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Biology

Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas

Published: May 17, 2016 doi: 10.3791/53924
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

Abstract

Esquelética diferenciación terminal muscular comienza con el compromiso de las células precursoras mesodérmicas pluripotentes de mioblastos. Estas células tienen todavía la capacidad de proliferar o pueden diferenciar y fusible en miotubos multinucleados, que maduran adicionalmente para formar miofibras. Esquelético muscular diferenciación terminal está orquestada por la acción coordinada de diversos factores de transcripción, en particular los miembros de los factores o MFR reguladoras musculares (MyoD, Miogenina, Myf5 y MRF4), también llamado el bHLH myogenic factores de transcripción de la familia. Estos factores cooperan con los complejos de remodelación de la cromatina dentro elaborada red de regulación transcripcional para lograr la miogénesis esquelético. En esto, MyoD se considera el factor de transcripción miogénica principal en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular. Esta noción se ve reforzada por la capacidad de MyoD para convertir células no musculares en las células del músculo esquelético. Aquí se describe un enfoque utilizado para identificar MyoDcompañeros de la proteína de una manera exhaustiva con el fin de dilucidar los diferentes factores que intervienen en la diferenciación terminal del esqueleto muscular. El objetivo a largo plazo es entender los mecanismos epigenéticos implicados en la regulación de los genes del músculo esquelético, es decir, las metas. MyoD. socios MyoD se identifican mediante el uso de Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) de un sistema heterólogo acoplado a la caracterización Espectrometría de Masas (MS), seguido de la validación del papel de los interlocutores relevantes durante la diferenciación terminal del esqueleto muscular. formas aberrantes de factores miogénicos, o su regulación aberrante, se asocian con una serie de trastornos musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiosarcoma y defectos en la regeneración muscular. Como tal, factores miogénicos proporcionan un número de posibles dianas terapéuticas en trastornos musculares, tanto con respecto a los mecanismos que causan la enfermedad en sí y los mecanismos de regeneración que puede mejorar el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, la understan detalladading de las interacciones intermoleculares y los programas genéticos controlados por los factores miogénicos es esencial para el diseño racional de terapias eficaces.

Introduction

organismos multicelulares eucariotas están compuestos de diferentes órganos y tejidos. Cada tejido funcional tiene una expresión patrón de gen específico, que se determina en cada paso diferenciación. La diferenciación celular implica la activación de genes específicos, el mantenimiento de su expresión y, en general, el silenciamiento de un conjunto de genes, tales los que participan en la proliferación celular. la diferenciación del músculo esquelético, o miogénesis, es por tanto un proceso de múltiples pasos, que comienza con la determinación de las células madre mesodérmicas en mioblastos, y luego lleva a la diferenciación terminal de estas mioblastos en primera mono-nucleado, y a continuación, multi-nucleado, miotubos . Por lo tanto, los mioblastos se "determinan" las células, que son todavía capaces de proliferar, pero que están comprometidos con el linaje del músculo esquelético, y por lo tanto pueden diferenciar únicamente en las células del músculo esquelético, ya sea durante el desarrollo embrionario o en la regeneración del músculo adulto. El proceso de la terminal de músculo esquelético difierendife- está orquestada por un programa genético específico que comienza con la salida permanente del ciclo celular de las células precursoras de mioblastos que conduce a un silenciamiento definitiva de la proliferación asociada genes, tales como E2F genes diana 1. De hecho, durante el proceso de diferenciación terminal, detener la proliferación de mioblastos es un paso crucial que precede a la expresión de genes específicos del músculo esquelético y la fusión de mioblastos en miotubos 2. un programa de este tipo permite células madre musculares adultas, también llamadas células satélite, para diferenciar durante el proceso de regeneración tras una lesión del músculo esquelético.

Miogénesis mamífero es críticamente dependiente de una familia de miogénica hélice-bucle-hélice (bHLH) factores de transcripción MyoD, Myf5, MRF4 y Miogenina, a menudo referido como la familia de factores de determinación del esqueleto muscular o MFR (músculo factores reguladores) 3. Cada uno de ellos tiene un papel esencial en la especificación y difdiferencia- de las células del músculo esquelético y tiene un patrón de expresión específico 4 5-7. La activación de Myf5 y MyoD constituye el paso determinante que compromete a las células con el linaje miogénico, y la posterior expresión de miogenina desencadena la miogénesis con la activación de genes específicos de músculo esquelético, como MCK (Muscle creatina quinasa). Myogenic factores de transcripción bHLH cooperan con miembros de la familia MEF2 en la activación de genes musculares de loci previamente silenciosa 8. También estimulan la transcripción de genes del esqueleto muscular como heterodímeros con proteínas bHLH ubicua, E12 y E47, conocidas como proteínas E, que se unen las denominadas cajas E en varias regiones gen regulador de las 8. Twist, Id (inhibidor de la diferenciación) y otros factores regulan negativamente este proceso, al competir con MyoD de proteínas E de unión 8.

MyoD es considerado como el principal jugador en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular 9 10-13. De hecho, la expresión forzada de MyoD induce la trans-diferenciación de los distintos tipos celulares, incluso las derivadas de otro origen embriológico 12. Por ejemplo, puede convertir MyoD hepatocitos, fibroblastos, melanocitos, los neuroblastos, y adipocitos en células musculares similares. La acción trans-diferenciación de MyoD implica una activación anormal del programa genético miogénica (en particular sus genes diana) en un entorno no-muscular, concomitante con el silenciamiento del programa genético original (en particular, la proliferación de genes).

En la proliferación de mioblastos, MyoD se expresa pero es incapaz de activar sus genes diana incluso cuando se une a sus promotores 14-16. Por lo tanto, el requisito de MyoD a ser expresadas de forma continua en mioblastos indiferenciados sigue siendo bastante elusiva. MyoD pudo reprimir sus genes diana debido a la contratación de las enzimas represivas cromatina modificadores en la proliferación de mioblastos antes de la carga de la activación de las enzimas de remodelación de la cromatina 14,17. Por ejemplo, en la proliferación de mioblastos, MyoD se asocia con co-represor transcripcional CAP-1, las histona desacetilasas (HDACs) y methyltransferases lisina represivos (KMTS), incluyendo la lisina de la histona H3 9 o H3K9 y H3K27 KMTS, y suprimir de forma activa su expresión genes diana mediante el establecimiento de un local represiva 14,17 estructura de la cromatina. Es importante destacar que un informe reciente indica que MyoD resulte directa metilado H3K9 por el KMT G9a lo que resulta en la inhibición de su actividad transactivadora 16.

