Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Identifisering av myod interactome Bruke Tandem Affinity Rensing Koblet til massespektrometri

Published: May 17, 2016 doi: 10.3791/53924
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

Abstract

Skjelettmuskulatur terminal differensiering starter med engasjement av pluripotente mesodermal forløper celler til myoblasts. Disse cellene har fortsatt muligheten til å spre seg, eller de kan differensiere og sikring i multinucleated myotubes, som maturate ytterligere å danne myofibers. Skjelettmuskulatur terminal differensiering er orkestrert av koordinert aksjon av ulike transkripsjonsfaktorer, spesielt medlemmer av Muscle regulatoriske forhold eller MRFs (myod, Myogenin, Myf5, og MRF4), også kalt myogenisk bHLH transkripsjonsfaktorer familien. Disse faktorene samarbeide med kromatin-remodeling komplekser innen forseggjort transkripsjonen regulatoriske nettverk for å oppnå skjelett myogenesen. I denne er myod anses master myogenic transkripsjonsfaktor i utløser muskel terminal differensiering. Denne oppfatningen styrkes av evnen til myod å konvertere ikke-muskelceller i skjelettmuskelceller. Her beskriver vi en tilnærming som brukes til å identifisere myodproteinpartnere i en uttømmende måte for å belyse de forskjellige faktorer som er involvert i skjelettmuskel terminal differensiering. Det langsiktige målet er å forstå de epigenetiske mekanismene som er involvert i reguleringen av skjelettmuskel gener, altså., Myod mål. Myod partnere er identifisert ved hjelp av Tandem Affinity Rensing (TAP-tag) fra et heterologt system koblet til massespektrometri (MS) karakterisering, etterfulgt av validering av rollen til aktuelle samarbeidspartnere i løpet av skjelettmuskulatur terminal differensiering. Avvikende former for myogeniske faktorer, eller deres avvikende regulering, er forbundet med en rekke muskelsykdommer: medfødt gravis, myotonic dystrofi, rhabdomyosarkom og mangler i muskel regenerasjon. Som sådan, myogeniske faktorene gir en pool av potensielle terapeutiske mål i muskelsykdommer, både med hensyn til mekanismene som forårsaker sykdommen selv og regenerative mekanismer som kan forbedre sykdom behandling. Således, den detaljerte Forståelsending av de intermolekylære interaksjoner og de genetiske programmer styrt av myogeniske faktorer er avgjørende for den rasjonelle utforming av effektive terapier.

Introduction

Eukaryote flercellede organismer som er sammensatt av forskjellige organer og vev. Alle de funksjonelle vev har en bestemt gen mønster uttrykk, som bestemmes ved hvert differensiering trinn. Cellulær differensiering innebærer aktivering av spesifikke gener, opprettholdelse av deres ekspresjon og, generelt, tie av et sett av gener, for eksempel de som er involvert i celleformering. Skjelettmuskel differensiering, eller myogenese, er således en flertrinnsprosess, som begynner med å bestemme mesodermal stamceller i myoblaster, og deretter fører til terminal differensiering av disse myoblaster i første mono-kjernedannelse, og deretter flerkjernedannelse, myotubes . Dermed myoblasts er "bestemt" celler, som fremdeles er i stand til å spre seg, men de er forpliktet til skjelettmuskulatur avstamning, og dermed kan skille utelukkende i skjelettmuskelceller enten under embryonal utvikling eller i voksen muskel regenerasjon. Fremgangsmåten i skjelettmuskulatur terminal avvikeentiation er organisert med en spesifikk genetisk program som begynner med den permanente utgang fra cellesyklusen av myoblast forløperceller som fører til en definitiv stanse av sprednings forbundet gener, slik som E2F målgener 1. Faktisk, under prosessen med terminal differensiering, er myoblast spredning arrest et avgjørende skritt som går forut for uttrykket av skjelettmuskel spesifikke gener og sammensmeltingen av myoblasts inn myotubes 2. Et slikt program tillater voksne muskel stamceller, også kalt satellittceller, for å differensiere under regenereringen følgende skjelettmuskelskader.

Pattedyr myogenesen er kritisk avhengig av en familie av myogenic grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjon faktorer myod, Myf5, MRF4 og Myogenin, ofte referert til som familien av skjelettmuskelbestemmelsesfaktorer eller MRFs (Muscle regulatoriske forhold) 3. Hver av dem spiller en viktig rolle i spesifikasjon og differentiation av skjelettmuskelceller og har et bestemt uttrykk M.4 5-7. Aktivering av Myf5 og myod utgjør bestemmende trinnet som forplikter celler til myogenisk avstamning, og påfølgende uttrykk for Myogenin utløser myogenesen med aktivering av skjelettmuskel spesifikke gener som MCK (Muscle kreatin kinase). Myogeniske bHLH transkripsjonsfaktorer samarbeide med medlemmer av MEF2 familien i aktivering av muskel gener fra tidligere taus loci 8. De har også stimulere skjelettmuskel gentranskripsjon som heterodimerer med allestedsnærværende bHLH proteiner, E12 og E47, kjent som E proteiner som binder såkalte E-bokser i ulike gen-regulatoriske regioner 8. Twist, Id (hemmer av differensiering) og andre faktorer negativt regulere denne prosessen, ved å konkurrere med myod for E proteiner bindende 8.

Myod er regnet som den store spilleren i utløser muskel terminal differensiering 9 10-13. Faktisk tvunget uttrykk for myod induserer trans-differensiering av ulike celletyper, selv de som stammer fra en annen embryologic opprinnelse 12. For eksempel kan myod konvertere hepatocytter, fibroblaster, melanocytter, neuroblasts og adipocytter i muskel-lignende celler. Den trans-differensierende virkning av myod innebærer en unormal aktivering av myogenisk genetisk program (særlig dets målgener) i et ikke-muskulær miljø, samtidig til den stanse av den opprinnelige genetisk program (særlig, spredning gener).

I prolifererende myoblasts er myod uttrykk, men er ikke i stand til å aktivere sine mål gener selv når det binder seg til sine arrangører 14-16. Derfor er det behov for myod å være kontinuerlig uttrykkes i udifferensierte myoblaster forblir ganske elubart. Myod kunne undertrykke sine mål gener på grunn av rekruttering av undertrykkende kromatin modifiserende enzymer i prolifererende myoblasts før lasting av aktivering kromatin remodelle enzymer 14,17. For eksempel, i voksende myoblasts er myod forbundet med transcriptional co-repressor KAP-en, histone deacetylases (HDACs) og undertrykkende lysin metyltransferaser (kmts), inkludert histon H3 lysin 9 eller H3K9 og H3K27 kmts, og aktivt undertrykke sin målgener uttrykk ved å etablere et lokalt undertrykkende kromatinstruktur 14,17. Viktigere, en fersk rapport indikerte at myod selv er direkte metylert ved H3K9 KMT G9a resulterer i hemming av sin transaktive aktivitet 16.

Den epigenetiske mekanismer som er involvert i denne transdifferensiering av ikke-muskelceller etter myod er stort sett ukjent. Spesielt, noen cellelinjer er resistent mot myod-indusert trans-differensiering. Derfor, i HeLa-celler, er myod enten deaktivert ellerselv kan fungere som repressor snarere enn aktivator av transkripsjon grunn av mangel på ekspresjon av BAF60C subenhet av kromatin remodeling komplekset SWI / SNF 18. Denne modellen kan dermed være av valg å bedre karakter mekanismene for myod-indusert gen undertrykkelse. Det er også egnet til å analysere muligheten for myod å indusere undertrykkende kromatin miljø på sitt mål loci med tilhørende partnere og dermed avdekke myod avhengige undertrykkende mekanismer i prolifererende myoblasts å finjustere terminal differensiering.

Her beskriver vi protokollen for identifisering av myod partnere ved hjelp Tandem Affinity Rensing (TAP-Tag) koblet til massespektrometri (MS) karakterisering. Bruken av HeLa-S3 celler som stabilt uttrykker Flag-HA-myod tillates å få nok materiale til å rense myod komplekser fra fraksjonerte nukleære ekstrakter. Identifiseringen av myod partnere i heterologe systemet ble etterfulgt av validatipå i et aktuelt system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av HeLa-S3 Nuclear Salt-uttrekk og Chromatin-bundet Fraksjoner

  1. Innsamling av cellene
    1. Grow HeLa-S3 Flag-HA-myod og HeLa-S3 Flag-HA (kontrollcellelinje) i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) supplert med 10% føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin (vekst medium) ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig inkubator.
      Merk: HeLa-S3-celler som stabilt uttrykker Flag-HA-myod og HeLa-S3 celler transduced med tom vektor (HeLa-S3 Flag-HA) kan enten opprettes ved hjelp av protokollen beskrevet i: 19,20, eller levert av forfatterne.
    2. Forsterke celler opp til 10 fullt konfluente 150 mm retter av hver cellelinje (HeLa-S3 Flag-HA-myod og HeLa-S3 Flag-HA celler).
    3. Samle supernatanten (inneholder ikke-klebende subpopulasjon) i 5 l spinner.
    4. Vask heft subpopulasjon med 10 ml PBS pr 150 mm skål, trypsineres cellene i 1 minutt ved værelses temtemperaturen (0,05% trypsin-EDTA løsning, 2 ml for en 15 cm parabol).
    5. Tilsett 4 ml medium pr 150 mm skål og samle cellene i 50 ml rør.
    6. Kombiner supernatanten fra trinn 1.1.3 (i det 5 L spinner), og cellene fra trinn 1.1.5, tilsett 500 ml frisk forvarmet vekstmedium for hver cellelinje.
    7. Overfør cellesuspensjonen i 5 l spinner og dyrke cellene i minst 60 timer ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig inkubator.
    8. Legg 500 ml friskt vekstmedium og dyrke cellene i 24 timer.
    9. Legge til 1 liter friskt vekstmedium og dyrke cellene i 24 timer.
    10. Ta ut 1 ml av cellesuspensjonen for å telle cellene og kontrollere celle-levedyktighet. Color 30 mL av cellesuspensjon med 30 mL av 0,4% trypanblått og teller i live (ikke blå) celler under mikroskop ved hjelp hemocytometer.
    11. Hold celletetthet på 2 - 6 x 10 5 celler / ml ved å tilsette frisk vekst medium daglig; ikke overstiger 1 x 10 6 celler / ml. den maksimalevolum for en 5 L spinner er 2,5 L.
      Merk: For de neste trinnene, fortsetter med grupper på 2 - 2,5 L kultur på en tetthet 1 x 10 6 celler / ml. Gjenta trinn 1.1.12 - 1.1.14 å samle ca 20 L (≈ 20 g tørr pellet) for hver cellelinje før du går videre til neste trinn.
    12. Pellet cellene ved sentrifugering ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C og kast supernatanten.
    13. Resuspender celler i 100 ml iskald PBS ved pipettering og sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C for å vaske pelleten.
    14. Gjenta vaskingen ved resuspendering av cellene med 25 ml iskald PBS, overføring av suspensjonen i 50 ml rør og sentrifugering ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
      Merk: Cellepellets kan enten brukes umiddelbart eller frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C i flere dager.
  2. Isolering av Nuclei
    Merk: Utfør trinn 1.2.1 - 1.4.3 i kjølerommet.
    1. Pre-kulden buffers og homogenizers.
    2. Ved bruk av frosset materiale, raskt tine cellepelletene i vannbad ved 37 ° C.
    3. Gjensuspender 20 g (≈ 20 ml) av cellene i 20 ml (et volum lik størrelsen av cellen pellet) av hypoton buffer A (tabell 3) ved anvendelse av 10 ml av bufferen på først, og deretter tilsetning av 5 ml, deretter tilsette ytterligere 5 ml. Vask pipetter godt med frisk buffer for å få maksimum av celler.
    4. Overføring 40 ml cellesuspensjon inn i det på forhånd avkjølt homogenisator med en tettsittende pistill.
    5. Homogenisere celler med 20 slag i en homogenisator (20 inn og ut-bevegelse) og overføre cellesuspensjon i 50 ml rør.
    6. Vask homogenisatoren med 7 ml sukrose-buffer (1/3 av det opprinnelige cellevolumet, tabell 3) for å gjenopprette den maksimale av celler. Overfør denne suspensjonen raskt inn i 50 ml tube fra trinn 1.2.5 for å bevare kjerner og begrense lekkasje.
    7. Flekk en porsjon på 30 pl med 30 mL av 0,4% stypan blå, analysere under mikroskop for å kontrollere lysis effektivitet (hvis lysis er vellykket, må alle kjerner være blå). Gjenta om nødvendig homogenisering trinn.
    8. -Sentrifuge i 7 minutter ved 10000 xg og 4 ° C for å pelletere kjerner. Ta vare på supernatanten som den cytoplasmiske fraksjon.
  3. Utarbeidelse av Nuclear Salt-ekstraherbare (SE) Fraksjon
    1. Resuspender pellet kjerner i 8 ml sukrose-buffer (et volum lik størrelsen av den kjerner pellet). Legg dråpevis mens det ble blandet grundig på en vortex 8 ml buffer med høyt saltinnhold (1 kjerner pellet volum, tabell 3) for å få en sluttkonsentrasjon på 300 mM NaCl. Inkuber i 30 min på is og blandes hver 5 min.
    2. Reduser NaCl-konsentrasjonen til 150 mM ved tilsetning av 8 ml (1/3 av det totale volum) sukrose-buffer. -Sentrifuge i 10 minutter ved 13000 xg og 4 ° C. Samle supernatanten (atom salt uttrekkbare delen, SE).
      Merk: Enten går du videre til trinn 1.3.3 eller forlate SEfraksjon på is under forberedelse av kromatin-bundet fraksjon og deretter ultra-sentrifuge begge fraksjoner samtidig.
    3. Ultra-sentrifuge SE i 30 minutter ved 85 000 x g ved 4 ° C. Ta supernatant (≈ 26 ml).
    4. Fryse 100 pl prøve i flytende nitrogen. Fortsett til trinn 2 "Protein kompleks rensing", ved hjelp av resten av ekstrakten.
      Merk: aliquot skal brukes som en inngangsstyre under trinn 5.1.1.
  4. Utarbeidelse av Chromatin-bundet fraksjon
    1. Resuspender pelleten (fra trinn 1.3.5.) Omhyggelig i 7 ml (et volum lik størrelsen av pelleten) sukrose-buffer.
    2. Legg CaCl2 til en sluttkonsentrasjon på 1 mM (28 pl av 0,5 M CaCl2 i 14 ml suspensjon) for å aktivere MNase (trinn 1.4.4) og bland.
    3. Forvarm suspensjon i 1 min ved 37 ° C.
    4. Legg 70 mL micrococcal nuklease (MNase) for å få sluttkonsentrasjon på 0,0025 U / ul (1/200 fortynning fra 0,5U / mL lager) og bland.
    5. Inkuber nøyaktig 12 minutter ved 37 ° C. Bland hvert 4 min.
    6. Umiddelbart plassere reaksjonen på is.
    7. For å stoppe MNase aktivitet, tilsett 112 ul av 0,5 M EDTA pH 8,0 (1/125 fortynning) til en sluttkonsentrasjon på 4 mM. Inkuber i 5 min på is.
    8. Sonikere 5 ganger i 1 min ved høy amplitude, mellom to sonications tillate en pause på ett min (10 min totalt).
    9. Ultrasentrifuge i 30 minutter ved 85000 xg og 4 ° C.
    10. Samle supernatanten (nucleosome beriket fraksjon, NE, ≈ 12 ml).
    11. Fryse 50 ul delmengde i flytende nitrogen. Fortsett til trinn 2 "Protein kompleks rensing", ved hjelp av resten av ekstrakten.
      Merk: aliquot skal brukes som en inngangsstyre under trinn 5.1.1.

2. Protein Komplekser Rensing

Merk: Fortsett i parallelle ekstrakter fra hver cellelinje (HeLa-S3 Flag-HA-myod og kontroll, Hela-S3 Flag-HA).

  1. Flag- basert Rensing
    1. Forvask Flag harpiks. Bruk 600 mL av Flag harpiks (fra kommersielle 50% lager) for hvert forsøk (SE og NE fraksjoner for hver cellelinje).
    2. Overføre harpiksen i 15 ml rør, resuspender i 13 ml kald tegn (tabell 3), sentrifuge i 2 minutter ved 1000 xg og fjern supernatanten. Gjenta 5 ganger. Etter den siste vaskingen resuspender Flag harpiks inn i tilsvarende volum av tegn (300 ul for hver forsøkspunkt).
    3. For hvert forsøk, blande 600 ul av vaskede Flag harpiks og de tilsvarende proteinekstrakter (i et 15 ml rør for 12 ml NE og i et 50 ml rør for de 26 ml SE fraksjoner, henholdsvis). Inkuber på et roterende hjul over natten ved 4 ° C.
    4. Sentrifuge i 2 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C, satt til side supernatanten og holde ved 4 ° C inntil resultatet av rensingen effektivitet test (2,2).
    5. For SE prøvene, suspendere Flag harpiksi 4 ml Tegn og overføring til en 15 ml tube. Gjenta dette trinnet 3 ganger, hver gang du overfører til den samme 15 ml tube unngå å miste perler. Sentrifuger 2 minutter ved 1000 xg og 4 ° C og fjern supernatanten.
    6. Vask Flag harpiks 7 ganger i et 15 ml rør ved bruk av 13 ml av tegn og sentrifugering i 2 minutter ved 1000 xg og 4 ° C.
    7. Etter den siste vaskingen, resuspender i 1 ml tegn og overføring til et 1,5 ml lav-bindende rør. Sentrifuger 2 minutter ved 1000 xg og 4 ° C og fjern supernatanten.
    8. Resuspender i 200 ul Flag peptid oppløsning på 4 mg / ml ved pH 7,8 for hvert eksperimentelt punkt. Bland perler og peptid. Tilsett 200 ul av tegn buffer og inkuber ved 4 ° C i minst 4 timer eller over natten for å eluere bundne proteiner.
    9. Sentrifuger i 2 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C og overføre harpiksen og supernatanten (Flag eluat) til en tom spinnkolonne plassert i en 2 ml rør.
    10. Sentrifuger kolonnen, samle den venstre over supernatant i 2 ml rør. Samle Flag harpiksen ved tilsetning av tegn-buffer til kolonnen, og videre til den andre flagg eluering med 200 ul Flag peptidløsning (4 mg / ml) over natten ved 4 ° C i hvert forsøk.
    11. Gjenta trinn 2.1.9 - 2.1.10 å samle andre eluering. Kombiner første og andre eluatene.
  2. Test av renseeffekt
    Merk: Under trinn 2.1.11 - 2.1.12, utføre SDS-PAGE og sølvfarging (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Ta 15 ul eluatene, tilsett 5 mL 4x lasting buffer og 2 mL av 10x reduksjonsmiddel, kok i 5 minutter ved 96 ° C og kjøre en SDS-polyakrylamid 4-12% gel i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Stain gelen ved hjelp av sølvfarging kit (følg produsentens anvisninger). Hvis det er klare forskjeller i proteinmønsteret mellom Flag-HA-myod og Flag-HA mock eluatene, spesielt band av Flag-HA myod (rundt 50 kDa, figur 1A), gå videre til neste stes.
  3. Hemagglutinin (HA) -basert Rensing
    1. Vask HA harpiks ved å overføre inn i 15 ml rør, resuspenderes i 13 ml av tegn og sentrifugering i 2 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C. Gjenta vasketrinn 5 ganger. Etter siste vask resuspender perler i samme volum Tegn buffer.
      Merk: Volumet må justeres i henhold til effektiviteten av Flag basert rensing. Start med 300 ul fra den kommersielle 50% lager for hvert forsøk.
    2. Overfør HA harpiks for hvert forsøk i en 1,5 ml lav bindings rør. Sentrifuger 2 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C, eliminere den maksimale av vaskebuffer (tabell 3) og tilsett eluatene fra Flag-baserte rensing for å HA harpiksen.
    3. Inkuber rørene på den roterende hjul over natten ved 4 ° C.
    4. Sentrifuge i 2 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C, satt til side supernatanten og holde ved 4 ° C inntil resultatet av rensingen effektivitet test (2.3.12.).
    5. Resuspendere HA harpiks i 0,5 ml av tegn, overføre til en ny lav bindende 1,5 ml tube. Gjenta resuspendering en gang å tilsette til samme 1,5 ml rør for å unngå tap av perler og sentrifuger 2 minutter ved 1000 xg og 4 ° C. Fjern supernatant.
    6. Vask kulene 8 ganger ved hjelp av 1 ml av tegn hver gang, sentrifugering 2 minutter ved 1000 xg og 4 ° C og fjerning av supernatanten (unngå å miste perler). Etter den siste vaskingen, overføre perlene inn i 0,5 ml rør.
    7. Fjern supernatanten så mye som mulig. Tilsett 100 ul av HA fritt peptid-oppløsning (4 mg / ml) ved pH 7,8 på perlene for å eluere bundne proteiner. Inkuber på den roterende hjul over natten ved 4 ° C.
      Merk: Mengden av HA-peptid må justeres avhengig av overflod av kompleksene.
    8. Sentrifuger i 2 minutter ved 1000 xg ved 4 ° C og overføre harpiksen og supernatanten (HA eluat) til en tom spinnkolonne plassert i en 2 ml rør.
    9. Sentrifuger kolonnen for å samle den venstre over supernatant i 2 ml rør. Utføre en andre eluering med 100 ul av HA peptid (4 mg / ml) for hvert eksperimentelt punkt. Inkuber på den roterende hjul over natten ved 4 ° C. Gjenta trinn 2.3.8 - 2.3.9 for å samle andre eluering.
    10. Kombiner første og andre eluatene.
    11. Test renseeffekt ved SDS-PAGE og sølvfarging (se trinn 2.2.) (Figur 1A).
    12. Konsentrer HA eluatet til 30 pl ved hjelp sentrifugale filter enheter med et 10 kDa cut-off (nominell molekylvektgrense, NMWL) i henhold til produsentens instruksjoner.
    13. Del konsentrerte prøvene inn i to deler: 22.5 (3/4) og 7,5 (1/4) pl. Snap fryse 1/4 av prøvene i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. Bruk 3/4 del for trinn 3.
      Merk: 1/4 frosne delen som skal brukes for bekreftelse av massespektrometri resultater ved western blot (se trinn 5.1).

3. Massespektrometri Analyse

Merk: Følgende trinn bør diskuteres med massespektrometri anlegget som skal utføre analysen.

  1. Supplement 3/4 (22,5 ul) av prøvene med 7,5 pl 4 x lastebuffer og 3,3 ul av 10 x reduksjonsmiddel og koke i 5 minutter ved 96 ° C.
  2. Laste prøver på en SDS-polyakrylamid 4-12% gel. Kjør gel på 150 V konstant i 5 min for å la alle proteiner for å gå inn i gel uten separasjon.
  3. Vask gelen med vann; feste for 20 - 30 For minutter med fikseringsmiddel-løsning (10% eddiksyre, 50% metanol, 40% ultrarent vann) og deretter vaske det faste gelen 5 ganger i ultrarent vann.
  4. Kutt båndene som inneholder proteiner, butikk i 1 ml vann i en 1,5 ml tube og send til massespektrometri anlegget.

4. Data Analysis

Merk: Dette er en generell veiledning for analysen. Den nøyaktige fremgangsmåten vil avhenge av den spesielle dataene gitt av MS-anleggetanvendes for å utføre analysen (f.eks 21,22).

  1. Sammenlign listen over de identifiserte proteinene i "myod" eluater med en liste hentet fra tilsvarende negativ kontroll forberedelse. Utelukke fra analysen proteiner som finnes i begge listene.
  2. Fjern proteiner som har ≤2 totalt antall identifiserte peptider fra resterende listen.
  3. Tilgang funksjonell annotering og funksjonelle klassifisering av det oppnådde liste av proteiner med David Bioinformatikk Resources (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) og klassifisere listen av proteiner 23,24.
  4. (Valgfritt) Fjern fra listen "haikere", belastes ikke-nukleære proteiner med sterk adventitious binding til negativt ladet DNA 25. Disse inneholder cytoskeletal, cytoplasmatiske, mitokondrielle, membran og reseptorproteiner (proteinfolding, cytoskjelettet og Diverse gruppe proteiner i tabell 1 og 2). </ Li>
  5. Sammenlign innhentet lister over de myod interactors fra SE og NE fraksjoner å identifisere felles proteiner og proteiner spesifikke for hver fraksjon (figur 2).

5. Bekreftelse av identifisert Interactors av Western Blot

  1. Bekreftelse i HeLa-S3 Flag-HA-myod og HeLa-S3 Flag-HA
    1. Tine-eluat prøver oppnådd ved trinnet 2.3.14 (7,5 ul) på is. Tilsett 12 pl tegn buffer, 10 pl 4 x loading buffer og 3 ul av 10 x reduksjonsmiddel. Koke prøvene i 5 min ved 96 ° C.
    2. Forbered inngangsprøver for western blotting.
      1. Tine porsjoner fra trinnene 1.3.9 og 1.4.11 og måle protein konsentrasjon, for eksempel ved hjelp av BCA kit (følg produsentens anvisninger).
      2. Bruk 15 ug protein pr kjørefelt. Måle den passende mengde av ekstraktet og justere volumet av prøven opp til 15 ul med Tegn buffer.
      3. Tilsett 5 mL 4x lasting buffer og1,5 mL 10x reduksjonsmiddel. Koke prøvene i 5 min ved 96 ° C.
    3. Utfør en western blot analyse med antistoffer av interesse (spesifikke for partner kandidat identifisert under MS-analyse) med 15 ul eluat prøver. Bruk inngangs ekstrakter som en kontroll av endogene proteinnivå (figur 3A).
  2. Bekreftelse på relevante mobil System
    1. Utarbeidelse av total kjerneekstrakt av C2C12 muse myoblasts.
      1. Vokse C2C12 mus myoblaster i DMEM medium supplementert med 15% føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2 i en fuktig inkubator. Aldri overstige 80% celle samløpet å opprettholde celler i proliferativ tilstand.
      2. Vokse minst to 150 mm skåler av C2C12 for ett punkt (en antistoff) av immunutfelling (IP). Aspirer medium, vaskes cellene to ganger med 10 ml PBS.
      3. Skrap cellene og samle inn 15 ml tube. Centrifuge ved 250 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kast supernatant.
      4. Estimere volumet av cellepelleten (= V celle). Forsiktig resuspender pelleten i 3 volumer V celle av Hypoton buffer B for å forstyrre cytoplasmiske membran (tabell 3).
      5. Legg 0,44 x V cellevolum på 10% NP-40 for å nå sluttkonsentrasjon på 1% (v / v). Snu forsiktig røret flere ganger for å blande.
      6. Legg 0,89 x V cellevolum av SR (tabell 3) for å bevare integriteten kjerner. Snu røret forsiktig flere ganger for å homogenisere suspensjonen, og sentrifuger i 5 minutter ved 2000 x g for å pelletere kjerner.
      7. Fjern supernatanten (cytosoliske fraksjon). Estimere volumet av kjerner pellet (= V NUC). Resuspender kjerner pellet i ett bind V NUC sukrose buffer.
      8. Legg dråpevis mens det ble blandet grundig på en vortex en volum V nuc av høy saltbuffer for å få en sluttkonsentrasjon på 300 mMNaCl, og inkuberes i 30 min på is. Bland hvert 5 min.
      9. Tilsett en volumet V nuc av sukrose-buffer (for å senke NaCl-konsentrasjonen til 150 mM) og CaCl2 (sluttkonsentrasjon 1 mM). Blande.
      10. Forvarm suspensjon i 1 min ved 37 ° C, tilsett micrococcal nuclease for å få sluttkonsentrasjon på 0,0025 U / ul (1/200 fra lager på 0,5 U / pl). Blande.
      11. Inkuber nøyaktig 12 minutter ved 37 ° C. Bland alle 3 min.
      12. Umiddelbart reaksjon på is og tilsett EDTA (sluttkonsentrasjon 4 mM) for å stoppe MNase aktivitet. Inkuber i 5 min på is.
      13. Sonicate 5 ganger for 0,5 min hver på høy amplitude. Mellom to sonications, tillate en pause på 0,5 min (5 minutter totalt).
      14. Ultra-sentrifuge i 30 minutter ved 85000 xg og 4 ° C. Samle supernatanten (total atom ekstrakt).
      15. Mål proteinkonsentrasjonen av den totale atom ekstrakt, for eksempel ved hjelp av BCA kit (følg produsentens anvisninger) og fortsett immediately til trinn 5.2.2.
    2. Immunpresipitasjon (IP) av endogen myod.
      1. Til pre-klar ekstrakter, vask 10 mL av protein G agarose perler for hver IP punkt.
        1. Overfør den nødvendige volum av protein G-agarose perler inn i et 1,5 ml rør, resuspender i 1,4 ml kald tegn, sentrifuge i 2 minutter ved 1800 xg og fjern supernatanten. Dette gjentas 3 ganger.
      2. Bland forvasket protein G agarose perler med riktig volum av total kjerneekstrakt. Bruk 500 ug av total kjerneekstraktprotein per IP-punktet.
      3. Inkuber på et roterende hjul ved 4 ° C i 2 timer for å forhånds fjerne ekstraktene.
      4. Sentrifuger i 5 minutter ved 1800 xg ved 4 ° C. Hold supernatant.
      5. Bland 5 mikrogram myod Ab eller 5 mikrogram av kanin IgG med 500 mikrogram forhånds ryddet totale atom ekstrakter i 1,5 ml lave bindende rør. Legg tegn buffer opp til 1 ml. Inkuber på et roterende hjul ved 4 ° C over natten.
        Merk: Utfør following trinnene under trinn 5.2.2.3.
      6. Forvask 7,5 pl protein A / G lagerkuler oppløsning pr IP-punktet.
        1. Overfør den nødvendige volumet av perler inn i et 1,5 ml rør, resuspender perlene i 1 ml tegn og sentrifuger ved 1800 xg ved 4 ° C i 2 min. Fjern supernatanten. Dette gjentas 3 ganger.
      7. Resuspender protein A / G-perler i 1,5 ml blokkeringsløsning (tabell 3) og inkuberes på en roterende hjul over natten ved 4 ° C.
      8. Sentrifuger totale atom ekstrakter inkubert med Abs (trinn 5.2.2.5) ved 16 000 xg i 10 min ved 4 ° C. Hold supernatant.
      9. Sentrifuger blokkerte protein A / G-harpiks (trinn 5.2.2.7) ved 1800 xg i 2 min ved 4 ° C. Kast supernatant og resuspender i 1 ml Tegn buffer. Re-sentrifuge ved 1800 xg i 2 min ved 4 ° C for å vaske ut blokkeringsbuffer.
      10. Resuspender blokkert protein A / G harpiks i 1 ml tegn buffer og delmengde inn nye lav proteinbindings rør for å oppnå 7,5 mL blocked protein A / G harpiks per IP-punkt. Sentrifuger ved 1800 xg ved 4 ° C i 2 minutter og fjerne så mye som mulig av supernatanten.
      11. Legge til den totale atom ekstraktene ble inkubert med Abs (eller kontroll IgG) til A / G harpiks. Bland og inkuber i 2 timer ved romtemperatur (RT) på et roterende hjul.
      12. Sentrifuger suspensjonen 1800 xg ved romtemperatur i 2 min. Kast supernatanten, resuspender i 1 ml vaskebuffer og overføre suspensjonen til nye lave bindende rør. Inkuber ved RT på et roterende hjul i 5 minutter.
      13. Sentrifuger suspensjonen ved 1800 xg ved romtemperatur i 2 min, resuspendert i 1 ml vaskebuffer og inkuber ved romtemperatur på et roterende hjul i 5 minutter. Gjenta 4 ganger. For den siste vask overføring til en ny lav bindingsøret.
      14. Fjern maksimum av supernatanten. Legg 7 ul vaskebuffer, 7 ul av 4x ladningsbuffer og 3 ul av 10 x reduksjonsmiddel til kulene, blandes og koke i 5 minutter ved 96 ° C.
      15. Utfør en western blot analyse med antistoffer av interest (spesielle partner kandidat for immun utfelt protein). Bruk 1% (5 mikrogram) av input ekstrakter som en kontroll av endogene proteinnivå (Figur 3B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å forstå regulering av myod aktivitet, foretok vi en uttømmende karakterisering av myod kompleksene ved hjelp av biokjemisk rensing, basert på immunorensing av en dobbelt merket form av myod etterfulgt av massespektrometri (MS). Bruken av HeLa-S3 cellelinje som uttrykker Flag-HA-merket myod og en kontrollcellelinje som uttrykker Flag-HA tillater å få nok materiale til å rense myod komplekset ved å utføre dobbelt-affinitetsrensing av Flag-HA-myod.

Vi fraksjonert celleekstrakter i cytoplasma og kjernefysiske fraksjoner, deretter videre fraksjonert atomfraksjonen til salt ekstrahert (atom salt-ekstraherbare, SE) og beriket for nukleosomer (nucleosome-beriket, NE) fraksjoner. TAP-Tag rensing fra disse separerte kjernefysiske fraksjoner (figur 1, tabell 1 og 2) lov til å rakne partnere som har relativt lav abundance når lokalisert på en bestemt subnuclear rommet. Videre ble en slik strategi utnyttes til å avdekke partnere av ubundet (SE) versus DNA-bundet (NE) myod å få innsikt i myod aktivitet regulering.

For TAP-Tag rensing ble Flag-HA tandem epitop som brukes. De små hydrofile flagg og HA-epitoper har minimal forstyrrelse av proteinfunksjon og er svært tilgjengelig for antistoff-antigen-interaksjon. Anti-Flag og anti-HA-harpiks-baserte sekvensiell immunorensing ble utført, etterfulgt av eluering av de immunopurified kompleksene ved hjelp av flagg og HA peptider. De eluerte proteiner ble så kjørt på en SDS-PAGE for å tillate alle proteiner for å gå inn i gel. Bitene av gel som inneholder alle rensede proteiner ble kuttet; proteinene ble ekstrahert, trypsin-spaltet og identifisert ved massespektroskopi (MS).

Som vist i figur 2, (bilde 2 og 3) 26-28. Dette belyser DNA-bundet myod samarbeidspartnere og mulige co-regulatorer som kan etablere et undertrykkende-kromatin miljø. For eksempel, HP1 proteiner, som ble identifisert som myod partnere ved å beskrevne metodikk er kjent for å binde metylert H3K9 for å opprettholde genet undertrykkelse og heterochromatin struktur. Faktisk hemmer HP1 myod transkripsjonen aktivitet resulterer i nedsatt myod mål genekspresjon og muskel terminal differensiering 26.

Ytterligere fraksjonering avSE og NE myod komplekser på glycerol-gradient (som beskrevet i 29) avdekket myod sub-komplekser i de to subnuclear kamrene (figur 1B). Spesielt blir SE myod fordelt i tre underkomplekser, mens den kromatin-bundet myod tilhører hovedsakelig til en kompleks.

Noen av TAP-tag / MS avslørt interactors ble bekreftet av western blot på myod komplekser. Disse inkluderer transkripsjonsfaktor CBF, EBB, MTG8R og SWI / SNF subenheten BAF47 (SNF5) (figur 3A, venstre) og HP1 proteiner (CBX1 og CBX3) (figur 3A, høyre). Viktigere, ettersom HeLa-celler er ikke muskelceller og uttrykker ikke myod, er det nødvendig å bekrefte interaksjonen mellom nylig identifiserte interactors og myod i myoblaster (figur 3 BD). Spesielt, for eksempel validering, vil den totale atom ekstrakter (uten separasjon på SE og NE) er vanligvis tilstrekkelig, hh muliggjør reduksjon av mengden av myoblaster som brukes for prøvepreparering. In vitro interaksjons analyser som i 26,27, bidra til ytterligere validert disse funnene. Til slutt bør de funksjonelle betydningene av disse interaksjonene i muskelcellene bli ytterligere adressert som i 26-28.

Tatt sammen, presenterte data viser en global oversikt over overalt uttrykt myod partnere og legge til rette for ytterligere funksjonelle studier i en mer relevant muskel modell.

Figur 1
Figur 1: myod Komplekser Isolert ved Tandem Affinitetsrensing (a) en sølvfarging av dobbelt affinitetsrensede eMyoD komplekser isolert fra atom salt-ekstraherbare (SE) eller nucleosome anriket (NE) atomfraksjoner av HeLa-S3 cellelinjer som stabilt. uttrykke Flag-HA-myod (myod kompleks) end kontrollcellelinje (Mock). MW, molekylvekt markør i kilo Dalton (kDa). Pil viser Flag-HA-myod (eMyoD). Denne forskningen ble opprinnelig utgitt i 37. Copyright The American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Dette tallet har blitt forandret fra 26: baner med mock rensinger og eMyoD kompleks isolert fra SE atomfraksjoner vises nå. (B) Dobbelts affinitetsrensede eMyoD komplekser som i (A) ble fraksjonert på glyserol gradient varierende fra 20% til 41%. Fraksjonene ble oppsamlet manuelt, konsentrert og analysert ved hjelp av Western blot (WB) under anvendelse av anti-Flag-antistoffer. Legg merke til tilstedeværelsen av flere eMyoD holdig under komplekser i atom salt-ekstraherbare (SE) fraksjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 Figur 2:. Sammenligning av Chromatin bundet (nucleosome beriket, NE) versus Nuclear Løselig (atom salt utvinnbar, SE) myod Partnere Top: Venn-diagram som viser overlapping mellom eMyoD interactors isolert fra atom salt-ekstraherbare (SE) og nucleosome-beriket ( NE) fraksjon. De ribosomale proteiner, ble oversettelses-initiering faktorer, DNA reparasjon faktorer og tubulin isoformene ekskludert fra analysen som de er til stede i ulike datasett innhentet av TAP og anses som ikke-spesifikk Bunn:. De myod interactors som finnes i både SE og NE fraksjoner (felles) eller spesifikke for en av fraksjonene (unike) ble delt i grupper basert på deres funksjonelle merknader. Cytoskjelettet relaterte og andre diverse proteiner er ikke avbildet. De understreket proteiner er myod interactors validerte enten i HeLa og / eller i myoblasts av co-immunoprecipitation. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Validering av valgt sett av myod Interactors (A) Validering av myod interactors, identifisert av massespektrometri, i HeLa-S3 cellelinje som stabilt uttrykker Flag-HA-myod (eMyoD) Venstre panel. Western blot analyse av dobbel tilhørighet -purified myod komplekser isolert fra atom salt-ekstraherbare (SE) eller nucleosome-beriket (NE) fraksjoner av HeLa-S3 cellelinje stabilt uttrykker eMyoD eller kontroll cellelinje (Mock) med de angitte antistoffer. MW, vekt markør molekylær Høyre panel. Western blot analyse av dobbelt affinitetsrensede myod komplekser isolert fra atom nucleosome-beriket fraksjoner av HeLa-S3 cellelinje sroter uttrykker eMyoD eller kontrollcellelinje (Mock) med angitte antistoffer. Dette panelet ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 29 august; 283 (35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juli 2. Opphavsrett The American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Dette tallet har blitt forandret fra 26: Politiet type og størrelse ble endret, og teksten ble rotert å forene merking i figuren. Myod ble merket som eMyoD å unngå forveksling med endogent IP presentert i de andre panelene. (BD) Validering av myod interactors i C2C12 muse myoblasts. (B) Kjernefysiske samlede ekstrakter fra prolifererende C2C12 myoblasts ble brukt for immunoprecipitation (IP) med antistoffer dannet mot BAF47 (SNF5) eller myod, eller med kontroll IgG. De resulterende bunnfall ble analysert ved WB vetth de angitte antistoffer. For anti-myod antistoffer lengre (lang expo.) Og kortere (kort expo.) Eksponeringstider vises. Input ekstrakter ble lastet vise endogene protein nivåer. Dette panelet har blitt publisert i 28 under (CC BY) Creative Commons-lisens (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dette tallet har blitt forandret fra 28: Politiet type og størrelse ble endret, og testen ble rotert å forene merking i figuren. (C) Kjernefysiske samlede ekstrakter fra prolifererende C2C12 myoblasts ble brukt for immunoprecipitation med antistoffer dannet mot myod, Suv39h1 (positiv kontroll), eller kontrollere IgG (negativ kontroll). De resulterende presipitater ble deretter utsatt for WB med de angitte antistoffer. Dette panelet ble opprinnelig publisert i The Journal of Biological Chemistry. Yahi H, Fritsch L, Philipot O, Guasconi V, Souidi M, Robin P, Polesskaya A, Losson R, Harel-Bellan A, Ait-Si-Ali S. J Biol Chem. 2008 29 august; 283(35): 23692-700. doi: 10,1074 / jbc.M802647200. Epub 2008 juli 2. Opphavsrett The American Society for biokjemi og molekylærbiologi. Dette tallet har blitt forandret fra 26: Politiet type og størrelse ble endret, og teksten ble rotert å forene merking i figuren. (D) Kjernefysiske samlede ekstrakter fra voksende (formeringen.) Og differensierende C2C12 myoblasts (48 hr, angitt som Diff.) Ble brukt for immunoprecipitation (IP) med antistoffer dannet mot myod og Myf5, eller med normal kanin IgG og med tomme perler som negativ kontroll. De resulterende bunnfall ble analysert ved WB med de angitte antistoffer. Input ekstrakter ble lastet vise endogene protein nivåer. Dette panelet har blitt publisert i 27 under (CC BY) Creative Commons-lisens (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Dette tallet har blitt forandret fra 27: Politiet type og størrelse ble endret, og teksten ble rotert å forene merking innenfor figur. Panelene med de oppnådde resultatene fra voksende og differensierende C2C12 skilles i to i motsetning til den opprinnelige figuren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1:. Liste over Proteiner identifisert av MS-analyse i Double Affinity-rensede eMyoD Komplekser Isolerte fra Nuclear Salt uttrekkbare delen etter subtraksjon av bakgrunns Proteins (Proteiner identifisert av MS i eluatene fra kontroll cellelinje ble ansett som ikke-spesifikk bakgrunn .) dataene representerer summen av fire uavhengige renselser. klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 2: Liste over Proteiner jegdentified av MS-analyse i Double Affinity-rensede eMyoD Komplekser Isolerte fra nucleosome-beriket Fraksjon etter subtraksjon av bakgrunnen proteiner. Dataene representerer summen av tre uavhengige renselser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell 3. Buffer Komposisjoner. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den presenterte metoden tillater uttømmende identifisering av partnere av en transkripsjonsfaktor, myod. Det avslørte myod partnere i et heterologt system motstandsdyktig mot myod-indusert differensiering, nemlig HeLa-S3 celler. Dermed, per definisjon, identifiserte myod partnere er allestedsnærværende uttrykt. Disse omfatter de generelle og sekvensspesifikke transkripsjonsfaktorer, kromatin-modifiserende enzymer, RNA prosessering proteiner, kinaser (tabell 1 og 2). Siden HeLa-S3 cellene er resistente mot myod-indusert trans-differensiering, er myod aktivitet hovedsakelig undertrykkende og de identifiserte partnere er sannsynlig å være myod co-repressors. Dette er markert med tilstedeværelse av Id proteiner (tabell 1 og 2, figur 2), som hemmer myod trans evne åtte. Viktigere, tilsvarer en slik undertrykkende stat til myod status i voksende myoblasts. Faktisk fikk vi bekreftet at myod interaksjoner med CBFβ, en myodpartner identifisert ved den beskrevne fremgangsmåten, kan påvises i prolifererende C2C12 myoblaster, men går tapt når cellene gikk differensiering (se figur 3D). Ikke desto mindre er det viktig å merke seg at en av de største begrensninger i den framlagte metoden er mangelen på myod ko-aktivatorer identifikasjon. Gående, ved hjelp av denne fremgangsmåten ingen av de kjente myod ko-aktivatorer, så som histon acetyltransferases 32 ble identifisert.

Rensing av myod komplekser, enten fra den løselige fraksjon (atom salt ekstraherbart, SE) av kjernen eller den kromatin-anrikede fraksjon (nucleosome anriket, NE) (figur 1A) tjener i det minste to viktige funksjoner. For det første øker slik fraksjonering representasjon av de ikke-støkiometriske partnere som ville bli maskert hvis myod rensing utføres fra total atom ekstrakter. For det andre tillater denne separasjon av to funksjonelle subpopulasjoner av myod: pre-deponert / evicted (SE) og kromatin-bundet (NE). Blant interactors spesifikke for DNA-ubundet myod, mange kinaser, transkripsjonsfaktorer, smugling proteiner samt noen kromatin remodelers ble identifisert (figur 2). Når fullt validert, kan et slikt nettverk gi et innblikk i modus for aktivitet regulering av DNA-ubundet myod. Ytterligere søk etter myod posttranslasjonelle modifikasjoner i disse to atom avdelinger ved massespektrometri, ytterligere kan rakne myod aktivitet regulering. Til slutt, fraksjonering av løselige og kromatin-bundet myod komplekser på en glyserol gradient avslørte at mens kromatin-bundet myod er hovedsakelig finnes i en kompleks, er DNA-ubundet myod fordelt i tre under komplekser (Figur 1b). Karakterisering av disse under komplekser ved enten MS og / eller western blot mot protein kandidater bør klargjøre ytterligere modusen for myod regulering.

Som fremhevet ovenfor, trenger HeLa-celler ikke naturlig EXPREss muskelen transkripsjonsfaktor myod. Det var derfor viktig for å bekrefte funnet interaksjoner i en skjelettmuskulatur modell (figur 3). Mange rapporter bekreftet i relevante modeller slike funksjonelle samspillet mellom myod og noen av partnerne identifisert i present TAP-tag analysen. Dette er for eksempel tilfelle for prohibitin 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26, og SWI / SNF kromatin-remodeling kompleks 36,28,30.

Legg merke til at det er mulig å utføre en slik TAP-tag rensing fra lavt antall celler, slik som fra myoblaster, når de kombineres til sensitive MS. Faktisk en nyere artikkel beskrevet myod partnere karakterisering etter induserbar uttrykk for Flag-merket myod i myoblasts 30. Siden stabil og kontinuerlig myod overekspresjon i myoblasts er skadelig, ville en alternativ tilnærming være å legge til Flag-HA-koder i den endogene myod allel (er) på myoblastsved hjelp av genom-redigering metoder, slik som CRISPR-Cas9 31. Spesielt, tilsetning av koden (e) kan potensielt forandre proteinfunksjon og / eller en forbindelse med bindingspartnere, derfor sted på etiketten (N- eller C-terminus) bør velges med forsiktighet. En funksjonell analyse av fusjonsproteinet i aktuelle system må utføres før TAP-tag rensing for å sikre den kodede protein er funksjonell. Immunoutfelling av endogene proteiner unngår disse problemene, men det er avhengig av tilgjengeligheten av en spesifikk og høyaffinitets antistoff som er sjelden tilgjengelig.

En annen merverdi av den beskrevne tilnærming er muligheten til å identifisere posttranslasjonelle modifikasjoner (PTMs) av det rensede proteinet i seg selv og sin rike partnere. Dermed, med denne funksjonen TAP-tag rensing er egnet til å identifisere ikke bare nye interaksjonspartnere, men også nye enzymatiske funksjoner knyttet til protein av interesse og / eller dets partnere. IVed en kromatin-bindende protein (f.eks., transkripsjonsfaktorer, enzymer), er denne fremgangsmåte således innrettet for å identifisere den tilhørende "histon-kode". Faktisk, amino-terminal histone haler, som er utsatt på nucleosome overflaten, er gjenstand for flere kovalente PTMs. Histone PTMs gi en unik signatur for de involverte nucleosomes. En kombinasjon av forskjellige modifikasjoner av histon N-terminal hale kan således endre kromatinstruktur for å tillate genekspresjon regulering. Dermed karakteriserer slike endringer knyttet til et gitt protein kan gi innsikt i roller og virkningsmekanismer av de studerte kromatin-bindende proteiner 22.

Oppsummert tillater presenteres metodikk omfattende identifisering av myod partnere. TAP-tag rensing gir et alternativ til andre tilnærminger som GST pull-downs, gjær to-hybrid analyser og fag skjerm. Selv om av praktiske grunner (blusern av store mengder atom utdrag) vi må bruke et heterologe cellesystem, har vi vært i stand til å bekrefte involvering av de identifiserte myod partnere i skjelettmuskulatur differensiering. Den oppnådde data viser at myod myogenic faktor synes å samhandle med en mengde proteiner som spenner fra transcriptional regulatorer til RNA bindende proteiner, noe som tyder på de ulike mekanismene som regulerer aktiviteten til en transkripsjonsfaktor.

Som konklusjon kan det samme metodiske tilnærming brukes til å identifisere ubikvitært uttrykt partnere for mange nukleære faktorer som kan være vanskelig å studere deres spesifikk cellulær kontekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
HeLa-S3 ATCC CCL-2.2
C2C12 ATCC CRL-1772
Equipment
Spinner Corning 778531
Homogenizer:  Dounce homogenizer  Wheaton 432-1273 and 432-1271
Agitating device for spinners Bellco 778531
Sonicator Diagenode UCD 200
Hemocytometer Marienfeld Superior  640610
Low-binding tubes Sorenson 27210
Empty spin column Bio-Rad 7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gel Life technologies NP0336BOX
4x loading buffer  Life technologies NP0007
10x reducing agent Life technologies NP0004
Silver staining kit Life technologies A8592
Centrifugal filter units, 10K Millipore UFC501024
Protein G agarose beads Sigma-Aldrich P4691
Protein A/G  Resin Thermo Scientific 53132
Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) Sigma-Aldrich A2220
HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) Sigma-Aldrich A2095
MNase Sigma-Aldrich N3755
Flag free peptide (DYKDDDDK) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
HA free peptide (YPYDVPDYA) Ansynth Service BV Custom synthesis Resuspend up to 4 mg/ml in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8
Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit Thermo Scientific 23225
Protease inhibitors Sigma-Aldrich S8830
Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate Life technologies 34075
BSA Sigma-Aldrich A9647
Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) Sigma-Aldrich D1626
Spermine tetrahydrochloride Sigma-Aldrich S1141
Spermidine Sigma-Aldrich S0266
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
PBS Sigma-Aldrich D8537
MOPS running buffer Life technologies NP0001
DMEM (high glucose) Sigma-Aldrich D0822 Pre-warm  at 37 °C before use
Trypsin-EDTA (0.05% phenol red Life technologies 25300-054
Serum GE healthcare life sciences  PAA A15-102 Each lot of serum has to be first tested for your cells.
Penicillin and Streptomycin  Life technologies 15140-122
Trypan Blue Solution, 0.4% Life technologies 15250-061
Water (sterile-filtered) Sigma-Aldrich W3500
Antibodies
HA from rat (12CA5) Roche 11583816001
Flag Sigma-Aldrich A8592
MyoD Santa Cruz sc-32758 To use for western blotting
MyoD Santa Cruz SC-760 To use for immunoprecipitation and western blotting
CBFbeta Santa Cruz FL-182 
HP1alpha Euromedex 2HP2G9
HP1beta Euromedex 1MOD1A9AS
HP1gamma Euromedex 2MOD1GC
Suv39h1 Cell Signaling Technology 8729
BAF47 BD Biosciences 612111
Myf5 Santa Cruz SC-302
Tubulin Sigma-Aldrich T9026
Actin Sigma-Aldrich A5441
IgG Mouse Santa Cruz SC-2025
IgG Rabbit Santa Cruz SC-2027
Goat anti-rat -HRP Sigma-Aldrich A9037
Goat anti-rabbit -HRP Sigma-Aldrich A6154 
Goat anti-mouse -HRP Sigma-Aldrich A4416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

Tags

Biokjemi myod TAP-Tag massespektrometri kromatin transkripsjon muskel HeLa-S3.
Identifisering av myod interactome Bruke Tandem Affinity Rensing Koblet til massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch,… More

Boyarchuk, E., Robin, P., Fritsch, L., Joliot, V., Ait-Si-Ali, S. Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (111), e53924, doi:10.3791/53924 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter