Abstract
Der Skelettmuskel terminale Differenzierung beginnt mit dem Einsatz von pluripotenten mesodermalen Vorläuferzellen zu Myoblasten. Diese Zellen haben immer noch die Möglichkeit, sich zu vermehren oder sie können unterscheiden und Sicherung in kernige Myotuben, die maturate weiter Muskelfasern zu bilden. Der Skelettmuskel terminalen Differenzierung wird durch die koordinierte Wirkung von verschiedenen Transkriptionsfaktoren orchestriert, insbesondere die Mitglieder der Muskel-regulierende Faktoren oder MRF (MyoD, Myogenin, Myf5 und MRF4), auch genannt die myogenen bHLH Transkriptionsfaktoren Familie. Diese Faktoren wirken mit Chromatin-Remodeling-Komplexe in aufwendigen Transkriptionsregulationsnetzskelett myogenesis zu erreichen. Dabei ist der Master MyoD myogenen Transkriptionsfaktor betrachtet in Muskel terminalen Differenzierung auszulösen. Diese Vorstellung wird durch die Fähigkeit von MyoD verstärkt nicht-Muskelzellen in Skelettmuskelzellen umwandeln. Hier haben wir einen Ansatz beschreiben MyoD zu identifizierenProteinpartner in erschöpfender Weise, um die verschiedenen Faktoren in Skelettmuskel terminalen Differenzierung beteiligt aufzuklären. Das langfristige Ziel ist es, die epigenetische Mechanismen bei der Regulation der Skelettmuskulatur Gene beteiligt zu verstehen, dh., MyoD Ziele. MyoD Partner werden durch die Verwendung Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) von einem heterologen System gekoppelt mit der Massenspektrometrie (MS) Charakterisierung, gefolgt von Validierung der Rolle der relevanten Partner während der Skelettmuskulatur terminalen Differenzierung identifiziert. kongenitale Myasthenie, Muskeldystrophie, Rhabdomyosarkom und Defekte in der Regeneration der Muskulatur: Aberrant Formen von myogenen Faktoren oder deren abweichende Regelung, sind mit einer Reihe von Muskelerkrankungen in Verbindung gebracht. Als solche bieten myogenen Faktoren einen Pool von potenziellen therapeutischen Ziele in Muskelerkrankungen, sowohl im Hinblick auf Mechanismen, die Krankheit selbst und regenerative Mechanismen verursachen, die Behandlung von Krankheiten zu verbessern. Somit ist die detaillierte underding der intermolekularen Wechselwirkungen und die genetischen durch die myogene Faktoren gesteuert Programme ist für das rationale Design von effizienten Therapien unerlässlich.
Introduction
Eukaryotische mehrzellige Organismen werden aus verschiedenen Organen und Geweben besteht. Jedes funktionale Gewebe hat ein spezifisches Gen-Musterausdruck, der bei jedem Differenzierungsschritt bestimmt wird. Zelldifferenzierung beinhaltet die Aktivierung von spezifischen Genen, Wartung ihrer Expression und, im allgemeinen, die von einem Satz von Genen, beteiligt an der Zellproliferation silencing. Skelettmuskeldifferenzierung oder Myogenese, ist somit ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bestimmung von mesodermalen Stammzellen in Myoblasten beginnt, und dann führt zur terminalen Differenzierung dieser Myoblasten in erste mono nukleiert, und dann mehrkernigen, Myotuben . Somit Myoblasten "bestimmt" Zellen, die noch in der Lage zu proliferieren, aber sie sind auf die Skelettmuskelabstammungslinie gebunden und somit ausschließlich in Skelettmuskelzellen entweder während der embryonalen Entwicklung oder im Erwachsenenmuskelregeneration unterscheiden kann. Der Prozess der Skelettmuskulatur Terminal unterscheidenzierung wird durch eine spezifische genetische Programm orchestriert , die aus dem Zellzyklus der Myoblasten - Vorläuferzellen mit dem Permanent Ausgang beginnt , die mit 1 der Proliferation assoziierten Genen, wie E2F Zielgenen auf eine definitive silencing führt. Tatsächlich während des Prozesses der terminalen Differenzierung, Proliferation Myoblasten Stillstand ist ein entscheidender Schritt, der die Expression von Skelettmuskel - spezifischen Genen und die Fusion von Myoblasten in Myotuben 2 vorausgeht. Ein solches Programm ermöglicht erwachsenen Muskelstammzellen, auch Satellitenzellen genannt, während des Regenerationsprozesses folgende Skelettmuskelverletzung zu unterscheiden.
Mammalian myogenesis auf eine Familie von myogenic basischen Helix-Loop-Helix kritisch abhängig ist (bHLH) Transkriptionsfaktoren MyoD, Myf5, MRF4 und Myogenin bezeichnet häufig als die Familie der Skelettmuskulatur Bestimmung Faktoren oder MRF (Muscle Regulatory Factors) 3. Jeder von ihnen spielt eine wesentliche Rolle in der Beschreibung und den difzierung von Skelettmuskelzellen und eine spezifische Expressionsmuster April 05-07. Die Aktivierung von Myf5 und MyoD bildet die bestimmend Schritt, die Zellen in die myogenen Linie, und anschließende Expression der Myogenin löst myogenesis mit der Aktivierung von Skelettmuskel spezifische Gene, wie MCK (Muscle Creatine Kinase) begeht. Myogenen bHLH - Transkriptionsfaktoren wirken mit Mitgliedern der MEF2 - Familie bei der Aktivierung von Muskel Gene von zuvor stillen loci 8. Sie stimulieren auch Skelettmuskel Gentranskription als Heterodimere mit ubiquitären bHLH - Proteinen, E12 und E47, wie E - Proteine bekannt, die in verschiedenen Gen-regulatorischen Regionen 8 sogenannte E-Boxen binden. Twist, Id (Inhibitor der Differenzierung) und andere Faktoren negativ diesen Prozess regulieren, durch die Bindung 8 mit MyoD für E - Proteine konkurrieren.
MyoD wird als wichtiger Akteur betrachtet bei der Auslösung von Muskel terminale Differenzierung 9 10-13 zu induzieren. Tatsächlich induziert gezwungen Expression von MyoD die trans-Differenzierung verschiedener Zelltypen , auch diejenigen , die aus einem anderen embryologischen Ursprungs 12. Zum Beispiel MyoD können Hepatozyten, Fibroblasten, Melanozyten, Neuroblasten und Adipozyten in muskelähnliche Zellen umwandeln. Die trans-differentiative Wirkung von MyoD beinhaltet eine abnormale Aktivierung des genetischen Programms myogene (insbesondere seine Zielgene) in einem nicht-muskuläre Umgebung gleichzeitige zum Silencing des ursprünglichen genetischen Programms (insbesondere Proliferationsgene).
