Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي

Published: May 17, 2016 doi: 10.3791/53924
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

Abstract

يبدأ الهيكل العظمي محطة العضلات التمايز مع التزام خلايا السلائف أرومية متوسطة المحفزة لmyoblasts. هذه الخلايا لديها لا تزال القدرة على التكاثر أو أنها يمكن أن تفرق والصمامات في myotubes متعددة النوى، الذي ينضج أيضا على تشكيل myofibers. ومدبرة الهيكل العظمي التمايز محطة العضلات من خلال العمل المنسق لعوامل النسخ المختلفة، ولا سيما أعضاء العوامل التنظيمية العضلات أو MRFs (MyoD، Myogenin، Myf5، وMRF4)، وتسمى أيضا bHLH عضلي عوامل النسخ الأسرة. هذه العوامل تتعاون مع المجمعات إعادة عرض لونين داخل الشبكة التنظيمية النسخي مفصلة لتحقيق تكون العضل والهيكل العظمي. وفي هذا الصدد، يعتبر MyoD سيد عامل النسخ عضلي في إحداث محطة العضلات التمايز. ويعزز هذه الفكرة عن طريق قدرة MyoD لتحويل الخلايا غير العضلات في خلايا العضلات والهيكل العظمي. نحن هنا وصف والنهج المتبع لتحديد MyoDشركاء البروتين بطريقة شاملة من أجل إلقاء الضوء على العوامل المختلفة المشاركة في الهيكل العظمي التمايز محطة العضلات. والهدف على المدى الطويل هو فهم الآليات الجينية تشارك في تنظيم الجينات العضلات والهيكل العظمي، أي، أهداف MyoD. يتم تحديد شركاء MyoD باستخدام جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات الوسم) من نظام مغاير بالإضافة إلى الشامل التوصيف الطيفي (MS)، تليها المصادقة على دور الشركاء المعنيين خلال الهيكل العظمي التمايز محطة العضلات. أشكال شاذة من العوامل عضلي، أو تنظيمها الشاذة، وترتبط مع عدد من اضطرابات العضلات: الوهن العضلي الخلقي، الحثل العضلي، العضلية المخططة والعيوب في تجديد العضلات. على هذا النحو، توفر عوامل عضلي مجموعة من الأهداف العلاجية المحتملة في اضطرابات العضلات، سواء فيما يتعلق بالآليات التي تسبب المرض في حد ذاته وآليات التجدد التي يمكن أن تحسن معالجة المرض. وهكذا، فإن فهمه تفصيلادينغ من التفاعلات بين الجزيئات وبرامج الوراثية التي تسيطر عليها عوامل عضلي غير ضروري لتصميم الرشيد للعلاجات فعالة.

Introduction

وتتكون الكائنات الحية متعددة الخلايا حقيقية النواة من الأعضاء والأنسجة المختلفة. كل الأنسجة وظيفية لديها التعبير نمط جين معين، والتي يتم تحديدها في كل خطوة التمايز. ويشمل تمايز الخلايا تفعيل جينات معينة، والحفاظ على التعبير عنها، وبشكل عام، إسكات مجموعة من الجينات مثل المتورطين في تكاثر الخلايا. الهيكل العظمي التمايز العضلات، أو تكون العضل، وبالتالي فإن عملية متعددة الخطوات، التي تبدأ مع تقرير من الخلايا الجذعية أرومية متوسطة إلى myoblasts، ومن ثم يؤدي إلى التمايز النهائي من هذه myoblasts في أول أحادية منوى، ثم متعددة منوى، myotubes . وهكذا، myoblasts هي "تحديد" الخلايا، التي لا تزال قادرة على التكاثر، ولكنهم ملتزمون نسب الهيكل العظمي والعضلات، وبالتالي يمكن أن تفرق فقط في خلايا العضلات والهيكل العظمي سواء أثناء التطور الجنيني أو في تجديد العضلات الكبار. عملية محطة العضلات والهيكل العظمي تختلفومدبرة entiation باستخدام برنامج جيني محدد يبدأ مع خروج دائم من دورة الخلية من خلايا السلائف بالخلايا العضلية الجذعية التي تؤدي إلى إسكات نهائي من الجينات انتشار المرتبطة بها، مثل الجينات المستهدفة E2F 1. في الواقع، خلال عملية التمايز النهائي والاعتقال بالخلايا العضلية الجذعية انتشار خطوة الحاسمة التي تسبق التعبير عن العضلات والهيكل العظمي جينات معينة ودمج myoblasts إلى myotubes 2. يسمح هذا البرنامج الخلايا الجذعية العضلية الكبار، وتسمى أيضا الخلايا الأقمار الصناعية، للتمييز خلال عملية تجديد بعد اصابة في العضلات والهيكل العظمي.

تكون العضل الثدييات تعتمد بشكل كبير على عائلة مكونة من عضلي الأساسي الحلزون حلقة حلزون (bHLH) النسخ عوامل MyoD، Myf5، MRF4 وMyogenin، وكثيرا ما يشار إليها باسم الأسرة من العوامل الهيكلية تقرير العضلات أو MRFs (العضلات العوامل التنظيمية) 3. كل واحد منهم يلعب دورا أساسيا في مواصفات وDIFferentiation من خلايا العضلات والهيكل العظمي لديه نمط التعبير محددة 05-07 أبريل. تفعيل Myf5 وMyoD يشكل خطوة حاسمة من أن يرتكب الخلايا إلى النسب عضلي، والتعبير لاحق من Myogenin يطلق تكون العضل مع تفعيل جينات معينة العضلات والهيكل العظمي، مثل MCK (العضلات الكرياتين كيناز). عضلي عوامل النسخ bHLH تتعاون مع أفراد الأسرة MEF2 في تفعيل الجينات العضلات من مواضع الصمت سابقا 8. كما أنها تحفز الهيكل العظمي النسخ الجيني العضلات وheterodimers مع البروتينات bHLH في كل مكان، E12 و E47، والمعروفة باسم البروتينات E، التي تربط ما يسمى صناديق البريد في مختلف المناطق الجينات التنظيمية 8. تطور، رقم (المانع من التمايز) وعوامل أخرى تنظم سلبا على هذه العملية، من خلال التنافس مع MyoD للبروتينات E ملزمة 8.

يعتبر MyoD كلاعب رئيسي في التسبب في العضلات محطة التمايز 9 10-13. في الواقع، والتعبير القسري للMyoD الحث على تمايز العابر للأنواع الخلوية المختلفة حتى تلك المستمدة من أصل embryologic آخر 12. على سبيل المثال، يمكن MyoD تحويل خلايا الكبد، الخلايا الليفية، الخلايا الصباغية، neuroblasts، والخلايا الشحمية إلى خلايا تشبه العضلات. العمل العابر للdifferentiative من MyoD ينطوي على تنشيط غير طبيعي للبرنامج جيني عضلي (وخاصة الجينات المستهدف) في بيئة غير العضلات، يصاحب ذلك إلى إسكات البرنامج الوراثي الأصلي (لا سيما الجينات انتشار).

