Abstract
骨格筋分化は、筋芽細胞への多能性中胚葉前駆細胞のコミットメントから始まります。これらの細胞はまだ増殖する能力を持っているか、彼らは筋線維を形成するために、さらに成熟さ多核筋管に分化するとヒューズができます。骨格筋分化は、様々な転写因子の協調作用によって編成され、特に筋肉調節因子またはMRFは（のMyoD、ミオゲニン、Myf5の、およびMRF4）のメンバーは、また、筋原性のbHLH転写因子ファミリーと呼ばれます。これらの要因は、骨格筋形成を達成するために精巧な転写制御ネットワーク内のクロマチンリモデリング複合体と協力しています。この中で、MyoDのは、筋分化を誘発におけるマスター筋原性転写因子であると考えられます。この概念は、骨格筋細胞への非筋細胞に変換するのMyoDの能力によって強化されます。ここでは、MyoDのを識別するために使用される方法を説明します骨格筋分化に関与するさまざまな要因を解明するために、徹底的な方法でタンパク質パートナー。長期的な目的は、骨格筋遺伝子の制御、 すなわち 。、MyoDの標的に関与するエピジェネティックなメカニズムを理解することです。 MyoDのパートナーは骨格筋分化の間に、関連するパートナーの役割の検証に続いて、質量分析（MS）特性評価、に結合された異種システムからタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用して識別されます。筋再生における先天性筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、横紋筋肉腫および欠陥：筋原性因子、またはそれらの異常調節の異常な形態は、筋障害の数と関連しています。このように、筋原性の要因は、両方の病気自体を引き起こすメカニズムおよび疾患の治療を改善することができ、回生機構に関しては、筋疾患における潜在的な治療標的のプールを提供しています。したがって、詳細なunderstan筋原性の要因によって制御分子間相互作用や遺伝的プログラムの鼎は、効率的な治療法の合理的な設計のために不可欠です。
Introduction
真核生物の多細胞生物は、異なる器官及び組織で構成されています。それぞれの機能的な組織は、各分化段階で決定される特定の遺伝子パターンの発現を有します。細胞分化は、特定の遺伝子の活性化、一般的にそれらの発現の維持、遺伝子、細胞増殖に関与するものなどの組のサイレンシングを含みます。骨格筋分化、または筋形成、すなわち筋芽細胞に中胚葉幹細胞の決意から始まり、従って、多段階のプロセスであり、最初の単核、その後多核、筋管へのこれらの筋芽細胞の分化をもたらします。このように、筋芽細胞はまだ増殖することが可能である細胞を、「決定」されているが、それらは、骨格筋系統にコミットしている、したがって、胚発生中または成体の筋再生のいずれかで、骨格筋細胞にのみ分化することができます。骨格筋端末の処理が異なりますentiationは、E2F標的遺伝子1のような増殖関連遺伝子の明確なサイレンシングを導く筋芽細胞前駆細胞の細胞周期から永久出口から始まる特定の遺伝的プログラムによって調整されます。実際、最終分化のプロセスの間に、筋芽細胞の増殖停止は、骨格筋特異的遺伝子の発現と筋管2への筋芽細胞の融合の前に重要なステップです。このようなプログラムは、衛星細胞と呼ばれる成体筋幹細胞は、骨格筋損傷後の再生処理中に分化することが可能になります。
哺乳動物の筋形成は、筋原性塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスの家族に決定的に依存している（のbHLH）転写があるMyoD、Myf5の、MRF4とミオゲニン因子、頻繁に骨格筋決意因子またはのMRFの家族と呼ばれる（筋肉の調節因子）3。それらの各々は、本明細書及びDIFにおいて重要な役割を果たしています骨格筋細胞のferentiationと特異的発現パターン4 5-7ました。 Myf5のとのMyoDの活性化は、筋原系統に細胞をコミットする決定的なステップを構成し、ミオゲニンのその後の発現は、MCK（筋クレアチンキナーゼ）などの骨格筋特異的遺伝子の活性化と筋形成を誘発します。筋原性のbHLH転写因子は、以前にサイレント遺伝子座8から筋遺伝子の活性化におけるMEF2ファミリーのメンバーと協力します。彼らはまた、様々な遺伝子調節領域8に、いわゆるE-ボックスに結合するEタンパク質として知られているユビキタスのbHLHタンパク質とヘテロダイマー、E12とE47、などの骨格筋遺伝子の転写を刺激します。ねじれは、ID（分化の阻害剤）、および他の要因は、負8結合 Eタンパク質についてのMyoDと競合することによって、このプロセスを調節します。
MyoDのは、筋肉分化を誘発するの主要なプレーヤーとして考えられている9 10-13に筋原決意/分化（トランス分化）プログラムを誘導する能力を有しているので>アップ。確かに、のMyoDの強制発現は、異なる細胞型のトランス分化を誘導する別の発生学的起源12から誘導されるものです。例えば、MyoDのは、筋様細胞に肝細胞、線維芽細胞、メラノサイト、神経芽細胞、および脂肪細胞に変換することができます。 MyoDのトランス分化作用は、元の遺伝的プログラム（特に、増殖遺伝子）のサイレンシングに付随する非筋肉環境での筋原性遺伝的プログラム（特にその標的遺伝子）の異常な活性化を伴います。
筋芽細胞の増殖では、MyoDのは発現するが、それはそれらのプロモーター14-16に結合する場合でも、その標的遺伝子を活性化することができませんされています。したがって、連続的に未分化の筋芽細胞で発現されるのMyoDの要件は非常にELUままSIVE。 MyoDのは、酵素14,17を改造クロマチンを活性化のロード前に増殖する筋芽細胞における抑圧的なクロマチン修飾酵素の補充のためにその標的遺伝子を抑制することができます。例えば、筋芽細胞増殖に、MyoDのは、ヒストンH3のリジン9またはH3K9とH3K27 KMTsなどの転写コリプレッサーKAP-1、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）と抑圧的なリジンメチルトランスフェラーゼ（KMTs）、関連付けられている、と積極的にその標的遺伝子の発現を抑制され、局所的に抑圧的なクロマチン構造14,17を確立することもできます。重要なことは、最近の報告では、MyoDのは、直接そのトランス活性16の阻害をもたらすH3K9 KMT G9Aによってメチル化自体であることが示されました。