In proliferierenden Myoblasten wird MyoD ausgedrückt , ist aber nicht imstande, seine Zielgene selbst aktivieren , wenn es um ihre Promotoren bindet 14-16. Daher ist für die Anforderung MyoD kontinuierlich in undifferenzierte Myoblasten exprimiert werden bleibt ganz elusive. MyoD konnte seine Zielgene aufgrund Rekrutierung von repressiven Chromatin-modifizierende Enzyme in proliferierenden Myoblasten vor dem Laden von Chromatin - Remodeling - Enzyme 14,17 Aktivierung unterdrücken . Zum Beispiel Myoblasten in wuchernden, MyoD mit Transkriptions Korepressor KAP-1, Histon-Deacetylasen (HDACs) und repressive Lysin-Methyltransferasen (KMZ) verbunden sind, einschließlich Histon H3 Lysin 9 oder H3K9 und H3K27 Kmts und unterdrücken aktiv seine Zielgene Ausdruck durch eine lokal repressiven Chromatinstruktur 14,17 etablieren. Wichtig ist , zeigte eine kürzlich veröffentlichten Bericht , dass MyoD ist selbst durch die H3K9 KMT G9a was zu einer Hemmung der Aktivität transaktivierend 16 direkt methyliert.
Die epigenetische Mechanismen in dieser Transdifferenzierung nicht-Muskelzellen durch MyoD sind weitgehend unbekannt. Bemerkenswerterweise sind einige Zelllinien resistent gegen MyoD-induzierte Transdifferenzierung. So wird in HeLa-Zellen, MyoD ist entweder inaktiv oderkönnte sogar als Repressorfunktion anstatt Aktivator der Transkription aufgrund des Fehlens der Expression der BAF60C Untereinheit des Chromatin - Remodeling - Komplexes SWI / SNF 18. Dieses Modell kann somit der Wahl sein, um besser die Mechanismen der MyoD-induzierte Gen Repression zu charakterisieren. Es ist auch geeignet , um die Fähigkeit von MyoD dem Test an seinem Zielloci mit seinen zugehörigen Partner repressive Chromatin - Umgebung zu induzieren und daher die MyoD abhängigen repressive Mechanismen aufzudecken Myoblasten in proliferierenden terminalen Differenzierung zur Feinabstimmung.
Hier beschreiben wir das Protokoll für die Identifizierung von MyoD Partner unter Verwendung von Tandem Affinity Purification (TAP-Tag), die mit der Massenspektrometrie (MS) Charakterisierung. Die Verwendung von HeLa-S3-Zellen stabil Flag-HA-MyoD exprimieren erlaubt genug Material bekommen die MyoD Komplexe aus fraktionierten Kernextrakten zu reinigen. Die Identifizierung von MyoD Partner im heterologen System wurde von validati gefolgtauf in einem relevanten System.
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Protocol
1. Herstellung von HeLa-S3 Nuclear Salz-gebundene und Chromatin-gebundenen Fraktionen
- Sammlung der Zellen
- Wachsen HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 Flag-HA (Kontrollzelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Wachstums Medium) bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Inkubator.
Hinweis: HeLa-S3 - Zellen stabil exprimieren Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 transduzierten Zellen mit dem leeren Vektor (HeLa-S3 Flag-HA) entweder festgelegten Protokoll in beschriebenen werden könnte: 19,20, oder von den Autoren zur Verfügung gestellt. - Amplify Zellen bis zu 10 vollständig konfluenten 150 mm-Schalen von jeder Zelllinie (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 Flag-HA-Zellen).
- Die überstehende Flüssigkeit (enthalten nicht adhärenten Subpopulation) in 5 L Spinner.
- Waschen Sie die anhaftende Subpopulation mit 10 ml PBS pro 150 mm Schale, trypsinize Zellen für 1 min bei Raum temtur (0,05% Trypsin-EDTA-Lösung, 2 ml für eine 15-cm-Schale).
- 4 ml des Mediums pro 150 mm Schale und sammeln die Zellen in 50-ml-Röhrchen.
- Kombinieren Sie den Überstand aus Schritt 1.1.3 (in der 5 L Spinner) und den Zellen aus Schritt 1.1.5, 500 ml frischem vorgewärmten Wachstumsmedium für jede Zelllinie.
- Übertragen Zellsuspension in 5 L spinner und wachsen Zellen für mindestens 60 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Inkubator.
- In 500 ml frisches Wachstumsmedium und wachsen Zellen für 24 Stunden.
- 1 l frischem Wachstumsmedium und wachsen Zellen für 24 Stunden.
- Nehmen Sie 1 ml der Zellsuspension, die Zellen zu zählen und zu überprüfen, die Lebensfähigkeit der Zellen. Farbe 30 ul Zellsuspension mit 30 ul 0,4% Trypanblau und zählen am Leben (nicht blau) Zellen unter dem Mikroskop mit Zählkammer.
- Halten Sie die Zelldichte bei 2 - 6 x 10 5 Zellen / ml von täglich frischem Wachstumsmedium Zugabe; nicht mehr als 1 x 10 6 Zellen / ml. Das MaximumVolumen für einen 5-l-Spinner 2,5 L.
Hinweis: Für die folgenden Schritte gehen von Chargen von 2-2,5 l Kultur bei einer Dichte 1 x 10 6 Zellen / ml. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.12 - 1.1.14 etwa 20 l zu sammeln (≈ 20 g trockenes Pellet) jeder Zelllinie vor dem nächsten Schritt fortfahren. - Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand zu verwerfen.
- Die Zellen in 100 ml eiskaltem PBS durch Pipettieren und Zentrifugieren bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C, um das Pellet zu waschen.
- Wiederholen Sie die Wäsche durch Resuspendieren der Zellen mit 25 ml eiskaltem PBS, die Suspension in 50-ml-Röhrchen übertragen und bei 500 g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert.
Anmerkung: Die Zellpellets können entweder sofort verwendet oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und mehrere Tage bei -80 ° C gelagert.
- Wachsen HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 Flag-HA (Kontrollzelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Wachstums Medium) bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Inkubator.
- Isolierung der Nuclei
Hinweis: Führen Sie die Schritte 1.2.1 - 1.4.3 im Kühlraum.- Pre-Chill buffers und Homogenisatoren.
- Wenn gefrorene Material, schnell bei 37 ° C, um die Zellpellets in einem Wasserbad auftauen.
- Resuspendieren von 20 g (≈ 20 ml) der Zellen in 20 ml (ein Volumen gleich der Größe des Pellets Zelle) des hypotonischen Puffers A (Tabelle 3) auf den ersten 10 ml des Puffers verwendet, dann Zugabe von 5 ml, dann Zugabe weitere 5 ml. Waschen Sie die Pipetten gut mit frischem Puffer, um die maximal Zellen zu erhalten.
- Transfer 40 ml Zellsuspension in die vorgekühlten Homogenisator mit einem eng anliegenden Stößel.
- Homogenisieren Zellen mit 20 Schlägen in einem Homogenisator (20 in und aus Bewegungen) und Zellsuspension in 50-ml-Röhrchen übertragen.
- Waschen den Homogenisator mit 7 ml Saccharosepuffer (1/3 des anfänglichen Zellvolumen, Tabelle 3) das Maximum von Zellen zu gewinnen. Übertragen Sie diese Suspension schnell in die 50-ml-Röhrchen aus Schritt 1.2.5, um die Kerne zu erhalten und die Leckage zu begrenzen.
- Stain ein 30-ul-Aliquot mit 30 ul 0,4% trypan blau, unter dem Mikroskop zu analysieren, um die Lyse Effizienz zu steuern (wenn die Lyse erfolgreich ist, sollten alle Kerne blau sein). Falls erforderlich, wiederholen Homogenisierungsschritt.
- Zentrifuge für 7 min bei 10.000 × g und 4 ° C, um die Kerne zu pelletieren. Speichern Sie den Überstand als Zytoplasmafraktion.
- Herstellung von Kernsalz extrahierbar (SE) Fraktion
- Resuspendieren Kerne Pellet in 8 ml Saccharosepuffer (ein Volumen gleich der Größe der Kerne Pellet). Hinzufügen tropfen unter Mischen gründlich auf einem Vortex - 8 ml Hochsalzpuffer (1 Kerne Pelletvolumen, Tabelle 3) zu einer Endkonzentration von 300 mM NaCl zu erhalten. Inkubieren für 30 min auf Eis und mischen alle 5 min.
- Verringern NaCl-Konzentration auf 150 mM durch Zugabe von 8 ml (1/3 des Gesamtvolumens) Sucrose-Puffer. Zentrifuge für 10 min bei 13.000 xg und 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand (Kern Salz extrahierbare Fraktion, SE).
Hinweis: Entweder gehen 1.3.3 zu treten oder die SE verlassenFraktion auf Eis während der Herstellung von Chromatin-gebundenen Fraktion und dann Ultrazentrifuge gleichzeitig beide Fraktionen. - Ultrazentrifuge SE für 30 min bei 85.000 × g bei 4 ° C. Nehmen Überstand (≈ 26 ml).
- Frieren 100 ul aliquoten in flüssigem Stickstoff. Gehen Sie 2 "Protein-Komplex Reinigung" zu dem Schritt, den Rest des Extraktes verwenden.
Hinweis: Das Aliquot als Eingabesteuerung während Schritt 5.1.1 verwendet werden soll.
- Herstellung von Chromatin-gebundenen Fraktion
- Resuspendieren des Pellets (aus Schritt 1.3.5.) Sorgfältig in 7 ml (ein Volumen gleich der Größe des Pellets) Sucrose-Puffer.
- Hinzufügen CaCl 2 auf eine Endkonzentration von 1 mM (28 & mgr; l 0,5 M CaCl 2 für 14 ml Suspension) MNase (Schritt 1.4.4) und mischen zu aktivieren.
- Vorheizen Suspension für 1 min bei 37 ° C.
- In 70 ul Mikrokokken-Nuclease (MNase) Endkonzentration von 0,0025 U / ul (1/200 Verdünnung von 0,5 zu erhaltenU / ul Lager) und mischen.
- Inkubieren genau 12 min bei 37 ° C. Mischen Sie alle 4 Minuten.
- Sofort legen Sie die Reaktion auf Eis.
- MNase Aktivität, fügen Sie 112 ul 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 Verdünnung) bis zu einer Endkonzentration von 4 mM zu stoppen. Inkubieren für 5 min auf Eis.
- Beschallen 5 mal für 1 min bei hoher Amplitude, zwischen zwei sonications erlauben eine Pause von 1 min (10 min insgesamt).
- Ultrazentrifuge für 30 Minuten bei 85.000 xg und 4 ° C.
- Die überstehende Flüssigkeit (Nukleosomen angereicherte Fraktion, NE, ≈ 12 ml).
- Frieren 50-ul-Aliquot in flüssigem Stickstoff. Gehen Sie 2 "Protein-Komplex Reinigung" zu dem Schritt, den Rest des Extraktes verwenden.
Hinweis: Das Aliquot als Eingabesteuerung während Schritt 5.1.1 verwendet werden soll.
2. Proteinkomplexe Reinigung
Hinweis: Gehen Sie parallel Auszüge aus jeder Zelllinie (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und die Kontrolle, HELa-S3 Flag-HA).
- Flag- basierte Reinigung
- Vorwäsche Flag Harz. Verwenden Sie 600 ul Flag Harz (von der handelsüblichen 50% Lager) für jeden experimentellen Punkt (SE und NE-Fraktionen für jede Zelllinie).
- Transfer von Harz in 15 ml - Röhrchen, Resuspendieren in 13 ml kaltem tegn (Tabelle 3), Zentrifuge für 2 min bei 1000 xg Überstand und zu entfernen. 5-mal wiederholen. Nach dem letzten Wasch Resuspensierbereich Flag Harz in gleichen Volumen tegn (300 & mgr; l für jeden experimentellen Punkt).
- Für jeden experimentellen Punkt, mischen 600 ul gewaschenen Flag Harz und die entsprechenden Proteinextrakte (in einem 15-ml-Röhrchen für die 12 ml NE und in einem 50-ml-Röhrchen für die 26 ml SE Fraktionen, jeweils). Inkubieren auf einem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
- Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C, zur Seite legen Sie den Überstand und halten bei 4 ° C, bis das Ergebnis des Reinigungseffizienz-Test (2.2).
- Für die SE Proben, resuspendieren Flag Harzin 4 ml tegn und in ein 15-ml-Tube. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal, jedes Mal auf den gleichen 15-ml-Röhrchen übertragen zu vermeiden Perlen zu verlieren. Zentrifuge 2 min bei 1000 × g und 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand.
- Wasch Flag Harz 7 mal in einem 15 ml Röhrchen unter Verwendung von 13 ml tegn und Zentrifugieren 2 min bei 1000 xg und 4 ° C.
- Nach der letzten Waschung Resuspension in 1 ml tegn und Transfer in ein 1,5 ml schwach bindende Rohr. Zentrifuge 2 min bei 1000 xg und 4 ° C und den Überstand entfernen.
- Resuspendieren in 200 ul Flag-Peptid-Lösung bei 4 mg / ml bei pH 7,8 für jeden experimentellen Punkt. Mischen Sie die Perlen und Peptid. Mit 200 & mgr; l tegn Puffer und Inkubation bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht gebundenen Proteine eluieren.
- Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C und übertragen das Harz und der Überstand (Flag Eluat) auf eine leere Spin-Säule platziert in einem 2-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Spalte, sammeln die übrig gebliebenen Überstand in der 2-ml-Röhrchen. Sammeln Sie die Flag Harz durch tegn Puffer auf die Säule Zugabe und mit dem zweiten Flag Elution mit 200 ul Flag Peptidlösung (4 mg / ml) über Nacht bei 4 ° C für jeden experimentellen Punkt fortfahren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.9 - 2.1.10 zweite Elution zu sammeln. Kombinieren ersten und zweiten Eluate.