في المتكاثرة myoblasts، وأعرب عن MyoD كنه غير قادر على تنشيط الجينات هدفه حتى عندما يفرض على المروجين 14-16. ولذلك، فإن الحاجة إلى MyoD أن يتم التعبير عنها بشكل مستمر في myoblasts غير متمايزة يبقى ELU تماماالجديد إنجازا هاما. MyoD يمكن قمع الجينات هدفه بسبب توظيف إنزيمات تعديل الكروماتين القمعية في المتكاثرة myoblasts قبل التحميل تفعيل الكروماتين إعادة الانزيمات 14،17. على سبيل المثال، في المتكاثرة myoblasts، ويرتبط MyoD مع النسخي شارك في كاظمة KAP-1، deacetylases هيستون (HDACs) وميثيل يسين القمعي (KMTs)، بما في ذلك هيستون H3 يسين 9 أو H3K9 وH3K27 KMTs، وقمع بنشاط التعبير الجينات المستهدف عن طريق إنشاء هيكل لونين القمعية محليا 14،17. الأهم من ذلك، أشار تقرير صدر مؤخرا أن MyoD هو في حد ذاته ميثليته مباشرة من قبل H3K9 حزب الكومينتانغ G9a مما أدى إلى تثبيط النشاط transactivating لها (16).

الآليات الجينية تشارك في هذا التمايز عبر الخلايا غير العضلات التي MyoD غير معروفة إلى حد كبير. والجدير بالذكر أن بعض خطوط الخلايا مقاومة لالناجم عن MyoD العابرة للتمايز. وهكذا، في خلايا هيلا، MyoD إما غير نشطة أوبل قد تكون بمثابة كاظمة بدلا من منشط النسخ نظرا لعدم وجود تعبير عن الوحيدات BAF60C من لونين إعادة عرض معقدة السويسري / الجبهة الوطنية الصومالية 18. وبالتالي يمكن لهذا النموذج أن يكون الاختيار لوصف أفضل لآليات القمع الجينات التي يسببها MyoD. وهي مناسبة أيضا لفحص قدرة MyoD للحث على البيئة لونين القمعية في مواضع هدفه مع الشركاء المرتبطين بها، وبالتالي الكشف عن الآليات القمعية التي تعتمد على MyoD في المتكاثرة myoblasts لضبط محطة التمايز.

نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد الشركاء MyoD باستخدام جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات الوسم) بالإضافة إلى قياس الطيف الكتلي (MS) التوصيف. استخدام خلايا هيلا-S3 التعبير عن مستقر العلم-HA-MyoD يسمح للحصول على ما يكفي من المواد لتنقية المجمعات MyoD من مقتطفات النووية مجزأ. وأعقب تحديد الشركاء MyoD في نظام مغاير من قبل validatiعلى في النظام ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكسور هيلا-S3 النووية القابلة للاستخراج الملح ومتجهة الى لونين

  1. مجموعة من الخلايا
    1. تنمو هيلا-S3 العلم-HA-MyoD وهيلا-S3 العلم-HA (مراقبة خط الخلية) في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ الجنين مصل العجل، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (النمو متوسطة) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في حاضنة الرطبة.
      ملاحظة: خلايا هيلا-S3 معربا عن ستابلي الخلايا transduced مع ناقلات فارغة (هيلا-S3 العلم-HA) العلم-HA-MyoD وهيلا-S3 يمكن إما إنشاء باستخدام بروتوكول وصفها في: 19،20، أو قدمت من قبل المؤلفين.
    2. تضخيم الخلايا يصل إلى 10 متكدسة تماما أطباق ملم 150 كل سطر خلية (خلايا هيلا-S3 العلم-HA-MyoD وهيلا-S3 العلم-HA).
    3. جمع طاف (تحتوي حيوانية غير ملتصقة) إلى 5 L الدوار.
    4. غسل حيوانية ملتصقة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني في 150 طبق مم، ويعرض للتريبسين الخلايا لمدة 1 دقيقة في غرفة تيمperature (0.05٪ حل التربسين-EDTA، 2 مل لطبق 15 سم).
    5. إضافة 4 مل من المتوسط ​​في 150 طبق ملم وجمع الخلايا في 50 مل أنابيب.
    6. الجمع بين طاف من الخطوة 1.1.3 (في الدوار 5 لتر) والخلايا من الخطوة 1.1.5، إضافة 500 مل من جديد متوسطة النمو قبل تحسنت لكل خط الخلية.
    7. نقل تعليق خلية في 5 L الدوار وتنمو الخلايا لمدة لا تقل عن 60 ساعة على 37 درجة مئوية، وCO 2 5٪ في حاضنة الرطبة.
    8. إضافة 500 مل من متوسط ​​النمو الطازجة وتنمو الخلايا لمدة 24 ساعة.
    9. إضافة 1 لتر من متوسط ​​نمو جديدة وتنمو الخلايا لمدة 24 ساعة.
    10. اخراج 1 مل من خلية إلى تعليق عدد الخلايا وتحقق بقاء الخلية. اللون 30 ميكرولتر من تعليق خلية مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق والاعتماد على قيد الحياة الخلايا (لا زرقاء) تحت المجهر باستخدام عدادة الكريات.
    11. الحفاظ على كثافة الخلايا في 2-6 × 10 5 خلية / مل بإضافة متوسطة النمو الطازجة يوميا. لا تتجاوز 1 × 10 6 خلية / مل. الحد الأقصىحجم واحد الدوار 5 L 2.5 L.
      ملاحظة: للحصول على الخطوات التالية، المضي قدما في طريق دفعات من 2-2،5 لتر للثقافة في مناطق ذات كثافة 1 × 10 6 خلية / مل. كرر الخطوات 1.1.12 - 1.1.14 لجمع حوالي 20 L (≈ 20 غراما من بيليه الجاف) من كل سطر الخلية قبل الشروع في الخطوة التالية.
    12. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
    13. Resuspend الخلايا في 100 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني قبل pipetting وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لغسل بيليه.
    14. تكرار غسل عن طريق إعادة التعليق الخلايا مع 25 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني، ونقل تعليق في أنبوب 50 مل و الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن الكريات خلية إما استخدامها على الفور أو تجميدها في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية لعدة أيام.
  2. العزلة من نوى
    ملاحظة: تنفيذ الخطوات 1.2.1 - 1.4.3 في غرفة باردة.
    1. قبل البرد العازلهالتمرير والمجانسة.
    2. في حالة استخدام المواد المجمدة، وبسرعة ذوبان الجليد الكريات الخلايا في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    3. و resuspend 20 غ (≈ 20 مل) من الخلايا في 20 مل (أ حجم مساو لحجم الخلية بيليه) من ناقص التوتر العازلة ألف (الجدول 3) باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت في البداية، ثم إضافة 5 مل، ثم إضافة آخر 5 مل. غسل الماصات بشكل جيد مع عازلة جديدة للحصول على الحد الأقصى من الخلايا.
    4. نقل 40 مل تعليق خلية في الخالط قبل المبردة مع مدقة ضيقة.
    5. التجانس الخلايا مع 20 السكتات الدماغية في الخالط (20 الدخول والخروج الحركات) ونقل تعليق خلية في أنبوب 50 مل.
    6. غسل الخالط مع 7 مل من عازلة السكروز (1/3 من حجم الخلية الأولي، الجدول 3) لاسترداد الحد الأقصى من الخلايا. نقل هذا التعليق بسرعة في أنبوب 50 مل من الخطوة 1.2.5 للحفاظ على نواة والحد من التسرب.
    7. وصمة عار قسامة 30 ميكرولتر مع 30 ميكرولتر من 0.4٪ طن تبريدypan الأزرق وتحليلها تحت المجهر للسيطرة على كفاءة تحلل (إذا كان تحلل ناجحا، يجب أن تكون كل نواة الأزرق). إذا لزم الأمر، كرر الخطوة التجانس.
    8. الطرد المركزي لمدة 7 دقائق في 10000 x ج و 4 درجات مئوية لتكوير نوى. حفظ طاف باعتبارها جزء حشوية.
  3. إعداد السلط استخراجها (SE) الكسر النووية
    1. Resuspend وبيليه نوى في 8 مل من عازلة السكروز (أ حجم مساو لحجم بيليه نوى). إضافة قطرة قطرة في حين خلط دقيق في دوامة 8 مل من العازلة عالية من الملح (1 نوى حجم بيليه، الجدول 3) للحصول على التركيز النهائي من 300 ملي مول كلوريد الصوديوم. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد وتخلط كل 5 دقائق.
    2. انخفاض تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملي بإضافة 8 مل (1/3 من إجمالي حجم) من العازلة السكروز. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 13000 x ج و 4 درجات مئوية. جمع طاف (الملح للاستخراج جزء النووي، جنوب شرق).
      ملاحظة: إما انتقل إلى الخطوة 1.3.3 أو ترك SEجزء على الجليد أثناء إعداد جزء محدد لونين ثم فائقة الطرد المركزي الصورتين في وقت واحد.
    3. فائقة الطرد المركزي SE لمدة 30 دقيقة في 85000 x ج في 4 درجات مئوية. اتخاذ طاف (≈ 26 مل).
    4. تجميد 100 قسامة ميكرولتر في النيتروجين السائل. انتقل إلى الخطوة 2 "البروتين تنقية معقدة"، وذلك باستخدام ما تبقى من استخراج.
      ملاحظة: قسامة لاستخدامه كعنصر تحكم المدخلات خلال خطوة 5.1.1.
  4. إعداد جزء محدد لونين
    1. resuspend الكرية (من الخطوة 1.3.5.) بدقة في 7 مل (أ حجم مساو لحجم بيليه) من العازلة السكروز.
    2. إضافة CaCl 2 إلى تركيز النهائي من 1 ملم (28 ميكرولتر من 0.5 M CaCl 2 لمدة 14 مل من تعليق) لتنشيط MNase (الخطوة 1.4.4) وتخلط.
    3. تعليق قبل الحرارة لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. إضافة 70 ميكرولتر نوكلياز micrococcal (MNase) للحصول على التركيز النهائي من 0.0025 U / ميكرولتر (1/200 التخفيف من 0.5الأسهم / ميكرولتر U) وتخلط.
    5. احتضان بالضبط 12 دقيقة عند 37 درجة مئوية. خلط كل 4 دقائق.
    6. المكان على الفور رد فعل على الجليد.
    7. لوقف النشاط MNase، إضافة 112 ميكرولتر من 0.5 M EDTA 8.0 درجة الحموضة (1/125 تمييع) إلى تركيز النهائي من 4 ملم. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
    8. يصوتن 5 مرات لمدة 1 دقيقة في السعة العالية، بين اثنين من sonications تسمح استراحة من 1 دقيقة (10 دقيقة في المجموع).
    9. نابذة فائقة السرعة لمدة 30 دقيقة في 85000 x ج و 4 درجات مئوية.
    10. جمع طاف (جسيم نووي مخصب جزء، NE، ≈ 12 مل).
    11. تجميد 50 قسامة ميكرولتر في النيتروجين السائل. انتقل إلى الخطوة 2 "البروتين تنقية معقدة"، وذلك باستخدام ما تبقى من استخراج.
      ملاحظة: قسامة لاستخدامه كعنصر تحكم المدخلات خلال خطوة 5.1.1.