MyoDによる非筋細胞のこのトランス分化に関与するエピジェネティックなメカニズムは不明な点が多いです。特に、いくつかの細胞株は、MyoDの誘導性のトランス分化に耐性です。このように、HeLa細胞では、MyoDのは、非アクティブかのいずれかでありますでもによる複雑なSWI / SNF 18クロマチン再構築のBAF60Cサブユニットの発現の欠如にリプレッサーではなく、転写活性化因子として機能する可能性があります。このモデルは、より良好MyoDの誘導性の遺伝子抑制機構を特徴づけるために選択されることができます。それに関連するパートナーとその標的遺伝子座で抑圧的なクロマチン環境を誘導し、したがって、最終分化を微調整する筋芽細胞の増殖でのMyoD依存抑圧的なメカニズムを明らかにするのMyoDの能力を検定することも好適です。
ここでは、質量分析（MS）特性評価に結合されたタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用してのMyoDパートナーを識別するためのプロトコルについて説明します。安定フラグ-HA-のMyoDを発現するHeLa-S3細胞の使用は、分別核抽出物からのMyoD複合体を精製するために十分な材料を入手することを許可しました。異種システムでのMyoDパートナーの同定はvalidatiが続きました関連するシステムで上。
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Protocol
HeLa細胞-S3核塩抽出可能とクロマチン結合画分の調製
- 細胞のコレクション
- 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン（成長を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中のHeLa-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA（コントロール細胞株）を成長さ湿ったインキュベーター内で37℃で培地）および5％CO 2。
注：空のベクター（ヒーラ-S3フラグ-HA）で形質導入したHeLa-S3細胞を安定に発現するフラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3細胞を、記載されたプロトコルを使用して確立することができたのいずれか：19,20、または著者によって提供さ。 - 各細胞株（HeLa細胞-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA細胞）の10完全にコンフルエント150ミリメートル皿に細胞を増幅します。
- 5 Lスピナーに（非接着亜集団が含まれている）、上清を収集します。
- 部屋のTEMで1分間細胞をトリプシン処理、150ミリメートル皿当たり10mlのPBSで付着亜集団を洗いますperature（0.05％トリプシン-EDTA溶液を、15cmのディッシュ2 ml）で。
- 150ミリメートル皿当たり培地4mlを加え、50ミリリットルチューブに細胞を収集します。
- （5 Lスピナーに）ステップ1.1.3からの上清を合わせ、ステップ1.1.5からの細胞は、各細胞株についての新鮮な予め加温した成長培地の500ミリリットルを追加します。
- 5 Lスピナーに細胞懸濁液を移し、湿ったインキュベーター中で37℃、5％CO 2で少なくとも60時間、細胞を増殖させます。
- 新鮮な増殖培地の500ミリリットルを加え、24時間細胞を増殖させます。
- 新鮮な増殖培地の1リットルを加え、24時間細胞を増殖させます。
- 細胞を計数し、細胞生存率をチェックするために、細胞懸濁液1mlを取り出します。色血球計数器を用いて顕微鏡下で30青色の0.4％トリパンμlのカウント生きている（青ではない）細胞と細胞懸濁液の30μlの。
- 、毎日新鮮な成長培地を添加することによって、6×10 5細胞/ ml - 2の細胞密度を保ちます1×10 6細胞/ mlを超えません。最大1 5 Lスピナーのボリュームは2.5 Lです。
注：以下の手順については、2のバッチにより進行-密度1×10 6細胞/ mlで培養物の2.5 L。約20 Lを収集するために1.1.14 - 繰り返して、1.1.12ステップ 次のステップに進む前に、各細胞株の（乾燥ペレットの≈20グラム）。 - 4℃で5分間、500×gで遠心分離により細胞をペレット化し、上清を捨てます。
- ペレットを洗浄するために4℃で5分間、500×gでピペッティングし、遠心分離によって氷冷PBSの100ミリリットル中に細胞を再懸濁し。
- 50mlチューブに懸濁液を移し、4℃で5分間、500×gで遠心分離し、氷冷PBS 25mlで細胞を再懸濁することにより洗浄を繰り返します。
注：細胞ペレットを直ちに使用するか、または液体窒素中で凍結し、数日間-80℃で保存することができます。
- 10％ウシ胎児血清、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン（成長を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中のHeLa-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HA（コントロール細胞株）を成長さ湿ったインキュベーター内で37℃で培地）および5％CO 2。
- 核の単離
注：手順1.2.1実行-低温室で1.4.3を。- 事前冷却ブフェRSとホモジナイザー。
- 凍結した材料を使用する場合は、すぐに37℃の水浴中で細胞ペレットを解凍。
- 再懸 濁し20 gで20 ml単位セルの（≈20ml）で、次いで、次いで、5ミリリットル追加、最初に緩衝液10mlを用いて加算することにより低張緩衝液A（ 表3）の（細胞ペレットのサイズに等しい体積）別の5ミリリットル。細胞の最大値を取得するために、新鮮な緩衝液でよくピペットを洗ってください。
- タイトフィット乳棒で予備冷却ホモジナイザーへの転送40ミリリットルの細胞懸濁液。
- ホモジナイザーで20ストローク（中や動きアウト20）で細胞をホモジナイズし、50mlチューブに細胞懸濁液を転送します。
