Abstract
Hela montera in situ hybridisering (WMISH) är en teknik som gör det möjligt för den rumsliga upplösningen av nukleinsyramolekyler (ofta mRNA) i en "hela berget" vävnadspreparat, eller utvecklingsstadiet (t.ex. ett embryo eller larv) av intresse. WMISH är extremt kraftfull, eftersom det kan bidra avsevärt till den funktionella karakteriseringen av komplexa flercelliga genom, en utmaning som blir mer av en flaskhals med störtflod av nästa generations sekvensdata. Trots den konceptuella enkelheten i tekniken behövs ofta mycket tid att optimera de olika parametrarna inneboende WMISH experiment för nya modellsystem; subtila skillnader i de cellulära och biokemiska egenskaper mellan vävnadstyper och utvecklingsstadier innebär att en enda WMISH metoden inte kan vara lämpliga för alla situationer. Vi har utvecklat en uppsättning WMISH metoder för återkommande gastropod modell lymnaea stagn som genererar konsekvent ochtydliga WMISH signaler för ett antal gener, och i alla utvecklingsstadier. Dessa metoder innefattar tilldelningen av larver av okänt kronologisk ålder till en ontogenetiska fönster, det effektiva avlägsnandet av embryon och larver från sina ägg kapslar, tillämpningen av en lämplig proteinas-K-behandling för varje ontogenetiska fönster, och hybridisering, post-hybridisering och immunodetection steg. Dessa metoder ger en grund från vilken den resulterande signalen för en given RNA-transkript kan ytterligare förfinas med sond specifik justeringar (primärt probkoncentration och hybridiseringstemperaturen).
Introduction
Blötdjur är en grupp av djur som håller intresset av ett brett spektrum av vetenskapliga discipliner. Trots deras morfologiska mångfald en art, rikedom (näst efter Leddjur i fråga om art nr 2) och relevans för ett brett spektrum av kommersiella 3, medicinska 4 och vetenskapliga frågor 5-8, finns det relativt få blötdjur arter som kan göra anspråk på att vara både välutrustade vetenskapliga modeller och lätt att underhålla i laboratoriemiljö. En blötdjur som mycket används av discipliner såsom neurobiologi 9, ekotoxikologi 10 och mer nyligen evolutionsbiologi 11,12, är lymnaea stagn, främst på grund av dess omfattande spridning och extrem enkelt underhåll. Trots sin popularitet som en modell organism och dess långa historia av användning av utvecklingsbiologer 13-19, utbudet och kraften i molekylära verktyg tillgängliga för L. stagnalis vetenskapliga samfundet ligger långt efter det att mer traditionella djurmodeller (Drosophila, mus, sjöborre, nematoder).
Vår önskan att utveckla lymnaea som en molekylmodell härrör från ett intresse för de molekylära mekanismer som styr skalbildning. Detta motiverade oss att förfina en uppsättning tekniker som gör det möjligt för en effektiv, konsekvent och känslig visualisering av genuttryck under lymnaea utveckling. Hela montera in situ hybridisering (WMISH) är allmänt används för en mängd olika modellorganismer och har använts i mer än 40 år 20. I dess olika skepnader, kan ISH användas för att spatialt lokalisera specifika loci på kromosomerna, rRNA, mRNA och mikro RNA.
En av de utmaningar som vi behövde för att ta itu med innan förfina en WMISH metod för L. stagn var frågan om försiktigt och effektivt extrahera embryon och larver av olika stadier från than ägg kapslar, i vilka de är avsatta. Denna extraktion, eller "decapsulation ', behöver uppnås effektivt i syfte att samla in tillräckligt material för en given in situ experiment, medan på samma gång bibehålla morfologiska och cellulär integritet. Medan andra modellorganismer genomgår också inkapslad utveckling, i våra händer inget av de metoder som rapporterats för dessa arter kan med framgång användas i L. stagn.