- Test von Reinigungseffizienz
Hinweis: Während der Schritt 2.1.11 - 2.1.12, führen SDS-PAGE und Silberfärbung (2.2.1 - 2.2.2).- Nehmen Sie sich 15 ul der Eluate, fügen Sie 5 ul 4x Ladepuffer und 2 ul 10x Reduktionsmittel, kochen für 5 min bei 96 ° C und betreiben ein SDS-Polyacrylamid von 4 - 12% Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Stain das Gel mit Silberfärbung Kit (folgen Sie den Anweisungen des Herstellers). Wenn es deutliche Unterschiede in der Proteinmuster zwischen Flag-HA-MyoD und Flag-HA Mock Eluate ist, insbesondere die Band von Flag-HA MyoD (etwa 50 kDa, 1A), gehen Sie zum nächsten steSeite
- Hämagglutinin (HA) -basierte Reinigung
- Wasch HA-Harz, indem sie in 15 ml-Röhrchen übertragen, Resuspendieren in 13 ml tegn und Zentrifugieren 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C. Waschschritt wiederholen 5-mal. Nach dem letzten Wasch resuspendieren Perlen in gleichen Volumen tegn Puffer.
Hinweis: Die Lautstärke eingestellt werden, müssen entsprechend der Leistungsfähigkeit von Flag-basierte Reinigung. Beginnen Sie mit 300 & mgr; l aus dem handelsüblichen 50% Lager für jeden experimentellen Punkt. - Übertragen HA Harz für jeden experimentellen Punkt in ein 1,5 ml geringe Bindungsrohr. Zentrifuge 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C, das Maximum des Waschpuffer (Tabelle 3) zu beseitigen , und die Eluate von Flag-basierten Reinigung in die HA - Harz hinzuzufügen.
- Die Röhrchen auf dem sich drehenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
- Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C, zur Seite legen Sie den Überstand und halten bei 4 ° C, bis das Ergebnis des Reinigungseffizienz-Test (2.3.12.).
- ReAussetzung der HA Harz in 0,5 ml tegn, übertragen auf einen neuen Tief 1,5-ml-Röhrchen zu binden. Wiederholen Sie einmal Aufwirbelung auf den gleichen 1,5-ml-Röhrchen Zugabe zu vermeiden, Perlen und Zentrifuge 2 min bei 1000 × g und 4 ° C zu verlieren. Überstand entfernen.
- Waschen Perlen 8-mal um 1 ml tegn jedes Mal mit, Zentrifugieren 2 min bei 1000 × g und 4 ° C und Entfernen von Überstand (nicht zu verlieren Kügelchen). Nach der letzten Waschung, übertragen Sie die Perlen in 0,5-ml-Röhrchen.
- Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich. Füge 100 & mgr; l HA freie Peptidlösung (4 mg / ml) bei pH 7,8 auf Kügelchen gebundenen Proteine zu eluieren. Inkubieren auf dem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
Anmerkung: Die Menge des HA-Peptids angepasst werden muss in Abhängigkeit von der Fülle der Komplexe. - Zentrifuge für 2 min bei 1000 × g bei 4 ° C und übertragen das Harz und der Überstand (HA Eluat) auf eine leere Spin-Säule platziert in einem 2-ml-Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Spalte mit der linken Überstands in der 2-ml-Röhrchen zu sammeln. Führen Sie eine zweite Elution mit 100 ul HA-Peptid (4 mg / ml) für jeden experimentellen Punkt. Inkubieren auf dem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C. Wiederholen Sie Schritt 2.3.8 - 2.3.9 auf den zweiten Elution sammeln.
- Kombinieren ersten und zweiten Eluate.
- Test - Reinigungswirkungsgrad durch SDS-PAGE und Silberfärbung (siehe Schritte 2.2.) (1A).
- Konzentriere das Eluat HA bis 30 & mgr; l unter Verwendung von Zentrifugal-Filtereinheiten mit einer 10 kDa cut-off (Nennmolekulargewichtsgrenze, NMWL) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Teilen Sie die konzentrierten Proben in zwei Teile: 22,5 (3/4) und 7,5 (1/4) ul. Schnellfrost 1/4 der Proben in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C. Verwenden Sie den 3/4 Teil für Schritt 3.
Hinweis: Der 1/4 gefrorenen Teil ist durch Western-Blot zur Bestätigung der Massenspektrometrie Ergebnisse verwendet werden (siehe Schritt 5.1).
- Wasch HA-Harz, indem sie in 15 ml-Röhrchen übertragen, Resuspendieren in 13 ml tegn und Zentrifugieren 2 min bei 1.000 × g bei 4 ° C. Waschschritt wiederholen 5-mal. Nach dem letzten Wasch resuspendieren Perlen in gleichen Volumen tegn Puffer.
3. Massenspektrometrie-Analyse
Hinweis: Die folgenden Schritte sollten mit dem Mass Spectrometry Facility besprochen werden, die die Analyse durchführen wird.
- Nachtrag 3/4 (22,5 ul) der Proben mit 7,5 ul 4x Ladepuffer und 3,3 ul 10x Reduktionsmittel und kochen für 5 min bei 96 ° C.
- Laden Sie die Proben auf einem SDS-Polyacrylamid von 4 - 12% Gel. Führen Gel bei 150 V konstant für 5 Minuten, damit alle Proteine des Gels ohne Trennung einzugeben.
- Waschen Sie das Gel mit Wasser; fix für 20 - 30 min mit Fixierungslösung (10% Essigsäure, 50% Methanol, 40% besonders sauberes Wasser), dann die festen Gel 5-mal in extrem sauberes Wasser waschen.
- Schneiden Sie die Bänder, die die Proteine, lagern in 1 ml Wasser in einem 1,5-ml-Röhrchen und senden Massenspektrometrie-Anlage enthält.
4. Datenanalyse
Hinweis: Dies ist eine allgemeine Anleitung für die Analyse ist. Die genauen Schritte hängen von der speziellen Art der von MS Einrichtung angegebenen Datenverwendet , um die Analyse (zB 21,22) durchzuführen.
- Vergleichen Sie die Liste der identifizierten Proteine in "MyoD" Eluate mit der Liste von entsprechenden negativen Kontrollpräparat erhalten. Ausschließen aus der Analyse der Proteine in beiden Listen gefunden.
- Entfernen Sie Proteine, die ≤2 Gesamtzahl der identifizierten Peptide aus den verbleibenden Liste haben.
- Zugang funktionelle Annotation und funktionelle Klassifizierung der erhaltenen Liste von Proteinen DAVID Bioinformatik - Ressourcen (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) und klassifizieren die Liste der Proteine 23,24.
- (Optional) Entfernen der Liste "Tramper", geladene nichtnukleare Proteine mit starken zufälliges Bindung zu 25 negativ geladene DNA. Diese enthalten Zytoskelett, zytoplasmatische, mitochondriale Membran und Rezeptorproteine (Proteinfaltung, Zytoskelett und Sonstiges Gruppe Proteine in den Tabellen 1 und 2). </ Li>
- Vergleichen der erhaltenen Listen der MyoD Interaktoren von SE und NE Fraktionen gemeinsame Proteine und Proteine , die für jede Fraktion (Abbildung 2) spezifisch zu identifizieren.
5. Bestätigung der Identifizierten Interacter durch Western Blot
- Bestätigung in HeLa-S3 Flag-HA-MyoD und HeLa-S3 Flag-HA
- Thaw Eluatproben bei dem Schritt 2.3.14 (7,5 ul) auf Eis erhalten. Liste 12 ul tegn Puffer, 10 & mgr; l 4x Ladepuffer und 3 ul 10fach Reduktionsmittel. Boil Proben für 5 min bei 96 ° C.
- Bereiten Eingangsabtastwerte für das Western-Blotting.
- Auftauen Aliquots aus den Schritten 1.3.9 und 1.4.11 und Proteinkonzentration zu messen, zum Beispiel BCA Kit (Herstellerangaben beachten).
- Verwenden Sie 15 ug des Proteins pro Spur. Messen Sie die entsprechende Menge des Extrakts und justieren Volumen der Probe bis zu 15 & mgr; l mit tegn Puffer.
- In 5 ul 4x Ladepuffer und1,5 ul 10x Reduktionsmittel. Boil Proben für 5 min bei 96 ° C.
- Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit Antikörpern von Interesse (spezifisch für Partner Kandidat bei MS-Analyse identifiziert) unter Verwendung von 15 ul Eluatproben. Verwenden Eingangs Extrakte als Kontrolle der endogenen Proteinspiegel (3A).
- Bestätigung im Relevant Cellular System
- Vorbereitung der gesamten Kernextrakt von C2C12 Maus-Myoblasten.
- Wachsen C2C12 - Maus - Myoblasten in DMEM Medium mit 15% fötalem Kälberserum, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Inkubator. Überschreiten Sie niemals 80% Zellkonfluenz Zellen in proliferativen Zustand zu halten.
- Wachsen mindestens zwei 150 mm-Schalen von C2C12 für einen Punkt (ein Antikörper), der Immunpräzipitation (IP). Saugen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml PBS.
- Abkratzen der Zellen und sammeln in 15-ml-Tube. Centrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
- Schätzen das Volumen des Zellpellets (= V Zelle). Sanft das Pellet in 3 Volumen V Zelle von hypotonischen Puffer B Cytoplasmamembran (Tabelle 3) zu stören.
- Hinzufügen 0,44 x V Zellvolumen von 10% NP-40 zu erreichen Endkonzentration von 1% (v / v). vorsichtig umdrehen das Rohr mehrmals zu mischen.
- Hinzufügen 0,89 x V Zellvolumen von SR (Tabelle 3) , um die Kerne Integrität zu bewahren. Vorsichtig wird das Röhrchen mehrmals die Suspension und Zentrifuge für 5 min bei 2000 xg zu homogenisieren Kerne zu pelletieren.
- Entfernen Sie den Überstand (Cytosol-Fraktion). Schätzen Sie das Volumen der Kerne Pellet (= V Nuk). Resuspendieren Kerne Pellet in einem Volumen V Nuk von Saccharose - Puffer.
- Hinzufügen tropfen während gründliches Mischen auf einem Vortex einem Volumen V nuc Hochsalzpuffer in einer Endkonzentration von 300 mM zu erhaltenNaCl, und 30 min auf Eis inkubieren. Mischen Sie alle 5 Minuten.
- In einem Volumen V Nuk von Saccharose - Puffer (zu verringern NaCl - Konzentration auf 150 mM) und CaCl 2 (Endkonzentration 1 mM). Mischen.
- Vorheizen Suspension für 1 min bei 37 ° C, fügen Mikrokokken-Nuklease zu bekommen Finale der Konzentration 0,0025 U / ul (1/200 ab Lager von 0,5 U / ul). Mischen.
- Inkubieren genau 12 min bei 37 ° C. Mischen Sie alle 3 min.
- Unmittelbar danach Reaktion auf Eis und fügen EDTA (Endkonzentration 4 mM) MNase Aktivität zu stoppen. Inkubieren für 5 min auf Eis.
- Beschallen 5 mal für 0,5 min jeweils bei hoher Amplitude. Zwischen zwei sonications, eine Pause von 0,5 min (5 min insgesamt) ermöglichen.
- Ultrazentrifuge für 30 Minuten bei 85.000 xg und 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand (Gesamtkernextrakt).
- Messen Sie die Proteinkonzentration des gesamten Kernextrakt, zum Beispiel unter Verwendung von BCA-Kit (Herstellerangaben beachten) und fahren Sie immediately 5.2.2 Schritt.
- Immunopräzipitation (IP) von endogenem MyoD.
- Um vorab klar die Extrakte, Waschen 10 ul Protein G-Agarosekügelchen für jeden Punkt IP.
- Übertragen Sie die benötigte Menge an Protein G Agarose-Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen, Resuspension in 1,4 ml kaltem tegn, Zentrifuge für 2 min bei 1800 × g und entfernen Sie den Überstand. 3-mal wiederholen.
- Mischen vorgewaschene Protein G-Agarosekügelchen mit dem entsprechenden Volumen der gesamten Kernextrakt. Verwenden Sie 500 ug Gesamt-Kernextrakt Protein pro IP-Punkt.
- Inkubieren auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C für 2 Stunden, um die Extrakte vorge löschen.
- Zentrifuge für 5 min bei 1800 × g bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand.
- Mix 5 ug MyoD Ab oder 5 ug Kaninchen-IgG mit 500 ug bereits geklärten Gesamtkernextrakten in 1,5 ml geringe Bindungsröhrchen. In tegn bis zu 1 ml Puffer. Inkubieren auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C über Nacht.
Hinweis: Führen Sie die fach Schritte während Schritt 5.2.2.3. - Vorwäsche 7,5 ul Protein A / G Lager Perlen Lösung pro IP-Punkt.
- Übertragen Sie das benötigte Volumen der Kugeln in ein 1,5-ml-Röhrchen, resuspendieren Perlen in 1 ml tegn und Zentrifuge bei 1800 × g bei 4 ° C für 2 min. Entfernen Sie den Überstand. 3-mal wiederholen.
- Resuspendieren Protein A / G - Kügelchen in 1,5 ml Blockierungslösung (Tabelle 3) und Inkubieren auf einem rotierenden Rad über Nacht bei 4 ° C.
- Zentrifuge Gesamtkernextrakten inkubiert mit Abs (Schritt 5.2.2.5) bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Halten Sie den Überstand.
- Zentrifuge blockiert Protein A / G-Harz (Schritt 5.2.2.7) bei 1.800 × g für 2 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und Resuspendieren in 1 ml tegn Puffer. Re-Zentrifuge bei 1800 × g für 2 min bei 4 ° C auszuwaschen Blocking-Puffer.
- Resuspendieren blockiert Protein A / G-Harz in 1 ml tegn Puffer und aliquoten in neue proteinbindungsarmen Rohre 7,5 ul blo zu erhaltencked Protein A / G Harz pro IP-Punkt. Zentrifuge bei 1.800 × g bei 4 ° C für 2 min und so viel wie möglich von dem Überstand zu entfernen.
- Fügen Sie die Gesamtkernextrakten mit dem ABS inkubiert (oder Kontroll-IgG) mit dem A / G-Harz. Mischen und Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) auf einem rotierenden Rad.