- セルの最大を回復するために、ショ糖バッファ（初期セル容量の1/3、 表3）の7ミリリットルでホモジナイザーを洗ってください。核を維持し、漏れを制限するために、ステップ1.2.5から50ミリリットルチューブに迅速にこの懸濁液を転送します。
- 0.4％TRの30μlの30μlのアリコートを染色（溶解が成功した場合、すべての核は青でなければならない）溶解効率を制御するために、顕微鏡下で分析し、青ypan。必要に応じて、均質化工程を繰り返します。
- 核をペレット化する万×gで4℃で7分間遠心分離します。細胞質画分として上清を保存します。
- 原子力塩抽出可能（SE）画分の調製
- ショ糖バッファー（核ペレットのサイズに等しい体積）8mlに核ペレットを再懸濁します。 300mMのNaClの最終濃度を得るために渦に徹底的に高塩緩衝液の8ミリリットル（1核ペレットの量は 、 表3）を混合しながら一滴ずつ加えます。氷上で30分間インキュベートし、5分ごとに混ぜます。
- ショ糖バッファの8ミリリットル（総容量の1/3）を添加することにより150mMのにNaCl濃度を減少させます。 13,000×gで4℃で10分間遠心分離します。上清（核塩抽出物画分、SE）を収集します。
注：いずれかのSEを1.3.3ステップまたは残すために進んでクロマチン結合画分と両方の画分を同時にその後、超遠心機の準備中に氷の上で分数。 - 4℃で85,000×gで30分間超遠心SE。上清（≈26ミリリットル）を取ります。
- 液体窒素中で100μlのアリコートを凍結します。抽出物の残りの部分を使用して、2「タンパク質複合体の精製」をステップに進みます。
注：アリコートは、ステップ5.1.1の間、入力制御として使用されます。
- クロマチン結合画分の調製
- （ステップ1.3.5から。）ペレットを再懸濁細心の注意を払ってスクロースバッファの7ミリリットル（ペレットのサイズに等しい体積）に。
- MNase（ステップ1.4.4）を活性化し、混合するために1 mMの（サスペンションの14ミリリットルのための0.5MのCaCl 2の28μL）の最終濃度までのCaCl 2を追加します。
- 37℃で1分間プレヒートサスペンション。
- 0.5から0.0025 U /μlの最終濃度（1/200希釈を得るために70μlのにミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）を追加U /μlのストック）と混ぜます。
- 37℃で正確に12分間インキュベート。すべての4分を混ぜます。
- 直ちに氷上に反応を配置します。
- MNaseの活動を停止するには、4 mMの最終濃度が0.5 M EDTA pHが8.0（1/125希釈）の112μlを添加します。氷上で5分間インキュベートします。
- 2超音波処理の間の高振幅で1分間超音波処理を5回には、1分（合計10分）の休憩を可能にします。
- 85,000×gで、4℃で30分間超遠心機。
- 上清（ヌクレオソーム濃縮画分、NE、≈12ミリリットル）を収集します。
- 液体窒素中で50μlのアリコートを凍結します。抽出物の残りの部分を使用して、2「タンパク質複合体の精製」をステップに進みます。
注：アリコートは、ステップ5.1.1の間、入力制御として使用されます。
2.タンパク質複合体の精製
注：各細胞株（HeLa細胞-S3フラグ-HA-のMyoDおよび制御、HELから並列抽出物に進みます-S3フラグ-HA）。
- FLAG-ベースの精製
- プレウォッシュフラグ樹脂。各実験点（各細胞株のためのSEおよびNE画分）のために（商業50％ストックから）旗樹脂600μlのを使用してください。
- 転送15ミリリットルチューブに樹脂、冷たいTEGN（ 表3）の13ミ リリットルで再懸濁し、千×gで2分間遠心分離し、上清を除去します。 5回繰り返します。最後の洗浄再懸濁フラグ樹脂後TEGN等量の（各実験点について300μlの）へ。
- 各実験点について、（NEおよびそれぞれ26ミリリットルSE画分、50 mlチューブに12ミリリットルのための15ミリリットルチューブ中）600洗浄した旗樹脂μlの対応するタンパク質抽出物を混ぜます。 4℃で回転ホイールの一晩でインキュベートします。
- 4℃で千×gで2分間遠心分離し、脇上清を入れて、浄化効率試験（2.2）の結果まで4℃で維持。
- SEのサンプルについては、フラグ樹脂を再懸濁TEGNの4ミリリットルで、15 mlチューブに移します。ビーズを失うことを避けるために、同じ15ミリリットルチューブに移し、この手順を毎回3回繰り返します。千×gで遠心分離し、2分、4℃、上清を除去します。
- ウォッシュ旗樹脂15mlチューブで7回TEGNの13ミリリットルを使用して、1,000×gで4℃で2分間遠心分離します。
- 最後の洗浄後、1ミリリットルTEGNで再懸濁し、1.5ミリリットルに低結合チューブを移します。千×gで遠心分離し、2分、4℃、上清を除去します。
- 各実験点についてのpH 7.8で4ミリグラム/ mlのFlagペプチド溶液200μlで再懸濁。ビーズおよびペプチドを混ぜます。 TEGN緩衝液200μlを加え、結合したタンパク質を溶出するために、少なくとも4時間または一晩4℃でインキュベートします。
- 4℃で千×gで2分間遠心分離し、樹脂及び上清（フラグ溶出液）2 mlチューブに配置された空のスピンカラムに移します。
- 遠心分離カラムは、2ミリリットルチューブに左オーバー上清を収集します。 カラムにTEGNバッファを追加することにより、フラグ樹脂を収集し、各実験点のために4℃で一晩Flagペプチド溶液200μl（4 mg / mlで）を有する第二旗溶出に進みます。
- 2回目の溶出を収集するために2.1.10 - 繰り返して、2.1.9を繰り返します。第一および第二の溶出液を兼ね備えています。
- 浄化効率のテスト
注：ステップ2.1.11の間に - 2.1.12、SDS-PAGEおよび銀染色（ - 2.2.2 2.2.1）を行います。- 溶出液の15μLを取り、4倍のローディングバッファーを5μlと還元剤を10倍の2μlを添加、96℃で5分間沸騰させ、SDSポリアクリルアミド4実行 - 製造業者の説明書に従って、12％ゲルを。
- 銀染色キットを用いてゲルを染色（製造元の指示に従ってください）。旗-HA-のMyoDとフラグ-HA間のタンパク質パターンにおける明確な違いモック溶出液、旗-HAのMyoDの特定のバンドがある場合（50 kDaの、 図1Aの周り）、次のSTEに進みますP。
- 赤血球凝集素（HA）は、精製をベース
- TEGNの13ミリリットル中に再懸濁し、4℃で千×gで2分間遠心分離し、15ミリリットルチューブに転送することにより洗浄HA樹脂。洗浄工程を5回繰り返します。 TEGNバッファ等量の中で最後の洗浄再懸濁ビーズの後。
注：ボリュームが旗ベースの精製の効率に応じて調整する必要があります。各実験点のための市販の50％の株式から300μlで開始します。 - 1.5ミリリットル低い結合チューブに各実験点のHA樹脂を転送します。 4℃で千×gで遠心分離し、2分間、洗浄緩衝液（ 表3）の最大値を排除し、HA樹脂に旗ベースの精製からの溶出液を追加します。
- 4℃で回転ホイールの一晩にチューブをインキュベートします。
- 4℃で千×gで2分間遠心分離は、上清を脇に置くと、浄化効率試験の結果まで4℃で維持（2.3.12）。
- リ1.5mlチューブを結合新しい低に転送、TEGNの0.5ミリリットルでHA樹脂を一時停止します。千×gで4℃でビーズや遠心分離機2分の損失を避けるために一度に同じ1.5mlチューブに追加し、再懸濁を繰り返します。上清を取り除きます。
- ウォッシュ（ビーズを失うことを避ける）千×gで4℃で2分間遠心分離し、上清を除去し、TEGNの1ミリリットルを毎回使用して8回ビーズ。最後の洗浄後、0.5ミリリットルチューブにビーズを移します。
- できるだけ多くの上清を取り除きます。結合したタンパク質を溶出するビーズ上のpH 7.8でのHA遊離ペプチド溶液（4mg / mL）の100μLを加えます。 4℃で一晩回転ホイール上でインキュベートします。
注：HAペプチドの量は、複合体の存在量に応じて調整する必要があります。 - 4℃で千×gで2分間遠心し、2 mlチューブに配置された空のスピンカラムに樹脂および上清（HA溶出液）を転送。
- 2ミリリットルチューブに左オーバー上清を回収し、カラムを遠心します。 各実験点のHAペプチド100μlの（4 mg / mlで）との2回目の溶出を実行します。 4℃で一晩回転ホイール上でインキュベートします。繰り返しステップ2.3.8 - 2.3.9は、2回目の溶出を収集します。
- 第一および第二の溶出液を兼ね備えています。
- SDS-PAGE及び銀染色による試験精製効率（ステップ2.2を参照してください。）（ 図1A）。
- 製造者の指示に従って10 kDaのカットオフ（公称分子量限界、NMWL）を用いて遠心分離フィルターユニットを用いて30μlにHA溶出液を濃縮します。
- 22.5（3/4）7.5（1/4）μL：二つの部分に集中し、サンプルを分割します。スナップは、-80℃で液体窒素とストア内のサンプルの1/4を凍結します。ステップ3のための3/4の部分を使用してください。
注：1/4凍結部分はウェスタンブロットによる質量分析結果を確認するために使用される（ステップ5.1参照）。
- TEGNの13ミリリットル中に再懸濁し、4℃で千×gで2分間遠心分離し、15ミリリットルチューブに転送することにより洗浄HA樹脂。洗浄工程を5回繰り返します。 TEGNバッファ等量の中で最後の洗浄再懸濁ビーズの後。
3.質量分析
注：次の手順は、分析を実行する質量分析施設で議論されるべきです。
- 4Xローディング緩衝液の7.5μlのと10倍還元剤の3.3μlのサンプルの3/4（22.5μl）を補足し、96℃で5分間沸騰させます。
- 12％ゲル - SDSポリアクリルアミド4の負荷サンプル。すべてのタンパク質が分離せずにゲルを入力できるようにするために5分間150 V一定でゲルを実行します。
- 水でゲルを洗浄し;超きれいな水に一定のゲルを5回洗浄後、固定液（10％酢酸、50％メタノール、40％超きれいな水）と30分 - 20のために固定します。
- 1.5mlチューブに水1ml中のタンパク質、店舗を含むバンドをカットし、質量分析施設に送ります。
4.データ解析
注：これは、分析のための一般的なガイダンスです。正確な手順は、MS機能によって与えられたデータの特定のモードに依存します分析を実行するために使用される（ 例えば、21,22）。
- ネガティブコントロールの準備を対応から得られたリストで「MyoDの "溶出液中の同定されたタンパク質のリストを比較してください。分析から、両方のリストに見出されるタンパク質を除外します。
- 残りのリストから同定されたペプチドの≤2総数を有するタンパク質を除去します。
- アクセス機能注釈とDAVIDバイオインフォマティクスリソースを使用して、タンパク質の得られたリストの機能分類（http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp）およびタンパク質23,24のリストを分類します。
- （オプション）負DNA 25に帯電する強い結合不定で非核タンパク質の荷電リスト「ヒッチハイカー」から削除します。これらは、細胞骨格、細胞質、ミトコンドリア、膜および受容体タンパク質を含有する（タンパク質の折り畳み、 表1における細胞骨格およびその他のグループタンパク質および2）。</李>
- 各画分（ 図2）に特異的な共通のタンパク質およびタンパク質を同定するためにSEとNE画分からのMyoDの相互作用の得られたリストを比較。
ウエスタンブロットによって識別されるインターアクターの5確認
- HeLa細胞-S3フラグ-HA-のMyoDおよびHeLa-S3フラグ-HAで確認
- 氷の上でステップ2.3.14で得られた溶出液のサンプル（7.5μl）を解凍します。 TEGNバッファー12μlの、4Xローディング緩衝液10μlと還元剤の10倍の3μLを加えます。 96℃で5分間沸騰サンプル。
- ウェスタンブロッティングのために入力サンプルを準備します。
- ステップ1.3.9と1.4.11からのアリコートを解凍し、BCAキットを（製造元の指示に従ってください）を使用して、例えば、タンパク質濃度を測定します。
- レーンあたり15μgのタンパク質を使用してください。抽出物の適切な量を測定し、TEGNバッファーで15μlのまでのサンプルの音量を調整します。
- 5μlの4倍のローディングバッファーを追加し、1.5μlの10倍還元剤。 96℃で5分間沸騰サンプル。
- 溶出液のサンプル15μLを使用して（MS分析中に識別パートナー候補に特異的）目的の抗体を用いたウエスタンブロット分析を実行します。内因性タンパク質レベル（ 図3A）の制御などの入力抽出物を使用してください。
- 関連するセルラーシステムで確認
- C2C12マウス筋芽細胞の全核抽出物の調製。
- 湿ったインキュベーター中で37℃、5％CO 2で15％ウシ胎児血清を補充したDMEM培地、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンでC2C12マウス筋芽細胞を成長させます。増殖状態で細胞を維持するために、80％の細胞集密度を超えないようにしてください。
- 免疫沈降（IP）の一点（1抗体）のために、C2C12の少なくとも二つの150mmディッシュを成長させます。培地を吸引除去し、10mlのPBSで細胞を2回洗浄します。
- 細胞をこすり落とし、15ミリリットルチューブに集めます。 Ceの4℃で5分間、250×gでntrifuge。上清を捨てます。
- 細胞ペレット（= V 電池 ）の容量を見積もります。静かに細胞質膜（ 表3）を破壊する低張緩衝液Bの3体積V セルにペレットを再懸濁します。
- 1％（v / v）の最終濃度に達するように10％のNP-40の0.44のx V 細胞ボリュームを追加します。穏やかに混合するためにチューブを数回転倒。
- 核整合性を保持するために、SR（ 表3）の0.89のx V 電池容量を追加します。静かに核をペレット化するために2000×gで5分間サスペンション、および遠心分離機を均質化するために、チューブを数回転倒。
- 上清（細胞質画分）を取り外します。核ペレット（= V NUC）の量を推定します。ショ糖バッファの1体積V NUCに核ペレットを再懸濁。
- 300mmの最終濃度を得るために、高塩緩衝液の渦1体積V NUCに徹底的に混合しながら一滴ずつ追加します。NaClを、氷上で30分間インキュベートします。 5分ごとに混ぜます。
- （150mMのにNaCl濃度を減少させる）スクロース緩衝液の容積V NUCを追加のCaCl 2（最終濃度1mMの）。ミックス。
- 予熱懸濁液を37℃で1分間、濃度0.0025 U /μL（0.5 U /μlにストックから1/200）の最終的な取得するミクロコッカスヌクレアーゼを追加します。ミックス。
- 37℃で正確に12分間インキュベート。 3分毎に混ぜます。
- 直ちに氷上に反応を配置し、MNaseの活動を停止するために、EDTA（最終濃度4 mm）を追加します。氷上で5分間インキュベートします。
- 超音波処理、高振幅で0.5分間、5回。 2超音波処理の間に、0.5分（合計で5分）の休憩を可能にします。
- 85,000×gで、4℃で30分間超遠心機。上清（総核抽出物）を収集します。
- 例えばBCAキットを用いて、総核抽出物のタンパク質濃度を測定する（製造者の指示に従う）とimmediatを続行エリー5.2.2に進みます。
- 内因性のMyoDの免疫沈降（IP）。
- 、エキスクリアプレ各IP点についてプロテインGアガロースビーズを10μlを洗浄します。
- 1.5ミリリットルチューブにプロテインGアガロースビーズの必要な量を移し、冷たいTEGNの1.4ミリリットルで再懸濁し、1,800×gで2分間遠心分離し、上清を除去します。 3回繰り返します。
- 総核抽出物の適切な量で予め洗浄したプロテインGアガロースビーズを混ぜます。 IP点当たりの総核抽出タンパク質500μgのを使用してください。
- 抽出物を事前にクリアするために2時間4℃で回転ホイール上でインキュベートします。
- 4℃で1800×gで5分間遠心分離します。上清を保管してください。
- 1.5ミリリットルで500μgのプレクリア総核抽出物低結合管を5のMyoD抗体のμgのまたはウサギIgG5μgのを混ぜます。 TEGNが1ミリリットルまでバッファに追加します。 4℃で一晩回転ホイール上でインキュベートします。
注：Fを実行しますステップ5.2.2.3時の手順をollowing。 - IPポイントごとに予洗7.5μlのプロテインA / Gストックビーズ溶液を。
- 2分間、4℃で1800×gで、1.5ミリリットルチューブにTEGNと遠心分離機の1ミリリットル中に再懸濁ビーズをビーズの必要な量を転送します。上清を取り除きます。 3回繰り返します。
- ブロッキング溶液1.5 ml溶液に再懸濁し、タンパク質A / Gビーズ（ 表3）と4℃で回転ホイールの一晩のインキュベート。
- 4℃で10分間16,000×gでABS（ステップ5.2.2.5）と共にインキュベートし、遠心分離総核抽出物。上清を保管してください。
- 遠心分離機は、4℃で2分間、1800×gでプロテインA / G樹脂（ステップ5.2.2.7）を遮断しました。 TEGN緩衝液1mlで上清と再懸濁を捨てます。再び遠心分離し、4℃で2分間1800×gでブロッキング緩衝液洗い流すします。
- 再懸濁は、7.5μlのBLOを得るために新しい低タンパク質結合チューブにTEGNバッファとアリコート1mlのプロテインA / G樹脂をブロックIPポイントごとckedプロテインA / G樹脂。 2分間、4℃、1,800×gで遠心分離し、上清のできるだけ多くを削除。
- A / G樹脂にABS（またはコントロールIgG）とインキュベートし、総核抽出物を追加します。混合し、回転ホイール上で室温（RT）で2時間インキュベートします。
- 2分間、室温で遠心分離サスペンション1800×gで。上清を、新しい低結合チューブに洗浄バッファーと転送懸濁液1ml中に再懸濁を捨てます。 5分間回転ホイール上で室温でインキュベートします。
- 2分間室温で1800×gで、洗浄用緩衝液1ml中に再懸濁での遠心分離サスペンションと5分間回転ホイール上で室温でインキュベートします。 4回繰り返します。新しい低い結合チューブに最後の洗浄転送のため。
- 上清の最大値を削除します。 、洗浄バッファーの7μlを、4倍のローディングバッファーの7μlのビーズに還元剤を10倍3μlを添加混合し、96℃で5分間沸騰させます。
- int型の抗体を用いてウェスタンブロット分析を実行erest（免疫のためのパートナー候補に特異的なタンパク質を沈殿させました）。内因性タンパク質レベル（ 図3B）の制御等の入力抽出物の1％（5μgの）を使用します。
- 、エキスクリアプレ各IP点についてプロテインGアガロースビーズを10μlを洗浄します。
- C2C12マウス筋芽細胞の全核抽出物の調製。
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Representative Results
MyoDの活性の調節を理解するために、我々は、質量分析（MS）、続いてのMyoDの二重タグ付けされた形の免疫精製に基づいて、生化学的精製を用いてのMyoD複合体の網羅的特徴付けを行いました。フラグ-HAタグ付きのMyoDとフラグ-HA-のMyoDの二アフィニティー精製を行うことにより、MyoDの複合体を精製するための十分な材料を得るためにフラグ-HA許可を発現する対照細胞株を発現するHeLa-S3細胞株の使用。
私たちは、その後、さらに塩抽出（核塩抽出性、SE）に核画分を分画し、ヌクレオソーム（ヌクレオソームに富む、NE）の画分について濃縮、細胞質および核画分に細胞抽出物を分画しました。これらの分離した核画分（ 図1、表1および2）からのTAPタグの精製は、比較的低いABを持つパートナーを解明許可しました一つの特定の核内コンパートメントに局在undance。さらに、このような戦略は、MyoDの活動の規制上の洞察を得るためにDNAに結合した（NE）のMyoD 対結合していない（SE）のパートナーを発見するために利用されました。
TAPタグの精製のために、フラグ-HAタンデムエピトープシステムを使用しました。小さな親水性フラグおよびHAエピトープは、タンパク質機能との最小限の干渉を有する抗体 - 抗原相互作用のために非常にアクセス可能です。抗Flagおよび抗HA樹脂系シーケンシャル免疫精製フラグ及びHAペプチドを用いて免疫精製複合体の溶出に続いて、実施しました。溶出されたタンパク質は、その後、すべてのタンパク質がゲルに入ることを可能にするために、SDS-PAGEにかけました。すべての精製されたタンパク質を含むゲル片を切断しました。タンパク質は、抽出されたトリプシン消化及び質量分析（MS）により同定しました。
図2に示すように、 図2および3）26-28。これは、抑圧的なクロマチン環境を確立することができるDNAに結合したMyoDのパートナーと可能なコレギュレーターに光を投げかけています。例えば、記載された方法論によってMyoDのパートナーとして同定されたHP1タンパク質は、遺伝子抑制およびヘテロクロマチン構造を維持するために、メチル化H3K9を結合することが知られています。実際、HP1は、障害のMyoDの標的遺伝子の発現および筋肉分化26で得られたMyoDの転写活性を阻害します。
のさらなる分画グリセロール勾配上のSEとNEのMyoD錯体は（29で説明したように）2核内の区画（ 図1B）でのMyoDサブ複合体を発見しました。クロマチン結合のMyoDが1複合体に主に属しながら、具体的には、SEのMyoDは、三つのサブ複合体に分布しています。
TAP-タグ/ MSのいくつかは、相互作用がMyoDの複合体のウェスタンブロットによって確認された明らかにしました。これらは、転写因子CBF、EBB、MTG8RとSWI / SNFサブユニットBAF47（SNF5）（ 図3A、左 ）とHP1タンパク質（CBX1とCBX3）（ 右図3Aを、）が含まれます。 HeLa細胞は、筋細胞ではないとのMyoDを発現しないので、重要なことには、筋芽細胞（ 図3 BD）で新たに同定された相互作用とMyoDの間の相互作用を確認する必要があります。注目すべきは、このような検証のため、（SEとNE上での分離なし）合計核抽出物は、通常は十分であり、whicHは、試料調製のために使用された筋芽細胞量の減少を可能にします。 26,27のように、in vitroでの相互作用アッセイは、さらにこれらの知見を検証するのに役立ちます。最後に、筋細胞におけるこれらの相互作用の機能的意義はさらに26-28のように対処すべきです。
まとめると、データを提示のグローバルビューを表示遍在MyoDのパートナーを発現し、より関連性の筋モデルの更なる機能的研究への道を開きます。
図1：タンデムアフィニティー精製によって単離されたMyoDの複合体 （A）核塩抽出性（SE）またはヌクレオソームに富む（NE）から単離された二重アフィニティー精製eMyoD複合体のHeLa-S3細胞株安定の核画分の銀染色。発現している旗-HA-のMyoD（MyoDの複合体）ANDコントロール細胞株（モック）。 MW、キロダルトンの分子量マーカー（kDaの）。矢印は旗-HA-のMyoD（eMyoD）を示しています。この研究は、もともと37に掲載されました。生化学・分子生物学のための著作権アメリカの社会。モック精製とレーンをとSE核画分から単離された複合体は、現在示されているeMyoD：この図は、26から変更されています。 （B）（A）のように二重の親和性精製eMyoD複合体は、20％から41％までのグリセロール勾配で分画しました。画分を手動で収集し、濃縮し、抗Flag抗体を用いたウエスタンブロット（WB）によって分析しました。核塩抽出可能（SE）画分にはいくつかのeMyoD含有サブ複合体の存在に注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ベン図はeMyoDの相互作用核塩抽出性（SE）から単離し、ヌクレオソームに富んだ（との間の重複を示す： 核可溶性（核塩抽出可能な、SE）のMyoDパートナー トップ 対 クロマチン結合（ヌクレオソーム富んだ、NE）の比較 NE）画分。彼らは様々な異なるデータセット内に存在するTAPによって得られ、非特異的と見なされるように、リボソームタンパク質、翻訳開始因子、DNA修復因子、およびチューブリンアイソフォームは、分析から除外した下：。両方のSEで見つかったのMyoDの相互作用およびNE画分（ユニーク）（共通）または画分の1のための特定は、その機能の注釈に基づいてグループに分けました。細胞骨格関連およびその他のタンパク質が示されていません。下線を引いたタンパク質は、いずれかのHeLa細胞内および/またはmyoblasで検証のMyoD相互作用しています共免疫沈降によりTS。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：MyoDのインターアクターの選択されたセットの検証安定旗-HA-のMyoD（eMyoD）を発現するHeLa-S3細胞株における質量分析により同定のMyoDの相互作用の（A）の検証、 左パネル ：。。二重親和性のウェスタンブロット分析核抽出可能な塩（SE）または安定的に示された抗体を用いた（モック）eMyoDまたは対照細胞株を発現するHeLa-S3細胞株のヌクレオソームに富む（NE）の画分から単離された-purifiedのMyoD錯体。 MW、分子量マーカー右パネル：のHeLa-S3細胞株の核ヌクレオソームに富む画分から単離された二重アフィニティー精製のMyoD複合体のウェスタンブロット分析tably示した抗体とeMyoDまたはコントロール細胞株（モック）を発現します。このパネルは、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。 Yahi H、フリッチュL、Philipot O、Guasconi V、Souidi M、ロビン・P、Polesskaya A、Losson R、ハレル-ベランA、AIT-のSi-アリS. J BIOL CHEM。 2008年8月29日; 283（35）：23692から700。 DOI：10.1074 / jbc.M802647200。生化学・分子生物学のためのEPUB 2008 7 2.著作権本アメリカの社会。この図は、26から変更されている：警察の種類とサイズを変更し、テキストが図形内の標識を統一するために回転させました。 MyoDのは、他のパネルに提示内因性IPとの混同を避けるためにeMyoDとして標識しました。 C2C12マウス筋芽細胞でのMyoDの相互作用の（BD）の検証。 C2C12筋芽細胞を増殖するから（B）核総抽出物をBAF47（SNF5）またはのMyoDに対する抗体と、または対照IgGで免疫沈降（IP）のために使用しました。得られた沈殿物は、WBウィットによって分析しました時間表示の抗体。抗MyoDの長い抗体（長い博覧会。）及び短い（ショート博覧会。）については露光時間が示されています。入力された抽出物は、内因性タンパク質のレベルを示すためにロードしました。このパネルはクリエイティブ・コモンズ（CC BY）ライセンス（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の下で28に掲載されました。この図は、28から変更されている：警察の種類とサイズを変更し、試験は、図内の標識を統一するために回転させました。 （C）増殖するC2C12筋芽細胞からの核の総抽出物のMyoD、SUV39H1（ポジティブコントロール）に対する抗体による免疫沈降のために使用される、またはIgG（ネガティブコントロール）を制御しました。得られた沈殿物は、次に示された抗体を用いてWBに供しました。このパネルは、もともとバイオロジカルケミストリー誌に掲載されました。 Yahi H、フリッチュL、Philipot O、Guasconi V、Souidi M、ロビン・P、Polesskaya A、Losson R、ハレル-ベランA、AIT-のSi-アリS. J BIOL CHEM。 2008年8月29日; 283（35）：23692から700。 DOI：10.1074 / jbc.M802647200。生化学・分子生物学のためのEPUB 2008 7 2.著作権本アメリカの社会。この図は、26から変更されている：警察の種類とサイズを変更し、テキストが図形内の標識を統一するために回転させました。増殖してから（D）核総抽出物（prolif。）と区別するC2C12筋芽細胞（48時間は、差分として示す。）、免疫沈降（IP）のために使用されたのMyoDとMyf5のに対して惹起された抗体を用いた、または正常ウサギIgGとし、として空のビーズとネガティブコントロール。得られた沈殿物を標識した抗体を用いWBにより分析しました。入力された抽出物は、内因性タンパク質のレベルを示すためにロードしました。このパネルはクリエイティブ・コモンズ（CC BY）ライセンス（http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）の下で27に掲載されました。この図は、27から変更されている：警察の種類とサイズを変更し、テキストがF内の標識を統一するために回転させ、igure。元の姿とは対照的に、C2C12増殖および分化する得られた結果とパネルが二つに分離されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1： 背景タンパク質の減算後の核塩抽出物画分から単離された二アフィニティー精製eMyoD複合体でMS分析によって同定されたタンパク質のリスト （対照細胞株からの溶出液にMSによって同定されたタンパク質は、非特異的な背景として考えられました。 。データは4つの独立した精製物の和を表す）。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表2： タンパク質Iの一覧背景タンパク質の減算後のヌクレオソームに富む画分から単離された二アフィニティー精製eMyoD複合体でMS分析によってdentified。データは、3つの独立した精製の 合計を表しています。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
表3バッファーの組成物。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
提示された方法は、転写因子、のMyoDのパートナーの網羅的同定を可能にします。これは、MyoDの誘導性の分化、すなわちのHeLa-S3細胞に耐性異種システムでのMyoDパートナーを明らかにしました。したがって、定義により、識別されたのMyoDのパートナーは、遍在的に発現されています。これらは一般的かつ配列特異的な転写因子、クロマチン修飾酵素、RNA処理タンパク質キナーゼ（ 表1および2）が挙げられます。 HeLa-S3細胞はMyoDの誘導性のトランス分化に耐性があるので、MyoDの活性は、主に抑圧され、識別されたパートナーは、MyoDのコリプレッサーである可能性が高いです。これは、MyoDのトランス能力8を阻害することが知られているのIdタンパク質（ 表1および表 2、図2）の存在によって強調されています。重要なことは、このような抑圧的な状態は、筋芽細胞増殖にMyoDの状況に対応しています。確かに、我々はCBFβ、のMyoDとそのMyoDの相互作用を確認しました記載の方法によって同定されたパートナーは、C2C12筋芽細胞増殖を検出することができるが、細胞は分化を受けたとき（ 図3Dを参照）失われます。それにもかかわらず、提示された方法の主な制限の一つはMyoDの共活性化因子の同定の欠如であることに留意することが重要です。一貫して、このようなヒストンのような既知のMyoDのクチベーター、この方法のどれを使用していないと、32が同定されたアセチルトランスフェラーゼ。
MyoDの複合体の精製は、核またはクロマチンに富む画分（濃縮されたヌクレオソーム、NE）（ 図1A）の可溶性画分（抽出可能な核塩、SE）から少なくとも二つの主要な機能を提供していますどちらか。まず、このような分別がMyoDの精製は、全核抽出物から行った場合にマスクされることになる非化学量論的パートナーの表現を増加させます。第二に、これはのMyoDの二つの機能亜集団の分離を可能にする：予め堆積/ evicテッド（SE）とクロマチン結合（NE）。 DNA非結合のMyoDのための具体的な相互作用、多くのキナーゼ、転写因子、人身売買のタンパク質と同様の中でいくつかのクロマチン改築は（ 図2）を同定しました。完全に検証すると、このようなネットワークは、DNA結合していないのMyoDの活性調節のモードへの洞察を提供することができます。質量分析法によるこれらの2つの核の区画でのMyoDの翻訳後修飾のための追加の検索は、さらにのMyoDの活性調節を解明できました。最後に、グリセロール勾配の可溶性およびクロマチン結合のMyoD複合体の分別は、クロマチン結合MyoDのは、主に1つの複素中に含有されている間、DNA非結合のMyoDは、3つのサブ複合体（ 図1B）に分布していることを明らかにしました。タンパク質候補に対するMSおよび/またはウェスタンブロットのいずれかによって、これらのサブ複合体のキャラクタリゼーションは、さらにMyoDの規制のモードを解明する必要があります。
上記強調したように、HeLa細胞は、自然にexpreませんssの筋肉転写因子のMyoD。骨格筋モデル（ 図3）に見相互作用を確認することが重要でした。関連するモデルのMyoDおよび提示TAP-タグアッセイで同定されたパートナーの一部との間に、このような機能的相互作用で確認多くのレポート。これは、例えばプロヒビチン33、DDX17 34、MEIS1 35、CBF 27、HP1 26、およびSWI / SNFクロマチンリモデリング複雑36,28,30の場合です。
敏感MSに結合した場合、例えば、筋芽細胞のような、細胞の少量から、このようなTAPタグ精製を行うことが可能であることに留意されたいです。実際、最近の論文は、筋芽細胞30でFlagタグ付きのMyoDの誘導発現後のMyoDパートナーの特徴付けを説明しました。筋芽細胞における安定的かつ継続的なMyoDの過剰発現が有害であるので、別のアプローチは、筋芽細胞における内因性のMyoD対立遺伝子（複数可）に旗-HAタグを付加することになりますこのようなCRISPR-Cas9 31としてゲノム編集方法を、使用することによって。特に、タグ（複数可）の添加は、潜在的に、したがってタグ（N末端またはC末端）の場所は慎重に選択されるべきである、タンパク質の機能および/または結合パートナーとの会合を変化させることができます。関連するシステムにおける融合タンパク質の機能的アッセイは、タグ付けされたタンパク質が機能的であることを確認する前にするTAP-タグ精製を行わなければなりません。内因性タンパク質の免疫沈降は、これらの問題を回避し、しかし、それはほとんど利用可能で特異的かつ高親和性抗体の利用可能性に依存しています。
記載されたアプローチの別の付加価値は、精製されたタンパク質自体及びその豊富なパートナーの翻訳後修飾（PTMを）を識別するための可能性です。これにより、この機能にTAPタグ精製は、目的のタンパク質および/またはそのパートナーに関連付けられた新たな相互作用パートナーでなく、新しい酵素機能だけでなく特定するのに適しています。にクロマチン結合タンパク質（ すなわち 、転写因子、酵素）の場合は、この方法は、このように関連する「ヒストンコード」の識別のために適合されています。確かに、ヌクレオソーム表面に露出されているアミノ末端ヒストン尾部は、複数の共有結合のPTMの対象となっています。ヒストンのPTMは関与ヌクレオソームに特有の署名を付与します。ヒストンのN末端尾部上の異なる修飾の組み合わせは、このような遺伝子発現の調節を可能にするために、クロマチン構造を変化させることができます。このように、役割と研究クロマチン結合タンパク質22の作用メカニズムへの洞察を提供することができる所定のタンパク質に関連するこのような修正を特徴付けます。
要約すると、提示された方法論は、MyoDのパートナーの総合的な同定を可能にします。 TAP-タグ精製は、GSTプルダウン、酵母ツーハイブリッドアッセイおよびファージディスプレイなどの他のアプローチの代替手段を提供します。たとえ実際的な理由のために（productio核抽出物の大量のn）は、我々は、異種セルラーシステムを使用する必要があり、我々は骨格筋分化における識別されたのMyoDパートナーの関与を確認することができました。得られたデータは、MyoDの筋原性因子は、転写因子の活性を調節する異なるメカニズムを示唆し、転写調節因子のRNA結合タンパク質の範囲のタンパク質の過多と相互作用するように思われることを示しています。
結論として、同じ方法論的アプローチは、お客様の特定の細胞状況で勉強するのが難しいかもしれない多数の核要因の遍在的に発現パートナーを同定するために使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer: Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10x reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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