Los mecanismos epigenéticos que participan en este trans-diferenciación de las células no musculares por MyoD son en gran parte desconocidos. En particular, algunas líneas de células son resistentes a la MyoD inducida trans-diferenciación. Por lo tanto, en células HeLa, MyoD es o bien inactiva oincluso podría funcionar como represor en lugar de activador de la transcripción debido a la falta de expresión de la subunidad BAF60C de la remodelación de la cromatina complejo SWI / SNF 18. Este modelo puede por lo tanto ser de elección para caracterizar mejor los mecanismos de la represión de genes MyoD inducida. También es adecuado para ensayar la capacidad de MyoD para inducir la cromatina medio ambiente represivo en su meta loci asociados con sus socios y por lo tanto descubrir los mecanismos represivos MyoD-dependiente en la proliferación de mioblastos para afinar la diferenciación terminal.

A continuación se describe el protocolo para la identificación de los socios MyoD utilizando Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) acoplada a espectrometría de masas caracterización (MS). El uso de células HeLa-S3 que expresan de forma estable Bandera-HA-MyoD permitido obtener suficiente material para purificar los complejos de MyoD a partir de extractos nucleares fraccionadas. La identificación de los socios MyoD en el sistema heterólogo fue seguido por validatien un sistema en cuestión.

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Protocol

1. Preparación de las fracciones HeLa-S3 Nuclear Sal-extraíbles y con destino a la cromatina

  1. Colección de las células
    1. Crecer HeLa-S3 Flag-HA-MyoD y HeLa-S3 Flag-HA (línea de células de control) en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (crecimiento medio) a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador húmedo.
      Nota: Las células HeLa-S3 de forma estable que expresan las células transducidas con el vector vacío (HeLa-S3 Bandera-HA) Bandera-HA-MyoD y HeLa-S3 podría ser bien establecidos usando el protocolo descrito en: 19,20, o proporcionados por los autores.
    2. Amplificar las células hasta 10 platos completamente confluentes de 150 mm de cada línea celular (células HeLa S3-Bandera-HA-MyoD y HeLa S3-Bandera-HA).
    3. Recoger el sobrenadante (contenga subpoblación no adherentes) en 5 L de spinner.
    4. Lavar la subpoblación adherente con 10 ml de PBS por placa de 150 mm, trypsinize células durante 1 min a tem habitaciónambiente (solución de tripsina-EDTA al 0,05%, 2 ml para un plato de 15 cm).
    5. Añadir 4 ml del medio por placa de 150 mm y recoger las células en tubos de 50 ml.
    6. Combinar el sobrenadante de la etapa 1.1.3 (en el 5 L spinner) y las células de la etapa 1.1.5, añadir 500 ml de medio de crecimiento pre-calentado de nuevo para cada línea celular.
    7. Transferencia de suspensión celular en 5 L spinner y crecer las células durante al menos 60 horas a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador húmedo.
    8. Añadir 500 ml de medio de crecimiento fresco y crecer las células durante 24 horas.
    9. Añadir 1 L de medio de crecimiento fresco y crecer las células durante 24 horas.
    10. Sacar 1 ml de la suspensión celular a contar las células y comprobar la viabilidad celular. Color de 30 l de suspensión celular con 30 l de 0,4% de azul de tripano y las células vivas contar (no azules) bajo el microscopio utilizando hemocitómetro.
    11. Mantener la densidad celular en 2 - 6 x 10 5 células / ml mediante la adición de medio de cultivo fresco todos los días; sea ​​inferior a 1 x 10 6 células / ml. El maximode volumen durante un 5 L spinner es de 2,5 L.
      Nota: Para los siguientes pasos, proceder por lotes 2 - 2,5 l de cultivo a una densidad de 1 x 10 6 células / ml. Repita los pasos del 01/01/12 a 01/01/14 para recoger cerca de 20 L (≈ 20 g de sedimento seco) de cada línea celular antes de proceder al siguiente paso.
    12. Precipitar las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
    13. Resuspender las células en 100 ml de PBS enfriado con hielo por pipeteo y se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para lavar el pellet.
    14. Repetir el lavado mediante la resuspensión de las células con 25 ml de PBS enfriado en hielo, la transferencia de la suspensión en 50 ml de tubo y centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
      Nota: Los sedimentos celulares pueden ser o bien utilizarse inmediatamente o se congelan en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C durante varios días.
  2. Aislamiento de los núcleos
    Nota: Realice los pasos 1.2.1 - 1.4.3 en la cámara frigorífica.
    1. bufé era pre-enfriamientoRS y homogeneizadores.
    2. Si se utiliza material congelado, descongelar rápidamente los sedimentos celulares en baño de agua a 37 ° C.
    3. Resuspender 20 g (≈ 20 ml) de las células en 20 ml (un volumen igual al tamaño de la pella de células) de tampón hipotónico A (Tabla 3) utilizando 10 ml del tampón al principio, luego la adición de 5 ml, a continuación, añadir otros 5 ml. Se lavan las pipetas bien con tampón fresco para obtener el máximo de las células.
    4. Transferencia de suspensión de células 40 ml en el homogeneizador de pre-enfriada con una mano de mortero ajustada.
    5. Homogeneizar las células con 20 golpes en un homogeneizador (20 movimientos de entrada y salida) y la transferencia de suspensión celular en un tubo de 50 ml.
    6. Lavar el homogeneizador con 7 ml de tampón de sacarosa (1/3 del volumen inicial de la célula, la Tabla 3) para recuperar el máximo de células. Transferir dicha suspensión rápidamente en el tubo de 50 ml de la etapa 1.2.5 para preservar los núcleos y limitar las fugas.
    7. Manchar una alícuota de 30 l con 30 l de 0,4% trypan azul, analizar bajo el microscopio para controlar la eficiencia de lisis (lisis si el tiene éxito, todos los núcleos deben ser de color azul). Si es necesario, repetir el paso de homogeneización.
    8. Centrifugar durante 7 min a 10.000 xg y 4 ° C para sedimentar los núcleos. Guardar el sobrenadante como la fracción citoplasmática.
  3. Preparación de fracción nuclear Sal-extraíble (SE)
    1. Resuspender el precipitado núcleos en 8 ml de tampón de sacarosa (un volumen igual al tamaño de la pastilla núcleos). Añadir gota a gota mientras que se mezcla a fondo en un vórtice 8 ml de tampón de alta concentración de sal (volumen pellet 1 núcleos, Tabla 3) para obtener una concentración final de NaCl 300 mM. Incubar durante 30 min en hielo y la mezcla cada 5 min.
    2. Disminuir la concentración de NaCl a 150 mM mediante la adición de 8 ml (1/3 del volumen total) de tampón de sacarosa. Centrifugar durante 10 min a 13.000 xg y 4 ° C. Recoger el sobrenadante (fracción extraíble con sal nuclear, SE).
      Nota: Ninguno de ellos continúe en el paso 1.3.3 o salir de la SEfracción en hielo durante la preparación de la fracción de cromatina determinada y luego ultra centrífuga ambas fracciones de forma simultánea.
    3. Ultra-centrífuga SE durante 30 min a 85.000 xg a 4 ° C. Tome sobrenadante (≈ 26 ml).
    4. Congelar parte alícuota de 100 l en nitrógeno líquido. Continúe con el paso 2 "proteína compleja de purificación", utilizando el resto del extracto.
      Nota: La alícuota es para ser utilizado como un control de entrada durante la etapa 5.1.1.
  4. Preparación de la fracción unida a la cromatina
    1. Resuspender el precipitado (de la etapa 1.3.5.) Meticulosamente en 7 ml (un volumen igual al tamaño de la pastilla) de tampón de sacarosa.
    2. Añadir CaCl 2 a una concentración final de 1 mM (28 l de 0,5 M CaCl 2 para 14 ml de suspensión) para activar MNase (etapa 1.4.4) y mezclar.
    3. suspensión de precalentamiento durante 1 min a 37 ° C.
    4. Añadir 70 l de nucleasa micrococcal (MNase) para obtener una concentración final de 0,0025 / l (dilución 1/200 de 0,5 TU / l de valores) y mezclar.
    5. Incubar exactamente 12 min a 37 ° C. Mezclar todos los 4 min.
    6. Colocar inmediatamente la reacción en hielo.
    7. Para detener la actividad MNase, añadir 112 l de 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 dilución) a una concentración final de 4 mM. Incubar durante 5 minutos en hielo.
    8. Someter a ultrasonidos 5 veces durante 1 min a alta amplitud, entre dos sonicaciones permitir un descanso de 1 min (10 min en total).
    9. Ultracentrífuga durante 30 min a 85.000 xg y 4 ° C.
    10. Recoger el sobrenadante (fracción enriquecida nucleosoma, NE, ≈ 12 ml).
    11. Congelación de 50 l alícuota en nitrógeno líquido. Continúe con el paso 2 "proteína compleja de purificación", utilizando el resto del extracto.
      Nota: La alícuota es para ser utilizado como un control de entrada durante la etapa 5.1.1.

2. La proteína Complejos Purificación

Nota: Se procede de extractos paralelos de cada línea celular (HeLa-S3 Bandera-HA-MyoD y el control, Hela-S3 Bandera-HA).

  1. La purificación basado Bandera-
    1. Prelavado resina de la bandera. Utilice 600 l de resina de la bandera (del 50% existencias comerciales) para cada punto experimental (SE y NE fracciones para cada línea celular).
    2. La resina se transfiere a 15 ml tubo, resuspender en 13 ml de tegn frío (Tabla 3), se centrifuga durante 2 minutos a 1000 xg y eliminar el sobrenadante. Repetir 5 veces. Después de la resina de la bandera de volver a suspender último lavado en un volumen idéntico de Tegn (300 l para cada punto experimental).
    3. Para cada punto experimental, mezclar 600 l de resina de la bandera de lavado y los correspondientes extractos de proteínas (en un tubo de 15 ml para el NE 12 ml y en un tubo de 50 ml para las fracciones 26 ml SE, respectivamente). Incubar durante la noche en una rueda que gira a 4 ° C.
    4. Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg a 4 ° C, dejar a un lado el sobrenadante y mantener a 4 ° C hasta que el resultado de la prueba de eficiencia de purificación (2.2).
    5. Para las muestras SE, resuspender la resina Flagen 4 ml de Tegn y la transferencia a un tubo de 15 ml. Repita este paso 3 veces, cada vez la transferencia al mismo tubo de 15 ml para evitar la pérdida de cuentas. Centrifugar 2 min a 1.000 xg y 4 ° C y retirar el sobrenadante.
    6. resina de la bandera de Wash 7 veces en un tubo de 15 ml utilizando 13 ml de tegn y centrifugando 2 min a 1.000 xg y 4 ° C.
    7. Después del último lavado, resuspender en 1 ml Tegn y transferencia en un tubo de 1,5 ml bajos vinculante. Centrifugar 2 min a 1.000 xg y 4 ° C y separar el sobrenadante.
    8. Resuspender en 200 l de solución de péptido Flag en 4 mg / ml a pH 7,8 para cada punto experimental. Mezclar los granos y los péptidos. Añadir 200 l de tampón de tegn y se incuba a 4 ° C durante al menos 4 horas o durante la noche para eluir las proteínas unidas.
    9. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xga 4 ° C y transferir la resina y el sobrenadante (la bandera de eluato) a una columna de centrifugación vacío colocado en un tubo de 2 ml.
    10. Se centrifuga la columna, recoger los sobrantes de sobrenadante en el tubo de 2 ml. Recoger la resina de la bandera añadiendo tampón Tegn a la columna y pasar a la segunda elución de la bandera con 200 l de solución de péptido Flag (4 mg / ml) durante la noche a 4 ° C para cada punto experimental.
    11. Repita los pasos 2.1.9 - 2.1.10 para recoger segunda elución. Combinar primer y segundo eluidos.
  2. Prueba de la eficacia de la purificación
    Nota: Durante el paso 2.1.11 a 2.1.12, lleve a cabo SDS-PAGE y tinción de plata (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Tomar 15 l de los eluidos, añadir 5 l de tampón de carga de 4x y 2 l de 10x agente reductor, hervir durante 5 min a 96 ° C y ejecutar un SDS-poliacrilamida al 4 - 12% gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Teñir el gel utilizando el kit de tinción de plata (siga las instrucciones del fabricante). Si hay claras diferencias en los patrones de proteínas entre Bandera-HA-MyoD y Bandera-HA eluidos simulacros, en particular, la banda de la bandera-HA MyoD (alrededor de 50 kDa, la figura 1A), pasar a la siguiente step.
  3. La hemaglutinina (HA) Purificación basado
    1. resina Wash HA mediante la transferencia en 15 ml de tubo, de resuspender en 13 ml de tegn y centrifugando 2 min a 1000 xg a 4 ° C. Repita el paso de lavado 5 veces. Después de volver a suspender las perlas último lavado en un volumen igual de tampón Tegn.
      Nota: El volumen se ajusta de acuerdo con la eficiencia de purificación basado-Flag. Comience con 300 l del 50% en acciones comerciales para cada punto experimental.
    2. Por transferencia de resina HA para cada punto experimental en un tubo de unión de baja de 1,5 ml. Centrifugar 2 min a 1000 xg a 4 ° C, a eliminar el máximo de la solución tampón de lavado (Tabla 3) y añadir los eluatos de purificación basado-Flag a la resina HA.
    3. Incubar los tubos en la rueda giratoria durante la noche a 4 ° C.
    4. Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg a 4 ° C, dejar a un lado el sobrenadante y mantener a 4 ° C hasta que el resultado de la prueba de eficiencia de purificación (2.3.12.).
    5. Resuspender la resina de HA en 0,5 ml de Tegn, traslado a una nueva unión de 1,5 ml tubo de baja. Repetir una vez resuspensión añadiendo al mismo tubo de 1.5 ml para evitar la pérdida de cuentas y centrífuga 2 min a 1.000 xg y 4 ° C. Aspirar el sobrenadante.
    6. Lavar los granos 8 veces utilizando 1 ml de tegn cada vez, centrifugación 2 min a 1.000 xg y 4 ° C y la eliminación de sobrenadante (evitar los granos pierden). Después del último lavado, transferir las perlas en tubos de 0,5 ml.
    7. Eliminar la mayor cantidad posible sobrenadante. Añadir 100 l de solución de HA péptido libre (4 mg / ml) a pH 7,8 en perlas para eluir las proteínas unidas. Incubar en la rueda giratoria durante la noche a 4 ° C.
      Nota: La cantidad de HA-péptido necesita ser ajustado dependiendo de la abundancia de los complejos.
    8. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xga 4 ° C y transferir la resina y el sobrenadante (HA eluato) a una columna de centrifugación vacío colocado en un tubo de 2 ml.
    9. Centrifugar la columna para recoger el sobrante de sobrenadante en el tubo de 2 ml. Realizar una segunda elución con 100 l de péptido HA (4 mg / ml) para cada punto experimental. Incubar en la rueda giratoria durante la noche a 4 ° C. Repita el paso 2.3.8 - 2.3.9 para recoger segunda elución.
    10. Combinar primer y segundo eluidos.
    11. Prueba de eficacia de la purificación por SDS-PAGE y tinción con plata (ver pasos 2.2.) (Figura 1A).
    12. Se concentra el eluato de HA a 30 l utilizando unidades de filtración centrífuga con un 10 kDa de corte (límite de peso molecular nominal, NMWL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    13. Divida las muestras concentradas en dos partes: 22,5 (3/4) y 7.5 (1/4) l. Congelamiento rápido 1/4 de las muestras en nitrógeno líquido y se almacena a -80 ° C. Utilice la parte 3/4 para el paso 3.
      Nota: La parte congelada 1/4 se va a utilizar para la confirmación de los resultados de espectrometría de masas por transferencia de western (véase el paso 5.1).

Análisis 3. Espectrometría de Masas

Nota: Los siguientes pasos deben ser discutidos con la instalación de espectrometría de masas que llevará a cabo el análisis.

  1. Suplemento 3/4 (22,5 l) de las muestras con 7,5 l de tampón de carga de 4x y 3,3 l de 10x agente reductor y hervir durante 5 min a 96 ° C.
  2. Cargar las muestras en un SDS-poliacrilamida al 4 - 12% de gel. gel de funcionar a 150 V constantes durante 5 minutos para permitir que todas las proteínas para entrar en el gel sin separación.
  3. Se lava el gel con agua; fijar, por 20 - 30 min con solución de fijación (ácido acético 10%, 50% de metanol, 40% de agua ultra-limpio) y luego lavar el gel fijo 5 veces en agua ultra-limpio.
  4. Cortar las bandas que contienen las proteínas, almacén en 1 ml de agua en un tubo de 1,5 ml y se enviará a las instalaciones de espectrometría de masas.

Análisis 4. Datos

Nota: Esta es una guía general para el análisis. Los pasos exactos dependerán del modo particular de los datos dados por la instalación MSutilizado para realizar el análisis (por ejemplo, 21,22).

  1. Compare la lista de las proteínas identificadas en los eluidos "MyoD" con la lista obtenida de preparación de control negativo correspondiente. Excluir del análisis de las proteínas que se encuentran en ambas listas.
  2. Eliminar las proteínas que tienen ≤2 número total de péptidos identificados a partir de la lista restante.
  3. Anotación funcional de acceso y la clasificación funcional de la lista obtenida de proteínas utilizando recursos DAVID Bioinformática (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) y clasificar la lista de las proteínas 23,24.
  4. (Opcional) Remover de la lista "autoestopistas", cargadas proteínas no nucleares con una fuerte accidental de unión a ADN cargado negativamente 25. Estos contienen proteínas del citoesqueleto, citoplásmicos, mitocondriales, y los receptores de membrana (plegamiento de proteínas, las proteínas del grupo citoesqueleto y diversas en las Tablas 1 y 2). </ Li>
  5. Comparación de las listas obtenidas de los interactores MyoD de fracciones SE y NE para identificar las proteínas y las proteínas comunes específicas para cada fracción (Figura 2).

5. Confirmación de Interactianos identificadas por Western Blot

  1. Confirmación en HeLa-S3 Bandera-HA-MyoD y HeLa S3-Bandera-HA
    1. muestras de eluato descongelación obtenidos en el paso 2.3.14 (7,5 l) en hielo. Añadir 12 l de tampón de tegn, 10 l de tampón de carga de 4x y 3 l de 10x agente reductor. Hervir las muestras durante 5 minutos a 96 ° C.
    2. Preparar muestras de entrada para el Western Blot.
      1. Descongelar alícuotas de los pasos 1.3.9 y 1.4.11 y medir la concentración de proteínas, por ejemplo utilizando el kit BCA (siga las instrucciones del fabricante).
      2. Utilizar 15 mg de la proteína por carril. Medir la cantidad apropiada de extracto y ajustar el volumen de la muestra hasta 15 l con tampón Tegn.
      3. Añadir tampón de carga 4x 5 ly1,5 l 10x agente reductor. Hervir las muestras durante 5 minutos a 96 ° C.
    3. Realizar un análisis de Western blot con anticuerpos específicos de interés (para el candidato socio identificado durante el análisis de MS) usando 15 l de muestras de eluato. Utilice extractos de entrada como control de los niveles de proteína endógenos (Figura 3A).
  2. La confirmación en el sistema celular relevante
    1. Preparación de extracto nuclear total de mioblastos C2C12 de ratón.
      1. Crecer C2C12 mioblastos de ratón en medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal 15%, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador húmedo. Nunca exceda el 80% de confluencia celular para mantener las células en estado de proliferación.
      2. Creciendo al menos dos placas de 150 mm de C2C12 por un punto (un anticuerpo) de inmunoprecipitación (IP). Aspirar el medio, lavar células dos veces con 10 ml de PBS.
      3. Raspar las células y recoger en tubo de 15 ml. Centrifuge a 250 g durante 5 min a 4 ° C. sobrenadante de descarte.
      4. Estimar el volumen del sedimento celular (= células V). Resuspender suavemente el sedimento en 3 volúmenes V de células de tampón hipotónico B para interrumpir membrana citoplasmática (Tabla 3).
      5. Añadir 0,44 x volumen de la celda V de 10% NP-40 para alcanzar la concentración final de 1% (v / v). Invertir suavemente el tubo varias veces para mezclar.
      6. Añadir 0,89 x volumen de la celda V de SR (Tabla 3) para preservar la integridad núcleos. Invertir suavemente el tubo varias veces para homogeneizar la suspensión, y se centrifuga durante 5 min a 2000 xg para sedimentar los núcleos.
      7. Eliminar el sobrenadante (fracción citosólica). Estimar el volumen de los núcleos de pellets (= V nuc). Resuspender pellet núcleos en un solo volumen V nuc de tampón de sacarosa.
      8. Añadir gota a gota mientras que se mezcla a fondo en un vórtice un volumen V nuc de tampón de sal alta para obtener una concentración final de 300 mMNaCl, y se incuba durante 30 minutos en hielo. Mezclar todos los 5 min.
      9. Añadir un volumen V nuc de tampón de sacarosa (para disminuir la concentración de NaCl a 150 mM) y CaCl 2 (concentración final 1 mM). Mezcla.
      10. suspensión de precalentamiento durante 1 min a 37 ° C, añadir micrococcal nucleasa para obtener la concentración final del 0,0025 U / l (1/200 desde el almacén de 0,5 U / l). Mezcla.
      11. Incubar exactamente 12 min a 37 ° C. Mezclar todos los 3 min.
      12. Colocar inmediatamente reacción sobre hielo y se añade EDTA (concentración final de 4 mM) para detener la actividad MNase. Incubar durante 5 minutos en hielo.
      13. Someter a ultrasonidos 5 veces para cada 0,5 minutos a alta amplitud. Entre dos sonicaciones, permite una interrupción de 0,5 minutos (5 minutos en total).
      14. Ultra-centrifugar durante 30 minutos a 85.000 x g y 4 ° C. Recoger el sobrenadante (extracto nuclear total).
      15. Medir la concentración de proteínas del extracto nuclear total, por ejemplo utilizando el kit BCA (siga las instrucciones del fabricante) y proceder immediatEly al paso 5.2.2.
    2. La inmunoprecipitación (IP) de MyoD endógeno.
      1. Comprobar la validez de los extractos clara, lavar 10 l de proteína G bolas de agarosa para cada punto IP.
        1. Transferir el volumen necesario de la proteína G perlas de agarosa en un tubo de 1,5 ml, se resuspenden en 1,4 ml de tegn frío, se centrifuga durante 2 min a 1.800 xg y eliminar el sobrenadante. Repetir 3 veces.
      2. Mezclar los granos proteína G agarosa pre-lavar con el volumen adecuado de extracto nuclear total. Utilizar 500 g de proteína total extracto nuclear por punto IP.
      3. Incubar en una rueda giratoria a 4 ° C durante 2 horas para pre-limpiar los extractos.
      4. Centrifugar durante 5 minutos a 1800 xga 4 ° C. Mantenga sobrenadante.
      5. Mezclar 5 g de MyoD Ab o 5 mg de IgG de conejo con 500 g de extractos nucleares totales pre-limpiado en tubos de 1,5 ml de unión de baja. Añadir Tegn de almacenar hasta 1 ml. Incubar en una rueda giratoria a 4 ° C durante la noche.
        Nota: Realizar la fespués de pasos durante el paso 5.2.2.3.
      6. Prelavado proteína de 7,5 l / G solución de cuentas de valores por punto IP.
        1. Transferir el volumen necesario de perlas en un tubo de 1,5 ml, perlas de volver a suspender en 1 ml de tegn y centrifugar a 1800 xg a 4 ° C durante 2 min. Eliminar el sobrenadante. Repetir 3 veces.
      7. Proteínas Resuspender A / G cuentas en 1,5 ml de solución (Tabla 3) y se incuba en una rueda giratoria de bloqueo durante la noche a 4 ° C.
      8. Centrifugar extractos nucleares totales incubadas con Abs (paso 5.2.2.5) a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Mantenga sobrenadante.
      9. Centrifugadora bloqueado resina de Proteína A / G (paso 5.2.2.7) a 1.800 xg durante 2 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de tegn. Vuelva a centrifugar a 1.800 xg durante 2 min a 4 ° C para lavar tampón de bloqueo.
      10. Resuspender bloqueado proteína A / G resina en 1 ml de tampón Tegn y alícuota en nuevos tubos de baja unión a proteínas para obtener 7,5 l bloUna resina de proteínas cked / G por punto IP. Centrifugar a 1800 xga 4 ° C durante 2 min y eliminar la mayor cantidad posible del sobrenadante.
      11. Añadir los extractos nucleares totales incubadas con el Abs (o IgG control) a la resina A / G. Mezclar e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente (RT) en una rueda giratoria.
      12. Centrifugar la suspensión 1.800 xg a TA durante 2 min. Desechar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de tampón de lavado y suspensión de la transferencia en nuevos tubos de unión de baja. Se incuba a RT en una rueda giratoria durante 5 min.
      13. suspensión Centrifugar a 1800 xg a TA durante 2 min, se resuspenden en 1 ml de tampón de lavado y se incuba a RT en una rueda giratoria durante 5 min. Repetir 4 veces. Para la última transferencia de lavado a un nuevo tubo de unión de baja.
      14. Eliminar máxima del sobrenadante. Añadir 7 l de tampón de lavado, 7 l de tampón de carga y 4x 3 l de 10x agente reductor a las perlas, mezclar y hervir durante 5 min a 96 ° C.
      15. Realizar un análisis de Western blot con anticuerpos de interest (específico para el candidato socio para la proteína precipitada inmunológico). Utilice 1% (5 g) de extractos de entrada como control de los niveles de proteína endógenos (Figura 3B).

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Representative Results

Para entender la regulación de la actividad MyoD, se realizó la caracterización exhaustiva de los complejos MyoD utilizando purificación bioquímica, basado en la inmunopurificación de una forma de doble etiquetado de MyoD seguido por espectrometría de masas (MS). El uso de la línea celular HeLa-S3 expresar MyoD Bandera de etiquetado-HA y una línea celular de control que expresa permisos Bandera-HA para obtener material suficiente para purificar el complejo MyoD mediante la realización de la purificación de doble afinidad del Bandera-HA-MyoD.

Fraccionado los extractos de células en fracciones citoplasmáticas y nucleares, y luego volvieron a fraccionar la fracción nuclear de la sal extraída (sal-extraíble nuclear, SE) y enriquecido por nucleosomas (NE nucleosomas, enriquecida con fracciones). Purificación TAP-Tag de estas fracciones nucleares separados (Figura 1, Tablas 1 y 2) permitió socios que tienen relativamente baja ab desentrañarUndance cuando está localizado en un compartimiento subnuclear específico. Por otra parte, esta estrategia fue explotada para descubrir socios de no unida (SE) frente a MyoD unido a ADN (NE) para obtener ideas sobre la regulación de la actividad MyoD.

Para la purificación TAP-Tag, se utilizó el sistema tándem epítopo Flag-HA. La pequeña bandera hidrófilo y epítopos HA tienen una mínima interferencia con la función de las proteínas y son muy accesibles para la interacción antígeno-anticuerpo. Anti-Flag y anti-HA inmunopurificación secuencial a base de resina se llevó a cabo, seguido de la elución de los complejos inmunopurificados utilizando Flag y HA péptidos. Las proteínas eluidas a continuación, se corrieron en un SDS-PAGE para permitir que todas las proteínas para entrar en el gel. Se cortaron las piezas de gel que contiene todas las proteínas purificadas; Se extrajeron las proteínas, digerida con tripsina y se identificó por espectrometría de masas (MS).

Como se muestra en la Figura 2, (Figura 2 y 3) 26-28. Esto arroja luz sobre los socios MyoD ADN-vinculados y posibles co-reguladores que pueden establecer un ambiente represivo cromatina. Por ejemplo, las proteínas HP1, que fueron identificados como socios MyoD por metodología descrita, se sabe que se unen H3K9 metilado para mantener la represión de genes y la estructura de la heterocromatina. De hecho, HP1 inhibe la actividad transcripcional MyoD que resulta en la expresión de genes objetivo MyoD deterioro muscular y la diferenciación terminal 26.

El fraccionamiento adicional delos complejos de MyoD SE y NE en gradiente de glicerol (como se describe en 29) descubrieron los MyoD sub-complejos en los dos compartimentos subnuclear (Figura 1B). En particular, SE MyoD se distribuye en tres sub-complejos, mientras que el MyoD cromatina determinada pertenece principalmente al complejo.

Algunos de los TAP-tag / MS reveló interactores fueron confirmados por Western blot de los complejos de MyoD. Estos incluyen el factor de transcripción CBF, EBB, MTG8R y la BAF47 SWI / SNF subunidad (SNF5) (Figura 3A, izquierda) y proteínas HP1 (CBX1 y CBX3) (Figura 3 A, derecha). Es importante destacar que, puesto que las células HeLa no son células musculares y no expresan MyoD, es necesario confirmar las interacciones entre los interactores recientemente identificados y MyoD en mioblastos (Figura 3 BD). Cabe destacar que, para dicha validación, los extractos nucleares totales (sin separación en SE y NE) suelen ser suficientes, which permite la reducción de la cantidad de mioblastos usados ​​para la preparación de la muestra. Los ensayos de interacción in vitro como en 26,27, ayudan a validar estos hallazgos. Por último, los significados funcionales de estas interacciones en las células del músculo deberán dirigirse más que en el 26-28.

Tomados en conjunto, presentan datos muestran una visión global de socios MyoD expresión ubicua y allanan el camino a nuevos estudios funcionales en un modelo muscular más relevante.

Figura 1
Figura 1: MyoD complejos aislados por Tandem Purificación por Afinidad (a) una tinción con plata de los dobles complejos eMyoD purificados por afinidad aislados de sal-extractable nuclear (SE) o-nucleosoma enriquecida (NE) fracciones nucleares de líneas de células HeLa-S3 estable. expresando Bandera-HA-MyoD (complejo MyoD) unalínea celular de control d (Mock). MW, marcador de peso molecular en daltons kilo (kDa). La flecha indica la bandera-HA-MyoD (eMyoD). Esta investigación fue publicada originalmente en 37. Derechos de autor La Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Esta cifra ha sido modificado a partir de 26: los carriles con purificaciones simuladas y eMyoD complejo aislado a partir de las fracciones nucleares SE ahora se muestran. (B) dobles purificados por afinidad complejos eMyoD como en (A) se fraccionaron en gradiente de glicerol que van desde 20% a 41%. Las fracciones se recogieron manualmente, se concentraron y se analizaron por Western Blot (WB) utilizando anticuerpos anti-Flag. Tenga en cuenta la presencia de varios sub-complejos de sal fracción nuclear extraíble (SE) que contiene eMyoD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 Figura 2:. Comparación de la cromatina determinada (nucleosoma enriquecido, NE) versus Soluble Nuclear (sal nuclear extraíble, SE) MyoD Partners Top: diagrama de Venn que muestra superposición entre interactores eMyoD aisladas de sal-extractable nuclear (SE) y nucleosoma enriquecido ( NE) fracción. Las proteínas ribosomales, factores de traducción de iniciación, factores de reparación del ADN y las isoformas de tubulina se excluyeron del análisis ya que están presentes en varios diferentes conjuntos de datos obtenidos por TAP y considerados como no específica Inferior:. Los interactores MyoD se encuentran tanto en SE y las fracciones NE (comunes) o específicas para una de las fracciones (únicas) se dividieron en grupos en función de sus anotaciones funcionales. Citoesqueleto relacionada con las proteínas y otras misceláneas que no se representan. Las proteínas subrayadas son interactores MyoD validados ya sea en HeLa y / o en myoblasts de co-inmunoprecipitación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Validación del conjunto seleccionado de MyoD Interactianos (A) Validación de los interactores MyoD, identificado por espectrometría de masas, en la línea celular HeLa-S3 expresan de forma estable Bandera-HA-MyoD (eMyoD) Panel izquierdo:. Western blot de doble afinidad complejos MyoD -purified aisladas de fracciones (NE) nucleosomas enriquecida de línea celular HeLa-S3 que expresan de forma estable eMyoD o célula de control de línea (Mock) con los anticuerpos indicados sal extraíble nuclear (SE) o. MW, marcador de peso molecular Panel derecho:. Western blot de los complejos de MyoD dobles purificados por afinidad aislado a partir de fracciones enriquecidas de nucleosomas nucleares de HeLa-S3 línea celular stablemente expresar o línea celular de control eMyoD (Mock) con anticuerpos indicados. Este panel fue originalmente publicado en The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, L Fritsch, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, R Losson, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 Ago 29; 283 (35): 23692-700. doi: 10.1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 julio 2. Derechos de Autor La Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Esta cifra ha sido modificado a partir de 26: tipo y tamaño de policía fue cambiado y el texto fue girado para unificar el etiquetado dentro de la figura. MyoD fue etiquetado como eMyoD para evitar la confusión con IP endógeno se presenta en los otros paneles. (BD) Validación de los interactores MyoD en C2C12 mioblastos de ratón. (B) los extractos totales nucleares de proliferación de mioblastos C2C12 se utilizaron para la inmunoprecipitación (IP) con anticuerpos producidos contra BAF47 (SNF5) o MyoD, o con IgG de control. Los precipitados resultantes se analizaron por el ingenio WBh los anticuerpos indicados. Para los anticuerpos anti-MyoD más largos (larga exposición.) Y más corto (expo corto.) Se muestran los tiempos de exposición. extractos de entrada se cargaron para mostrar los niveles de proteínas endógenas. Este panel ha sido publicado en 28 bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Esta cifra ha sido modificado a partir de 28: tipo y tamaño de policía fue cambiado y se ha girado la prueba de unificar el etiquetado dentro de la figura. (C) se utilizaron extractos totales nucleares de proliferación de mioblastos C2C12 para la inmunoprecipitación con anticuerpos producidos contra MyoD, Suv39h1 (control positivo), o IgG de control (control negativo). Los precipitados resultantes se sometieron a continuación a WB con los anticuerpos indicados. Este panel fue originalmente publicado en The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, L Fritsch, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, R Losson, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 Ago 29; 283(35): 23692-700. doi: 10.1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 julio 2. Derechos de Autor La Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Esta cifra ha sido modificado a partir de 26: tipo y tamaño de policía fue cambiado y el texto fue girado para unificar el etiquetado dentro de la figura. (D) los extractos totales nucleares de proliferación (prolife.) Y la diferenciación de C2C12 mioblastos (48 hr, indicado como Dif.) Fueron utilizados para la inmunoprecipitación (IP) con anticuerpos producidos contra MyoD y Myf5, o con IgG normal de conejo y con perlas vacías como control negativo. Los precipitados resultantes se analizaron por WB con los anticuerpos indicados. extractos de entrada se cargaron para mostrar los niveles de proteínas endógenas. Este panel ha sido publicado en 27 bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Esta cifra ha sido modificado a partir de 27: tipo y tamaño de policía fue cambiado y el texto fue girado para unificar el etiquetado en el figura. Los paneles con los resultados obtenidos a partir de proliferar y diferenciarse C2C12 están separados en dos en oposición a la figura original. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1:. Lista de las proteínas identificadas por MS Análisis de Complejos eMyoD purificados de afinidad de doble aislamiento de Nuclear Fracción Sal-extraíble después de la resta de las proteínas de fondo (proteínas identificadas por la EM en eluidos de control de línea celular se consideraron como fondo no específica .) los datos representan la suma de cuatro purificaciones independientes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 2: Lista de Proteínas Identified por MS Análisis de Complejos eMyoD purificados de afinidad de doble aislamiento de la fracción enriquecida en Nucleosoma después de la resta de las proteínas de fondo. Los datos representan la suma de tres purificaciones independientes. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla 3. Las composiciones de búfer. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El método presentado permite la identificación exhaustiva de los socios de un factor de transcripción, MyoD. Se reveló socios MyoD en un sistema heterólogo resistente a la diferenciación inducida por MyoD, es decir, células HeLa-S3. Por lo tanto, por definición, los socios de MyoD identificados se expresan de forma ubicua. Estos incluyen factores generales y específicos de la secuencia de transcripción, enzimas de la cromatina modificadores de proteínas, procesamiento del ARN, quinasas (Tablas 1 y 2). Dado que las células HeLa-S3 son resistentes a MyoD inducida trans-diferenciación, la actividad MyoD es principalmente represivo y los socios identificados es probable que sean MyoD co-represores. Esto se destaca por la presencia de ID de proteínas (Tablas 1 y 2, Figura 2), se sabe que inhiben la capacidad de transactivación MyoD 8. Es importante destacar que, tal estado represivo corresponde al estado MyoD en la proliferación de mioblastos. De hecho, se confirmó que las interacciones con MyoD CBFβ, un MyoDsocio identificado por el método descrito, se puede detectar en la proliferación de mioblastos C2C12, pero se perdió cuando las células se sometieron a la diferenciación (véase la figura 3D). Sin embargo, es importante tener en cuenta que una de las principales limitaciones de la metodología que se presenta es la falta de MyoD identificación co-activadores. En consonancia, el uso de este método de ninguno de los co-activadores MyoD conocidos, tales como la histona acetiltransferasas se identificaron 32.

La purificación de los complejos de MyoD o bien de la fracción soluble (sal nuclear extraíble, SE) del núcleo o de la fracción enriquecida de la cromatina (nucleosoma enriquecido, NE) (Figura 1A) sirve al menos dos funciones principales. En primer lugar, tal fraccionamiento aumenta la representación de los socios no estequiométricas que estarían enmascarados si la purificación MyoD realiza a partir de extractos nucleares totales. En segundo lugar, esto permite la separación de dos subpoblaciones funcionales de MyoD: pre-depositado / EVICTed (SE) y la cromatina determinada (NE). Entre interactores específicos para el ADN no unido MyoD, muchas quinasas, factores de transcripción, el tráfico de proteínas, así como se identificaron algunos remodeladores de la cromatina (Figura 2). Cuando está completamente validado, una red de este tipo podría proporcionar una penetración en el modo de regulación de la actividad MyoD ADN no unido. búsqueda adicional de MyoD modificaciones postraduccionales en estos dos compartimentos nucleares mediante espectrometría de masas, podría desentrañar una mayor regulación actividad MyoD. Finalmente, el fraccionamiento de los complejos solubles MyoD y cromatina dependiente en un gradiente de glicerol reveló que mientras que el MyoD cromatina determinada está contenida principalmente en un solo complejo, MyoD de ADN no unido se distribuye en tres sub-complejos (Figura 1B). La caracterización de estos sub-complejos, ya sea por la EM y / o western blot contra proteínas candidatos deben aclarar aún más el modo de regulación MyoD.

Como se destacó anteriormente, las células HeLa no EXPRE naturalss el factor de transcripción MyoD muscular. Era por lo tanto importante para confirmar las interacciones que se encuentran en un modelo de músculo esquelético (Figura 3). Muchos informes confirmados en modelos relevantes tales interacciones funcionales entre MyoD y algunos de los socios identificados en el ensayo de TAP-tag presentado. Este es por ejemplo el caso de la prohibitina 33, 34 ddx17, Meis1 35, CBF 27, 26 HP1, y SWI / SNF 36,28,30 complejo remodelador de la cromatina.

Observe que es posible llevar a cabo tal purificación TAP-tag de baja cantidad de células, tales como a partir de mioblastos, cuando se combinan para MS sensibles. De hecho, un reciente documento describe socios MyoD caracterización después de la expresión inducible de MyoD Bandera de etiquetado en mioblastos 30. Desde estable y continua sobreexpresión de MyoD en mioblastos es perjudicial, un enfoque alternativo sería la adición de las etiquetas bandera-HA en el alelo (s) MyoD endógeno en mioblastosmediante el uso de métodos genoma de edición, como CRISPR-Cas9 31. Cabe destacar que, además de la etiqueta (s) podría alterar potencialmente la función de proteínas y / o asociación con parejas de unión, por lo tanto el lugar de la etiqueta (N- o C-terminal) debe ser escogido con cuidado. Un ensayo funcional de la proteína de fusión en el sistema en cuestión debe llevarse a cabo la purificación a TAP-tag previa para asegurar el etiquetado de proteínas es funcional. La inmunoprecipitación de proteínas endógenas evita estos problemas, sin embargo, se basa en la disponibilidad de un anticuerpo específico y de alta afinidad, que no suele estar disponible.

Otro valor añadido del enfoque descrito es la posibilidad de identificar las modificaciones posteriores a la traducción (PTM) de la propia proteína purificada y de sus socios abundantes. De esta manera, con esta característica la purificación TAP-tag es adecuado para identificar no sólo las nuevas parejas de interacción, sino también nuevas funciones enzimáticas asociadas a la proteína de interés y / o de sus socios. Enel caso de una proteína de unión a la cromatina (es decir., factores de transcripción, enzimas), este método se adapta así para la identificación del "código de histonas" asociado. En efecto, las colas de las histonas amino-terminal, que están expuestos en la superficie nucleosoma, están sujetas a múltiples PTM covalentes. PTM histonas confieren una firma única de los nucleosomas involucrados. Una combinación de diferentes modificaciones en las histonas colas N-terminal de este modo puede alterar la estructura de la cromatina para permitir la regulación de la expresión génica. Por lo tanto, la caracterización de las modificaciones asociadas a una determinada proteína podría ayudar a comprender las funciones y mecanismos de acción de las proteínas de unión a la cromatina estudiados 22.

En resumen, la metodología presentada permite la identificación completa de los socios MyoD. La purificación TAP-etiqueta proporciona una alternativa a otros enfoques, tales como GST pull-downs, levadura de dos ensayos de híbridos y de presentación de fagos. Incluso si por razones prácticas (Production de la gran cantidad de extractos nucleares) tenemos que utilizar un sistema celular heteróloga, hemos podido confirmar la participación de los interlocutores MyoD identificados en la diferenciación del músculo esquelético. Los datos obtenidos muestran que el factor miogénica MyoD parece interactuar con una gran cantidad de proteínas que van desde los reguladores transcripcionales a las proteínas de unión a ARN, sugiriendo los diferentes mecanismos que regulan la actividad de un factor de transcripción.

En conclusión, el mismo enfoque metodológico podría utilizarse para identificar socios de expresión ubicua de numerosos factores nucleares que podrían ser difíciles de estudiar en su contexto celular específica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

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References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

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Bioquímica No. 111 MyoD TAP-Tag espectrometría de masas la cromatina la transcripción músculo HeLa-S3.
Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas
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Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

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