De övergripande målen med denna metod är därför: att extrahera L. stagn embryon och larver från deras kapslar i en hög genomströmning sätt, att tillämpa förhybridisering behandlingar som optimerar WMISH signalen, för att förbereda embryon och larver med tillfredsställande WMISHsignals för avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande steg beskriva vår metod för att utföra en in situ experiment på embryonala och larvstadier L. stagn. Om ett steg innebär användning av ett farligt kemiskt detta indikeras med ordet "VARNING" och alla lämpliga säkerhetsförfaranden bör antas. Länkar till representativa SDB ark för farliga kemikalier finns i tilläggs fil 1. Recept för alla reagenser finns i tilläggs fil 2.
1. Montering av Decapsulation Apparatus
- För att göra detta, anslut en 20 ml engångsspruta till kisel slang (med en innerdiameter på 1 mm och en ytterdiameter på 3 mm) med en P1,000 spets kapas till lämplig längd som visas i figur 2A.
- Tejpa en standardobjektsglas till en inverterad stor petriskål. Tejpa kisel slangen omedelbart intill objektsglas såsom visas i figur60, 2C och 2D.
- Vila en drog glas nål på objektglas och försiktigt in den i silikonslangen tills spetsen av nålen skjuter ungefär 20% av vägen över innerdiameter slang (se figur 2C och 2D). När nålen är i position tejpa fast den ner till petriskål.
- Tillåta den fria änden av kisel slangen att vila i en annan petriskål som kommer att samla in decapsulated materialet.
2. Provtagning, Fixering och Decapsulation
NOTERA: Alla steg utförs vid RT om inget annat anges.
- Noggrant samla ägg strängar från väggarna i ett akvarium. För att göra detta, använd en platt bit av flexibel plast som en spatel att skrapa ägget strängen från substratet, och använda en plast tesil att fiska flytande ägg strängen ur vattnet. Scen och sortera materialet under ett mikroskop med hjälp av guiden ges i figur1.
- Placera ägget strängen på en pappershandduk och göra ett längsgående snitt längs ägget massan med hjälp av de fjäderlätta pincett. Rulla ägget kapslarna ur ägget strängen och ta bort så mycket av jellymaterial som möjligt från varje kapsel genom att trycka dem runt pappershandduk med hjälp av fjäderlätta pincett.
- Med hjälp av fjäderlätta pincett, överföra ägget kapslar i en petriskål med 5 ml kranvatten. Fortsätta att samla in de-gelé ägg kapslar av de önskade utvecklingsstadier i denna maträtt. Samla tillräckligt kapslar från alla utvecklingsstadier för den planerade WMISH experiment fortsätter sedan till nästa steg.
- När man arbetar med mer utvecklade larver (5 dagar efter första klyvning (dpfc) och äldre) söva dem före fixering.
OBS: Detta kommer att förhindra muskler från upphandlande vilket gör tolkningen av in situ färgningsmönster mycket svårt.- Koppla larver (medan de fortfarande är i sin capsules) i en 2% vikt / volym lösning av MgCl2 • 6 H2O i 30 min före fixering.
- Bedöma graden av avkoppling efter 30 minuter genom att sänka flera larver samtidigt i sina ägg kapslar i fixeringslösning och övervaka deras svar under ett mikroskop. Ofullständigt avslappnad larver kommer att dras tillbaka in i sina skal, medan helt avslappnad larver inte kommer att reagera. När dessa larver har avslappnad gå vidare till nästa steg.
- Överför ägget kapslar med hjälp av ett stort hål plastpipett i en förslutningsbar rör som ger 10 gånger volymen av ägg kapslar (t ex., En ml av avvecklade kapslar skulle kräva en 10+ ml rör).
- Aspirera så mycket vätska som möjligt från röret och ersätta med en volym av fixeringslösning som är 10 gånger volymen av de sedimenterade ägg kapslar. Rotera försiktigt ägget kapslar i fixativ vid RT för lämplig tid för varje utvecklingsstadium (se figur 1).
- Discontinue rotation och låta kapslarna att sjunka och aspirera fixativlösning i en lämplig avfallsbehållare.
- Tvätta ägg kapslar genom att ersätta fixeringslösning med fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% Tween-20 (PBTw) och som roterar vid RT i 5 min. Aspirera PBTw och upprepa två gånger.
- Ta bort embryon och larver från sina kapslar som använder apparaten (se avsnitt 1 för detaljer) som visas i figur 2. Rita kapslarna upp i 20 ml sprutan, fäst slangen och sedan skingra kapslarna genom slangen och förbi glasålen ut i insamling skålen.
OBS! Normalt bör majoriteten (> 90%) av alla kapslar behöver endast en passage genom anordningen. I många fall kapselmembranet är skadad men embryon och larver kvar inuti den uppbrutna kapsel. Upparbeta detta material genom att helt enkelt dra upp den i sprutan och att skingra det igen. - Samla decapsulated embryon och larver i ett 1,5 ml rör med hjälp av en mikrofonropipette (en P20 för 0-3 dagar gamla larver, och en P200 för äldre larver med slutet av spetsen avskurna).
OBS: En paus (för upp till flera månader) i protokollet kan göras i detta skede. Om detta krävs, bör decapsuled material samlas i ett 1,5 ml rör för lagring (gå vidare till nästa steg). Annars fortsätter omedelbart till protokoll 3. - Tillåter embryon och larver att sjunka till botten av röret och aspirera supernatanten. Ersätt med 33% etanol (EtOH) i PBTw och låt sitta i 5-10 minuter. Upprepa med 66% EtOH i PBTw och 100% EtOH. Tvätta larver två gånger i 100% EtOH vid RT. Lagra materialet vid -20 ° C i 100% EtOH.
- När du är klar att fortsätta, återfukta proverna genom att ta bort 100% EtOH och ersätta med 66% EtOH i PBTw, låt sitta i 5-10 minuter. Upprepa med 33% EtOH i PBTw, låt sitta i 5-10 minuter. Skölj med 3x 5 min tvättar i PBTw att säkerställa att all EtOH avlägsnas.
3. Proteinase-K, TEA och Post-fixation
OBS: Vi finner att utföra följande steg i små korgar med en maskgolvet mest effektiva och skonsamma metod för att snabbt utbyta tidskritiska lösningar. Även om dessa kan göras hem, använder vi korgar (medelstora) som är kompatibla med Intavis InSituPro -Vsi vätska hanteringsrobot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc). Sådana korgar kan snabbt och enkelt flyttas mellan brunnarna i en 12-brunnars vävnadsodlingsskål (TCD) för att utbyta lösningar, eller lösningen kan sugas från brunnen med hjälp av en pipett. Alternativt kan alla lösnings utbyten utföras utan dessa korgar genom att helt enkelt suga supernatanten från larverna. I detta fall en försiktigt snurra kommer att koncentrera alla embryon och larver till centrum av skålen tillåter supematanten tas bort från kanten av brunnen. Följande förutsätter att användaren utnyttjar korgar för lösning utbyten.
- Med hjälp av en pipettEmbryon överföring och larver i en korg som sitter i en 12 brunn TCD med 2 ml PBTw.
OBS:. Antalet embryon och / eller larver som kan läggas beror på utvecklingsstadiet utreds, men en allmän tumregel är att ha minst 25% av golvytan fri från embryon / larver (dvs inte befolka korgen). - Förbered en intilliggande väl med 2 ml av den lämpliga proteinas-K-lösning (se figur 1), och en annan 2 brunnar med 2 ml 0,2% glycin vardera. Flytta varje korg i brunnen innehållande den lämpliga koncentrationen av proteinas-K och omedelbart starta tidtagningen.
- Efter 10 min flytta varje korg i en brunn innehållande 0,2% glycin och inkubera i 5 min. sedan flytta varje korg i den andra brunnen med 0,2% glycin och inkubera i 5 min. Tvätta ur glycin med 3x 5 min utbyte av 3 ml PBTw.
- Avlägsna PBTw lösning och behandla proverna en gång med nygjord Trietanolamin (TEA) solution under 5 min VARNING! inte agitera. Ersätta med 3 ml av nyberedd TEA-lösning under 5 min. Inte agitera. Aspirera majoriteten av TEA-lösning från proverna. Tillsätt nyberedd Trietanolamin med ättiksyraanhydrid (TEAAA) lösning och inkubera under 5 min. OBS! Inte agitera.
- EXTRA - Även om ovanstående steg ruvar, förbereda en annan färsk sats av TEAAA lösning och upprepa ovanstående steg.
OBS: Denna andra behandling med TEAAA är valfri men kan bidra till att helt eliminera alla bakgrund med prober benägna att generera bakgrund. - Ta bort TEAAA lösning genom att aspirera det från brunnen och ersätt med 3 ml PBTw. Inte agitera. Avlägsna PBTw och tillämpa 3 ml 3,7% formaldehyd i PBTw. snurra försiktigt då och då under en 30 min inkubation.
- Ta bort fixativ genom att aspirera det från brunnen och ersätt med 3 ml PBTw. Överför materialet till ett 1,5 ml rör. REPlacera PBTw med hybridiseringsbuffert och inkubera under 5 min vid RT - VARNING.
- Placera rören i en varm kvarter vid RT, och ställa in temperaturen till den önskade hybridiseringstemperaturen.
OBS: Hybridiseringstemperaturen är sond specifik och kommer att behöva empiriskt optimeras, men vi hitta 55 ° C för att vara en bra temperatur för att initialt prov. Göra det möjligt för blocket att komma till hybridiseringstemperaturen, och tillåta proverna att i förväg hybridisera under ca 15 min (dvs., är den tid det tar att förbereda de riboprobes, längre inte nödvändigt). Förbered tillräckliga volymer (normalt 100 pl) av de utspädda riboprober. Vi normalt provsondkoncentrationer av 100 och 500 ng / ml som en initial sortiment. Vi förbereder riboprobes enligt 12. - Avlägsna hybridiseringsbuffert från proverna och tillsätt sonden i hybridiseringsbuffert till proverna. Överlagring med 100 | j, l (eller en lämplig volym för att bilda en fas ovanför hybridisering buffer) av mineralolja.
OBS: Mineraloljan förhindrar omfattande kondens som bildas under den långa hybridiseringssteget. Omfattande kondensation kommer att avsevärt ändra både kemin i hybridiseringslösningen och koncentrationen av sonden. - Denaturera prob och mål-RNA genom upphettning av proven till 75 ° C under 10 minuter, därefter reducera värmen till den önskade hybridiseringstemperaturen. Tillåta hybridisering fortgå under ett minimum av 12 tim (O / N) eller längre (24-48 h).
- Under hybridisering bort en enda rör från värmeblocket, rotera den snabbt mellan tummen och pekfingret för att avbryta larverna utan att störa oljefasen, och ersätta den i värmeblocket. Upprepa detta en gång var 6-12 timmar eller så.
4. Hot Tvättar och Immunodetektion
OBS: Medan vi använder en vätskehanteringsrobot för följande steg, dessa kan också lätt ske manuellt. I det här fallet, embryon och larver should hållas i 1,5 ml rör de hybridiserade i. Alla efterföljande lösning börser sugs och tillsätts med en P1,000 pipett. När manuellt vart och ett av följande steg bör använda 1 ml av varje lösning.
- Värme tillräckliga volymer (3 ml vardera för varje prov) i 4x, 2x och 1x tvättlösningarna till hybridiseringstemperaturen.
- Tvätta alla prover tre gånger i 4x tvättbuffert under 15 minuter vardera vid hybridiseringstemperaturen. Tvätta alla prover tre gånger i 2x tvättbuffert under 15 minuter vardera vid hybridiseringstemperaturen. Tvätta alla prover tre gånger i 1x tvättbuffert under 15 minuter vardera vid hybridiseringstemperaturen.
- Tvätta alla prover en gång med 1x Natriumklorid natriumcitratbuffert + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) vid hybridiseringstemperaturen. Låt prover svalna till RT.
- Tvätta alla prover två gånger i 1 x SSC + 0,1% Tween under 15 minuter Ersätt denna 1x SSC-lösning med maleinsyra Buffer (MAB) och låt stå i 10 minuter Upprepa MAB waska. Ersätta MAB med block-lösning och inkubera under 1,5 h.
- Utbyta blocket lösning för antikroppslösning (1: 10000 utspädning av antikropp i blocket lösning) och inkubera under 12 h (O / N) vid RT under försiktig omrörning.
5. Färgutveckling och Montering
- Aspirera antikroppslösningen och tvätta 15 gånger med PBTw under 10 min vardera. Ersätta PBTw med 1x Alkaline Phosphatase Buffer (AP) och inkubera under 10 min.
- Även om ovanstående inkubationssteg fortskrider förbereda AP färglösningen (se Tilläggs File 2) - VARNING. Överför materialet till en TCD väl och ersätta 1x AP lösning med AP färgning lösning. Notera den tid nu, så att den tidslängd färgreaktionen äger rum för kan spelas in. Övervaka utvecklingen av färgningsmönstret tills signalen till bakgrundsförhållande är optimalt.
- För att stoppa färgutvecklingen, ta bort 1x AP färglösningen (kassera i lämplig waste behållare), och tillämpa 2 ml PBTw och notera tiden nu. Skölj två gånger med PBTw under 5 minuter vardera. Använd ett av dessa sköljningar för att överföra materialet till en 1,5 ml rör.
- Avlägsna PBTw och applicera 1 ml av 3,7% formaldehyd i PBTw och skaka eller rotera för minst 30 min vid RT (detta kan också göras O / N).
- Tvätta ur fixativ med 3 tvättar i PBT (avyttra avfallsfixerings i en lämplig avfallsbehållare). Tvätta proverna 3 gånger vid 50 ° C i avjoniserat vatten.
OBS! Dessa tvättar eliminera utfällning av salter som kan bli synliga under clearing och visualiserings steg. - Bestäm om proverna ska monteras i bensylbensoat: bensylalkohol (BB: BA, även känd som Murrays klar) eller glycerol.
OBS: Vi föredrar mer kraftfull clearing agent BB: BA som L. stagn embryon är något ogenomskinlig. Prover som skall monteras i BB: måste BA först att uttorkad genom en etanolserie. Prover som skall monteras i 60%glycerol omedelbart kan monteras. - Överför proverna i monteringslösning (BB: BA eller 60% glycerol) med hjälp av en pipett.
OBS: Vid montering i BB: BA detta måste ske i ett glas väl (BB: BA kommer att smälta polykarbonatplast). - Låt prover för att rensa i 5 - 10 min, och sedan montera dem på en bild med hjälp av ett lämpligt antal staplade täck som distanser (ett täck för prover <1 dpfc, 2 Täckglas för prover> 1 dpfc).
OBS: Hela fästen kan nu avbildas med en förening mikroskop med DIC optik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa WMISH färgningsmönster som visas i figur 3 genererades med användning av tekniken beskriven ovan, och återspegla en mängd rumslig uttrycksmönster för gener som är involverade i en rad olika molekylära processer som sträcker sig från skalbildning (Roman gen 1, 2, 3 och 4), till cell-cellsignalering (DPP) till transkriptionsreglering (Brachyury) inom en rad olika utvecklingsstadier. Även om vi inte har kvantifierat uttrycksnivåerna av dessa gener vi förväntar oss att de skulle också variera kraftigt, vilket indikerar att vår metod kan appliceras mot ett brett utbud av genprodukter som uttrycks i alla stadier av utveckling på olika nivåer. Endast en av de gener som presenteras här (DPP) har tidigare beskrivits i L. stagn 21,22. De resultat vi presenterar här är i stort sett i linje med dessa tidigare rapporter, men med betydligt högre spatial reso lution. Den rumsliga Uttrycksmönstret för Brachyury har beskrivits i abalone 23 och limpet 24 och i båda fallen detekterades också i mantelceller vi hittar för L. stagn (Figur 3F). Vi isolerade nya gener 1-4 (från en proteomik skärm syftar till att identifiera genprodukter direkt involverade i skalbildning, och så deras spatiala uttrycksmönster i samband med skalet körteln (Figur 3A och B) eller skal fält (Figur 3C och D) är fullständigt kongruent med mantelbildande funktioner. Dessa resultat indikerar att den höga genomströmning teknik som vi har utvecklat för att ta bort embryon och larver från ägget kapsel, och de efterföljande stadiespecifika permeabilization behandlingar, generera hela Mount prover som kommer att ge hög kvalitet in situ-färgning mönster för ett stort antal olika gener för alla stadier av embryonal och larvutveckling.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1. En sammanfattning Ontogeny av lymnaea stagn och motsvarande Fixering och proteinas-K behandlingar. Representativa bilder av embryon och larver från de första 7 dagarna av utveckling visar en signifikant ökning i storlek (rad 1) och morfologiska komplexitet (raderna 2 och 3) . Dessa utvecklingsmässiga förändringar leda till stora skillnader i lämplig fixeringstiden och proteinas-K koncentrationer som genererar optimala WMISH signaler. För WMISH alla stadier bör fastställas i 3,7% formaldehyd i PBS vid RT under försiktig omrörning i sina ägg kapslar. Alla stadier bör sedan behandlas med den lämpliga proteinas-K-koncentrationen för 10 min. Observera att vi observerar betydande inter-batch variation i aktiviteten av proteinas-K från vår leverantör. Denna variation måste redovisas av performing en runda "kalibrering" WMISH experiment där aktiviteten hos den nya proteinas-K är empiriskt bestämd. De proteinas-K koncentrationer som anges i figuren bör därför behandlas som en inledande guide, men de relativa koncentrationerna mellan utvecklingsstadier (exempelvis två dagar gamla embryon kräver en proteinas-K koncentration 3 gånger högre än dag 1 embryon) är inställda. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Apparat Används för att Decapsule L. stagn Embryon. (A) En översikt av apparaten som effektivt kan ta bort L. stagn embryon och larver från deras kapslar. (B) en förstorad bild avden gula inramade området i (A). En skarp glasnål placeras på mikroskopobjektglaset och sattes in i kisel slang (innerdiameter 1 mm, ytterdiameter 3 mm), så att spetsen skjuter ut ca 20% av vägen in i håligheten av slangen. Glaset nålen sedan också tejpade objektglas och petriskål. (C) En schematisk "plan" syn på den gula inramade delen i A. ägg kapslar innehållande fasta embryon och larver först erhållits med användning av 20 ml spruta. Sprutan fästes sedan vid kisel slang och kapslarna utvisas genom slangen och förbi nålen. Ägg kapselmembran slits av nålen och den frigjorda embryonala och larv material kan hämtas från uppsamlingsskål med en mikropipett. (D) En schematisk "tvärsnitt syn på den gula inramade delen i A. objektglas ser till att nål in i kisel slangen på rätt höjd.
Figur 3. Representativa bilder av WMISH uttrycksmönster mot en mängd olika gener från olika L. . stagnutvecklingsstadier som genereras av den här beskrivna metoden Alla utvecklingsstadier bearbetades såsom beskrivits i ovanstående metod och har monterats och avbildas i BB: BA (Murray tydliga). Ungefärliga åldrar anges i tillp höger om varje panel och orienteringen visas i det nedre högra. Gene ortologianalys (om det är känt) visas i det nedre vänstra hörnet av varje panel. Förkortningar: skal körteln (SG); skal fält (sf); mantel (mt); fot (ft); Decapentaplegic (DPP); dpfc (dagar efter första klyvnings). Alla skal barer är 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs här möjliggör effektiv visualisering av RNA-transkript med förmodligen varierande uttrycksnivåer inom alla utvecklingsstadier av lymnaea stagn. För att ta bort embryon och larver från deras kapslar vi provat en mängd olika kemiska, osmotisk chock och fysiska behandlingar rapporterats för andra encapsulated- utveckla modellorganismer. Men i våra händer den metod vi beskriver här är den enda hög genomströmning teknik som tar bort den hårda kapselmembranet utan att skada de embryon och larver. Följande decapsulation kan materialet antingen lagras eller behandlas med ett skede specifik regim av proteinas-K och sedan hybridiseras till en riboprob. Ytterligare empiriska optimering ansträngningar (oftast fokuserar på probkoncentration och hybridiseringstemperaturen) kan krävas för varje sond / mål. Dessa parametrar (utöver fixerings regimen och proteinas-K-behandlingar) är vanligtvis de mest inflytelserika parametrarnaav någon in situ-experiment (förutsatt att kvaliteten på det fasta materialet och det RNA-sond är av hög standard).
Betydelsen av en lämplig proteinas-K-behandling till det slutliga resultatet av en in situ experiment är av största vikt för L. stagn. Detta återspeglas i det stora utbudet av proteinas-K-koncentrationer krävs av distinkta utvecklingsstadier (som sträcker sig från 0 | ig / ml till 500 | ig / ml). Det är därför viktigt att kunna tilldela en given ägg sträng till en ontogenetiska fönster. För detta ändamål, den riktlinje som vi tillhandahåller i figur 1 medger iscensättningen av utvecklingsmaterial av okända åldrar (en utskrift Version av denna siffra finns i tilläggs fil 3 att användare kan ha nytta att ha mikroskopet när iscensätta material) . Vi noterar att för andra arter av snäckor Proteinase-K behandlingar för WMISH kan antingen hållas konstant för ett brett spektrum av developmental stegen 8,25,26, eller kan utelämnas helt och hållet 27. Detta står i skarp kontrast till situationen i L. stagn. Dessutom medan andra forskargrupper har tidigare rapporterat WMISH uttrycksmönster för flera gener i L. stagn larver (se 22,28,29) den metod som vi beskriver här ger mönster av betydligt högre spatial upplösning. Slutligen har vi observerat signifikant inter-batch variation i aktiviteten av proteinas-K från vår leverantör. Denna variation måste redovisas genom att utföra en runda "kalibrering" WMISH experiment där aktiviteten hos den nya proteinas-K bestäms empiriskt. Alla efterföljande experiment med alikvoter av proteinas-K från det partiet kan då fritt utföras.
Vi tidigare beskrivits en alternativ WMISH metod för L. stagn embryon och larver i andra områden 12. Denna metod beskrivs användningen av mucolytic agent N-acetyl-L-cystein (NAC), ett reduktionsmedel, såsom ditiotreitol (DTT) och en pre-hybridisering behandling med natriumdodecylsulfat (SDS). Vi hittade dessa behandlingar förbättrade färgningsmönster vissa gener för vissa utvecklingsstadier. Fixeringen strategi som vi nyligen utvecklat och beskriver här (om fastställande av larver i deras kapslar) förenklar och påskyndar de åtgärder som krävs för att förbereda material för en in situ experiment, och uppenbarligen eliminerar behovet av empiriskt bestämma ytterligare optimala förhybridisering behandlingar med NAC, DTT eller SDS. Framtida förbättringar av tekniken rapporteras här kan omfatta visualisering av mikroRNA (efter ändringar standard WMISH protokoll som tidigare rapporterats 30), dubbla eller tredubbla märkning av mRNA riktar 31, och fluorescerande visualisering av WMISH signaler 32. Utan tvekan den största begränsningen av tekniken är den totala tid det tar att gå från collecting av materialet, till en digital bild som representerar en given gen-expressionsmönster. På grund av naturen av de biokemiska och biofysiska händelser som måste äga rum under en sådan process är detta en inneboende egenskap hos de flesta in situ hybridisering protokoll.
Lymnaea intar en position inom Metazoa som är extremt underrepresenterade när det gäller modellorganismer. Som ett representativt Spiralian kan lymnaea föra insikt i utvecklingen av distinkta morfologiska funktioner såsom skalbildning 12 och kropps handedness 33-35 och är också en värdefull neuroetologi 36 och neurofysiologi modell 9,37. Kraftfulla tekniker såsom förmågan att effektivt visualisera genexpressionsmönster in situ ökar funktionaliteten hos lymnaea som modellorganism, och breddar de olika frågor som kan användas för att ta itu med. Vid en tidpunkt då generering av stora sekvens datasets (kompletta transcriptomes och även genomen) är relativt rutin, sådana metoder kommer att bli mer relevant för forskare som vill tolka flod av sekvensdata från sådana modeller. Medan lymnaea är en relativt härledd gastropod 38, och har vad som skulle vara en stor genomet i jämförelse med andra modellorganismer (1,22 Gb 39), har det många praktiska och intressanta funktioner som gör den till ett attraktivt modellsystem. De metoder som vi beskriver här utöka verktygslåda tillgänglig för lymnaea och kan vara till nytta för andra arter som genomgår inkapslade utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering till DJJ genom DFG projekt # JA2108 / 2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
