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Biology

Myod Interactome की पहचान संगठनों ने मिलकर आत्मीयता शुद्धि का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित

Published: May 17, 2016 doi: 10.3791/53924
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

Abstract

कंकाल की मांसपेशी टर्मिनल भेदभाव myoblasts को pluripotent mesodermal अग्रदूत कोशिकाओं की प्रतिबद्धता के साथ शुरू होता है। इन कोशिकाओं को अभी भी पैदा करने की क्षमता है या वे multinucleated myotubes है, जो आगे पकना myofibers के लिए फार्म में अंतर और फ्यूज कर सकते हैं। कंकाल की मांसपेशी टर्मिनल भेदभाव विभिन्न प्रतिलेखन कारक के समन्वित कार्रवाई के द्वारा करवाया जाता है, विशेष रूप से बलवान नियामक कारकों या MRFs के सदस्यों (Myod, Myogenin, Myf5, और MRF4), भी myogenic bHLH प्रतिलेखन कारक के परिवार को बुलाया। इन कारकों में विस्तृत विनियामक नेटवर्क के भीतर क्रोमेटिन-remodeling परिसरों के साथ सहयोग कंकाल myogenesis प्राप्त करने के लिए। इस में, Myod मास्टर पेशी टर्मिनल भेदभाव ट्रिगर में myogenic प्रतिलेखन कारक माना जाता है। यह धारणा Myod की क्षमता कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में गैर मांसपेशियों की कोशिकाओं में परिवर्तित करने से मजबूत है। यहाँ हम Myod की पहचान करने के लिए इस्तेमाल एक दृष्टिकोण का वर्णनक्रम में विभिन्न कंकाल की मांसपेशी टर्मिनल भेदभाव में शामिल घटकों को स्पष्ट करने के लिए एक व्यापक तरीके से प्रोटीन भागीदारों। लंबी अवधि के उद्देश्य epigenetic कंकाल की मांसपेशी जीनों के विनियमन, अर्थात्।, Myod लक्ष्यों में शामिल तंत्र को समझने की है। Myod भागीदारों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) लक्षण वर्णन करने के लिए मिलकर एक heterologous प्रणाली, कंकाल की मांसपेशी टर्मिनल भेदभाव के दौरान प्रासंगिक भागीदारों की भूमिका के सत्यापन के द्वारा पीछा से मिलकर आत्मीयता शुद्धि (नल-टैग) का उपयोग करके पहचाने जाते हैं। पेशी उत्थान में जन्मजात मायस्थेनिया, मायोटोनिक डिस्ट्रोफी, rhabdomyosarcoma और दोषों: myogenic कारकों, या उनके न्यायपालिका नियमन की न्यायपालिका रूपों, मांसपेशियों विकारों के एक नंबर के साथ जुड़े रहे हैं। जैसे, myogenic कारकों संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की एक पूल पेशी विकारों में, दोनों तंत्र है कि रोग ही है और पुनर्जन्म का तंत्र है कि बीमारी के इलाज में सुधार कर सकते हैं पैदा करने के संबंध में प्रदान करते हैं। इस प्रकार, विस्तृत understanintermolecular बातचीत और myogenic कारकों द्वारा नियंत्रित आनुवंशिक कार्यक्रमों की डिंग कुशल चिकित्सा के तर्कसंगत डिजाइन के लिए आवश्यक है।

Introduction

यूकेरियोटिक बहु-कोशिकीय जीवों विभिन्न अंगों और ऊतकों से बना रहे हैं। प्रत्येक कार्य ऊतक एक विशेष जीन पैटर्न अभिव्यक्ति है, जो प्रत्येक कदम पर भेदभाव चुना गया है है। सेलुलर भेदभाव जीनों का एक सेट में इस तरह के सेल प्रसार में शामिल लोगों के मुंह बंद विशिष्ट जीन की सक्रियता, उनकी अभिव्यक्ति के रखरखाव शामिल है और, आम तौर पर। कंकाल की मांसपेशी भेदभाव, या myogenesis, इस प्रकार एक बहु कदम प्रक्रिया है, कि myoblasts में mesodermal स्टेम कोशिकाओं का दृढ़ संकल्प के साथ शुरू होता है, और फिर पहली मोनो केन्द्रक, और फिर बहु ​​nucleated, myotubes में इन myoblasts के टर्मिनल भेदभाव की ओर जाता है । इस प्रकार, myoblasts "निर्धारित" कर रहे हैं कोशिकाओं, कि अभी भी पैदा करने में सक्षम हैं, लेकिन वे कंकाल की मांसपेशी वंश के लिए प्रतिबद्ध हैं, और इस तरह या तो भ्रूण के विकास के दौरान या वयस्क मांसपेशियों उत्थान में कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं में पूरी तरह से अलग कर सकते हैं। कंकाल की मांसपेशी टर्मिनल की प्रक्रिया भिन्नentiation एक विशिष्ट आनुवंशिक प्रोग्राम है कि myoblast अग्रदूत साबित कोशिकाओं की कोशिका चक्र है कि इस तरह के E2F लक्ष्य जीन 1 के रूप में प्रसार जुड़े जीन की एक निश्चित मुंह बंद करने के लिए सुराग से स्थायी रूप से बाहर निकलने के साथ शुरू होता है द्वारा करवाया जाता है। दरअसल, टर्मिनल भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान, myoblast प्रसार गिरफ्तारी एक महत्वपूर्ण कदम है कि कंकाल की मांसपेशी विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति और myotubes 2 में myoblasts के विलय पछाड़ दिया है। इस तरह के एक कार्यक्रम के उत्थान की प्रक्रिया कंकाल की मांसपेशी की चोट के बाद के दौरान अंतर करने के लिए वयस्क मांसपेशियों स्टेम सेल, उपग्रह कोशिकाओं को भी कहा जाता है, परमिट।

स्तनधारी myogenesis गंभीर रूप से myogenic बुनियादी हेलिक्स पाश-हेलिक्स के एक परिवार पर निर्भर है (bHLH) प्रतिलेखन Myod, Myf5, MRF4 और Myogenin, अक्सर कंकाल की मांसपेशी दृढ़ संकल्प कारकों या MRFs (मांसपेशी विनियामक कारकों) 3 के परिवार के रूप में भेजा कारकों। उनमें से प्रत्येक विनिर्देश और अलग में एक आवश्यक भूमिका निभाताकंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं के ferentiation और एक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न 4 5-7 है। Myf5 और Myod की सक्रियता के निर्धारक कदम है कि myogenic वंश के लिए कोशिकाओं को प्रतिबद्ध गठन किया है, और Myogenin के बाद अभिव्यक्ति ऐसे MCK (मांसपेशियों creatine kinase) के रूप में कंकाल की मांसपेशी विशिष्ट जीन, की सक्रियता के साथ myogenesis हो सके। Myogenic bHLH प्रतिलेखन कारक पहले से चुप लोकी 8 से पेशी जीनों की सक्रियता के MEF2 में परिवार के सदस्यों के साथ सहयोग करते हैं। उन्होंने यह भी सर्वव्यापी bHLH प्रोटीन, E12 और E47, ई प्रोटीन के रूप में जाना जाता है, जो विभिन्न जीन विनियामक क्षेत्रों 8 में तथाकथित ई-बक्से बाँध के साथ heterodimers के रूप में कंकाल की मांसपेशी जीन प्रतिलेखन को प्रोत्साहित। ट्विस्ट, ईद (भेदभाव के अवरोध) और अन्य कारकों को नकारात्मक रूप से इस प्रक्रिया को विनियमित करने, ई बाध्यकारी 8 प्रोटीन के लिए Myod के साथ प्रतिस्पर्धा द्वारा।

Myod पेशी टर्मिनल भेदभाव 9 ट्रिगर में प्रमुख खिलाड़ी के रूप में माना जाता है 10-13 में इस कार्यक्रम के लिए प्रेरित करने की क्षमता है। दरअसल, Myod के लिए मजबूर अभिव्यक्ति विभिन्न सेलुलर प्रकार भी एक और embryologic उत्पत्ति 12 से निकाली गई उन के पार भेदभाव लाती है। उदाहरण के लिए, Myod मांसपेशी कोशिकाओं की तरह में hepatocytes, fibroblasts, melanocytes, neuroblasts, और adipocytes बदल सकते हैं। Myod के पार differentiative कार्रवाई एक गैर पहलवान वातावरण में myogenic आनुवंशिक कार्यक्रम का एक असामान्य सक्रियण (विशेष रूप से अपने लक्ष्य जीन), मूल आनुवंशिक प्रोग्राम (विशेष रूप से, प्रसार जीन) का मुंह बंद करने के लिए सहवर्ती शामिल है।