2. البروتين مجمعات تنقية

ملاحظة: المضي قدما في مقتطفات موازية من كل سطر الخلية (هيلا-S3 العلم-HA-MyoD والسيطرة، هيلو-S3 العلم-HA).

  1. تنقية Flag- مقرها
    1. قبل غسل الراتنج العلم. استخدام 600 ميكرولتر من الراتنج العلم (من المخزون التجاري 50٪) لكل نقطة التجريبية (SE وNE كسور لكل خط الخلية).
    2. الراتنج نقل إلى 15 مل أنبوب، resuspend في 13 مل من TEGN البرد (الجدول 3)، الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج وإزالة طاف. كرر 5 مرات. بعد غسل الماضي الراتنج العلم و resuspend في حجم مساو من TEGN (300 ميكرولتر لكل نقطة التجريبية).
    3. لكل نقطة التجريبية، مزيج 600 ميكرولتر من الراتنج العلم غسلها ومقتطفات من البروتين المقابلة (في أنبوب 15 مل لNE 12 مل وفي أنبوب 50 مل لمدة 26 مل SE الكسور، على التوالي). احتضان على الدورية بين عشية وضحاها عجلة في 4 درجات مئوية.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، وضعت جانبا طاف والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى نتيجة اختبار كفاءة تنقية (2.2).
    5. لعينات SE، resuspend والراتنج العلمفي 4 مل من TEGN ونقل إلى أنبوب 15 مل. كرر هذه الخطوة 3 مرات، في كل مرة ينتقل الى نفس أنبوب 15 مل لتجنب فقدان الخرز. الطرد المركزي 2 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجات مئوية وإزالة طاف.
    6. الراتنج غسل العلم 7 مرات في أنبوب 15 مل باستخدام 13 مل من TEGN والطرد المركزي 2 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجات مئوية.
    7. بعد غسل الماضي، resuspend في 1 مل TEGN ونقل إلى 1.5 مل أنبوب منخفضة ملزم. الطرد المركزي 2 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجات مئوية وإزالة طاف.
    8. resuspend في 200 ميكرولتر من العلم حل الببتيد في 4 ملغ / مل في درجة الحموضة 7.8 لكل نقطة التجريبية. مزيج من الخرز والببتيد. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة TEGN واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة أو بين عشية وضحاها إلى أزل البروتينات ملزمة.
    9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، ونقل الراتنج وطاف (العلم شطافة) إلى عمود الدوران فارغة وضعت في أنبوب 2 مل.
    10. أجهزة الطرد المركزي في عمود، وجمع اليسار أكثر من طاف في أنبوب 2 مل. جمع الراتنج العلم بإضافة عازلة TEGN إلى العمود، والشروع في شطف العلم الثاني مع 200 ميكرولتر من محلول العلم الببتيد (4 ملغ / مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لكل نقطة التجريبية.
    11. كرر الخطوات من 2.1.9 - 2.1.10 لجمع شطف الثاني. الجمع بين eluates الأولى والثانية.
  2. اختبار كفاءة تنقية
    ملاحظة: خلال خطوة 2.1.11 - 2.1.12، نفذ SDS-PAGE وتلطيخ الفضة (2.2.1 - 2.2.2).
    1. خذ 15 ميكرولتر من eluates، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 4x والتحميل و2 ميكرولتر من 10X الحد من وكيل، وتغلي لمدة 5 دقائق في 96 ° C وتشغيل SDS-بولي أكريلاميد 4-12٪ هلام وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. وصمة عار الجل باستخدام عدة تلطيخ الفضة (اتبع إرشادات الشركة المصنعة). إذا كان هناك اختلافات واضحة في أنماط البروتين بين العلم-HA-MyoD والعلم-HA eluates وهمية، ولا سيما الفرقة من العلم-HA MyoD (حوالي 50 كيلو دالتون، الشكل 1A)، انتقل إلى الظريف المقبلص.
  3. هيماغلوتينين (HA) تنقية المستندة
    1. الراتنج غسل HA عن طريق نقل إلى أنبوب 15 مل، إعادة التعليق في 13 مل من TEGN والطرد المركزي 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية. خطوة غسل كرر 5 مرات. بعد Resuspend الخرز غسل الماضي في حجم مساو من العازلة TEGN.
      ملاحظة: يجب أن يتم تعديل حجم وفقا للكفاءة تنقية القائمة على العلم. تبدأ مع 300 ميكرولتر من المخزون التجاري 50٪ لكل نقطة التجريبية.
    2. نقل الراتنج HA لكل نقطة التجريبية إلى 1.5 مل أنبوب ملزم منخفضة. الطرد المركزي 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، والقضاء على الحد الأقصى من غسل العازلة (الجدول 3) وإضافة eluates من تنقية القائمة على العلم لالراتنج HA.
    3. احتضان الأنابيب على الدورية بين عشية وضحاها عجلة في 4 درجات مئوية.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، وضعت جانبا طاف والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى نتيجة اختبار كفاءة تنقية (2.3.12).
    5. إعادةتعليق الراتنج HA في 0.5 مل من TEGN، ونقل إلى أدنى مستوى جديد ملزم أنبوب 1.5 مل. تكرار إعادة تعليق مرة واحدة مشيرا إلى نفس أنبوب 1.5 مل لتجنب فقدان الخرز وأجهزة الطرد المركزي 2 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
    6. تغسل حبات 8 مرات باستخدام 1 مل من TEGN في كل مرة، الطرد المركزي 2 دقيقة في 1000 x ج و 4 درجات مئوية وإزالة طاف (تجنب الخرز فقدان). بعد غسل الماضي، ونقل الخرز إلى 0.5 مل أنابيب.
    7. إزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن. إضافة 100 ميكرولتر من HA الببتيد الحلول المجانية (4 ملغ / مل) في الرقم الهيدروجيني 7.8 الخرز لأزل البروتينات ملزمة. احتضان على عجلة دوارة أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: مقدار HA-الببتيد بحاجة إلى تعديل اعتمادا على وفرة من المجمعات.
    8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، ونقل الراتنج وطاف (HA شطافة) إلى عمود الدوران فارغة وضعت في أنبوب 2 مل.
    9. أجهزة الطرد المركزي العمود لجمع اليسار أكثر طاف في أنبوب 2 مل. إجراء شطف الثاني مع 100 ميكرولتر من HA الببتيد (4 ملغ / مل) لكل نقطة التجريبية. احتضان على عجلة دوارة أكثر من ليلة في 4 درجات مئوية. كرر الخطوة 2.3.8 - 2.3.9 لجمع شطف الثاني.
    10. الجمع بين eluates الأولى والثانية.
    11. كفاءة تنقية الاختبار من قبل SDS-PAGE وتلطيخ الفضة (انظر الخطوات 2.2.) (الشكل 1A).
    12. التركيز شطافة HA إلى 30 ميكرولتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع 10 كيلو دالتون قطع (الاسمي حد الوزن الجزيئي، NMWL) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    13. تقسيم العينات تتركز إلى قسمين: 22.5 (3/4) و 7.5 (1/4) ميكرولتر. التقط تجميد 1/4 العينات في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية. استخدام جزء 3/4 الخطوة 3.
      ملاحظة: الجزء المجمد 1/4 ليتم استخدامها لتأكيد النتائج مطياف الكتلة لطخة الغربية (راجع الخطوة 5.1).

تحليل 3. الطيف الكتلي

ملاحظة: يجب مناقشة الخطوات التالية مع مرفق الطيف الكتلي من شأنها أن تؤدي التحليل.

  1. الملحق 3/4 (22.5 ميكرولتر) من العينات مع 7.5 ميكرولتر من العازلة 4X تحميل و 3.3 ميكرولتر من 10X الحد من وكيل وتغلى لمدة 5 دقائق في 96 درجة مئوية.
  2. عينات الحمل على SDS-بولي أكريلاميد 4-12٪ هلام. تشغيل هلام في 150 V ثابت لمدة 5 دقائق للسماح لجميع البروتينات لدخول هلام دون فصل.
  3. غسل هلام مع الماء. إصلاح ل20 - 30 دقيقة مع الحل تثبيتي (حامض الخليك 10٪، 50٪ الميثانول، 40٪ من المياه نظيفة جدا) ثم يغسل هلام الثابتة 5 مرات في المياه نظيفة جدا.
  4. قطع العصابات التي تحتوي على البروتينات وتخزين في 1 مل من الماء في أنبوب 1.5 مل وإرسالها إلى منشأة قياس الطيف الكتلي.

تحليل 4. البيانات

ملاحظة: هذا هو التوجيه العام للتحليل. وسوف تعتمد على الخطوات الدقيقة على وضع معين من البيانات التي قدمها مرفق MSتستخدم لإجراء تحليل (على سبيل المثال، 21،22).

  1. قارن بين القائمة من البروتينات التي تم تحديدها في eluates "MyoD" مع القائمة التي تم الحصول عليها من المقابلة إعداد سيطرة سلبية. استبعاد من تحليل البروتينات الموجودة في كلا القائمتين.
  2. إزالة البروتينات التي لها ≤2 عدد من الببتيدات التي تم تحديدها من قائمة المتبقية.
  3. وصول الشرح الوظيفي والتصنيف الوظيفي للقائمة التي تم الحصول عليها من البروتينات باستخدام الموارد DAVID المعلوماتية الحيوية (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) وتصنيف قائمة من البروتينات 23،24.
  4. (اختياري) إزالة من قائمة "متنقل بالإيقاف"، اتهم البروتينات غير النووية مع العارض قوية ملزمة لالمشحونة سلبا DNA 25. هذه تحتوي على هيكل الخلية، حشوية، الميتوكوندريا، الغشاء ومستقبلات البروتين (البروتين للطي، والهيكل الخلوي ومتنوعة البروتينات المجموعة في الجدولين 1 و 2). </ لى>
  5. مقارنة القوائم التي تم الحصول عليها من interactors MyoD من SE و NE الكسور لتحديد البروتينات والبروتينات مشتركة محددة لكل جزء (الشكل 2).

5. تأكيد Interactors التي تم تحديدها عن طريق ويسترن وصمة عار

  1. التأكيد في هيلا-S3 العلم-HA-MyoD وهيلا-S3 العلم-HA
    1. عينات شطافة ذوبان التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.14 (7.5 ميكرولتر) على الجليد. إضافة 12 ميكرولتر من العازلة TEGN، 10 ميكرولتر من العازلة 4X تحميل و 3 ميكرولتر من 10X الحد من وكيل. عينات يغلي لمدة 5 دقائق في 96 درجة مئوية.
    2. إعداد نماذج المدخلات لالنشاف الغربية.
      1. ذوبان الجليد قسامات من الخطوات 1.3.9 و1.4.11 وقياس تركيز البروتين، على سبيل المثال باستخدام عدة BCA (اتبع تعليمات الشركة الصانعة).
      2. استخدام 15 ميكروغرام من البروتين لكل حارة. قياس كمية مناسبة من استخراج وضبط حجم العينة تصل إلى 15 ميكرولتر مع العازلة TEGN.
      3. إضافة 5 ميكرولتر عازلة 4x والتحميل و1.5 ميكرولتر 10X الحد من وكيل. عينات يغلي لمدة 5 دقائق في 96 درجة مئوية.
    3. إجراء تحليل لطخة غربية مع الأجسام المضادة من الفائدة (محددة للمرشح شريك تحديدها خلال تحليل MS) باستخدام 15 ميكرولتر من عينات شطافة. استخدام مقتطفات المدخلات كوسيلة لمراقبة مستويات البروتين الذاتية (الشكل 3A).
  2. التأكيد في النظام الخلوي ذات الصلة
    1. إعداد إجمالي استخراج النووي myoblasts الماوس C2C12.
      1. تنمو myoblasts الماوس C2C12 في المتوسط ​​DMEM تستكمل مع 15٪ مصل العجل الجنين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ في حاضنة الرطبة. لم تتجاوز 80٪ خلية التقاء للحفاظ على الخلايا في الدولة التكاثري.
      2. تنمو أطباق مم على الأقل اثنين من 150 من C2C12 لنقطة واحدة (الضد واحد) من مناعي (IP). نضح في المتوسط، وغسل خلايا مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
      3. تتخلص من الخلايا وجمع إلى 15 مل أنبوب. مntrifuge في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. طاف تجاهل.
      4. تقدير حجم الخلية بيليه (= خلية V). resuspend بلطف بيليه في 3 مجلدات خلية الخامس من ناقص التوتر B العازلة لعرقلة غشاء هيولي (الجدول 3).
      5. إضافة 0.44 س حجم الخلية الخامس من 10٪ NP-40 لتصل إلى تركيز النهائي من 1٪ (ت / ت). عكس بلطف الأنبوب عدة مرات لخلط.
      6. إضافة 0.89 س حجم الخلية الخامس من ريال (الجدول 3) للحفاظ على سلامة النوى. عكس بلطف الأنبوب عدة مرات لتجانس تعليق، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2000 x ج لتكوير نوى.
      7. إزالة طاف (جزء عصاري خلوي). تقدير حجم بيليه أنويتها (= V مجلس التوحيد الوطنى). بيليه نوى resuspend في مجلد واحد V مجلس التوحيد الوطنى العازلة السكروز.
      8. إضافة قطرة قطرة في حين خلط دقيق في دوامة مجلد واحد V مجلس التوحيد الوطنى العازلة الملح العالية للحصول على التركيز النهائي من 300 مليكلوريد الصوديوم، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. خلط كل 5 دقائق.
      9. إضافة مجلد واحد V مجلس التوحيد الوطنى العازلة السكروز (لتقليل تركيز كلوريد الصوديوم إلى 150 ملم) وCaCl 2 (تركيز النهائي 1 ملم). مزج.
      10. تعليق قبل الحرارة لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية، إضافة نوكلياز micrococcal للحصول على المباراة النهائية لتركيز 0.0025 U / ميكرولتر (1/200 من الأسهم من 0.5 U / ميكرولتر). مزج.
      11. احتضان بالضبط 12 دقيقة عند 37 درجة مئوية. خلط كل 3 دقائق.
      12. المكان على الفور رد فعل على الجليد وإضافة EDTA (تركيز النهائي 4 ملم) لوقف النشاط MNase. احتضان لمدة 5 دقائق على الجليد.
      13. يصوتن 5 مرات لمدة 0.5 دقيقة لكل منهما في السعة العالية. بين اثنين sonications، السماح لكسر 0.5 دقيقة (5 دقائق في المجموع).
      14. فائقة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 85000 x ج و 4 درجات مئوية. جمع طاف (مجموع استخراج النووي).
      15. قياس تركيز البروتين من مجموع استخراج النووي، على سبيل المثال باستخدام عدة BCA (اتبع تعليمات الشركة الصانعة) والمضي قدما فوريااعل إلى الخطوة 5.2.2.
    2. مناعي (IP) من MyoD الذاتية.
      1. إلى ما قبل اضحة مقتطفات، وغسل 10 ميكرولتر من بروتين G حبات الاغاروز لكل نقطة IP.
        1. نقل حجم الحاجة من البروتين G الخرز agarose في أنبوب 1.5 مل، resuspend في 1.4 مل من TEGN البرد، الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1800 x ج وإزالة طاف. كرر 3 مرات.
      2. مزيج ما قبل غسلها الخرز بروتين G الاغاروز مع حجم مناسب من إجمالي استخراج النووي. استخدام 500 ميكروغرام من إجمالي استخراج النووي البروتين لكل نقطة IP.
      3. احتضان على عجلة دوارة في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إلى ما قبل مسح مقتطفات.
      4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1800 x ج في 4 درجات مئوية. الحفاظ طاف.
      5. خلط 5 ميكروغرام من MyoD أب أو 5 ميكروغرام من مفتش أرنب مع 500 ميكروغرام إجمالي مقتطفات النووية مسح مسبقا في 1.5 مل أنابيب ملزمة منخفضة. إضافة TEGN عازلة تصل إلى 1 مل. احتضان على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية خلال الليل.
        ملاحظة: إجراء وollowing الخطوات خلال خطوة 5.2.2.3.
      6. قبل غسل 7.5 ميكرولتر بروتين A / G حل الأسهم حبات لكل نقطة IP.
        1. نقل الحجم اللازم من الخرز في أنبوب 1.5 مل، الخرز resuspend في 1 مل من TEGN وأجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف. كرر 3 مرات.
      7. البروتين و resuspend والخرز / G في 1.5 مل عرقلة الحل (الجدول 3)، واحتضان على عجلة دوارة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      8. مجموع مقتطفات النووية الطرد المركزي حضنت مع القيمة المطلقة (الخطوة 5.2.2.5) في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. الحفاظ طاف.
      9. منعت أجهزة الطرد المركزي بروتين A / G الراتنج (الخطوة 5.2.2.7) في 1800 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend في 1 مل من العازلة TEGN. إعادة الطرد المركزي في 1800 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية لتغسل عازلة تمنع.
      10. سدت و resuspend بروتين A / G الراتنج في 1 مل من العازلة TEGN وقسامة في أنابيب جديدة ملزمة البروتين منخفضة للحصول على 7.5 ميكرولتر المفكرهcked بروتين والراتنج / G في نقطة IP. أجهزة الطرد المركزي في 1800 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وإزالة أكبر قدر ممكن من طاف.
      11. إضافة الإجمالية مقتطفات النووية المحتضنة مع القيمة المطلقة (أو السيطرة مفتش) إلى الراتنج / G. خلط واحتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) على عجلة دوارة.
      12. الطرد المركزي تعليق 1800 x ج في RT لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف، resuspend في 1 مل من غسل العازلة ووقف نقل إلى أنابيب ملزمة جديدة منخفضة. في احتضان RT على عجلة دوارة لمدة 5 دقائق.
      13. تعليق الطرد المركزي في 1800 x ج في RT لمدة 2 دقيقة، resuspend في 1 مل من غسل العازلة واحتضان في RT على عجلة دوارة لمدة 5 دقائق. تكرار 4 مرات. لآخر نقل يغسل إلى أنبوب ملزم منخفض جديد.
      14. إزالة الحد الأقصى من طاف. إضافة 7 ميكرولتر من غسل العازلة، 7 ميكرولتر من العازلة 4X تحميل و 3 ميكرولتر من 10X الحد من وكيل إلى الخرز، وخلط ويغلي لمدة 5 دقائق في 96 درجة مئوية.
      15. إجراء تحليل لطخة الغربية مع الأجسام المضادة من كثافة العملياتerest (محددة للمرشح شريك لفي مأمن عجلت البروتين). استخدام 1٪ (5 ميكروغرام) مقتطفات من المدخلات كوسيلة لمراقبة مستويات البروتين الذاتية (الشكل 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لفهم تنظيم النشاط MyoD، التي قطعناها على أنفسنا توصيف شامل للمجمعات MyoD باستخدام تنقية الكيمياء الحيوية، وعلى أساس immunopurification من شكل الموسومة مزدوج من MyoD تليها مطياف الكتلة (MS). استخدام خط الخلية هيلا-S3 معربا عن MyoD الموسومة العلم-HA-وخط خلية مراقبة معربا عن تصاريح العلم-HA للحصول على ما يكفي من المواد لتنقية مجمع MyoD عن طريق أداء تنقية المزدوج تقارب من العلم-HA-MyoD.

