Introduction
Il cancro al seno è uno dei tumori più comuni che colpiscono la popolazione femminile in tutto il mondo. Oltre 1,3 milioni di casi di cancro al seno sono segnalati ogni anno in tutto il mondo 1,2. Anche se le cellule tumorali sono stati tradizionalmente considerati come biologicamente omogenea e altamente proliferative, è diventato evidente che il cancro al seno è geneticamente e clinicamente eterogenea. La resistenza ai farmaci antitumorali prevalenti è una caratteristica dei tumori al seno avanzato, che porta alla mortalità nella maggior parte dei pazienti attraverso la sua facilitazione della progressione del cancro e le metastasi a distanza 3.
I microRNA (miRNA) sono una classe di piccole molecole di RNA lunghi circa 22 nucleotidi che regolano l'espressione genica bloccando traduzione dell'mRNA o mediare mRNA degrado 4. Più di 2.000 differenti miRNA sono stati finora identificati nell'uomo, che sono collegati a malattie umane 5. Una crescente serie di studi have ha dimostrato che miRNA possono funzionare come oncogeni e soppressori tumorali e sono spesso disregolazione nei tumori 6. miRNA impatto fortemente tutta la tumorigenesi primaria controllando i principali regolatori del ciclo cellulare, la senescenza, l'apoptosi e autofagia, insieme a quelli della motilità delle cellule tumorali, invasione e metastasi 7.
Espressione aberrante miRNA è stata anche associata con implicazioni cliniche, come fase, la differenziazione, la prognosi e la risposta alla terapia adiuvante 8. In particolare, l'aumento di espressione di miR-146 è correlato con una scarsa prognosi nei pazienti affetti da cancro del polmone 9. Un altro studio ha dimostrato che l'espressione perduto di miRNA-let7b è legata a fenotipi maligni e, di conseguenza, scarsa sopravvivenza 6. Capire i tipi di cellule e strutture che esprimono miRNA è una parte importante di comprensione dei meccanismi attraverso i quali alterazioni delle cellule miRNA espressione e influenzatessuto fenotipi 10. Alcuni miRNA trovati ad essere secreto nelle cellule stromali sono prese in dalle cellule epiteliali e in particolare agiscono sui loro obiettivi. Allo stesso modo, miR-212 e miR-132 sono secreti dalle stroma e regolano le interazioni epiteliali-stromale necessari per l'escrescenza duttale durante lo sviluppo della ghiandola mammaria 11. L'obiettivo generale di questo articolo è quello di spiegare un protocollo dettagliato per rilevare miRNA nei tessuti di cancro al seno attraverso miRNA ibridazione in situ. Abbiamo ottimizzato tutte le condizioni per saggiare i livelli di espressione miRNA-489 nei campioni dei pazienti di cancro al seno. A tal fine, abbiamo utilizzato uno scavo con l'etichetta bloccato sonda di acido nucleico (LNA) nel nostro esperimento. Alcuni dei suoi nucleotidi avevano una modifica LNA, cioè, un ponte che collega metilene 'atomo di ossigeno e 4' del 2 atomi di carbonio dello scheletro ribosio che fissa il nucleotide tale che rimanga "blocchi" dopo ibridazione. Come risultato, è molto più difficileper il complesso ibridizzato denaturare 12,13.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Institutional Review Board dell'Università Hwasun Hospital Chonnam Nazionale e University of South Carolina. campioni TMA composte da cancro al seno e tessuti del seno normali adiacenti abbinati sono stati forniti dalla Biobanca di Chonnam National University Hospital Hwasun, membro della Corea del Biobanca rete.
1. Soluzione Preparazione
- Preparare 1 L di DNasi e RNasi acqua libera. Effettuare tutte le soluzioni chimiche che utilizzano dietilpirocarbonato (DEPC) acqua trattata. Trattare 1 L di acqua con 500 ml di DEPC e incubare per 3 ore a temperatura ambiente. Autoclave l'acqua per inattivare DEPC.
Attenzione: Non inalare DEPC poiché è noto agente cancerogeno. - Preparare 1x PBS da 10x PBS con acqua DEPC trattati.
- Preparare 20x SSC (sciogliere 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio in 800 ml di acqua, regolare il pH a 7,0 con poche goccia di 14 N soluzione di HCl e regolare il volume di 1 L con water), 4% paraformaldeide, 95% di etanolo, 80% di etanolo con acqua DEPC trattati.
- Aggiungere 8 ml di trietanolamina e 1,05 ml di HCl in 590 ml di acqua trattata con DEPC e aggiungere 1,5 ml di anidride acetica per acetilazione.
- Preparare 50 mg / mL proteinasi K in tampone (50 mM Tris-HCl, pH 8,0 in DEPC acqua trattata).
- Preparare tampone di ibridazione composta da 500 ml di formammide, 250 microlitri di 20x SSC, 100 ml di 50x soluzione di Denhardt, 12,5 l di t-RNA, 2,5 l di DNA aringhe sperma, 30 ml di RVC, 0,02 g di blocco dei reagenti e 50 ml di acqua DEPC. Preparare fresco.
2. tessuto mammario Sezioni
- Tagliare 5 micron sezioni incluse in paraffina fissati in formalina con microtomo e applicare la sezione per caricare slitta 14.
Nota: il tessuto del seno utilizzato qui è stato preparato in precedenza dalla Corea del Biobanche di rete.
3. Preparazione del tessuto
- Rimuovere la paraffina from tessuto immergendo i vetrini in Coplin 2x vaso in xilene fresco per 10 minuti ciascuno e reidratare la sezione di tessuto da 5 min incubazioni in concentrazioni decrescenti di etanolo (100%, 95% e 80%) in DDH 2 O. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante.
- Immergere il tessuto in DEPC acqua trattata per 5 min. A questo punto fare confini intorno sezione di tessuto con la penna barriera idrofoba.
- Fissare il tessuto con 4% PFA per 15 minuti seguita da un lavaggio con PBS.
- Immergere il tessuto in 0,3% Triton X-100 / PBS per 10 minuti seguita da un lavaggio con PBS.
- Incubare campione con 50 mg soluzione / ml proteinasi K per 15 minuti a 37 ° C. Poi incubare sezioni di tessuto con trietanolammina e anidride acetica per 5 min a temperatura ambiente, seguito da un lavaggio con PBS. Nessun lavaggio PBS è richiesto tra il trattamento proteinasi K e trietanolammina / trattamento anidride acetica.
4. ibridazione
- Lavare accuratamente e incu il tessutobate la sezione di tessuto con tampone di ibridazione da 2 a 3 ore a temperatura ambiente. Tipicamente 120 microlitri tampone di ibridazione è sufficiente a coprire la sezione di tessuto.
- Diluire 5'-DIG etichettata sonda LNA a concentrazione finale di 3:00 in 120 ml soluzione di ibridazione. Come la concentrazione stock di solito è di 40 ng / ml, aggiungere 3 ml di brodo di tampone di ibridazione 120 ml e incubare la miscela a 95 ° C per 5 min.
- Incubare la sezione di tessuto con sonda durante la notte a 54 ° C (Tm) in una camera umida. Tipicamente 120 ml è sufficiente a coprire una sezione. Creare umidità utilizzando due asciugamani di carta bagnati. La dimensione ideale della camera è di 10 pollici da 8 pollici.
- Nota: Tm può essere diverso per i diversi miRNA. 54 ° C è menzione per miR-489.
5. stringenza Wash
- Lavare il tessuto con 5x SSC per 7 minuti (dopo la fase di ibridazione, RNasi condizioni di libero non sono più necessari).
- Lavare l'arguzia sezione di tessutoh 1x SSC per 7 minuti due volte a 57 ° C.
- Lavare la sezione di tessuto con 0.2x SSC per 7 minuti a 57 ° C.
- Lavare la sezione di tessuto con 0.2x SSC per 7 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare sezione di tessuto in PBS per 10 min.
6. Blocco
- Incubare la sezione di tessuto con tampone di arresto a temperatura ambiente per 1 ora in camera umida (Per fare un tampone di bloccaggio con 2 ml di FBS, 10 ml di Tween-20 e 3 ml di BSA in 18 m di PBS. Conservare tampone di bloccaggio a 4 ° C).
7. incubazione dell'anticorpo primario e lo Sviluppo
- Diluire 1: 300 di anticorpi anti-DIG-AP in tampone di bloccaggio e incubare la sezione di tessuto con l'anticorpo a 4 ° C durante la notte.
- Lavare le sezioni con tampone di lavaggio per 3 volte, per 5 minuti ciascuna (buffer fornito dal kit di sviluppo).
- Sviluppare la sezione di tessuto con un kit commerciale per la fosfatasi alcalina che produce CY-3 luce fluorescente. <li> Lavare la sezione con tampone di lavaggio per 5 minuti. sezione macchia con 100 ml di 2,5 ng / ml colorante Hoechst per 5 minuti seguita da 5 minuti di lavaggio con tampone di lavaggio.
- Montare la sezione con il tampone di montaggio secondo il protocollo del produttore. Utilizzare 15 ml per sezione di tessuto e pulire soluzione di montaggio eccessiva con il tessuto pulire. Sigillare il vetrino con smalto trasparente per evitare perdite.
- Osservare il microscopio sezione fluorescente utilizzando con ingrandimento 10X lente in modo totale è di 100X.
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Representative Results
tessuto del cancro al seno umano è stato utilizzato per determinare l'espressione miRNA-489. Mammaria condotto ghiandola e cellule epiteliali sono stati trovati per esprimere significativamente più elevati miRNA-489 livelli di tessuto adiacente tumorale in due pazienti (Figura 1A e 1B). Ciò dimostra chiaramente che l'espressione miRNA-489 è stato perso nel tessuto tumorale, suggerendo tumore attività soppressiva di miRNA-489. Ad ulteriore conferma di questi risultati, il tessuto tumorale e tessuto normale adiacente dello stesso paziente sono stati confrontati. Come osservato nella Figura 2A e 2B, tessuto normale è stato trovato per esprimere più miRNA-489 rispetto al suo tessuto tumorale adiacente. 10 micron di immagini indica barra di scala. Le immagini sono state scattate utilizzando lente 10X.
Figura 1: Espressione di miR-489 nel tessuto mammario normale. Entrambe le normali cellule di struttura condotto e tumorali vengono visualizzati sulla stessa sezione. I tessuti sono di diversi pazienti con cancro mammario. Normale condotto mammaria e della ghiandola mammaria esprimono miRNA-489, mentre assente nel tessuto tumorale. Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. L'espressione di miR-489 nel cancro al seno Coppia paziente Un tessuto micro array è stato usato per studiare l'espressione di miR-489 in un malato di cancro al seno. Una coppia paziente rappresentativo è mostrato qui. Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'obiettivo di questo studio era di determinare il livello di espressione dei miRNA nei tessuti di cancro al seno utilizzando miRNA ibridazione in situ. Si deve notare che in questo esperimento, tutte le condizioni sono stati ottimizzati per il tessuto del cancro al seno. Ulteriore ottimizzazione potrebbe essere richiesto per altri tipi di tessuto. Tutte le soluzioni devono essere effettuate con acqua DEPC e tutti i contenitori da utilizzare devono essere risciacquati con acqua DEPC trattati e successivamente in autoclave. Anche lieve contaminazione RNasi può interferire con il risultato finale dell'esperimento. Come miRNA è una breve sequenza, è necessario utilizzare una sonda LNA per facilitare una migliore ibridazione con il bersaglio. Inoltre, dopo la fissazione dei tessuti, il trattamento con RNase-free proteinasi K è assolutamente necessario in caso contrario le proteine possono interferire con l'ibridazione della sonda con il endogena miRNA. Inoltre, prima di incubando la sezione di tessuto con la sonda, quest'ultimo deve essere bollita per 95 ° C a svolgersi ognistrutture secondarie.
Dopo aver incubato durante la notte, è importante lavare con concentrazioni variabili di SSC alla temperatura di cui sopra in protocollo per ridurre i legami non specifici. Per lo sviluppo della fluorescenza, incubare sezione di tessuto con il substrato per almeno 1 ora. È opportuno osservare della sezione per incubazione in modo che sviluppo eccessivo può essere evitato. Assicurarsi di montare la sezione con i mezzi di montaggio forniti con il kit.
C'è un fattore limitante che si dovrebbe prendere in considerazione. Se bersaglio miRNA espressione è più bassa nel tessuto sarà difficile da individuare la sua espressione utilizzando questa tecnica. E 'sempre consigliabile eseguire questo protocollo con un controllo positivo, come U6 in modo che la tecnica può essere confermata e tutti i reagenti sono garantite da lavorare e sono RNasi gratuito.
È possibile utilizzare biotina sonda marcata anziché DIG sonda marcata nel caso di segno deboleAL con DIG etichettato sonda. amplificazione del segnale è possibile utilizzando il sistema biotina-avidina. Avidina ha una forte affinità per la biotina. Sfruttando questa affinità, è possibile codificare sonda biotina con duplex avidina-biotina che è attaccare con fosfatasi alcalina. Utilizzando questa strategia, è possibile amplificare il segnale a partire miRNA abbondante pure.
Il campo di miRNA sta rapidamente emergendo, dal momento che i miRNA svolgono un ruolo critico nei processi cellulari fondamentali e sono fortemente collegati con lo sviluppo del cancro. Inoltre, questi miRNA possono anche essere utilizzati come biomarker nella diagnosi del cancro. Diversi studi hanno indicato una forte correlazione tra miRNA e parametri clinici come stadio del tumore suggerendo possibile applicazione di miRNA in prognosi del cancro. Questa tecnica può anche essere utilizzato per miRNA analisi di espressione in altri tipi di cancro. Per esempio, l'espressione di miR-182 e miR-503 sono stati analizzati nei tessuti dei pazienti con tumore del colon in SItu ibridazione 15.
Tradizionale analisi di espressione genica può rivelare miRNA livello di espressione nel tessuto, ma non può rivelare la posizione da cui la struttura miRNA viene espresso. Utilizzando questa tecnica, si può facilmente trovare il livello di espressione dei miRNA così come location.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ELF-97 | Life technology | E6604 | |
| 50x Denhard't | Life technology | 750018 | |
| t-RNA | Roche | 109541 | Reconstitute in DEPC water |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1815 | |
| Roche Blocking | Roche | 11096176001 | |
| RVC | Fisher | 50-812-650 | Before use spin down it at 16.1 RCF and take supernatant |
| miR-489 probe | Exiqon | 38599-01 | |
| Nuclease free BSA | Roche | 711454 | |
| Primary antibody-anti DIG | Roche | 11093274910 | |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma | 1609478 |
References
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