Myoblasts proliferating में, Myod व्यक्त की, लेकिन तब भी जब यह उनके प्रमोटरों 14-16 को बांधता अपने लक्ष्य जीन को सक्रिय करने में असमर्थ है। इसलिए, आवश्यकता के लिए Myod लगातार undifferentiated myoblasts में व्यक्त किया जा करने के लिए काफी ELU रहता हैनिर्णायक। Myod क्रोमेटिन remodeling सक्रिय एंजाइमों 14,17 के लदान से पहले myoblasts proliferating में दमनकारी क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों की भर्ती के कारण अपने लक्ष्य जीन दबाने सकता है। उदाहरण के लिए, myoblasts proliferating में, Myod ट्रांसक्रिप्शनल सह repressor सिर-1, हिस्टोन deacetylases (HDACs) और दमनकारी लाइसिन Methyltransferases (KMTs), हिस्टोन H3 लाइसिन 9 या H3K9 और H3K27 KMTs सहित के साथ जुड़ा हुआ है, और सक्रिय रूप से अपने लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति को दबाने एक स्थानीय रूप से दमनकारी क्रोमेटिन संरचना 14,17 स्थापित करके। महत्वपूर्ण बात है, हाल ही में एक रिपोर्ट में संकेत दिया है कि Myod ही सीधे H3K9 KMT G9A अपनी transactivating गतिविधि 16 के निषेध में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा methylated है।

epigenetic Myod द्वारा गैर मांसपेशियों की कोशिकाओं के इस पार भेदभाव में शामिल तंत्र काफी हद तक अनजान रहे हैं। विशेष रूप से, कुछ सेल लाइनों Myod प्रेरित ट्रांस-भेदभाव के लिए प्रतिरोधी रहे हैं। इस प्रकार, हेला कोशिकाओं में, Myod है या तो निष्क्रिय यायहां तक कि क्रोमेटिन जटिल श्रृंगार / एसएनएफ 18 remodeling के BAF60C सबयूनिट की अभिव्यक्ति की कमी के कारण repressor बजाय प्रतिलेखन के उत्प्रेरक के रूप में कार्य कर सकता है। यह मॉडल इस प्रकार बेहतर Myod प्रेरित जीन दमन के तंत्र को चिह्नित करने के लिए पसंद का हो सकता है। यह भी उसके संबंधित भागीदारों के साथ अपने लक्ष्य loci में दमनकारी क्रोमेटिन पर्यावरण के लिए प्रेरित करने और इसलिए myoblasts proliferating ठीक धुन करने के लिए टर्मिनल भेदभाव में Myod निर्भर दमनकारी तंत्र को उजागर Myod की क्षमता की परख के लिए उपयुक्त है।

यहाँ हम मिलकर आत्मीयता शुद्धि (नल-टैग) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) लक्षण वर्णन करने के लिए मिलकर उपयोग करके Myod भागीदारों की पहचान के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन। हेला-S3 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त करें-हा-Myod के उपयोग fractionated परमाणु अर्क से Myod परिसरों को शुद्ध करने के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने की अनुमति दी। heterologous प्रणाली में Myod भागीदारों की पहचान validati द्वारा पीछा किया गया थाएक प्रासंगिक प्रणाली में।

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Protocol

1. हेला-S3 परमाणु साल्ट-निष्कर्षण और chromatin बाध्य भागों की तैयारी

  1. कोशिकाओं के संग्रह
    1. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (विकास के साथ पूरक में हेला-S3 ध्वज-हा-Myod और हेला-S3 ध्वज-हा (नियंत्रण सेल लाइन) बढ़ो एक नम इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम) और 5% सीओ 2।
      नोट: हेला-S3 कोशिकाओं स्थिरतापूर्वक व्यक्त करें-हा-Myod और हेला-S3 खाली वेक्टर (हेला-S3 ध्वज-हा) के साथ transduced कोशिकाओं या तो में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर स्थापित किया जा सकता है: 19,20, या लेखकों द्वारा प्रदान की।
    2. प्रत्येक कोशिका लाइन (हेला-S3 ध्वज-हा-Myod और हेला-S3 ध्वज-हा कोशिकाओं) का 10 पूरी तरह से मिला हुआ 150 मिमी बर्तन करने के लिए कोशिकाओं को बढ़ाना।
    3. सतह पर तैरनेवाला (शामिल गैर पक्षपाती उप-जनसंख्या) 5 एल स्पिनर में ले लीजिए।
    4. 150 मिमी पकवान प्रति पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ पक्षपाती उप-जनसंख्या धो लें, कमरे मंदिर में 1 मिनट के लिए कोशिकाओं trypsinizeperature (0.05% trypsin EDTA समाधान, एक 15 सेमी पकवान के लिए 2 मिलीलीटर)।
    5. 150 मिमी पकवान प्रति मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़ें और 50 मिलीलीटर ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा।
    6. , कदम 1.1.3 (5 एल स्पिनर में) और कदम 1.1.5 से कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला गठबंधन प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए नए सिरे से पूर्व गर्म मध्यम विकास की 500 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. 5 एल स्पिनर में सेल निलंबन स्थानांतरण और एक नम इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कम से कम 60 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित।
    8. ताजा मध्यम विकास की 500 मिलीलीटर जोड़ें और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित।
    9. ताजा मध्यम विकास के 1 एल जोड़े और 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित।
    10. कोशिकाओं की गिनती और सेल व्यवहार्यता की जांच करने के लिए सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर बाहर ले जाओ। रंग 30 hemocytometer का उपयोग खुर्दबीन के नीचे गिनती जिंदा (नीला नहीं) कोशिकाओं 0.4% trypan नीले रंग की μl और साथ सेल निलंबन के 30 μl।
    11. ; दैनिक ताजा मध्यम विकास जोड़कर 6 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल - 2 पर सेल घनत्व रखें 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल से अधिक नहीं है। अधिकतमएक 5 एल स्पिनर के लिए मात्रा 2.5 एल है
      नोट: निम्न चरणों के लिए, 2 के बैच से आगे बढ़ना - एक घनत्व 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर संस्कृति के 2.5 एल। दोहराएँ कदम 1.1.12 - 1.1.14 के बारे में 20 एल इकट्ठा करने के लिए (सूखा गोली के ≈ 20 ग्राम) प्रत्येक कोशिका लाइन के अगले चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर और सतह पर तैरनेवाला त्यागें 5 मिनट के लिए 500 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर pipetting और सेंट्रीफ्यूज से ठंडा पीबीएस की 100 मिलीलीटर में Resuspend गोली कोशिकाओं को धोने के लिए।
    14. , ठंडा पीबीएस के 25 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspending 50 मिलीलीटर ट्यूब में निलंबन के हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 XG पर centrifuging द्वारा धोने दोहराएँ।
      नोट: सेल छर्रों या तो तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हैं और कई दिनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत।
  2. नाभिक का अलगाव
    नोट: कदम 1.2.1 प्रदर्शन - ठंडे कमरे में 1.4.3।
    1. पूर्व ठंड buffeरुपये और homogenizers।
    2. जमे हुए माल का उपयोग करते हैं, तो जल्दी से 37 डिग्री सेल्सियस पर नहाने के पानी में सेल छर्रों पिघलना।
    3. Resuspend 20 ग्राम 20 मिलीलीटर में कोशिकाओं की (≈ 20 मिलीलीटर) पहली बार में बफर के 10 मिलीलीटर का उपयोग करते हुए, तो 5 मिलीलीटर जोड़ने, तो जोड़कर (एक मात्रा सेल गोली के आकार के बराबर) hypotonic बफर (तालिका 3) के एक और 5 मिलीलीटर। कोशिकाओं की अधिकतम पाने के लिए ताजा बफर के साथ अच्छी तरह से pipettes धो लें।
    4. एक चुस्त मूसल के साथ पूर्व ठंडा homogenizer में स्थानांतरण 40 मिलीलीटर सेल निलंबन।
    5. एक homogenizer में 20 स्ट्रोक (और बाहर आंदोलनों 20) के साथ कोशिकाओं Homogenize और 50 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन हस्तांतरण।
    6. कोशिकाओं की अधिकतम ठीक करने के लिए सुक्रोज बफर (प्रारंभिक सेल की मात्रा का 1/3, 3 टेबल) के 7 मिलीलीटर के साथ homogenizer धो लें। इस निलंबन नाभिक के संरक्षण और रिसाव को सीमित करने का कदम 1.2.5 से 50 मिलीलीटर ट्यूब में जल्दी से स्थानांतरण।
    7. 0.4% टीआर के 30 μl के साथ एक 30 μl विभाज्य दागनीले ypan, खुर्दबीन के नीचे का विश्लेषण (यदि सेल सफल होता है, सभी नाभिक नीला होना चाहिए) सेल दक्षता नियंत्रित करने के लिए। यदि आवश्यक हो, homogenization कदम दोहराएँ।
    8. 10,000 XG पर 7 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र नाभिक गोली। cytoplasmic अंश के रूप में सतह पर तैरनेवाला बचाओ।
  3. परमाणु साल्ट-निष्कर्षण (एसई) अंश की तैयारी
    1. सुक्रोज बफर (एक मात्रा नाभिक गोली के आकार के बराबर) के 8 मिलीलीटर में नाभिक गोली Resuspend। ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़े जबकि एक भंवर उच्च नमक बफर (1 नाभिक गोली मात्रा तालिका 3) के 8 मिलीलीटर पर अच्छी तरह से मिश्रण 300 मिमी NaCl के अंतिम एकाग्रता पाने के लिए। बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और हर 5 मिनट मिश्रण।
    2. सुक्रोज बफर के 8 मिलीलीटर (कुल मात्रा का 1/3) जोड़कर 150 मिमी NaCl एकाग्रता में कमी। 13,000 XG पर 10 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला (परमाणु नमक-निष्कर्षण अंश, एसई) ले लीजिए।
      नोट: या तो 1.3.3 कदम या एसई छोड़ने के लिए आगे बढ़नाक्रोमेटिन बाध्य अंश और फिर अति सेंट्रीफ्यूज दोनों भागों को एक साथ की तैयारी के दौरान बर्फ पर अंश।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 85,000 XG पर 30 मिनट के लिए अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूज एसई। सतह पर तैरनेवाला (≈ 26 मिलीलीटर) ले लो।
    4. तरल नाइट्रोजन में 100 μl विभाज्य रुक। 2 "प्रोटीन जटिल शुद्धि" कदम करने, निकालने के बाकी का उपयोग कर आगे बढ़ें।
      नोट: विभाज्य कदम 5.1.1 के दौरान एक इनपुट नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है।
  4. Chromatin बाध्य अंश की तैयारी
    1. (एक मात्रा गोली के आकार के बराबर) सुक्रोज बफर के 7 मिलीलीटर में गोली Resuspend (कदम 1.3.5 से।) कुशलता।
    2. 2 CaCl 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता (निलंबन की 14 मिलीलीटर के लिए 0.5 एम 2 CaCl के 28 μl) में जोड़े MNase (कदम 1.4.4) को सक्रिय करने और मिश्रण करने के लिए।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए पूर्व गर्मी निलंबन।
    4. 0.5 से 0.0025 यू / μl (1/200 कमजोर पड़ने के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 70 μl micrococcal nuclease (MNase) जोड़ेंयू / μl शेयर) और मिश्रण।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर ठीक 12 मिनट सेते हैं। हर 4 मिनट मिक्स।
    6. बर्फ पर तुरंत प्रतिक्रिया जगह है।
    7. MNase गतिविधि को रोकने के लिए, 4 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.5 एम EDTA पीएच 8.0 (1/125 कमजोर पड़ने) के 112 μl जोड़ें। बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. Sonicate उच्च आयाम में 1 मिनट के लिए 5 बार, दो sonications के बीच 1 मिनट (कुल 10 मिनट) के एक ब्रेक अनुमति देते हैं।
    9. 85,000 XG पर 30 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ultracentrifuge।
    10. सतह पर तैरनेवाला (nucleosome समृद्ध अंश, पूर्वोत्तर, ≈ 12 एमएल) ले लीजिए।
    11. तरल नाइट्रोजन में 50 μl विभाज्य रुक। 2 "प्रोटीन जटिल शुद्धि" कदम करने, निकालने के बाकी का उपयोग कर आगे बढ़ें।
      नोट: विभाज्य कदम 5.1.1 के दौरान एक इनपुट नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है।

2. प्रोटीन परिसरों शोधन

नोट: प्रत्येक कोशिका लाइन (हेला-S3 ध्वज-हा-Myod और नियंत्रण, हेल से समानांतर अर्क में आगे बढ़ेंएक-S3 ध्वज-हा)।

  1. Flag- आधारित शुद्धीकरण
    1. पूर्व धोने करें राल। प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु (प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए एसई और पूर्वोत्तर भागों) के लिए (वाणिज्यिक 50% शेयर से) करें राल के 600 μl का प्रयोग करें।
    2. 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरण राल, 1000 XG पर 2 मिनट के लिए ठंडे TEGN (3 टेबल), सेंट्रीफ्यूज की 13 मिलीलीटर में resuspend और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 5 बार दोहराएँ। TEGN के बराबर मात्रा (प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए 300 μl) में पिछले धोने resuspend करें राल के बाद।
    3. प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए, धोया करें राल के 600 μl और इसी प्रोटीन के अर्क (12 मिलीलीटर पूर्वोत्तर के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में और 26 मिलीलीटर एसई भागों के लिए एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में, क्रमशः) मिश्रण। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया रातोंरात पर सेते हैं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, एक तरफ सतह पर तैरनेवाला डाल दिया है और शुद्धि दक्षता परीक्षण (2.2) का परिणाम जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।
    5. एसई के नमूने लिए, ध्वज राल resuspendएक 15 मिलीलीटर ट्यूब TEGN और हस्तांतरण के 4 मिलीलीटर में। इस चरण को दोहराएँ 3 बार, हर बार एक ही 15 मिलीलीटर ट्यूब को स्थानांतरित मोतियों को खोने से बचने के लिए। 1,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस और सतह पर तैरनेवाला हटाने पर अपकेंद्रित्र 2 मिनट।
    6. धो करें राल TEGN की 13 मिलीलीटर का उपयोग करते हुए और 1000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट centrifuging एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 7 बार।
    7. पिछले धोने, resuspend 1 मिलीलीटर TEGN में और एक 1.5 मिलीलीटर में हस्तांतरण के बाद कम-से बाध्यकारी ट्यूब। 1,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस और सतह पर तैरनेवाला हटाने पर अपकेंद्रित्र 2 मिनट।
    8. प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए 7.8 पीएच पर 4 मिलीग्राम / एमएल पर झंडा पेप्टाइड समाधान के 200 μl में Resuspend। माला और पेप्टाइड मिक्स। TEGN बफर के 200 μl जोड़ें और कम से कम 4 घंटा या बाध्य प्रोटीन elute करने के लिए रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और राल और सतह पर तैरनेवाला (ध्वज eluate) एक खाली स्पिन स्तंभ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में रखा के लिए स्थानांतरण।
    10. अपकेंद्रित्र स्तंभ, इकट्ठा बाएं से अधिक 2 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला। स्तंभ के लिए TEGN बफर जोड़कर करें राल लीजिए और प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (4 मिलीग्राम / एमएल) के ध्वज पेप्टाइड समाधान के 200 μl के साथ दूसरे ध्वज क्षालन करने के लिए आगे बढ़ें।
    11. दोहराएँ कदम 2.1.9 - 2.1.10 दूसरे क्षालन इकट्ठा करने के लिए। पहले और दूसरे eluates का मिश्रण।
  2. शोधन क्षमता का टेस्ट
    नोट: कदम 2.1.11 के दौरान - 2.1.12, प्रदर्शन एसडीएस पृष्ठ और चांदी धुंधला (2.2.1 - 2.2.2)।
    1. , Eluates के 15 μl लो 4x लोड हो रहा है बफर के 5 μl और 10x एजेंट को कम करने के 2 μl जोड़ने के लिए, 96 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फोड़ा और एक एसडीएस polyacrylamide 4 रन - निर्माता के निर्देशों के अनुसार 12% जेल।
    2. जेल चांदी धुंधला किट का उपयोग दाग (निर्माता के निर्देशों का पालन करें)। अगर वहाँ ध्वज-हा-Myod और फ्लैग-हा बीच प्रोटीन पैटर्न में स्पष्ट मतभेद नकली eluates, विशेष रूप से करें-हा Myod का बैंड (लगभग 50 केडीए, चित्रा 1 ए), अगले काएं के लिए आगे बढ़नापी।
  3. Hemagglutinin (हेक्टेयर) आधारित शुद्धीकरण
    1. 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित TEGN की 13 मिलीलीटर में resuspending और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 2 मिनट centrifuging द्वारा धो हा राल। दोहराएँ धोने कदम 5 बार। TEGN बफर के बराबर मात्रा में पिछले धोने resuspend मोती के बाद।
      नोट: मात्रा ध्वज आधारित शुद्धि की दक्षता के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए वाणिज्यिक 50% शेयर से 300 μl के साथ शुरू करो।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर कम बाध्यकारी ट्यूब में प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए हा राल स्थानांतरण। अपकेंद्रित्र 2 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर, धो बफर (3 टेबल) की अधिकतम खत्म करने और हा राल झंडा आधारित शुद्धि से eluates जोड़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन पहिया रातोंरात पर ट्यूबों सेते हैं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, एक तरफ रख दिया और सतह पर तैरनेवाला शुद्धि दक्षता परीक्षण का परिणाम जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना (2.3.12।)।
    5. फिर सेTEGN के 0.5 मिलीलीटर में हा राल निलंबित, एक नया कम 1.5 मिलीलीटर ट्यूब बाध्यकारी के लिए स्थानांतरण। एक बार में एक ही 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ने मेजबान दोहराएँ 1,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर माला और सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट के खोने से बचने के लिए। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
    6. , TEGN के 1 मिलीलीटर प्रत्येक समय का उपयोग कर 1,000 XG पर 2 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस centrifuging और हटाने सतह पर तैरनेवाला (खोने मोतियों से बचने) द्वारा मोती 8 बार धोएं। पिछले धोने के बाद, 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में मोती हस्तांतरण।
    7. जितना संभव हो उतना सतह पर तैरनेवाला निकालें। मोती बाध्य प्रोटीन elute करने पर पीएच 7.8 पर हा मुक्त पेप्टाइड समाधान (4 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μl जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में घूर्णन पहिया पर सेते हैं।
      नोट: हा-पेप्टाइड की राशि परिसरों की बहुतायत के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 XG पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और एक खाली स्पिन स्तंभ एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में रखा करने के लिए राल और सतह पर तैरनेवाला (हेक्टेयर eluate) हस्तांतरण।
    9. स्तंभ अपकेंद्रित्र 2 मिलीलीटर ट्यूब में छोड़ दिया सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने के लिए। प्रत्येक प्रयोगात्मक बिंदु के लिए हा पेप्टाइड के 100 μl (4 मिलीग्राम / एमएल) के साथ एक दूसरे क्षालन प्रदर्शन करना। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में घूर्णन पहिया पर सेते हैं। दोहराएँ कदम 2.3.8 - 2.3.9 दूसरे क्षालन इकट्ठा करने के लिए।
    10. पहले और दूसरे eluates का मिश्रण।
    11. एसडीएस पृष्ठ और चांदी धुंधला द्वारा टेस्ट शोधन क्षमता (कदम 2.2 देखें।) (चित्रा 1 ए)।
    12. एक 10 केडीए कट-ऑफ (नाममात्र आणविक वजन सीमा, NMWL) निर्माता के निर्देशों के अनुसार के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग कर 30 μl हा eluate ध्यान लगाओ।
    13. 22.5 (3/4) और 7.5 (1/4) μl: दो भागों में केंद्रित नमूने फूट डालो। स्नैप -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में नमूने के 1/4 फ्रीज। चरण 3 के लिए 3/4 भाग का उपयोग।
      नोट: 1/4 जमे हुए हिस्से पश्चिमी धब्बा द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है (5.1 कदम देखें)।

3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

नोट: निम्न चरणों का मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा है कि विश्लेषण प्रदर्शन करेंगे साथ चर्चा की जानी चाहिए।

  1. 4x लोड हो रहा है बफर के 7.5 μl और 10x एजेंट को कम करने की 3.3 μl के साथ नमूनों की 3/4 (22.5 μl) पूरक और 96 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबाल लें।
  2. 12% जेल - एक एसडीएस polyacrylamide 4 पर लोड नमूने हैं। 150 वी 5 के लिए निरंतर मिनट पर चलाने के लिए जेल सभी प्रोटीन जुदाई के बिना जेल में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए।
  3. पानी के साथ जेल धो; 20 के लिए ठीक - लगानेवाला समाधान (10% एसिटिक एसिड, 50% मेथनॉल, 40% अल्ट्रा साफ पानी) के साथ 30 मिनट तो अल्ट्रा साफ पानी में तय जेल 5 बार धो लें।
  4. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में प्रोटीन, पानी के 1 मिलीलीटर में दुकान युक्त बैंड कट और मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए भेज देते हैं।

4. डेटा विश्लेषण

नोट: इस विश्लेषण के लिए एक सामान्य मार्गदर्शन है। सही कदम एमएस सुविधा द्वारा दिए गए डेटा की विशेष मोड पर निर्भर करेगाविश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है (जैसे, 21,22)।

  1. इसी नकारात्मक नियंत्रण तैयारी से प्राप्त सूची के साथ "Myod" eluates में पहचान प्रोटीन की सूची की तुलना करें। विश्लेषण से प्रोटीन दोनों सूचियों में पाया खाये।
  2. प्रोटीन है कि शेष सूची से पहचान पेप्टाइड्स के ≤2 कुल संख्या निकालें।
  3. पहुँच कार्यात्मक एनोटेशन और डेविड जैव सूचना विज्ञान संसाधनों का उपयोग कर प्रोटीन की सूची प्राप्त की कार्यात्मक वर्गीकरण (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) और प्रोटीन 23,24 की सूची में वर्गीकृत।
  4. (वैकल्पिक) सूची "सहयात्रियों", मजबूत आकस्मिक करने के आरोप लगाए गैर परमाणु प्रोटीन बाध्यकारी नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए 25 से निकालें। ये cytoskeletal, cytoplasmic, mitochondrial झिल्ली और रिसेप्टर प्रोटीन होते हैं (प्रोटीन तह, टेबल्स 1 में cytoskeleton और विविध समूह प्रोटीन और 2)। </ Li>
  5. एसई और पूर्वोत्तर भागों से Myod interactors की प्राप्त सूची की तुलना में आम प्रोटीन और प्रोटीन प्रत्येक अंश (चित्रा 2) के लिए विशिष्ट पहचान के लिए।

5. वेस्टर्न ब्लाट द्वारा की पहचान की interactors की पुष्टि

  1. हेला-S3 ध्वज-हा-Myod और हेला-S3 ध्वज-हा में पुष्टि
    1. पिघलना eluate नमूने बर्फ पर कदम 2.3.14 (7.5 μl) में प्राप्त की। TEGN बफर के 12 μl, 4x लोड हो रहा है बफर के 10 μl और एजेंट को कम करने 10x के 3 μl जोड़ें। 96 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबाल लें नमूने हैं।
    2. पश्चिमी सोख्ता के लिए इनपुट नमूने तैयार करें।
      1. कदम 1.3.9 और 1.4.11 से aliquots गला लें और बीसीए किट (निर्माता के निर्देशों का पालन करें) का उपयोग प्रोटीन एकाग्रता को मापने, उदाहरण के लिए।
      2. लेन प्रति प्रोटीन के 15 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें। निकालने की उचित मात्रा को मापने और TEGN बफर के साथ 15 μl के लिए नमूना की मात्रा समायोजित करें।
      3. 5 μl 4x लोड हो रहा है बफर जोड़ें और1.5 μl 10x एजेंट को कम करने। 96 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबाल लें नमूने हैं।
    3. ब्याज की एंटीबॉडी eluate नमूने के 15 μl का उपयोग कर (साथी उम्मीदवार एमएस विश्लेषण के दौरान पहचान के लिए विशिष्ट) के साथ एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करते हैं। अंतर्जात प्रोटीन का स्तर (चित्रा 3 ए) के एक नियंत्रण के रूप में इनपुट के अर्क का प्रयोग करें।
  2. प्रासंगिक सेलुलर प्रणाली में पुष्टि
    1. C2C12 माउस myoblasts की कुल परमाणु निकालने की तैयारी।
      1. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 DMEM मध्यम 15% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन में C2C12 माउस myoblasts आगे बढ़ें एक नम इनक्यूबेटर में। कभी 80% से अधिक सेल संगम proliferative राज्य में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए।
      2. immunoprecipitation के एक बिंदु (एक एंटीबॉडी) (आईपी) के लिए कम से कम दो 150 मिमी C2C12 के व्यंजन आगे बढ़ें। मध्यम Aspirate, पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
      3. कोशिकाओं परिमार्जन और 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा। Ce4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 250 XG पर ntrifuge। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      4. सेल गोली (= वी सेल) की मात्रा का अनुमान है। धीरे Hypotonic बफर बी के 3 संस्करणों वी सेल में गोली बाधित करने के लिए cytoplasmic झिल्ली (3 टेबल) resuspend।
      5. 10% की 0.44 एक्स वी सेल मात्रा में जोड़ें एनपी 40 1% की अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए (वी / वी)। धीरे ट्यूब कई बार मिश्रण करने के लिए पलटना।
      6. एसआर (3 टेबल) की 0.89 एक्स वी सेल की मात्रा नाभिक अखंडता की रक्षा करने के लिए जोड़ें। धीरे ट्यूब कई बार 2,000 XG पर 5 मिनट के लिए निलंबन, और सेंट्रीफ्यूज homogenize करने के नाभिक गोली पलटना।
      7. सतह पर तैरनेवाला (साइटोसोलिक अंश) निकालें। नाभिक गोली (= वी NUC) की मात्रा का अनुमान है। सुक्रोज बफर में से एक मात्रा वी NUC में Resuspend नाभिक गोली।
      8. ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़े जबकि उच्च नमक बफर के एक भंवर एक मात्रा वी NUC पर अच्छी तरह से मिश्रण 300 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता पाने के लिएसोडियम क्लोराइड, और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। हर 5 मिनट मिक्स।
      9. सुक्रोज बफर में से एक मात्रा वी NUC जोड़ें और 2 CaCl (अंतिम एकाग्रता 1 मिमी) (150 मिमी NaCl एकाग्रता में कमी करने के लिए)। मिक्स।
      10. पूर्व गर्मी निलंबन 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए, एकाग्रता 0.0025 यू / μl (0.5 यू / μl के स्टॉक से 1/200) के अंतिम पाने के लिए micrococcal nuclease जोड़ें। मिक्स।
      11. 37 डिग्री सेल्सियस पर ठीक 12 मिनट सेते हैं। हर 3 मिनट मिक्स।
      12. बर्फ पर तुरंत प्रतिक्रिया जगह और MNase गतिविधि को रोकने के लिए EDTA (अंतिम एकाग्रता 4 मिमी) जोड़ें। बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
      13. Sonicate उच्च आयाम पर 0.5 मिनट प्रत्येक के लिए 5 बार। दो sonications बीच, 0.5 मिनट (कुल 5 मिनट) के एक ब्रेक अनुमति देते हैं।
      14. 85,000 XG पर 30 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए अल्ट्रा सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला (कुल परमाणु निकालने) ले लीजिए।
      15. कुल परमाणु निकालने के प्रोटीन एकाग्रता उपाय बीसीए किट (निर्माता के निर्देशों का पालन करें) का उपयोग कर उदाहरण के लिए, और आगे बढ़ना immediatइली 5.2.2 कदम।
    2. Immunoprecipitation अंतर्जात Myod की (आईपी)।
      1. पूर्व स्पष्ट करने के अर्क, प्रत्येक आईपी बिंदु के लिए प्रोटीन जी agarose मोती के 10 μl धो लें।
        1. प्रोटीन जी agarose मोती की आवश्यक मात्रा 1,800 XG पर 2 मिनट के लिए ठंडे TEGN, सेंट्रीफ्यूज के 1.4 मिलीलीटर में एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब, resuspend में स्थानांतरण और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 3 बार दोहराएँ।
      2. कुल परमाणु निकालने की उचित मात्रा के साथ मिक्स पूर्व धोया प्रोटीन जी agarose मोती। आईपी ​​बिंदु प्रति कुल परमाणु निकालने प्रोटीन की 500 माइक्रोग्राम का प्रयोग करें।
      3. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया पर सेते अर्क पूर्व स्पष्ट है।
      4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1800 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला रखें।
      5. 500 माइक्रोग्राम प्रति 1.5 मिलीलीटर कम बाध्यकारी ट्यूबों में पूर्व मंजूरी दे दी कुल परमाणु निष्कर्षों के साथ Myod Ab के 5 माइक्रोग्राम या 5 माइक्रोग्राम खरगोश आईजीजी के मिश्रण। TEGN 1 मिलीलीटर तक बफर जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया पर सेते हैं।
        नोट: एफ प्रदर्शन करनाकदम 5.2.2.3 के दौरान कदम ollowing।
      6. पूर्व धोने 7.5 μl प्रोटीन ए / जी आईपी बिंदु प्रति शेयर मोती समाधान।
        1. मोतियों की आवश्यक मात्रा 1.5 मिलीग्राम ट्यूब में 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1800 XG पर TEGN और सेंट्रीफ्यूज के 1 मिलीलीटर में स्थानांतरण, resuspend मोती। सतह पर तैरनेवाला निकालें। 3 बार दोहराएँ।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर समाधान (3 टेबल) और एक घूर्णन पहिया पर सेते अवरुद्ध 1.5 मिलीलीटर में Resuspend प्रोटीन ए / जी मोती।
      8. अपकेंद्रित्र कुल परमाणु अर्क 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर ABS (कदम 5.2.2.5) के साथ incubated। सतह पर तैरनेवाला रखें।
      9. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1800 XG पर प्रोटीन ए / जी राल (कदम 5.2.2.7) अवरुद्ध। TEGN बफर के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend त्यागें। पुनः सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1800 XG पर बाहर धोने के लिए बफर अवरुद्ध।
      10. Resuspend अवरुद्ध प्रोटीन ए / जी राल TEGN बफर और नए कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूबों में विभाज्य के 1 मिलीलीटर में 7.5 μl blo प्राप्त करने के लिएआईपी ​​बिंदु प्रति cked प्रोटीन ए / जी राल। 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1800 XG पर अपकेंद्रित्र और जितना सतह पर तैरनेवाला के संभव के रूप में हटा दें।
      11. एबीएस के साथ incubated कुल परमाणु अर्क जोड़ें (या आईजीजी नियंत्रण) ए / जी राल के लिए। मिक्स और एक घूर्णन पहिया पर कमरे के तापमान (आरटी) में 2 घंटे के लिए सेते हैं।
      12. अपकेंद्रित्र निलंबन 2 मिनट के लिए आरटी पर 1,800 XG। नया कम बाध्यकारी ट्यूबों में धो बफर और हस्तांतरण निलंबन के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, resuspend त्यागें। 5 मिनट के लिए एक घूर्णन पहिया पर आरटी पर सेते हैं।
      13. धोने बफर के 1 मिलीलीटर में 2 मिनट के लिए आरटी पर 1,800 XG, resuspend पर अपकेंद्रित्र निलंबन और 5 मिनट के लिए एक घूर्णन पहिया पर आरटी पर सेते हैं। 4 बार दोहराएँ। एक नया कम बाध्यकारी ट्यूब के लिए पिछले धोने के हस्तांतरण के लिए।
      14. सतह पर तैरनेवाला की अधिकतम निकालें। , धो बफर के 7 μl, 4x लोड हो रहा है बफर के 7 μl और मोती के लिए एजेंट को कम करने 10x के 3 μl जोड़े मिश्रण और 96 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबाल लें।
      15. int के एंटीबॉडी के साथ एक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रदर्शनerest (प्रतिरक्षा के लिए साथी उम्मीदवार के लिए विशिष्ट उपजी प्रोटीन)। अंतर्जात प्रोटीन का स्तर (चित्रा 3 बी) के एक नियंत्रण के रूप में इनपुट के अर्क का 1% (5 माइक्रोग्राम) का प्रयोग करें।

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Representative Results

Myod गतिविधि के नियमन के समझने के लिए हमें Myod के एक डबल टैग किए गए प्रपत्र मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के बाद की immunopurification पर आधारित जैव रासायनिक शुद्धि का उपयोग कर Myod परिसरों की संपूर्ण लक्षण वर्णन चलाया। ध्वज-हा-टैग Myod और एक नियंत्रण सेल लाइन ध्वज-हा परमिट व्यक्त व्यक्त हेला-S3 सेल लाइन का उपयोग करें-हा-Myod की डबल आत्मीयता शुद्धि के प्रदर्शन से Myod जटिल शुद्ध करने के लिए पर्याप्त सामग्री पाने के लिए।

हम आगे cytoplasmic और परमाणु भागों में सेल के अर्क fractionated, तो परमाणु अंश fractionated नमक निकाले (परमाणु नमक-निष्कर्षण, एसई) और nucleosomes के लिए समृद्ध (nucleosome समृद्ध, पूर्वोत्तर) अंशों। इन अलग परमाणु भिन्न (चित्रा 1, टेबल्स 1 और 2) से नल-टैग शुद्धि भागीदारों के अपेक्षाकृत कम अब है कि unraveling की अनुमति दीजब एक विशिष्ट subnuclear डिब्बे में स्थानीय undance। इसके अलावा, इस तरह के एक रणनीति बनाम डीएनए बाध्य (पूर्वोत्तर) Myod अपार (एसई) के भागीदारों को उजागर करने Myod गतिविधि विनियमन पर अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

नल-टैग शुद्धि के लिए, ध्वज-हा मिलकर मिलान प्रणाली का इस्तेमाल किया गया था। छोटे हाइड्रोफिलिक करें और हा epitopes प्रोटीन समारोह के साथ कम से कम हस्तक्षेप है और एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत के लिए अत्यधिक सुलभ हैं। विरोधी झंडा और विरोधी हा राल आधारित अनुक्रमिक immunopurification प्रदर्शन किया गया था, ध्वज और हा पेप्टाइड का उपयोग कर immunopurified परिसरों की क्षालन द्वारा पीछा किया। eluted प्रोटीन तो एक एसडीएस पृष्ठ पर चलाए जा रहे थे सभी प्रोटीन जेल में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए। सभी शुद्ध प्रोटीन युक्त जेल के टुकड़े काट रहे थे; प्रोटीन, निकाले गए थे trypsin पचा और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा की पहचान की।

चित्रा 2 में दिखाया गया है, (चित्रा 2 और 3) 26-28। यह डीएनए बाध्य Myod भागीदारों और संभव सह-नियामकों कि एक दमनकारी-क्रोमेटिन माहौल स्थापित कर सकते हैं पर प्रकाश डालता है। उदाहरण के लिए, HP1 प्रोटीन है, जो वर्णित पद्धति द्वारा Myod भागीदार के रूप में पहचान की गई है, मिथाइल H3K9 बाध्य करने के लिए जीन दमन और हेट्रोक्रोमैटिन संरचना को बनाए रखने के लिए जाना जाता है। दरअसल, HP1 Myod ट्रांसक्रिप्शनल बिगड़ा Myod लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति और मांसपेशियों टर्मिनल भेदभाव 26 में जिसके परिणामस्वरूप गतिविधि को रोकता है।

इसके अलावा विभाजनएसई और पूर्वोत्तर ग्लिसरॉल ढाल पर Myod परिसरों (29 में वर्णित) दो subnuclear डिब्बों (चित्रा 1 बी) में Myod उप परिसरों का पर्दाफाश किया। विशेष रूप से, एसई Myod, तीन उप परिसरों में वितरित करते हुए क्रोमेटिन बाध्य Myod एक जटिल करने के लिए मुख्य रूप से संबंध रखता है।

नल-टैग / एमएस में से कुछ का पता चला interactors Myod परिसरों पर पश्चिमी धब्बा द्वारा पुष्टि की गई। ये प्रतिलेखन कारक CBF, ईबीबी, MTG8R और श्रृंगार / एसएनएफ सबयूनिट BAF47 (SNF5) (चित्रा 3 ए, बाएं) और HP1 प्रोटीन (CBX1 और CBX3) (चित्रा 3 ए, दाएं) शामिल हैं। महत्वपूर्ण बात है, के बाद से हेला कोशिकाओं की मांसपेशी कोशिकाओं नहीं हैं और Myod व्यक्त नहीं करते, यह आवश्यक myoblasts में नव पहचान interactors और Myod के बीच बातचीत (चित्रा 3 बी) इस बात की पुष्टि करने के लिए है। विशेष रूप से, इस तरह के सत्यापन के लिए, (एसई और पूर्वोत्तर पर जुदाई के बिना) कुल परमाणु अर्क आमतौर पर पर्याप्त है, जो कर रहे हैंज नमूना तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया myoblasts की राशि की कमी परमिट। 26,27 के रूप में इन विट्रो बातचीत assays, इन निष्कर्षों का मान्य करने के लिए मदद करते हैं। अंत में, मांसपेशियों की कोशिकाओं में इन मुलाकातों के कार्यात्मक अर्थ आगे 26-28 में के रूप में संबोधित किया जाना चाहिए।

साथ में ले ली, प्रस्तुत डाटा सर्वत्र व्यक्त Myod भागीदारों की एक वैश्विक दृष्टि दिखाने के लिए और अधिक प्रासंगिक पेशी मॉडल में जिस तरह से करने के लिए आगे कार्यात्मक अध्ययन प्रशस्त हुआ।

आकृति 1
चित्रा 1: Myod परिसर संगठनों ने मिलकर आत्मीयता शुद्धि द्वारा पृथक (ए) परमाणु नमक-निष्कर्षण (एसई) या nucleosome समृद्ध (पूर्वोत्तर) से अलग डबल आत्मीयता शुद्ध eMyoD परिसरों हेला-S3 सेल लाइनों स्थिरतापूर्वक के परमाणु भागों का एक चांदी धुंधला। व्यक्त करें-हा-Myod (Myod जटिल) एकडी नियंत्रण सेल लाइन (नकली)। मेगावाट किलो डाल्टन में आणविक वजन मार्कर (केडीए)। तीर ध्वज-हा-Myod (eMyoD) इंगित करता है। इस शोध मूल रूप से 37 में प्रकाशित हुआ था। जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए कॉपीराइट अमेरिकन सोसायटी। यह आंकड़ा 26 से संशोधित किया गया है: नकली शुद्धिकरण के साथ गलियों और eMyoD एसई परमाणु अंशों से अलग जटिल अब दिखाए जाते हैं। (बी) डबल आत्मीयता शुद्ध (ए) के रूप में eMyoD परिसरों ग्लिसरॉल 20% से 41% को लेकर ढाल पर fractionated थे। भिन्न मैन्युअल एकत्र केंद्रित है और पश्चिमी धब्बा (पश्चिम बंगाल) विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग करके विश्लेषण किया गया। की उपस्थिति नोट कई eMyoD युक्त परमाणु नमक-निष्कर्षण (एसई) अंश में उप परिसरों। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2 चित्रा 2:। के Chromatin बाध्य (nucleosome समृद्ध, NE) बनाम परमाणु घुलनशील (परमाणु नमक निष्कर्षण, एसई) Myod भागीदारों के तुलना शीर्ष: परमाणु नमक-निष्कर्षण (एसई) और nucleosome समृद्ध से अलग eMyoD interactors के बीच वेन आरेख दिखा ओवरलैप ( NE) अंश। Ribosomal प्रोटीन, अनुवाद-दीक्षा कारकों, डीएनए की मरम्मत कारकों और tubulin isoforms विश्लेषण से बाहर रखा गया था के रूप में वे विभिन्न विभिन्न डेटा सेट्स नल से प्राप्त और गैर विशिष्ट नीचे के रूप में माना जाता है में मौजूद हैं। दोनों एसई में पाया Myod interactors और पूर्वोत्तर भिन्न (सामान्य) या भिन्न (अद्वितीय) में से एक के लिए विशिष्ट उनके कार्यात्मक एनोटेशन के आधार पर समूहों में विभाजित किया गया। Cytoskeleton से संबंधित और अन्य विविध प्रोटीन दर्शाया नहीं कर रहे हैं। रेखांकित प्रोटीन Myod मान्य या तो हेला में और / या myoblas में interactors हैंसह immunoprecipitation द्वारा TS। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Myod interactors के चयनित सेट के मान्यकरण (ए) Myod interactors का सत्यापन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, हेला-S3 सेल लाइन में स्थिरतापूर्वक व्यक्त करें-हा-Myod (eMyoD) वाम पैनल द्वारा की पहचान:। डबल समानता के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण -purified Myod परिसरों परमाणु नमक-निष्कर्षण (एसई) या nucleosome समृद्ध (पूर्वोत्तर) हेला-S3 सेल लाइन के भागों स्थिरतापूर्वक eMyoD या नियंत्रण सेल लाइन (मॉक) ने संकेत दिया एंटीबॉडी के साथ व्यक्त करने से अलग किया। मेगावाट, आणविक वजन मार्कर सही पैनल:। हेला-S3 सेल लाइन एस के परमाणु nucleosome समृद्ध अंशों से अलग डबल आत्मीयता शुद्ध Myod परिसरों के पश्चिमी धब्बा विश्लेषणtably eMyoD या नियंत्रण सेल लाइन (मॉक) ने संकेत दिया एंटीबॉडी के साथ व्यक्त। इस पैनल मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। Yahi एच, Fritsch एल, Philipot हे, Guasconi वी, Souidi एम, रॉबिन पी, Polesskaya ए, Losson आर, हारेल-Bellan ए, ईट-सी-एस अली जम्मू बॉय रसायन। अगस्त 2008 29; 283 (35): 23692-700। डोई: 10.1074 / jbc.M802647200। एपब 2008 जुलाई 2. कॉपीराइट अमेरिकी जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए सोसायटी। यह आंकड़ा 26 से संशोधित किया गया: पुलिस आकार और प्रकार में बदल गया था और पाठ आंकड़ा भीतर लेबलिंग को एकजुट करने के लिए घुमाया गया था। Myod अंतर्जात अन्य पैनलों में प्रस्तुत आईपी साथ भ्रम की स्थिति से बचने के लिए eMyoD के रूप में चिह्नित किया गया। (बी) C2C12 माउस myoblasts में Myod interactors के मान्यकरण। (बी) proliferating C2C12 myoblasts से परमाणु कुल अर्क BAF47 (SNF5) या Myod, के खिलाफ या नियंत्रण आईजीजी के साथ उठाया एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation (आईपी) के लिए इस्तेमाल किया गया। जिसके परिणामस्वरूप अवक्षेप पश्चिम बंगाल बुद्धि द्वारा विश्लेषण किया गयाज संकेत दिया एंटीबॉडी। विरोधी Myod एंटीबॉडी अब (लंबी एक्सपो।) और छोटे (लघु एक्सपो।) के लिए जोखिम बार दिखाए जाते हैं। इनपुट अर्क अंतर्जात प्रोटीन के स्तर को दिखाने के लिए भरी हुई थी। इस पैनल क्रिएटिव कॉमन्स रोपण (सीसी द्वारा) लाइसेंस (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) के तहत 28 में प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा 28 से संशोधित किया गया: पुलिस आकार और प्रकार में बदल गया था और परीक्षण आंकड़ा भीतर लेबलिंग को एकजुट करने के लिए घुमाया गया था। (सी) proliferating C2C12 myoblasts से परमाणु कुल अर्क Myod, Suv39h1 (सकारात्मक नियंत्रण) के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitation के लिए इस्तेमाल किया गया, या आईजीजी (नकारात्मक नियंत्रण) नियंत्रित करते हैं। जिसके परिणामस्वरूप अवक्षेप तो संकेत दिया एंटीबॉडी के साथ पश्चिम बंगाल के अधीन थे। इस पैनल मूल रूप से जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित हुआ था। Yahi एच, Fritsch एल, Philipot हे, Guasconi वी, Souidi एम, रॉबिन पी, Polesskaya ए, Losson आर, हारेल-Bellan ए, ईट-सी-एस अली जम्मू बॉय रसायन। अगस्त 2008 29; 283(35): 23692-700। डोई: 10.1074 / jbc.M802647200। एपब 2008 जुलाई 2. कॉपीराइट अमेरिकी जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए सोसायटी। यह आंकड़ा 26 से संशोधित किया गया: पुलिस आकार और प्रकार में बदल गया था और पाठ आंकड़ा भीतर लेबलिंग को एकजुट करने के लिए घुमाया गया था। (डी) परमाणु कुल अर्क proliferating से (prolif।) और फर्क C2C12 myoblasts (48 घंटा, डिफ संकेत के रूप में।) Immunoprecipitation (आईपी) के लिए इस्तेमाल किया गया Myod और Myf5 के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी के साथ, या सामान्य खरगोश आईजीजी के साथ और के रूप में खाली मोतियों के साथ नकारात्मक नियंत्रण। जिसके परिणामस्वरूप अवक्षेप संकेत दिया एंटीबॉडी के साथ पश्चिम बंगाल से विश्लेषण किया गया। इनपुट अर्क अंतर्जात प्रोटीन के स्तर को दिखाने के लिए भरी हुई थी। इस पैनल क्रिएटिव कॉमन्स रोपण (सीसी द्वारा) लाइसेंस (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) के तहत 27 में प्रकाशित किया गया है। यह आंकड़ा 27 से संशोधित किया गया है: पुलिस आकार और प्रकार में बदल गया था और पाठ च भीतर लेबलिंग को एकजुट करने के लिए घुमाया गया थाigure। Proliferating और C2C12 फर्क दो में अलग हो रहे हैं के रूप में मूल आंकड़ा करने के लिए विरोध से प्राप्त परिणामों के साथ पैनलों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1:। नियंत्रण सेल लाइन से eluates में एमएस द्वारा की पहचान डबल आत्मीयता शुद्ध eMyoD परिसर पृष्ठभूमि प्रोटीन के घटाव के बाद परमाणु साल्ट-निष्कर्षण अंश से पृथक में एमएस विश्लेषण द्वारा पहचान प्रोटीन की सूची (प्रोटीन गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि के रूप में माना जाता था ।) के आंकड़ों के चार स्वतंत्र शुद्धिकरण का योग प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: प्रोटीन मैं की सूचीडबल आत्मीयता शुद्ध eMyoD परिसर पृष्ठभूमि प्रोटीन के घटाव के बाद nucleosome समृद्ध अंश से पृथक में एमएस विश्लेषण द्वारा dentified। डेटा तीन स्वतंत्र शुद्धिकरण का योग प्रतिनिधित्व करते हैं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 3. बफर रचनाएँ। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रस्तुत विधि एक प्रतिलेखन कारक, Myod के भागीदारों में से संपूर्ण पहचान परमिट। यह एक heterologous प्रणाली Myod प्रेरित भेदभाव, अर्थात् हेला-S3 कोशिकाओं के लिए प्रतिरोधी में Myod में भागीदारों का पता चला। इस प्रकार, परिभाषा के द्वारा, पहचान Myod भागीदारों के सर्वत्र व्यक्त कर रहे हैं। ये सामान्य और अनुक्रम विशिष्ट प्रतिलेखन कारक, क्रोमेटिन संशोधित एंजाइमों, आरएनए प्रसंस्करण प्रोटीन, kinases (टेबल्स 1 और 2) शामिल हैं। चूंकि हेला-S3 कोशिकाओं Myod प्रेरित ट्रांस-भेदभाव के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, Myod गतिविधि मुख्य रूप से दमनकारी है और पहचान के भागीदारों Myod सह repressors होने की संभावना है। इस आईडी प्रोटीन (टेबल्स 1 और 2, चित्रा 2), Myod transactivation क्षमता 8 को बाधित करने के लिए जाना जाता है की उपस्थिति से प्रकाश डाला है। महत्वपूर्ण बात है, इस तरह के दमनकारी राज्य myoblasts proliferating में Myod स्थिति से मेल खाती है। दरअसल, हम इस बात की पुष्टि CBFβ, एक Myod के साथ कि Myod बातचीतवर्णित विधि द्वारा की पहचान साथी, C2C12 myoblasts proliferating में पता लगाया जा सकता है, लेकिन खो रहे हैं जब कोशिकाओं भेदभाव कराना पड़ा (चित्रा 3 डी देखें)। फिर भी, यह ध्यान दें कि प्रस्तुत पद्धति का मुख्य सीमाओं में से एक Myod सह activators पहचान की कमी है महत्वपूर्ण है। लगातार ऐसे हिस्टोन के रूप में जाना Myod सह activators, की इस पद्धति का उपयोग कर कोई भी acetyltransferases 32 की पहचान की गई।

Myod परिसरों की शुद्धि या तो नाभिक या क्रोमेटिन समृद्ध अंश (nucleosome समृद्ध, NE) (चित्रा 1 ए) के घुलनशील अंश (परमाणु नमक निष्कर्षण, एसई) से कम से कम दो प्रमुख कार्यों में कार्य करता है। सबसे पहले, इस तरह के विभाजन गैर stoichiometric भागीदार है कि यदि Myod शुद्धि की कुल परमाणु अर्क से प्रदर्शन किया नकाबपोश किया जाएगा प्रतिनिधित्व बढ़ जाती है। दूसरे, इस Myod के दो कार्यात्मक उप-जनसंख्या की जुदाई परमिट: पूर्व जमा / evicटेड (एसई) और क्रोमेटिन बाध्य (पूर्वोत्तर)। डीएनए अपार Myod, कई kinases, प्रतिलेखन कारक के लिए विशिष्ट interactors, प्रोटीन के साथ ही कुछ क्रोमेटिन remodelers की पहचान की गई है (चित्रा 2) की तस्करी के अलावा। जब पूरी तरह से पुष्टि, इस तरह के एक नेटवर्क के डीएनए अपार Myod की गतिविधि विनियमन के मोड में एक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा इन दो परमाणु डिब्बों में Myod बाद translational संशोधनों के लिए अतिरिक्त खोज, आगे Myod गतिविधि विनियमन को जानने सकता है। अंत में, एक ग्लिसरॉल ढाल पर घुलनशील और क्रोमेटिन बाध्य Myod परिसरों के विभाजन से पता चला है कि जब क्रोमेटिन बाध्य Myod मुख्य रूप से एक परिसर में निहित है, डीएनए अपार Myod तीन उप परिसरों (चित्रा 1 बी) में वितरित किया जाता है। या तो एमएस और / या प्रोटीन उम्मीदवारों के खिलाफ पश्चिमी धब्बा द्वारा इन उप-परिसरों की विशेषता आगे Myod विनियमन की विधा को स्पष्ट करना चाहिए।

जैसा कि ऊपर पर बल दिया, हेला कोशिकाओं स्वाभाविक रूप से expre नहीं हैएसएस पेशी प्रतिलेखन कारक Myod। यह इस प्रकार है (चित्रा 3) एक कंकाल की मांसपेशी मॉडल में पाया बातचीत पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण था। कई रिपोर्टों Myod और भागीदारों प्रस्तुत नल-टैग परख में पहचान से कुछ के बीच इस तरह के कार्यात्मक बातचीत प्रासंगिक मॉडल में पुष्टि की। इस उदाहरण के लिए prohibitin 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26, और श्रृंगार / एसएनएफ क्रोमेटिन-remodeling जटिल 36,28,30 के लिए मामला है।

ध्यान दें कि यह इस तरह के myoblasts, जब संवेदनशील एमएस करने के लिए संयुक्त रूप से कोशिकाओं के कम राशि से इस तरह के नल-टैग शुद्धि प्रदर्शन करने के लिए संभव है। दरअसल, हाल ही में एक कागज myoblasts 30 में चिह्नित करें टैग Myod की inducible अभिव्यक्ति के बाद Myod भागीदारों के लक्षण वर्णन का वर्णन किया। चूंकि myoblasts में स्थिर और सतत Myod overexpression हानिकारक है, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण myoblasts में अंतर्जात Myod एलील (ओं) में ध्वज-हा टैग जोड़ने होगाऐसे CRISPR-Cas9 31 के रूप में जीनोम संपादन विधियों का उपयोग करके। विशेष रूप से, टैग (ओं) के अलावा संभावित सहयोगियों के साथ बाध्यकारी प्रोटीन समारोह और / या संघ को बदल सकता है, इसलिए टैग (एन या सी टर्मिनस) की जगह सावधानी के साथ चुना जाना चाहिए। प्रासंगिक प्रणाली में संलयन प्रोटीन का एक कार्यात्मक परख सुनिश्चित करने के लिए टैग प्रोटीन कार्यात्मक है पहले नल-टैग शुद्धि प्रदर्शन किया जाना चाहिए। अंतर्जात प्रोटीन की Immunoprecipitation इन समस्याओं, तथापि, यह एक विशिष्ट और उच्च संबंध एंटीबॉडी, जो शायद ही उपलब्ध है की उपलब्धता पर निर्भर करता है से बचा जाता है।

वर्णित दृष्टिकोण का एक और जोड़ा मूल्य शुद्ध प्रोटीन ही की है और इसकी प्रचुर मात्रा में भागीदारों के बाद translational संशोधनों की पहचान करने के लिए (PTMs) संभावना है। इस प्रकार, इस सुविधा के साथ नल-टैग शुद्धि न केवल नए बातचीत में भागीदारों लेकिन यह भी नए एंजाइमी ब्याज और / या उसके सहयोगियों के प्रोटीन से जुड़े कार्यों की पहचान करने के लिए उपयुक्त है। मेंएक क्रोमेटिन बाध्यकारी प्रोटीन (यानी।, प्रतिलेखन कारक, एंजाइम) के मामले में, इस विधि इस प्रकार जुड़े "हिस्टोन कोड" की पहचान के लिए अनुकूलित है। दरअसल, एमिनो टर्मिनल हिस्टोन पूंछ, जो nucleosome सतह पर उजागर कर रहे हैं, कई सहसंयोजक PTMs के अधीन हैं। हिस्टोन PTMs शामिल nucleosomes के लिए एक अनूठा हस्ताक्षर प्रदान करते हैं। हिस्टोन एन टर्मिनल पूंछ पर विभिन्न संशोधनों का एक संयोजन इस प्रकार जीन अभिव्यक्ति विनियमन अनुमति देने के लिए क्रोमेटिन संरचना बदल सकते हैं। इस प्रकार, एक दिया प्रोटीन से जुड़े भूमिकाओं और अध्ययन क्रोमेटिन बाध्यकारी प्रोटीन 22 की कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है इस तरह के संशोधन निस्र्पक।

सारांश में, प्रस्तुत कार्यप्रणाली Myod भागीदारों की व्यापक पहचान परमिट। नल-टैग शुद्धि ऐसे जीएसटी पुल-चढ़ाव, खमीर दो संकर assays और फेज प्रदर्शन के रूप में अन्य तरीकों के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। यहां तक ​​कि अगर व्यावहारिक कारणों के लिए (production परमाणु अर्क की बड़ी राशि) हम एक heterologous सेलुलर प्रणाली का उपयोग करने के लिए है, हम कंकाल की मांसपेशी भेदभाव में पहचान Myod भागीदारों की भागीदारी की पुष्टि करने में सक्षम है। प्राप्त आंकड़ों से पता चलता है कि Myod myogenic कारक, transcriptional नियामकों से शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन को लेकर प्रोटीन की अधिकता के साथ बातचीत करने के लिए एक प्रतिलेखन कारक की गतिविधि को विनियमित अलग तंत्र का सुझाव दे रहा है।

अंत में, एक ही methodological दृष्टिकोण कई परमाणु कारक है कि उनकी विशिष्ट सेलुलर संदर्भ में अध्ययन करने के लिए मुश्किल हो सकता है की सर्वत्र व्यक्त भागीदारों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

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References

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जैव रसायन अंक 111 Myod नल-टैग मास स्पेक्ट्रोमेट्री क्रोमेटिन प्रतिलेखन मांसपेशियों हेला-S3।
Myod Interactome की पहचान संगठनों ने मिलकर आत्मीयता शुद्धि का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित
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Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

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