- Centrifuge Suspension 1800 × g bei RT für 2 min. Überstand verwerfen, Resuspendieren in 1 ml Waschpuffer und Transfer Suspension in neue niedrige Bindungs Rohre. bei RT inkubieren 5 min auf einem sich drehenden Rad.
- Zentrifuge Suspension bei 1.800 × g bei RT für 2 min, Resuspension in 1 ml Waschpuffer und Inkubation für 5 min bei RT auf einem rotierenden Rad. Wiederholen 4 mal. Für die letzte Wasch Übertragung auf einen neuen Tiefbindungsrohr.
- Entfernen Maximum des Überstands. In 7 ul Waschpuffer, 7 ul 4x Ladepuffer und 3 ul 10x Mittel an die Kügelchen zu reduzieren, mischen und kochen für 5 min bei 96 ° C.
- Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit Antikörpern von interest (spezifisch für Partner Kandidat für die Immun gefällte Protein). Verwenden 1% (5 ug) von Eingangs Extrakte als Kontrolle der endogenen Proteinspiegel (3B).
- Um vorab klar die Extrakte, Waschen 10 ul Protein G-Agarosekügelchen für jeden Punkt IP.
- Vorbereitung der gesamten Kernextrakt von C2C12 Maus-Myoblasten.
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Representative Results
Um die Regulierung der Aktivität MyoD verstehen, unternahmen wir die erschöpfende Charakterisierung der MyoD Komplexe mittels biochemischer Reinigung, basierend auf der Immunreinigung einer Doppel tagged Form MyoD gefolgt von Massenspektrometrie (MS). Die Verwendung von HeLa-S3-Zelllinie exprimiert Flag-HA-markierten MyoD und eine Linie Kontrollzelle, die Flag-HA erlaubt genug Material bekommen die MyoD-Komplex zu reinigen, indem Sie doppelt Affinitätsreinigung von Flag-HA-MyoD durchführen.
Wir fraktioniert, um die Zellextrakte in cytoplasmatischen und Kernfraktionen, dann fraktioniert weiter die Kernfraktion zu salz extrahiert (Kern Salz extrahierbaren, SE) und angereichert für Nukleosomen (Nukleosomen angereicherte, NE) Fraktionen. TAP-Tag Reinigung von diesen getrennt Kernfraktionen (Abbildung 1, Tabellen 1 und 2) erlaubt Partnern zu entwirren , die relativ niedrig ab habenundance wenn an einem bestimmten subnuclear Fach lokalisiert. Darüber hinaus ist eine solche Strategie wurde ausgebeutet Partner von ungebundenem (SE) im Vergleich zu DNA-gebundenen (NE) MyoD aufzudecken Erkenntnisse über MyoD Aktivitätsregulation zu erhalten.
Für TAP-Tag der Reinigung wurde das Flag-HA Tandem-Epitop-System verwendet. Die kleine hydrophile Flag und HA-Epitope haben minimale Interferenz mit der Proteinfunktionen und sind sehr zugänglich für Antikörper-Antigen-Wechselwirkung. Anti-Flag und anti-HA Harzbasis sequentielle Immunreinigung wurde durchgeführt, gefolgt von der Elution der immungereinigten Komplexen Flag und HA-Peptide. Die eluierten Proteine wurden dann auf einem SDS-PAGE laufen gelassen, damit alle Proteine des Gels zu gelangen. Die Stücke des Gels alle gereinigten Proteine enthielten, wurden ausgeschnitten; die Proteine wurden extrahiert, Trypsin-verdauten und durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert.
Wie in 2 gezeigt ist , (Abbildung 2 und 3) , 26-28. Dies wirft ein Licht auf DNA-gebundenen MyoD Partner und mögliche Co-Regulierungsbehörden, die eine repressive-Chromatin-Umgebung zu etablieren. Zum Beispiel HP1-Proteine, die als MyoD Partnern beschrieben Methodik identifiziert wurden, sind dafür bekannt, methylierte H3K9 zu binden Gen Repression und Heterochromatin Struktur aufrecht zu erhalten. Tatsächlich hemmt HP1 Transkriptionsaktivität MyoD beeinträchtigte MyoD Ziel Genexpression und Muskel terminale Differenzierung führt 26.
Eine weitere Fraktionierung vondie SE und NE MyoD - Komplexe auf Glycerin - Gradienten (wie in 29 beschrieben) freigelegt , die MyoD Unterkomplexe in den beiden Abteilen subnuclear (1B). Insbesondere wird SE MyoD in drei Teilkomplexe verteilt, während der Chromatin-gebundenen MyoD einem Komplex gehört hauptsächlich.
Einige der TAP-tag / MS ergab Interaktoren durch Western-Blot auf MyoD Komplexe bestätigt wurden. Dazu gehören der Transkriptionsfaktor CBF, EBB, MTG8R und die SWI / SNF - Untereinheit BAF47 (SNF5) (3A, links) und HP1 - Proteine (CBX1 und CBX3) (3A, rechts). Wichtig ist , dass da HeLa - Zellen nicht Muskelzellen sind und nicht zum Ausdruck bringen MyoD, ist es notwendig , Wechselwirkungen zwischen neu identifizierten Interaktionspartner und MyoD in Myoblasten (Abbildung 3 BD) zu bestätigen. Bemerkenswert ist, für eine solche Validierung sind die gesamten Kernextrakte (ohne Trennung auf SE und NE) sind in der Regel ausreichend, which ermöglicht eine Verringerung der Menge an Myoblasten für die Probenvorbereitung eingesetzt. Die in - vitro - Interaktionsassays wie in 26,27, helfen diese Erkenntnisse weiter validiert. Schließlich sollte die funktionelle Bedeutung dieser Wechselwirkungen in Muskelzellen weiter in 26-28 adressiert werden.
Insgesamt präsentierten Daten eine globale Sicht auf ubiquitär exprimierte MyoD Partner zeigen und den Weg zu weiteren funktionellen Studien in einem relevanten Muskelmodell.
Abbildung 1: MyoD Komplexe isoliert durch Tandem Affinity Purification (A) eine Silberfärbung der Doppel affinitätsgereinigtem eMyoD Komplexe isoliert aus Kern Salz extrahierbar (SE) oder Nukleosom angereicherte (NE) Kernfraktionen von HeLa-S3 - Zelllinien stabil. exprimierenden Flag-HA-MyoD (MyoD-Komplex) eind Kontrollzelllinie (Mock). MW, Molekulargewichtsmarker in Kilo-Dalton (kDa). Der Pfeil zeigt die Flag-HA-MyoD (eMyoD). Diese Forschung wurde ursprünglich in 37 veröffentlicht. Urheberrecht Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Die Gassen mit mock purifications und eMyoD Komplex aus SE Kernfraktionen isoliert werden jetzt gezeigt: Diese Zahl wurde von 26 geändert. (B) Doppel affinitätsgereinigtem eMyoD Komplexen wie in (A) wurden auf Glycerin - Gradienten fraktioniert im Bereich von 20% bis 41%. Die Fraktionen wurden manuell gesammelt, konzentriert und durch Western-Blot (WB) unter Verwendung von Anti-Flag-Antikörper untersucht. Beachten Sie die Anwesenheit von mehreren eMyoD haltigen Unterkomplexe in Kernsalz extrahierbar (SE) Fraktion. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung . 2: Vergleich von Chromatin-gebundenen (Nukleosomen angereichert, NE) im Vergleich zu Kern Lösliche (Kernsalz herausziehbaren, SE) MyoD Partner Top: Venn - Diagramm zeigt Überlappung zwischen eMyoD - Inter aus Kernsalz extrahierbar (SE) und Nukleosomen angereicherte isoliert ( NE) Fraktion. Die ribosomale Proteine, Translation-Initiationsfaktoren, DNA - Reparatur - Faktoren und die Tubulin - Isoformen wurden von der Analyse ausgeschlossen , da sie in verschiedenen Datensätzen von TAP und gilt als nicht-spezifische Bottom erhalten vorhanden sind. Die MyoD - Inter gefunden sowohl in der SE und NE-Fraktionen (common) oder spezifisch für eine der Fraktionen (unique) wurden in Gruppen unterteilt auf der Grundlage ihrer funktionellen Annotationen. Zytoskelett bezogene und andere verschiedene Proteine sind nicht dargestellt. Die unterstrichenen Proteine sind MyoD-Inter validiert entweder in HeLa und / oder in myoblasts durch Coimmunpräzipitation. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Validierung ausgewählter Satz von MyoD Interacter (A) Validierung von MyoD - Inter, durch Massenspektrometrie identifiziert, in HeLa-S3 - Zelllinie stabil exprimieren Flag-HA-MyoD (eMyoD) Linker Bereich:. Western - Blot - Analyse von Doppel Affinität -purified MyoD Komplexe isoliert aus Kernsalz extrahierbar (SE) oder Nukleosomen angereicherte (NE) Fraktionen von HeLa-S3-Zelllinie exprimieren stabil eMyoD oder Kontrollzelllinie (Mock) mit den angegebenen Antikörpern. MW, Molekulargewichtsmarker Rechts:. Western - Blot - Analyse von Doppel affinitätsgereinigtem MyoD Komplexe isoliert aus Kern Nukleosomen-angereicherten Fraktionen von HeLa-S3 - Zelllinie släufig exprimierenden eMyoD oder Kontrollzelllinie (Mock) mit angegebenen Antikörpern. Diese Platte wurde ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesky A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. Aug 2008 29; 283 (35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Juli 2. Urheberrecht Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Diese Zahl wurde von 26 geändert: Polizei Art und Größe geändert wurde und der Text wurde die Kennzeichnung in der Figur zu vereinen gedreht. MyoD wurde als eMyoD markiert, um die Verwechslung mit endogenen IP in den anderen Panels vorgestellt zu vermeiden. (BD) Validierung von MyoD - Inter in C2C12 Maus Myoblasten. (B) Kerngesamtextrakte aus wuchernden C2C12 Myoblasten wurden für die Immunpräzipitation (IP) mit Antikörpern gegen BAF47 (SNF5) oder MyoD angehoben verwendet wird , oder mit Kontroll - IgG. Die resultierenden Niederschläge wurden durch WB wit analysierth die angegebenen Antikörper. Für Anti-MyoD Antikörper länger (lange expo.) Und kürzere (kurze expo.) Belichtungszeiten gezeigt. Eingangs Extrakte wurden geladen endogene Protein-Spiegel zu zeigen. Diese Platte wurde in 28 unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) veröffentlicht. Diese Zahl wurde von 28 geändert: Polizei Art und Größe geändert wurde und der Test wurde die Kennzeichnung in der Figur zu vereinen gedreht. (C) Kerngesamtextrakte aus proliferierenden Myoblasten C2C12 wurden für die Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen MyoD, Suv39h1 (positive Kontrolle) erhöht verwendet werden, oder Kontroll - IgG (negative Kontrolle). Die resultierenden Niederschläge wurden dann mit den angegebenen Antikörpern gegen WB unterzogen. Diese Platte wurde ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesky A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. Aug 2008 29; 283(35): 23.692 bis 700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 Juli 2. Urheberrecht Die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Diese Zahl wurde von 26 geändert: Polizei Art und Größe geändert wurde und der Text wurde die Kennzeichnung in der Figur zu vereinen gedreht. (D) Kerngesamtextrakte aus wuchernden (prolif.) Und differenzierenden C2C12 Myoblasten (48 h, wie Diff angegeben.) Wurden für die Immunpräzipitation (IP) verwendet , mit Antikörpern , die gegen MyoD und Myf5 oder mit normalem Kaninchen - IgG und mit leeren Perlen als Negativkontrolle. Die resultierenden Niederschläge wurden durch WB mit den angegebenen Antikörpern analysiert. Eingangs Extrakte wurden geladen endogene Protein-Spiegel zu zeigen. Diese Platte wurde in 27 unter der Creative Commons Namensnennung (CC BY) Lizenz (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) veröffentlicht. Diese Zahl wurde von 27 geändert: Polizei Art und Größe geändert wurde und der Text wurde die Kennzeichnung innerhalb der f zu vereinigen gedrehtild. Die Platten mit den erzielten Ergebnissen aus wuchernden und Differenzierung C2C12 in zwei getrennt werden als auf die ursprüngliche Figur entgegen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1:. Liste der Proteine identifiziert durch MS - Analyse in Doppelaffinitätsgereinigtes eMyoD Komplexe isoliert von Kernsalz extrahierbare Fraktion nach der Subtraktion der Hintergrund - Proteine (identifizierten Proteine von MS in Eluaten von Kontrollzelllinie wurden als nicht-spezifischen Hintergrund betrachtet .) die Daten , die die Summe von vier unabhängigen purifications. vertreten Bitte klicken Sie hier , um diese Datei.
Tabelle 2: Liste der Proteine Identified durch MS - Analyse in Doppelaffinitätsgereinigtes eMyoD Komplexe isoliert von Nukleosomen angereicherte Fraktion nach der Subtraktion der Hintergrund - Proteine dar . Die Daten stellen die Summe von drei unabhängigen purifications. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Tabelle 3. Pufferzusammensetzungen. Bitte klicken Sie hier um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Das vorgestellte Verfahren erlaubt eine erschöpfende Identifizierung von Partnern eines Transkriptionsfaktors, MyoD. Es zeigte sich MyoD Partner in einem heterologen System resistent gegen MyoD-induzierte Differenzierung, nämlich HeLa-S3-Zellen. Somit definitions identifiziert MyoD Partner ubiquitär exprimiert. Diese umfassen allgemein und sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren, Chromatin-modifizierende Enzyme, RNA - Prozessierung Proteine, Kinasen (Tabellen 1 und 2). Da HeLa-S3-Zellen resistent gegen MyoD-induzierte Transdifferenzierung sind, ist MyoD Aktivität hauptsächlich repressiven und die identifizierten Partner sind wahrscheinlich MyoD Corepressoren zu sein. Dies wird durch die Anwesenheit von Id - Proteine (Tabellen 1 und 2, Figur 2) markiert ist , bekannt MyoD Transaktivierungsfähigkeit 8 inhibieren. Wichtig entspricht, wie repressive Zustand in den MyoD Status Myoblasten in wuchernden. Tatsächlich konnten wir bestätigen, dass die MyoD Wechselwirkungen mit CBFβ, einer MyoDPartner durch das beschriebene Verfahren identifiziert werden , können in proliferierenden Myoblasten C2C12 detektiert werden, aber verloren , wenn die Zellen die Differenzierung unterzogen (siehe Figur 3D). Dennoch ist es wichtig zu beachten, dass eine der Haupteinschränkungen der dargestellten Methodik der Mangel an MyoD Coaktivatoren Identifikation ist. Konsistent identifiziert Acetyltransferasen 32 mit dieser Methode keine der bekannten MyoD Co-Aktivatoren, wie Histon wurden.
Reinigung von MyoD Komplexe entweder aus der löslichen Fraktion (nuclear Salz extrahierbar, SE) des Kerns oder des Chromatins angereicherte Fraktion (Nukleosom angereichert, NE) (1A) dient mindestens zwei Hauptfunktionen. Zum einen erhöht sich solche Fraktionierung die Darstellung der nichtstöchiometrischen Partner, die maskiert werden würde, wenn MyoD Reinigung aus dem gesamten Kernextrakten durchgeführt. Zweitens erlaubt dies die Trennung von zwei funktionelle Subpopulationen von MyoD: pre dampften / evicted (SE) und Chromatin-gebunden (NE). Unter Interaktionspartner spezifisch für DNA-ungebundenen MyoD, viele Kinasen, Transkriptionsfaktoren, Proteine Handel sowie einige Chromatin remodelers wurden identifiziert (Abbildung 2). Wenn vollständig validiert, ein solches Netzwerk kann einen Einblick in die Art der Aktivität Regulation der DNA-ungebundenen MyoD bereitzustellen. Weitere Suche nach MyoD post-translationale Modifikationen in diesen beiden Kernfächer durch Massenspektrometrie könnten weitere MyoD Aktivitätsregulation entwirren. Schließlich Fraktionierung von löslichen und Chromatin-gebundenen MyoD Komplexe auf einem Glycerin - Gradienten ergab , dass während der Chromatin-gebundenen MyoD hauptsächlich in einem Komplex, DNA-ungebundenen MyoD verteilt ist in drei Teilkomplexe (1B) enthalten ist. Die Charakterisierung dieser Unter Komplexe entweder durch MS und / oder Western-Blot gegen Protein Kandidaten sollten die Art der MyoD Regelung erläutern weiter.
Wie oben betont, nicht HeLa-Zellen nicht natürlich EXPREss der Muskel-Transkriptionsfaktor MyoD. Es war daher wichtig , die gefundenen Wechselwirkungen in einem Skelettmuskel Modells (Figur 3) zu bestätigen. Viele Berichte in relevanten Modellen bestätigt solche funktionelle Wechselwirkungen zwischen MyoD und einige der in der dargestellten TAP-Tag-Test identifiziert Partner. Dies ist zum Beispiel der Fall für prohibitin 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26 und SWI / SNF Chromatin-Remodeling - Komplex 36,28,30.
Man beachte, dass es möglich ist, solche TAP-tag Reinigung von niedrigen Menge an Zellen durchzuführen, beispielsweise von Myoblasten, wenn auf sensible MS kombiniert. Tatsächlich ist ein kürzlich erschienenen Arbeit beschrieben MyoD Partner Charakterisierung nach induzierbare Expression von Flag-markierten MyoD in Myoblasten 30. Da stabile und kontinuierliche in Myoblasten MyoD Überexpression schädlich ist, ein alternativer Ansatz wäre es , die Flag-HA - Tags in das endogene Allel MyoD Zugabe (n) in Myoblastenunter Verwendung von Genom-Bearbeitung Methoden, wie CRISPR-Cas9 31. Bemerkenswert ist die Zugabe von dem Tag (e) könnte möglicherweise Proteinfunktion und / oder Verbindung mit Bindungspartnern zu ändern, damit die Stelle des Tags (N- oder C-Terminus) sollte mit Vorsicht gewählt werden. Ein Funktionstest des Fusionsproteins in relevanten System muß vor TAP-tag Reinigung durchgeführt werden, das markierte Protein ist funktionell zu gewährleisten. Immunpräzipitation von endogenen Proteinen vermeidet diese Probleme, aber es beruht auf der Verfügbarkeit eines spezifischen und hochaffinen Antikörpers, die nur selten zur Verfügung steht.
Ein weiterer Mehrwert der beschriebenen Vorgehensweise ist die Möglichkeit zur Identifizierung post-translationale Modifikationen (PTM) des gereinigten Protein selbst und seiner reichlich vorhandenen Partnern. Dadurch mit dieser Funktion ist die TAP-Tag Reinigung eignet sich nicht nur neue Interaktionspartner zu identifizieren, sondern auch neu auf dem Protein verbunden enzymatischen Funktionen von Interesse und / oder seine Partner. Imder Fall eines Chromatin-bindendes Protein (dh., Transkriptionsfaktoren, Enzyme), wird dieses Verfahren somit zur Identifizierung der zugeordneten "Histon - Code" angepasst. Tatsächlich sind die aminoterminalen Histonschwänze, die auf der Nukleosomen-Oberfläche ausgesetzt sind, unterliegen mehrere kovalente PTM. Histone PTM verleihen eine einzigartige Signatur für die beteiligten Nukleosomen. Eine Kombination verschiedener Modifikationen an Histon-N-terminalen Enden können somit die Chromatinstruktur verändern, um Genregulation ermöglichen. Somit charakterisierenden solche Modifikationen ein gegebenes Protein assoziiert Erkenntnisse 22 in die Rollen und Wirkmechanismen der untersuchten Chromatin-Bindungsproteine bieten könnte.
Zusammenfassend ermöglicht die vorgestellte Methodik umfassende Identifizierung von MyoD Partnern. Die TAP-Tag Reinigung bietet eine Alternative zu anderen Ansätzen wie GST-Pull-Downs, Hefe-Zwei-Hybrid-Assays und Phagen-Display. Auch wenn aus praktischen Gründen (production der großen Menge von Kernextrakten) müssen wir eine heterologe Zellsystem verwenden wir in der Lage gewesen, die Beteiligung der identifizierten MyoD Partner in der Skelettmuskeldifferenzierung zu bestätigen. Die erhaltenen Daten zeigen, dass die MyoD myogenen Faktor scheint mit einer Vielzahl von Proteinen zu interagieren, die von Transkriptionsregulatoren zur RNA-Bindungsproteine, was auf die unterschiedlichen Mechanismen der Aktivität eines Transkriptionsfaktors reguliert wird.
Abschließend könnte die gleiche methodische Ansatz verwendet werden ubiquitär exprimiert Partner zahlreicher Kernfaktoren zu identifizieren, die schwierig sein könnte, in ihren spezifischen zellulären Kontext zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer: Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12% gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4x loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10x reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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