نحن مجزأة مقتطفات الخلية إلى كسور حشوية والنووية، ثم تعزيز مجزأة جزء النووي المستخرج من الملح (ملح استخراجها النووي، SE) والمخصب لجسيم نووي (، NE التخصيب جسيم نووي) الكسور. تنقية TAP الوسم من هذه الكسور النووية فصل (الشكل 1، الجدولين 1 و 2) سمحت الشركاء الذين لديهم منخفض نسبيا من أساسها كشفundance عندما المترجمة في مقصورة النووية الدقيقة واحدة محددة. وعلاوة على ذلك، تم استغلال هذه الاستراتيجية للكشف عن شركاء من غير منضم (SE) مقابل (NE) MyoD محددة الحمض النووي للحصول على أفكار بشأن تنظيم النشاط MyoD.

لتنقية TAP الوسم، تم استخدام نظام جنبا إلى جنب حاتمة العلم-HA. علم ماء صغير والحواتم HA يكون الحد الأدنى من التدخل مع وظيفة البروتين ويمكن الوصول إليها إلى حد كبير للتفاعل الأجسام المضادة مستضد. تم إجراء ضد العلم ومكافحة HA-راتنجات immunopurification متتابعة، تليها شطف من المجمعات immunopurified باستخدام العلم وHA الببتيدات. البروتينات مزال كانت ثم تشغيل على SDS-PAGE للسماح لجميع البروتينات لدخول هلام. وقطعت قطعة من هلام يحتوي على جميع البروتينات النقاء. تم استخراج البروتينات، والتي حددها مطياف الكتلة (MS) هضم التربسين.

كما هو مبين في الشكل 2، (الشكل 2 و 3) 26-28. هذا يسلط الضوء على شركاء MyoD محددة الحمض النووي واحتمال تعاون المنظمين أن يمكن تأسيس بيئة قمعية الكروماتين. على سبيل المثال، والبروتينات HP1، التي تم تحديدها كشركاء MyoD التي كتبها منهجية وصفها، ومن المعروف أن ربط H3K9 الميثيلي للحفاظ على قمع الجينات وهيكل المغاير. في الواقع، HP1 يمنع MyoD النشاط النسخي مما أدى إلى التعبير الجيني MyoD الهدف ضعف العضلات ومحطة التمايز 26.

مزيد من التجزئة للالمجمعات MyoD SE وNE على التدرج الجلسرين (كما هو موضح في 29) كشفت MyoD المجمعات الفرعية في اثنين من مقصورات النووية الدقيقة (الشكل 1B). على وجه الخصوص، يتم توزيع SE MyoD في ثلاثة مجمعات فرعية، بينما ينتمي إليها MyoD محددة لونين أساسا إلى مجمع واحد.

كشفت بعض TAP العلامة / MS تأكدت interactors لطخة غربية على المجمعات MyoD. وتشمل هذه البرازيلي عامل النسخ، انحسار، MTG8R والوحيدات BAF47 السويسري / الجبهة الوطنية الصومالية (SNF5) (الشكل 3A، يسار) والبروتينات HP1 (CBX1 وCBX3) (الشكل 3A، يمين). الأهم من ذلك، حيث أن خلايا هيلا ليست خلايا العضلات ولا تعبر عن MyoD، فمن الضروري لتأكيد التفاعل بين interactors التي تم تشخيصها حديثا وMyoD في myoblasts (الشكل 3 دينار بحريني). والجدير بالذكر أن لهذا التحقق، فإن مجموع مقتطفات النووية (بدون الفاصل على SE وNE) وعادة ما تكون كافية، حركتيح يسمح الحد من كمية myoblasts المستخدمة في إعداد العينات. في المختبر المقايسات التفاعل كما هو الحال في 26،27، تساعد على زيادة التحقق من صحة هذه النتائج. وأخيرا، فإن المعاني الوظيفية لهذه التفاعلات في خلايا العضلات وينبغي مواصلة التصدي لها في 26-28.

مجتمعة، عرض البيانات تظهر وجهة نظر عالمية من الشركاء MyoD أعرب بتواجد مطلق وتمهد الطريق لمزيد من الدراسات الفنية في نموذج العضلات أكثر أهمية.

الشكل 1
الشكل 1: MyoD مجمعات معزولة من قبل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (A) وتلطيخ الفضة من مضاعفة مجمعات eMyoD-تنقية تقارب معزولة من الملح للاستخراج النووي (SE) أو جسيم نووي التخصيب (NE) كسور النووية من خطوط الخلايا هيلا-S3 ثابت. معربا عن العلم-HA-MyoD (MyoD مجمع) لد خط خلية السيطرة (وهمية). ميغاواط، الوزن الجزيئي علامة في دالتون كيلو (كيلو دالتون). السهم يشير العلم-HA-MyoD (eMyoD). وقد نشر هذا البحث أصلا في 37. حقوق التأليف والنشر الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. تم تعديل هذا الرقم من 26: الممرات مع التنقيات وهمية وeMyoD ترد مجمع معزولة عن كسور النووية SE الآن. (ب) كانت المجمعات eMyoD-تنقية تقارب مزدوجة كما في الفقرة (أ) مجزأة على التدرج الجلسرين تتراوح ما بين 20٪ إلى 41٪. تم جمع الكسور يدويا، ركز وتحليلها بواسطة لطخة غربية (WB) باستخدام أضداد العلم. ملاحظة وجود عدة eMyoD التي تحتوي على مجمعات فرعية في (SE) جزء الملح استخراجها النووي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 الشكل 2: مقارنة بين متجهة الى لونين (جسيم نووي المخصب، NE) مقابل القابلة للذوبان النووية (الملح النووي للاستخراج، SE) MyoD الشركاء الأعلى: فين رسم بياني يظهر التداخل بين interactors eMyoD معزولة من الملح للاستخراج النووي (جنوب شرق) والتخصيب جسيم نووي ( NE) الكسر. البروتينات الريباسي، تم استبعاد العوامل الترجمة بدء، والعوامل إصلاح الحمض النووي والإسوية تويولين من التحليل لأنها موجودة في مختلف مختلفة مجموعات البيانات التي حصلت عليها TAP، وتعتبر غير محددة القاع: لinteractors MyoD وجدت في كل SE وقسمت كسور NE (مشتركة) أو محددة لأحد من الكسور (فريدة) في مجموعات على أساس الشروح الوظيفية. الهيكل الخلوي ذات الصلة وليس وصفت البروتينات المتنوعة الأخرى. البروتينات هي شدد interactors MyoD التحقق من صحة إما في هيلا و / أو في myoblasالخبر عن طريق المشاركة في مناعي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: التحقق من مجموعة مختارة من MyoD Interactors (أ) التحقق من interactors MyoD، التي حددها مطياف الكتلة، في خط الخلية هيلا-S3 التعبير عن مستقر العلم-HA-MyoD (eMyoD) اللوحة اليمنى: تحليل لطخة غربية من تقارب مزدوج المجمعات MyoD -purified معزولة من الملح استخراجها النووي (SE) أو (NE) كسور التخصيب جسيم نووي من خط الخلية هيلا-S3 التعبير عن مستقر eMyoD أو خلية خط السيطرة (وهمية) مع الأجسام المضادة المشار إليها. ميغاواط، الوزن الجزيئي علامة الحق لوحة: تحليل لطخة غربية من مضاعفة مجمعات MyoD-تنقية تقارب معزولة عن كسور التخصيب جسيم نووي النووية هيلا-S3 خط الخلية الصورةمعربا عن tably eMyoD أو خط خلية السيطرة (وهمية) مع الأجسام المضادة المشار إليها. وقد نشرت هذه اللوحة في الأصل في مجلة الكيمياء البيولوجية. ياهي H، L فريتش، Philipot O، Guasconi الخامس، سويدي M، روبن P، Polesskaya A، R Losson، هاريل-بلن] A، آيت سي علي S. J بيول كيم. 29 أغسطس 2008، 283 (35): 23٬692-700. دوى: 10.1074 / jbc.M802647200. النشر الإلكتروني 2008 يوليو 2. حقوق الطبع والنشر والجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. تم تعديل هذا الرقم من 26: تم تغيير نوع الشرطة وحجم واستدارة النص إلى توحيد العلامات ضمن هذا الرقم. وصفت MyoD كما eMyoD لتجنب الخلط بينها وبين الملكية الفكرية الذاتية المعروضة في اللوحات الأخرى. (BD) التحقق من interactors MyoD في myoblasts الماوس C2C12. واستخدمت (ب) مجموع مقتطفات النووية من الانتشار myoblasts C2C12 للمناعي (IP) مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد BAF47 (SNF5) أو MyoD، أو مع مفتش الرقابة. وقد تم تحليل الرواسب الناتجة من الطرافة البنك الدوليح الأجسام المضادة المشار إليها. لأضداد MyoD أطول (المعرض طويلة.) وأقصر (المعرض قصيرة.) يتم عرض أوقات التعرض. تم تحميل مقتطفات الإدخال لتظهر مستويات البروتين الذاتية. وقد تم نشر هذا الفريق في 28 تحت المشاع المبدع مؤلفه (CC BY) رخصة (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). تم تعديل هذا الرقم من 28: تم تغيير نوع الشرطة وحجم واستدارة اختبار لتوحيد العلامات ضمن هذا الرقم. (C) واستخدمت إجمالي مقتطفات النووية من الانتشار myoblasts C2C12 للمناعي مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد MyoD، Suv39h1 (مراقبة إيجابية)، أو السيطرة مفتش (مراقبة سلبية). ثم تعرضوا للرواسب مما أدى إلى الضفة الغربية مع الأجسام المضادة المشار إليها. وقد نشرت هذه اللوحة في الأصل في مجلة الكيمياء البيولوجية. ياهي H، L فريتش، Philipot O، Guasconi الخامس، سويدي M، روبن P، Polesskaya A، R Losson، هاريل-بلن] A، آيت سي علي S. J بيول كيم. 2008 أغسطس 29، 283(35): 23٬692-700. دوى: 10.1074 / jbc.M802647200. النشر الإلكتروني 2008 يوليو 2. حقوق الطبع والنشر والجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. تم تعديل هذا الرقم من 26: تم تغيير نوع الشرطة وحجم واستدارة النص إلى توحيد العلامات ضمن هذا الرقم. (D) مجموع مقتطفات النووية من الانتشار (prolif.) والتفريق C2C12 myoblasts (48 ساعة، وأشار كما الفرق.) كانت تستخدم لمناعي (IP) مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد MyoD وMyf5، أو مع مفتش أرنب عادي ومع حبات فارغة كما السيطرة السلبية. وقد تم تحليل الرواسب الناتجة من قبل البنك الدولي مع الأجسام المضادة المشار إليها. تم تحميل مقتطفات الإدخال لتظهر مستويات البروتين الذاتية. وقد تم نشر هذا الفريق في 27 تحت المشاع المبدع مؤلفه (CC BY) رخصة (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). تم تعديل هذا الرقم من 27: تم تغيير نوع الشرطة وحجم واستدارة النص إلى توحيد العلامات داخل وigure. لوحات مع النتائج التي تم الحصول عليها من الانتشار والتفريق C2C12 يتم فصل في اثنين بدلا من الرقم الأصلي. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

واعتبرت قائمة البروتينات التي تم تحديدها من قبل التحليل ماجستير في مجمعات eMyoD تنقية الانجذاب-مزدوجة معزولة عن النووية جزء السلط استخراجها بعد الطرح من البروتينات الخلفية (البروتينات التي كتبها MS المحددة في eluates من خط الخلية السيطرة كخلفية غير محددة: الجدول 1. .) البيانات تمثل مجموع أربعة التنقيات مستقلة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 2: قائمة البروتينات أناdentified بواسطة تحليل ماجستير في مجمعات eMyoD تنقية الانجذاب-مزدوجة معزولة عن جزء المخصب جسيم نووي، بعد الطرح من البروتينات الخلفية. وتمثل البيانات مبلغ ثلاثة التنقيات مستقلة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول 3. العازلة التراكيب. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح الطريقة المعروضة تحديد شاملة من شركاء عامل النسخ، MyoD. وكشفت شركاء MyoD في نظام مغاير مقاومة للالتمايز الناجم عن MyoD، وهي خلايا هيلا-S3. وبالتالي، بحكم التعريف، يتم التعبير عن بتواجد مطلق شركاء MyoD التي تم تحديدها. وتشمل هذه العوامل العامة وتسلسل معين النسخ، والإنزيمات تعديل الكروماتين والبروتينات معالجة RNA، تحركات (الجدولين 1 و 2). منذ خلايا هيلا-S3 مقاومة لالناجم عن MyoD العابرة للتمايز، والنشاط MyoD هو قمعي أساسا، ومن المرجح أن يكون MyoD المشارك repressors الشركاء تحديدها. ويبرز ذلك من خلال وجود البروتينات رقم (الجدولين 1 و 2، الشكل 2)، والمعروف أن تمنع MyoD transactivation قدرة 8. الأهم من ذلك، هذه الدولة القمعية يتوافق مع الوضع MyoD في المتكاثرة myoblasts. في الواقع، أكدنا أن التفاعلات MyoD مع CBFβ، وMyoDشريك التي حددها طريقة وصفها، ويمكن الكشف في المتكاثرة myoblasts C2C12، ولكنها فقدت عندما خضعت خلايا التمايز (انظر الشكل 3D). ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن أحد القيود الرئيسية للالمنهجية المقدمة هو عدم وجود MyoD شارك في تفعيل الهوية. باستمرار، وذلك باستخدام هذا الأسلوب أيا من المعروف MyoD شارك في تفعيل، مثل هيستون acetyltransferases تم تحديد 32.

