La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales
Summary
Tools used for visualizing vascular regeneration require methods for contrasting the vascular trees. This film demonstrated a delicate injection technique used to achieve optimal contrasting of the vascular trees and illustrate the potential benefits resulting from a detailed analysis of the resulting specimen using µCT and histological serial sections.
Abstract
Un procedimiento de inyección de silicona modificado se utiliza para la visualización del árbol vascular hepática. Este procedimiento consistía en la inyección in vivo del compuesto de silicona, a través de un catéter 26 G, en el portal o vena hepática. Después de la inyección de silicona, los órganos fueron explantados y se prepararon para micro-TC ex-vivo (μCT). El procedimiento de inyección de silicona es un desafío técnico. El logro de un resultado exitoso requiere una amplia experiencia microquirúrgica del cirujano. Uno de los retos de este procedimiento consiste en la determinación de la tasa de perfusión adecuada para el compuesto de silicona. La tasa de perfusión para el compuesto de silicona tiene que ser definido en base a la hemodinámica del sistema vascular de interés. tasa de perfusión inadecuada puede dar lugar a una perfusión incompleta, la dilatación artificial y rotura de árboles vasculares.
La reconstrucción 3D del sistema vascular se basa en la TC y se logró utilizandosoftware preclínica como HepaVision. La calidad del árbol vascular reconstruida estaba directamente relacionada con la calidad de la perfusión de silicona. Posteriormente parámetros vasculares calculadas indicativas de crecimiento vascular, como el volumen vascular total, se calculan en base a las reconstrucciones vasculares. Contrastando el árbol vascular con silicona permitido para la posterior elaboración histológico de la muestra después de μCT de exploración. El espécimen se pueden someter a seccionamiento en serie, el análisis histológico y el escaneo de diapositivas conjunto, y, posteriormente, a la reconstrucción 3D de los árboles vasculares a partir de imágenes histológicas. Este es el requisito previo para la detección de eventos moleculares y su distribución con respecto al árbol vascular. Este procedimiento de inyección de silicona modificada también se puede utilizar para visualizar y reconstruir los sistemas vasculares de otros órganos. Esta técnica tiene el potencial de ser aplicado ampliamente para estudios en relación con la anatomía vascular y crecimiento en varios animales unamodelos de enfermedad de Newcastle.
Introduction
La regeneración hepática es a menudo determinado midiendo el aumento de peso del hígado y el volumen y mediante la evaluación de la tasa de proliferación de hepatocitos 16. Sin embargo, la regeneración del hígado no sólo es la inducción de la regeneración del parénquima sino también la regeneración vascular 6. Por lo tanto, el crecimiento vascular debe investigarse más con respecto a su papel en la progresión de la regeneración del hígado. Visualización del sistema vascular hepática es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de la regeneración vascular. Numerosos métodos indirectos se han desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes de la regeneración vascular hepática. Tradicionalmente, la detección de citoquinas (factor de crecimiento endotelial vascular, VEGF) 14, quimiocinas y sus receptores (CXCR4 / cxcr7 / CXCL12) 4 han sido el pilar para el estudio de la regeneración vascular. Sin embargo, un modelo 3D junto con el análisis cuantitativo de la vasculatura añadiría anatómico críticoinformación para obtener una mejor comprensión de la relación importante entre el parénquima hepático y la regeneración vascular.
Para visualizar el sistema vascular hepática, lo que requiere de contraste los árboles vasculares, los ratones fueron inyectados con un agente de contraste de caucho de silicona radiopaca directamente en el portal o árbol vascular venosa hepática. Después de la polimerización de la silicona y la explantación del órgano, las muestras de hígado se sometieron a μCT escaneado con un escáner CT. Las exploraciones dieron lugar a representaciones de imágenes voxel de la silicona de inyección de especímenes 9.
Para el control de calidad, el sistema vascular se visualizó primero en 3D utilizando software preclínica. La segmentación se realizó mediante el establecimiento de un umbral entre la intensidad de los tejidos blandos y la intensidad del vaso. La máscara buque resultante se visualizan mediante la representación de superficie. El software también permite la determinación manual de los dos parámetros de vascular el crecimiento: la longitud máxima de los vasos y el radio.
Después se usó una software preclínico para reconstrucción 3D de árboles vasculares y posterior cálculo de los territorios vasculares que suministran o de drenaje 13. Además, este software determina automáticamente ciertos parámetros de crecimiento vascular, como la longitud total de todas las estructuras vasculares visibles también conocidos como la longitud del borde, total o volumen total del vaso.
El procedimiento de perfusión de silicona se realizó en ratones ingenuos y en ratones que se sometieron a 70% de la hepatectomía parcial (PH). Los hígados se recogieron a diferentes puntos de tiempo de observación después de la resección para el análisis vascular y parenquimatoso regeneración hepática mediante la técnica de la visualización y la cuantificación antes mencionada.
Los objetivos principales de esta película son los siguientes: (1) demostrar la delicada técnica de inyección requerida para lograr contraste óptimo y (2) muestran el potencial beneficio resultante from un análisis detallado de la muestra de resultantes utilizando μCT y de serie de secciones histológicas. Después de ver esta película, el lector debe tener una mejor comprensión de cómo inyectar compuesto de silicona en un sistema vascular específico y de la utilidad y aplicabilidad de la técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrastando el árbol vascular mediante la inyección de silicona y de exploración μCT se ha introducido en modelos de tumores y modelos de enfermedades neurológicas con frecuencia para estudiar la progresión angiogénico 5,7,8,10. Las mejoras en la metodología de la inyección de silicona se hicieron en el presente estudio para visualizar y cuantificar el crecimiento vascular después de la hepatectomía parcial en ratones.
Hay una serie de pasos críticos que requieren ate…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding by the German Ministry of Education and Research (BMBF) via the systems biology network “Virtual Liver”, grant numbers 0315743 (ExMI), 0315765 (UK Jena), 0315769 (MEVIS).The authors also thank Frank Schubert for technical support.
Materials
| PERFUSOR® VI | B.BRAUN | 87 222/0 | |
| Pipetus®-akku | Hirschmann | 9907200 | |
| Pipets | Greiner | 606180 | |
| micro scissors | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | Fine Science Tools (F·S·L) | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 00649-11 | |
| needle-holder | Fine Science Tools (F·S·L) | No. 12061-01 | |
| 1ml syringe | B.Braun | 9161406V | |
| 5ml syringe | B.Braun | 4606051V | |
| extension and connection lines | B.Braun | 4256000 | 30cm, inner ø1.2mm |
| 6-0 silk (Perma-Hand Seide) | Ethicon | 639H | |
| 6-0 prolene | Ethicon | 8711H | |
| Microfil® MV diluent | FLOW TECH, INC | ||
| Microfil® MV – 120 | FLOW TECH, INC | MV – 120 (blue) | |
| MV curing agent | FLOW TECH, INC | ||
| Heparin 2500 I.E./5ml | Rotexmedica | ETI3L318-15 | |
| Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | E15117/D DE | |
| Imalytics Preclinical software | Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, Germany | ||
| HepaVision | Fraunhofer MEVIS, Bremen, Germany | ||
| NanoZoomer 2.0-HT Digital slide scanner | Hamamatsu Electronic Press, Japan | C9600 | |
| Tomoscope Duo CT | CT Imaging GmbH, Erlangen, Germany | TomoScope® Synergy | |
References
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