו הקרינה לא מסוגלים חתך אופטי. למרות מוגבל עבור תפוקה גבוהה, טכניקה זו מציעה אלטרנטיבת ציוד מורכב יותר כי משמש בדרך כלל עבור הקלטת הזמן לשגות של רקמות בפיתוח ודינמיקת איברים.
Introduction
בעקבות gastrulation, organogenesis הוא השלב הבא של מחזור החיים של הפרט. היא כוללת את הסידור מחדש, אינטראקציה ולעתים קרובות הגירה של תאים לייצר רקמות ואיברים. חוסר דיוק בתהליכים שבבסיס התפתחות האיברים מוביל לעתים קרובות מחלות שיכולות להתבטא מייד או גם בשלב מאוחר יותר בחיים. לפיכך, הבנת organogenesis כבר מאמץ אדיר בביולוגיה התפתחותית מחקר ביו. על מנת להיות מסוגל לחקור את הפיתוח של איבר מסוים, זה חייב להיות גלוי אפילו דרך קיר הגוף של העובר. זה מאפשר הקלטה של שינויים במרחב ובזמן המתרחשות במהלך הפיתוח. כמו כן על מנת לנתח את החשיבות של הגורמים המעורבים organogenesis, זה צריך להיות רגיש מניפולציה.
אורגניזם אחד כי הוא מתאים מאוד לחקירת organogenesis in vivo הוא דג הזברה. שלה transparency במהלך התפתחות עוברית בשילוב עם השימוש בקווים מהונדסים ניאון מאפשר תצפית של דינמיקת לוקליזציה ביטוי חלבון, כמו גם ההדמיה של האיברים הפנימיים 1. זה מספק יתרון ייחודי בדבר בירור פיתוח איברים בזמן אמת לעומת דגמים יונקים שאיבריהם אינם נגישים עבור ניתוח מיקרוסקופי. יתר על כן, כלים שונים זמינים כדי לתפעל התפתחות עוברית של דג זברה. לצד הדור של קווים מוטנטים, oligonucleotides morpholino antisense (MO) יכול לשמש מציאה הפעילות של גנים מסוימים כי הם מעורבים בהתפתחות איברים מסוימים. MOS למקד אתר שחבור או קודון ההתחלה translational (אוגוסט), ובכך להפריע שחבור של טרום mRNA או תרגום.
הכליה העוברית דג הזברה, את כִּליַת רֵאשִׁית, הוא מודל פשוט אנטומית אבל יקר ללמוד פיתוח כליות הפונקציה של genes הקשורים למחלות כליה 2. הוא מורכב רק שתי יחידות תפקודיות בשם nephrons. כל נפרון מורכב glomerulus שבו סינון הדם מתבצע 3. מרכיבים נוספים הם באזור הצוואר הקצר והן אבובית המפולחת להפרשה ואת הספיגה של מומס ואת הצינור, המסתיימת הביב 4. לא משנים הרכבו פשוט, הארגון ואת סוגי התאים השונים של כִּליַת רֵאשִׁית דג הזברה דומים מאוד בכליות היונקות 5,6.
גורם אחד, אשר הוא קריטי מעורב בפיתוח כליות, מקודד על ידי הגן המדכא גידולים ע"ש ווילם Wt1 7. דג זברה להחזיק שני paralogs שנקרא wt1a ו wt1b לידי ביטוי בתבנית חופפת אך לא זהה במהלך פיתוח של כִּליַת רֵאשִׁית 8. באמצעות דג הזברה מהונדס עם מבנים כִּליַת רֵאשִׁית GFP שכותרתו, הוכח כי עקום למטה המלא של wt1a </ em> או של צורה אחוי מסוימת מוביל מומים חמורים או מתונים של הכליה העוברית, בהתאמה 9,10.
השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח זמן לשגות של nephrogenesis נורמלי לקוי עוברי דג הזברה על ידי העסקת מיקרוסקופ לנתח פלואורסצנטי מצויד עבור חתך אופטי באמצעות תאורה מובנית. סעיפים אופטיים בכלל מאפשרים רכישת תמונות שרק מכילות מידע פוקוס. Out-of-מוקד מידע יכול להימנע על ידי גישות שונות כגון אלגוריתמים מתמטיים (למשל. Deconvolution), עיצוב אופטי (מיקרוסקופיית לייזר confocal למשל) או שילוב של שניהם (למשל תאורה מובנה).
כדי להשרות פגמים בפיתוח כליות השתמשנו antisense MO נגד wt1a שהזריקו קו דג הזברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)). שורה זו מציגה-GFP קרינה ב glomerulus, הצוואר הקדמיחלק אבובית 9,10. בהשוואת setups מורכב יותר להקלטות זמן לשגות עם חתך אופטי כגון סריקת ליזר או מיקרוסקופי גיליון אור, מיקרוסקופ זום קל לטפל ופחות יקר. יתר על כן, ציוד תאורה מובנה ניתן לשלב בקלות עם ציוד הקרינה קונבנציונאלי (למשל הקרינה מנורה, מסננים) והצעות לנתח יתרונות ספציפיים מיקרוסקופ כגון מרחק עבודה המורחבת שדה גדול של תצוגה. בעיות עם להיסחף נפתרו ללא שימוש בציוד נוסף (בתא סביבתי, שולחן נגד רעידות) בדרך כלל נדרש עבור תוצאות יציבות. כדי לתקן את נדידת מוקדי אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה ותאי הדמיה עם רשתות רילוקיישן מוטבעות נוצלו כדי להתאים מחדש את המיצוב בעקבות סחף x או בכיוון y.
השיטה המוצגת יכולה לחול גם על מיקרוסקופים ללא אפשרויות חתך אופטיות, כגון מ 'סטריאו הקרינהicroscopes ומציע אלטרנטיבה ציוד מורכב יותר כי משמשת בדרך כלל עבור ההקלטה זמן לשגות של רקמות בפיתוח ודינמיקה איברים.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם "העקרונות של טיפול בבעלי חיים במעבדה" וכן את הפריט לגרסה הנוכחית של החוק הגרמני על ההגנה על בעלי החיים.
1. הכנת אנטיסנס-Morpholino (MO)
- כדי להכין פתרון המניה 3 מ"מ MO, להוסיף 100 μl של מים סטריליים, ultrapure אל MO lyophilized (300 nmol ב בקבוקון זכוכית). עבור פירוק מוחלט, לחמם את פתרון מניות 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. חותם את הבקבוקון עם Parafilm ולאחסן את פתרון המניות MO בטמפרטורת החדר (RT). אל לצנן את פתרון המניות MO, כיוון שזה עלול לגרום עמותה של MO עם קירות בקבוקון.
- הכן פתרון עבודה 1 מ"מ MO על ידי דילול פתרון המניות MO עם מים סטריליים, ultrapure ולהוסיף פתרון אדום 0.5% פנול לריכוז סופי של 0.05%.
- כדי לקבל 10 μl של פתרון עובד MO, להוסיף 3.3 μl MO פתרון המניות 1 μl של 0.5% פתרון פנול אדום כדי 5.7 מים μl. לִהיוֹתקדמי מכינה קבוצה חדשה של פתרון עובד לחמם את פתרון מניות MO עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לפני השימוש, צנטריפוגות הפתרון עובד MO כדי למנוע סתימת המחט. לדוגמה, ספין 10 μl של פתרון המניות MO ב 15,000 XG במשך 5 דקות (RT) ולהסיר 8 μl של supernatant להזרקה.
הערה: הפסד של פעילות עלולה להתרחש בפתרונות morpholino לאורך זמן 11. כדי לא לכלול את זה, אפשר לבחון את הפתרונים על ידי ספקטרומטריית UV בעקבות הפרוטוקול המסופק על ידי היצרן. במקרה של wt1a בשימוש morpholino אפקטיבית מופחת לא נצפה על פני תקופה ארוכה של אחסון (3 פתרון עובד מ"מ אוחסן זמן רב יותר מאשר אחד שָׁנָה).
2. הגדרת זוגות זיווג וגביית ביצים מופרות
- אחר הצהריים לפני microinjection, להגדיר חמישה זוגות של Tg (wt1b: GFP) קו, כל במיכל רבייה מצויד מסננת נשלפת להפרידזכרים ונקבות במהלך הלילה.
הערה: כדי להבטיח כי ביצים מספיק זמינות עבור ניסוי זריקה מוצלח, דגים משמשים זוגות הזדווגות צריכים כבר הוקרנו מראש ומוערכים כמו "מפיקים" טובים. - למחרת בבוקר, אחרי שהאורות נדלקים, לשים את הזכר והנקבה ביחד מעל המסננת שמונעת את הדגים אוכלים את ביציהם.
- צפה ההשרצה. לאחר שסכום של הביצים מוטלות כי ניתן להזריק לפני שלב 4 תאים הוא הגיע (כ -50), נפרדים לגברים מנקבה שוב. מעבירים את הביצים עם פיפטה פסטר לתוך צלחת פטרי מלא מים העובר לסיבוב הראשון של הזריקה. כדי לקבל סיבובים נוספים של ביצים, למקם זוג הזדווגות יחד ונפרד מספר פעמים.
3. עבודת ההכנה Microinjection
הערה: בצע את השלבים 3.1 ו -3.2 מראש.
- כדי להכין מנה שמכילה את העוברים בעמדה במהלך (צלחת microinjection) הזריק להכניס GLשקופית תחת בזווית 40-45 מעלה לתוך צלחת 94 מ"מ פטרי מלא סיליקון נוזלי, שקוף, טהור, מזון כיתה. להסיר את השקופית כאשר סיליקון מוקשה. שמייצר חריץ בשכבת סיליקון.
הערה: לחילופין, להשתמש 1.5-3% agarose במקום סיליקון ולאחסן את המנה על 4 מעלות צלזיוס. - צור מחטי הזרקה מתוך נימי זכוכית עם חולץ מחט.
- השתמש נימים המכילים סיבים פנימיים.
הערה: הנימה תעזור להעביר את פתרון MO לכיוון קצה המחט לאחר למלא את המשבצות (ראה 3.3). - להקים הגדרות מתאימות על חולץ המחט. מחטים טובות להזרקה לתוך דג זברה צריכות טיפים ארוכים ודקים 12. צור טיפים באורך של כ 10 מ"מ ו בקוטר של 1.5-2 מיקרומטר שנמצאים בשלב האחרון שלהם. לדוגמה, השתמש חולץ מחט אופקי עם ההגדרות הבאות: חום = 330, משוך = 0, מהירות = 40, זמן = 100.
- בדוק את איכות המחטים תחתמיקרוסקופ לנתח ולמיין אותם החוצה עם טיפים קצרים או ארוכים מדי.
הערה: מחטים עם טיפים קצרים נוטות לפגוע בעובר בזמן כזה עם מאוד ארוכים ודק טיפים לכופף כשנוגעים סיסי ואינה לחדור אותו.
- השתמש נימים המכילים סיבים פנימיים.
- רשאים למלא את המחט עם 2 μl של פתרון עובד MO באמצעות טיפ microloader והכנס אותו לתוך מחזיק מחט של מנגנון microinjection.
- כמו מחטים סגורות בסוף טיפ, ליצור פתח ידי צובט בחזרה הסוף של המחט עם פינצטה חדה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. לחלופין להשתמש במנגנון microinjection לדחוף בעדינות את הקצה על גבי משטח קשיח (למשל. גוש מתכת קטנה או אחורי של פינצטה).
- כייל את עוצמת הזריקה על ידי הזרקת הפתרון עובד MO לתוך טיפה של שמן מינרלי להציב על graticule. התאם את משך ההזרקה להפקה בקוטר ירידה של 75 מיקרומטר להשיג נפח הזרקה של כ 200 pl.
- מסדר את בעוברי 1 תאים לאורך החריץ של מנת microinjection עם המוט הצמחי לכיוון לכיוון שממנו המחט מגיעה (לכיוון זווית 45 ° של החריץ).
- לנקב את סיסית ואת החלמון עם מחט להזריק 200 pl של הפתרון עובד 1 מ"מ MO (0.2 pmol) בחלמון של 1- עוברי 2 תאים.
- בעזרת פיפטה פסטר עם פתח רחב, לאסוף את כל עוברים המוזרקים בצלחת פטרי מלאת מים העובר דגירה אותם על 28.5 מעלות צלזיוס.
- בשעות אחר הצהריים, להסיר עוברת מתים באמצעות פיפטה פסטר עם פתח רחב ולהחליף את המים העוברים.
5. הכנה עוברת עבור in vivo הדמיה
- למחרת בבוקר, להחליף את המים העובר במי עובר המכילים 0.003% N-phenylthiourea (PTU) לעכב melanization. אין ליישם PTU לפני תום gastrulation כי זה interfEres עם התפתחות עוברית מוקדמת.
זהירות: PTU הוא רעיל טרטוגניות. יש להשתמש בכפפות בכל עת ולהימנע משאיפת ומגע עם העור. - Dechorionate את העוברים עם פינצטה חדה תחת מיקרוסקופ לנתיחה בשלב ההתפתחותי הרצוי. תפוס את סיסי עם אחד פינצטה ולנסות לתפוס את הצד השני של סיסי עם זוג נוסף של פינצטה. משוך בזהירות את פינצטה בכיוונים מנוגדים מבלי לשבש את העובר.
- להרדים את העובר על ידי החלפת המים העובר המכיל PTU (0.003%) עם מים העובר המכיל PTU (0.003%) ו- 0.02% אתיל methanesulfonate 3-aminobenzoate (Tricaine).
- להטביע את העובר התכה נמוכה agarose על צלחת-μ תחתית-coverglass עם רשת רילוקיישן 50 מיקרומטר. הטבעה פרופר דורש קצת תרגול.
- הכן 1 aliquots מ"ל של agarose 0.7% ב 1.5 מ"ל צינורות התגובה ולשים אותם על גוש חום מוגדר 36 ° C. השתמש פיפטה פסטר עם פתח רחב TRAnsfer העובר על צלחת μ. סר מים העובר עודפים באמצעות פיפטה פסטר עם קצה אולטרה-דק כיסוי העובר עם agarose מחוסמת.
- בעוד agarose עדיין נוזלי, כוון את העובר עם שני טיפים ג'ל מטעין במיקום הרצוי, בכל הנוגע למבנה של עניין, כמו גם את המרחק לרשת רילוקיישן. מניחים את המבנה של עניין (כאן כִּליַת רֵאשִׁית) קרוב ככל האפשר אל תחתית זכוכית (כאן: הגב למטה) ואת באזור קרוב לרשת.
- לקבלת איכות תמונה אופטימלית למזער את שכבת agarose בין העובר לבין תחתית זכוכית על ידי הצבת מבנה עניין של העובר קרוב ככל האפשר אל תחתית. חוץ מזה, לאתר את העובר באזור קרוב לרשת אבל לדאוג כי הרשת לא שכבה עם המבנה של עניין. להטביע 3-4 עוברים μ-מנות שונות בכל ולהשתמש אחד כי הוא בעמדה הטובה ביותר.
- כאשר agarose הוא מספיק חזק כדי להחזיק את ההמתנה העובר על 2-3 דקות ו כיסוי העובר המוטבע עם מי עובר המכילים PTU 0.003% ו- 0.02% Tricaine. למזוג את המים העובר העודפים או להסיר אותו באמצעות פיפטה פסטר עם קצה דק במיוחד. סגור את המכסה של μ-מאכל למצב נעילה כדי למנוע אידוי.
הערה: למנוע את התרחשותם של בועות אוויר μ-הצלחת, כפי שהם יפגעו הקלטת תמונה.
מיקרוסקופי 6.
הערה: השתמש מיקרוסקופ מצויד חתך אופטי באמצעות תאורה מובנית. תמונות שיא עם תוכנה המכילה את המודולים הבאים: רב-ערוצים, Z-Stack, סדרות עתיות, מיקוד אוטומטי תוכנת פוקוס מורחב.
- רכישת ערימות-Z
- הפוך את צלחת μ. תחתית הזכוכית עומדת עתה בפני לעבר המטרה לבין μ-הצלחת משמשת תא הדמיה.
- למתג את המחוון למצב הרשת ולאפשר מצב תאורה מובנית בבקרת התוכנה.
- לְדַרֵגמוקד הרשת עבור הערוץ (ים) של בחירה עם הדגימה להיבדק (עובר מוטבע) על ידי ביצוע ההוראות של אשף כיול הפוקוס.
- הפעל את מצב הרכישה z-סטאק אותה למצב במרכז. פוקוס לאמצע הדגימה ולהגדיר אותו כשהמטוס במרכז ערימת z- ידי לחיצת המרכז. הגדר את הממד של Z- מחסנית על ידי הגדרת הטווח סביב למצבה האמצעית.
הערה: מבני אובייקט אין לראות בחדות מחוץ הראשון והמטוס האחרון של Z- המחסנית. - התאם את המרווח בין חלקים אופטיים. עבור z ברזולוציה הטובה ביותר ללחוץ על הכפתור האופטימלי. בהתבסס על עומק המטרות בתחום התוכנה תקבע מרחק מומלץ בעקבות קריטריום נייקוויסט (חפיפת 50%).
הערה: אם מכוון קבצים קטנים יותר ואת היתרי המבנה, להגדיר גודל מרווח גדול באופן ידני. הגדרת צעדים קטנים יותר מהמומלץ רק תגרום גדלי קבצים גדולים יותר מבלי להגדיל מאוחר יותרמידע al.
- זמן לשגות הדמיה
- פתח את כלי סדרה עתית להגדיר את מרווח הזמן של הניסוי סדרת זמן. לדוגמא שיא Z- מחסנית תמונות כל 30 דקות במשך תקופה של 5 שעות.
- כדי לתקן את נדידת מוקדים לאורך זמן, להגדיר אסטרטגית פוקוס אוטומטית. בדוק את תיבת הדו-שיח אסטרטגית הפוקוס, בחר מיקוד אוטומטי תוכנה מהרשימה הנפתחת ולבחור את ערוץ TL-Brightfield כערוץ התייחסות.
- התחל כל נקודת זמן עם הפוקוס האוטומטי. על מנת להבטיח טווח חיפוש אמין בתוך מסגרת זמן אופטימיזציה, להגדיר טווח חיפוש ביחס קבוע 200 מיקרומטר. טווח זה נסרק באופן מלא (פרמטר טווח כיסוי) עם איכות בסיסית (פרמטר איכות) בתוך גודל צעד מקסימאלי (פרמטר דגימה).
- כדי להגדיל את הדיוק של הפוקוס האוטומטי, הפעל את שיטת המדידה בתוך אזור מיקוד של עניין (ROI פוקוס) ומצבה אמר ROI הפוקוס בחלון התצוגה החי סביב המבנה של עניין.
הערה: אםהמחשב חסר מודול המיקוד האוטומטי תוכנה אשר מעדכן את Z-Position המרכז אוטומטי במהלך הקלטת הזמן לשגות, להשהות את הניסוי בכל זמן נתון ולהתאים את הפוקוס באופן ידני להמשיך בניסוי. - כדי לפצות על xy להיסחף פוטנציאל במהלך הקלטת סדרות זמן, מקם נקודה מסוימת של הרשת המוטבעת (של חדר ההדמיה) לתוך הכוונת של התוכנה ולשמור את המיצוב על ידי ביצוע צילום מסך.
- הפעל את ניסוי סדרת הזמן. לפני הפסקת סדרת הזמן נגמר, להשהות את הניסוי, ואם יש צורך, להתאים מחדש מיצוב לפי המסך. המשך עם הניסוי.
עיבוד תמונה 7.
- עבור לכרטיסיית העיבוד ובחר את העומק המורחב של הפוקוס (EDF) בתיבת הדו-שיח השיטה. מאז חלקים אופטיים נרכשים, להחיל את אלגוריתם ההקרנה המקסימאלי לסדרת התמונה.
הערה: הנה האלגוריתם יהיה להקרין את brightest או הפיקסל הכהה ביותר מ ערימת תמונת 2D מורכבת בשלב ראשון, ובסופו של דבר להשתמש אחד עם השונות הגבוהות ביותר כתמונת תוצאה עבור כל נקודת זמן. - השתמש בשיטת יצוא הסרט ליצור סרט זמן לשגות (למשל קובץ avi או להזיז) מתוך הסדרת תמונת EDF.
Representative Results
זמן לשגות מיקרוסקופית היא טכניקה רבת עוצמה לצפות בתהליכים ביולוגיים דינמי על פני תקופה ארוכה של זמן. בעיה לעתים קרובות המתרחשת במהלך הדמית הזמן לשגות היא תנועה x, y או z כיוון, שנקראה להיסחף, אשר נגרמה עקב הפרשי טמפרטורות ותנודות מכאניות. השיטה המוצגת כאן מאפשרת זמן לשגות הקלטת מבנים שכותרתו של fluorescently עוברי דג זברה או זחלים על מיקרוסקופ לנתח ללא קאמרית סביבתית שולחן נגד רעידות.
לקבלת פיצוי של סחיפת XY, הדגימה ננעצה תא הדמיה עם רשת רילוקיישן מוטבעת (איור 1). המיקום של נקודה מסוימת של הרשת הקשורים על הכוונת של כלי התוכנה שמש להחזיר את הדגימה למצב טרום פורמה (איור 2 א). התוצאות המוצגות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ זוםעם מחוון משולב עבור חתך אופטי באמצעות תאורה מובנהית (איור 2 ב). עבור תיקון מתמשך מוקדים, אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה. באסטרטגיה זו, הפוקוס אוטומטי התוכנה משמש כדי למצוא את המיקוד מבוסס על ניגוד מרבי לפני כל נקודת זמן. כך מוגדר מוקדים זה מטוס מוגדר לאחר מכן כמו תכנית מרכז לרכישת Z- מחסנית. על מנת למזער phototoxicity במדגם, ערוץ brightfield האור מועבר משמש כערוץ התייחסות שכן היא מאפשרת פעמי חשיפה קצרות מספיק במהלך שלב הפוקוס האוטומטי (איור 2 ג).
השיטה יושמה עבור ניתוח השוואתי של התפתחות כליות בעוברי morphant בקרה ואת wt1a של קו דג זברה מהונדס (TG (wt1b: GFP)). במהלך מוקדם nephrogenesis קו זה מראה פלואורסצנטי ירוק ב mesoderm ביניים, היו אבות הכליות לנבוע 9,10 ומאוחר יותרב tubules להרכיב primordia נפרון (איור 3).
זמן לשגות הקלטת תמונה מגלה כי nephrogenesis בעוברי morpholino מוזרק שליטה הוא ללא שינוי בהשוואה לאלו uninjected (תוצאות לא מוצגות) ועוקב אחר השלבים המתוארים של פיתוח כלית דג זברה מוקדם 3. בגיל 20 hpf צינוריות pronephric המתפתחות גלויים על הקצוות הקדמיים שלהם, הצטברויות כדוריות של תאים, המייצגות את primordia נפרון הטביעה יכולות להתגלות. במהלך השעות הקרובות, tubules ו primordia נפרון לגדול מאוחר יותר על primordia להתחיל הפתיל על קו האמצע (איור 4, וידאו 2). לעומת זאת, nephrogenesis מופרת קשות בעוברים morphant wt1a. למרות כגלילי GFP החיובי גלויים ב 20 hpf, הם נראים יותר מפוזרים ופחות מפותחים. יתר על כן, אין primordia נפרון הראויה נוצרה. ההבדל הבולט ביותר ל- tהוא לשלוט עובר בנקודה זו בזמן, לעומת זאת, הוא המראה של מספר רב של תאי פלורסנט מחוץ כִּליַת רֵאשִׁית פיתוח (איור 4, וידאו 2). כתוצאה מכך, התאים הללו יש להשאיר את השדה pronephric ולהעביר ventrally (וידאו 2).
פיתוח כליה בעוברים מלאים morphants wt1a של הקו המהונדס wt1b כבר לעומת בעבר על ידי לקיחת תמונות בנקודות זמן קבוע שונות 9,10. בניגוד שיטה סטטית זה, הקלטת הזמן לשגות מאפשרת לעקוב דינמיקה של nephrogenesis הנורמלי misrouting של ובתאים כליות הנגרמים על ידי דלדול wt1a.
איור 1: איור סכמטי של עובר Embedded בתא זמין מסחרי עם רשתות רילוקיישן. יש המנהרשתות ארבע, כל מחולק במרחק חוזר של 50 מיקרומטר, המוטבע לתוך תחתית זכוכית coverslip. העובר להיות צילמו מוטבע במהופך, עם מבנה כליות בסמיכות לכיכר תצפית אבל בלי שכיסה עם רשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תיאומים בשל פיצוי של דריפט בגיוון זמן לשגות ורשת הטלה של תאורה מובנית עמדה ברורה של הרשת רילוקיישן הובא למרכז התמונה (מסומן על ידי הכוונת צהוב) ומשמש כנקודת התייחסות XY יישור מאוחר יותר במקרה של משמרות קטנות. המלבן האדום מייצג את האזור של (ROI) הריבית ששמש באסטרטגית הפוקוס האוטומטית (א). ווה חתך אופטישעות מתקבל על ידי תאורה מובנית. התמונה מראה מבנה רשת מוקרן במישור המוקד לאחר כיול נכון (B). את ההחזר על ההשקעה עבור אסטרטגית הפוקוס האוטומטית (מלבן אדום) מוגדרת לכסות מבנים עובריים ייחודיים גבוהים בניגוד (כאן somites) המאפשרים autofocusing האמין לתוך המבנה של עניין (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: טרנסגניים wt1b:. GFP עובר עם גרין קרינת כלית פיתוח שכבות של הגבי (א) או לרוחב (B) שידור ותמונות קרינה מוצגים עם קדמי בצד השמאל. np, נפרון primordium; pt, אבובית pronephric; ככה ככהקרדית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מציאה של wt1a משבש פיתוח כליה עוברי נציג, עומק מורחב של תמונות מוקד מהקלטות הזמן לשגות.. בשנת עוברים מוזרקים morpholino שליטה, פיתוח כליות מראה התקדמות נורמלית עם tubules גדל primordia נפרון אשר מתחילים פתיל על קו האמצע. לעומת זאת, wt1a morphants מצליח ליצור primordia נפרון נכון כמות מסיבית של תאי GFP חיוביים הם מחוץ לשדה pronephric. (np, נפרון primordium; pt, אבובית pronephric). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זהאיור.
הקלטת זמן לשגות משלימת וידאו 1. פיתוח כלייתי תקין בעוברים מוזרקים morpholino שליטה. (קליק ימני להוריד). הווידאו מראה כיצד tubules לגדול primordia נפרון מתחיל פתיל. החל מ 20 hpf, התמונות צולמו ב 30 מרווחי דקות על פני תקופה של 5 שעות.
משלימה וידאו 2. הקלטה זמן לשגות של nephrogenesis מופרע בעוברים wt1a morphant. (קליק ימני להוריד). בסרט רואים את הנדידה של ה- GFP חיובי תאים מחוץ לאזור pronephric. החל מ 20 hpf, התמונות צולמו ב 30 מיילn במרווחים על פני תקופה של 5 שעות.
Discussion
דג הזברה הפכה אורגניזם מודל פופולרי ללימודי פיתוח חוליות והכנת דגמים של מחלות אנושיות. בגלל עובר דג זברה לשמור על שקיפות, איברים מתפתחים כמו מוח ולב ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ הכנה סטנדרטית. ניצול קווים מהונדסים עם קרינה ספציפית איבר מאפשר הערכות של organogenesis ברחבי בשלבים שונים של פיתוח בתוך עוברי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מגבלה אחת הדמית פרטים מבניים של איברים שלמים עם מיקרוסקופיה epifluorescence הסטנדרטית היא ההשפעה של אותות מעצמים מעל ומתחת מישור המוקד. Out-of-ההתמקדות זו אור לא רק תוצאות בניגוד תמונת ירד ורזולוציה, זה גם עלולה לטשטש מבנים חשובים של עניין 13,14. מספר טכניקות כגון confocal- סריקת לייזר, ספינינג דיסק confocal- או מיקרוסקופיה multiphoton פותחו כדי למזער את המידע מחוץ פוקוס ובכך והעלייהדואר ניגודיות תמונה וכן פתרון צירי. שיטה חלופית להשיג חלקים אופטיים היא מיקרוסקופיה תאורת laser- וסריקה חינם המובנה, טכניקת תאורה רחבה מבוסס בתחום שהוא ופשוט ליישם על מיקרוסקופ רגיל 15. התוצאות המוצגות כאן להמחיש כי חתך אופטי, מושגת על ידי תאורה מובנהית, מיושם על מיקרוסקופ לנתח בשילוב עם שחזור של תמונות מוקד מורחבות, מאפשר הדמיה של פרטים מבניים של נורמה ומוטרדת פיתוח כלית דג זברה. בפרט, תאי GFP-חיובי morphants wt1a מפוזרים בעומקים שונים מוקדים, ותמונות של רק במישור אחד עם טשטוש מוקד out-of-היו לזלזל שלוש מורכבות הממדים של פנוטיפ.
כדי לעקוב אחר הדינמיקה של ארגון איבר, התארגנות או שיבוש, מיקרוסקופ פלואורסצנטי הזמן לשגות הוא חזק אם כי טכניקה מורכבת. במהלך זמן לשגותתנודות הדמיה קלות או תנודות טמפרטורת קטין לגרום ונסחפו x, בכיוון y או z. זה דורש ציוד נוסף (בתא סביבתי, שולחן נגד רעידות) על מנת להשיג תוצאות יציבות. השיטה המוצגת משתמשת היכולת של מיקרוסקופ לנתח עם כונן מוקד ממונע להקלטת זמן לשגות תמונות ללא התקנים נוספים. כדי לשמור על מיקוד יציב, אסטרטגית פוקוס אוטומטית הוקמה רשת רילוקיישן המוטבעת לתוך החלק התחתון של תא ההדמיה שמשה תיקון של x, חוסר יציבות y-.
הטבעה תקינה של העובר היא שלב קריטי בתוך הפרוטוקול. חלק באימון יש צורך למקם את המבנה של ריבית קרובה ככל האפשר אל תחתית הזכוכית באזור קרוב לרשת ללא שכיסה עם זה.
היתרון העיקרי של השיטה היא שהיא כלי זול ופשוט להסתכלות ישירה של תהליכים התפתחותיים כגון צמיחה והגירה בשנתי חייםעובר על פני כמה שעות. יתר על כן, את היתרונות מיקרוסקופ ספציפי לנתיחה כגון שדה גדול של תצוגת מרחק עבודה ממושכת להקל בחינת מדגמים גדולים כולל איברים שלמים. עם זאת, כמה מגבלות צריכות לזכור. ההשהייה של הניסוי כדי לבדוק ולתקן את המיקום שהופכת את ההליך זמן רב והיעדר בקרת טמפרטורה חזקה משנה את הזמן התפתחותי "הרגיל", אשר מוגדר הפרית שעות שלאחר על 28.5 מעלות צלזיוס למשך דג זברה 16. בעיה נוספת היא פוטנציאל העומק המוגבל של הדמיה לתוך החיה, במיוחד כאשר המבנה של העניין ממוקם בתוך העובר או זחלים. מבנה כזה הוא glomerulus pronephric דג הזברה, אשר ממוקם בין somites ואת שק החלמון. עומק הגבלת הדמית glomerulus נמצא כ -200 מיקרומטר, מרחק כי הוא הגיע אחרי 5 ימים של התפתחות. בניגוד לכך, מבנים פלורסנט שאינן located קרוב לפני השטח של החיה ניתן הדמיה למשך זמן ארוך יותר. לדוגמא תאי כבד נגישים הדמיה לפחות עד 9 DPF. מגבלה נוספת היא כי חוסר תנועה לטווח ארוך של העובר או זחלי agarose וטיפול Tricaine לגרום פיגור גדילה בצק לב, בהתאמה. בגלל זה עלול להפריע להתפתחות תקינה, מומלץ להגביל את משך ההקלטה זמן לשגות לתקופה מסוימת של עניין. לוודא שבתקופת מבני הדמיה של עניין להתפתח בצורה תקינה כדאי להשוות (בסוף) המראה הכללי עם זה של חיה כל זמן תחת אותם תנאים ניסיוניים אך ללא הטבעת הרדמה.
קלטת Z- מחסנית של חלקים אופטיים כל 30 דקות במשך תקופה של 5 שעות והחישוב הבא של עומק תמונות מוקד מורחב ספקו מידע במרחב ובזמן על אירועים המוקדמים של נורמה ומוטרדת פיתוח כליה אשר הושר בy morpholino בתיווך מציאה של wt1a. בעבר ניסויים שבוצעו מציאת morpholino כבר הראו כי Wt1a ממלא תפקיד מוקדם והכרחי ביצירת כִּליַת רֵאשִׁית הכלאה באתרו בטוש כליות 17,18 ותעסוקה של wt1b המהונדס. שורת GFP לפיתוח כִּליַת רֵאשִׁית הדמיה בזמן הקצוב מצביעה 9,10 גילו כי תוצאות מחסור wt1a ב morphogenesis גלומרולרי שבש ונכשלו מפרט podocyte. בניגוד לגישות סטטי אלה, הקלטות הזמן לשגות לדמיין דינמיקה ישירות של nephrogenesis מוקדם עובר מלא נדידת תאי GFP חיובי משם מאזור pronephric ב morphants wt1a. האפשרות לעקוב אחר תאים misrouted לאורך זמן מאפשר ניתוח פנוטיפ מפורט יותר.
באופן כללי, השיטה המוצגת כאן מספקת זול וקל לשימוש חלופי למתחם, ופחות נגיש setups המשמש בדרך כלל זמן לשגות הדמיה כגון מיקרוסקופ סורק לייזר (מצויד בתא סביבתי ושולחן נגד רעידות) או מיקרוסקופ גיליון אור. שהגרה תארה לתקן בעיות להיסחף יכולה להיות מיושמת גם לבצע זמן לשגות תמונות על setups ללא אפשרויות חתך אופטיות, כגון מיקרוסקופי סטריאו הקרינה.
הטכניקה היא לא רק מתאים לחקור פיתוח כליות אבל יכולה להיות מיושמת גם כדי לפקח המורפוגנזה נורמלי ופגום של איברים אחרים, כגון לב או כבד. יתר על כן, השיטה יכולה לשמש כדי לבחון תהליכים דינמיים שונים יותר באורגניזמים מודל עוברי המבוגר כגון ריפוי פצעים או התחדשות.
Disclosures
המחבר מיכאל גראף הנו עובד GmbH המיקרוסקופית Carl Zeiss שמייצרת ומכשירים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
אנו מודים תומאס בייטס לקריאת האנושות ושיפור כתב היד. אנו מודים גם כריסטינה אברט וסברינה Stötzer לצורך תחזוקת דגים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
| wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. 9 |
| 0.5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
| peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
| Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
| Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
| Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
| Graticule 5 mm/0.05 mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
| Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
| Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
| Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
| µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
| Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
| Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
| Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
| SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
| Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
| ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
| AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
| ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |
References
- Lieschke, G. J. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Drummond, I. A., et al. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125 (23), 4655-4667 (1998).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Kramer-Zucker, A. G., Wiessner, S., Jensen, A. M., Drummond, I. A. Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin, Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes. Dev Biol. 285 (2), 316-329 (2005).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
- Kreidberg, J. A., et al. Wt-1 Is Required for Early Kidney Development. Cell. 74 (4), 679-691 (1993).
- Bollig, F., et al. Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish. Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309 (1), 87-96 (2007).
- Schnerwitzki, D., et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor 1 (Wt1) exon 4 results in protein isoforms with different functions. Dev Biol. 393 (1), 24-32 (2014).
- Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Brief Funct Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
- Rembold, M., Lahiri, K., Foulkes, N. S., Wittbrodt, J. Transgenesis in fish: efficient selection of transgenic fish by co-injection with a fluorescent reporter construct. Nat Protoc. 1 (3), 1133-1139 (2006).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Jensen, E. C. Types of imaging, Part 2: an overview of fluorescence microscopy. Anat Rec (Hoboken). 295 (10), 1621-1627 (2012).
- Chasles, F., Dubertret, B., Boccara, A. C. Optimization and characterization of a structured illumination microscope. Opt Express. 15 (24), 16130-16140 (2007).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130 (10), 2107-2116 (2003).
- O'Brien, L. L., et al. Wt1a, Foxc1a, and the Notch mediator Rbpj physically interact and regulate the formation of podocytes in zebrafish. Dev Biol. 358 (2), 318-330 (2011).