تنقية المجمعات MyoD إما من الكسر للذوبان (الملح النووي استخراجها، SE) من نواة أو جزء التخصيب لونين (جسيم نووي مخصب، NE) (الشكل 1A) يخدم اثنين على الأقل وظائف رئيسية. أولا، هذه التجزئة زيادة تمثيل الشركاء غير متكافئة من شأنها أن ملثمين إذا تنقية MyoD أداء من إجمالي مقتطفات النووية. ثانيا، وهذا يسمح بفصل اثنين من القطعان وظيفية من MyoD: أودعت قبل / EVICتيد (SE) ومحددة لونين (NE). بين interactors محددة لMyoD الحمض النووي غير منضم، العديد من تحركات، عوامل النسخ، الاتجار البروتينات وكذلك تم تحديد بعض و remodelers لونين (الشكل 2). عندما التحقق من صحتها تماما، يمكن لهذه الشبكة توفر نظرة ثاقبة في طريقة تنظيم نشاط MyoD الحمض النووي غير منضم. بحث إضافي لMyoD التعديلات بعد متعدية في هذه المقصورات النوويتين التي كتبها الطيف الكتلي، يمكن أن تزيد تنهار MyoD تنظيم النشاط. وأخيرا، كشفت تجزئة المجمعات MyoD القابلة للذوبان ومحددة لونين على التدرج الجلسرين أنه في حين يرد أساسا MyoD محددة لونين في مجمع واحد، يتم توزيع MyoD الحمض النووي غير منضم في ثلاثة مجمعات الفرعية (الشكل 1B). توصيف هذه المجمعات الفرعية إما عن طريق MS و / أو لطخة غربية ضد المرشحين البروتين يجب أن نزيد من توضيح طريقة تنظيم MyoD.

كما أكد أعلاه، خلايا هيلا لا expre بشكل طبيعيSS عضلة النسخ عامل MyoD. ولذا كان من المهم التأكد من التفاعلات الموجودة في نموذج الهيكل العظمي والعضلات (الشكل 3). العديد من التقارير المؤكدة في النماذج ذات الصلة مثل هذه التفاعلات الوظيفية بين MyoD وبعض الشركاء المحددة في عرض TAP العلامة فحص. هذا هو على سبيل المثال قضية prohibitin 33، DDX17 34، MEIS1 35، البرازيلي 27، HP1 26، والسويسري / الجبهة الوطنية الصومالية، إعادة عرض لونين 36،28،30 تعقيدا.

لاحظ أنه من الممكن أن تؤدي هذه تنقية TAP العلامة من كمية قليلة من الخلايا، مثل من myoblasts، وعندما يقترن إلى MS الحساسة. في الواقع، وصفت ورقة حديثة شركاء MyoD توصيف بعد التعبير محرض من MyoD الموسومة العلم في myoblasts 30. منذ مستقرة ومستمرة overexpression MyoD في myoblasts هو ضار، فإن نهج بديل يكون إضافة علامات العلم-HA في أليل MyoD الذاتية (ق) في myoblastsباستخدام أساليب تحرير الجينوم، مثل كريسبر-Cas9 31. والجدير بالذكر، أن إضافة كلمة دلالية يحتمل أن يغير وظيفة البروتين و / أو بالتعاون مع شركاء ملزم، وبالتالي فإن مكان علامة (N- أو محطة سي) وينبغي اختيار بحذر. وفحص وظيفي من البروتين الانصهار في النظام المناسب يجب أن يؤديها قبل تنقية للاستفادة من العلامة لضمان البروتين الموسومة هو وظيفي. مناعي للبروتينات الذاتية يتجنب هذه المشاكل، ومع ذلك، فإنه يعتمد على توافر الأجسام المضادة المحددة وارتفاع تقارب، والتي نادرا ما تتوفر.

آخر القيمة المضافة للنهج وصفه هو إمكانية تحديد التعديلات بعد متعدية (PTMs) من البروتين النقي نفسها وشركائها وفيرة. وبالتالي، مع هذه الميزة تنقية TAP العلامة مناسبة لتحديد ليس فقط شركاء تفاعل جديد ولكن أيضا وظائف الأنزيمية الجديدة المرتبطة البروتين من الفائدة و / أو شركائها. فيفي حالة وجود بروتين ملزمة لونين (أي، عوامل النسخ، والإنزيمات)، وبالتالي تكييف هذه الطريقة لتحديد "مدونة هيستون" المرتبطة بها. والواقع أن ذيول هيستون الأمينية المحطة، التي يتعرض لها على سطح جسيم نووي، تخضع لPTMs تساهمية متعددة. PTMs هيستون تمنح توقيع فريدة من نوعها لجسيم نووي المعنية. وبالتالي يمكن لمزيج من تعديلات مختلفة على هيستون ذيول-N محطة يغير هيكل لونين للسماح تنظيم التعبير الجيني. وهكذا، واصفا هذه التعديلات المرتبطة بروتين معين يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لدور وآليات عمل للدرس البروتينات ملزم لونين 22.

وباختصار، تسمح منهجية قدمت تحديد شاملة من شركاء MyoD. توفر تنقية TAP العلامة بديلا عن المناهج الأخرى مثل ضريبة السلع والخدمات سحب هبوطا، الخميرة المقايسات يومين الهجينة وعرض فج. حتى لو كان لأسباب عملية (الانتاج:ن كمية كبيرة من مقتطفات النووية) لدينا لاستخدام نظام الهاتف الخلوي مغاير، وكنا قادرين على تأكيد مشاركة الشركاء MyoD المحددة في التمايز الهيكل العظمي والعضلات. تظهر البيانات المتحصل عليها أن عامل عضلي MyoD يبدو للتفاعل مع مجموعة كبيرة من البروتينات تتراوح بين المنظمين النسخي إلى البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة، مما يشير إلى آليات مختلفة لتنظيم النشاط عامل النسخ.

في الختام، يمكن أن تستخدم الأسلوب المنهجي نفسه لتحديد الشركاء أعرب بتواجد مطلق من العوامل النووية العديدة التي يمكن أن يكون من الصعب للدراسة في السياق الخلوية الخاصة بها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 111، MyoD، TAP الوسم، مطياف الكتلة، لونين، والنسخ، والعضلات، هيلا-S3.
تحديد MyoD Interactome عن طريق جنبا الى جنب الانجذاب تنقية جانب لقياس الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch,… More

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter