Abstract
Ganse berg in situ hybridisatie (WMISH) is een techniek die het mogelijk maakt voor de ruimtelijke resolutie van nucleïnezuurmoleculen (vaak mRNA) binnen een 'hele mount' het prepareren van weefsels of ontwikkelingsstadium (zoals een embryo of larve) van belang. WMISH is zeer krachtig omdat het aanzienlijk kunnen bijdragen tot de functionele karakterisatie van complexe metazoïsche genomen, een uitdaging die steeds meer een knelpunt wildgroei aan volgende generatie sequentiegegevens. Ondanks de conceptuele eenvoud van de techniek veel tijd vaak nodig om de verschillende parameters die inherent zijn aan WMISH experimenten nieuwe model te optimaliseren; subtiele verschillen in de cellulaire en biochemische eigenschappen tussen soorten weefsels en ontwikkelingsstadia dat één WMISH methode niet voor alle situaties. We hebben een set van WMISH methoden voor het opnieuw opkomende gastropod model poelslak die consistent genereren en ontwikkeldduidelijke WMISH signalen voor een reeks van genen, en in alle ontwikkelingsstadia. Deze werkwijzen zijn het inbrengen van larven van onbekende chronologische leeftijd een ontogenetische venster, het effectief verwijderen van embryo's en larven uit hun ei capsules, de toepassing van een geschikte proteïnase-K behandeling voor elk ontogenetische raam en hybridisatie, post-hybridisatie en immunodetectie stappen. Deze werkwijzen verschaffen een basis van waaruit het resulterende signaal voor een bepaald RNA-transcript verder verfijnd met probe specifieke aanpassingen (voornamelijk probe concentratie en hybridisatietemperatuur zijn).
Introduction
Weekdieren zijn een groep van dieren die het belang van een brede diversiteit aan wetenschappelijke disciplines te houden. Ondanks hun morfologische diversiteit 1, soortenrijkdom (tweede alleen voor de geleedpotigen in termen van soorten nummer 2) en relevantie voor een breed scala aan commerciële 3, 4 medische en wetenschappelijke kwesties 5-8, zijn er relatief weinig weekdieren soorten die aanspraak kunnen maken op zowel goed uitgerust wetenschappelijke modellen en onderhoudsvriendelijk in een laboratoriumomgeving. Een weekdier dat veel wordt gebruikt door disciplines zoals de neurobiologie 9, ecotoxicologie 10 en meer recentelijk de evolutionaire biologie 11,12, is poelslak, vooral vanwege de grote verspreiding en extreme gemak van onderhoud. Ondanks zijn populariteit als een 'model' organisme en zijn lange geschiedenis van gebruik door ontwikkelingsstoornissen biologen 13-19, het bereik en de kracht van moleculaire technieken beschikbaar om de L. stagnalis wetenschappelijke gemeenschap ligt ver achter bij die van de meer traditionele diermodellen (Drosophila, muis, zee-egels, nematoden).
Onze wens om Lymnaea ontwikkelen als een moleculair model komt voort uit een belang in de moleculaire mechanismen die shell vorming leiden. Dit motiveerde ons om een reeks technieken die het mogelijk maken voor de efficiënte, consistente en gevoelige visualisatie van genexpressie tijdens de ontwikkeling Lymnaea 's te verfijnen. Ganse berg in situ hybridisatie (WMISH) wordt op grote schaal gebruikt voor een verscheidenheid van model organismen en is in gebruik voor meer dan 40 jaar 20. In de verschillende gedaanten kan ISH worden gebruikt om ruimtelijk lokaliseren specifieke loci op chromosomen, rRNA, mRNA en micro-RNAs.
Een van de uitdagingen die we nodig hadden aan te pakken voorafgaand aan het verfijnen van een WMISH methode voor L. stagnalis was de kwestie van voorzichtig en efficiënt extraheren van embryo's en larven van verschillende stadia van tHij eikapsels waarin ze zijn gesteld. Deze extractie of "decapsulation", efficiënt moet worden bereikt om voldoende materiaal te verzamelen voor een bepaald experiment in situ, terwijl tegelijkertijd handhaven morfologische en cellulaire integriteit. Terwijl andere model organismen ook ingekapselde ontwikkeling ondergaan, in onze handen geen van de gerapporteerd voor deze soorten methoden kunnen worden met succes toegepast bij L. stagnalis.
De algemene doelstellingen van deze methode zijn dan ook: te extraheren L. stagnalis embryo's en larven van de capsules in een high-throughput fashion, pre-hybridisatie behandelingen die de WMISH signaal optimaliseren, embryo's en larven te bereiden met bevredigende WMISHsignals voor beeldvorming toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: De volgende stappen schets onze methode voor het uitvoeren van een in situ experiment op de embryonale en larvale stadia van L. stagnalis. Wanneer een stap omvat het gebruik van een gevaarlijk chemisch dit wordt aangegeven door het woord 'LET OP' en de nodige veiligheidsprocedures moeten worden aangenomen. Links naar representatieve MSDS sheets voor gevaarlijke chemische stoffen zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. Recepten voor alle reagentia zijn aanwezig bij het tweede Aanvullend File 2.
1. Vergadering van decapsulation Apparatus
- Hiertoe sluit een 20 ml wegwerpspuit te siliconenslang (met een binnendiameter van 1 mm en een buitendiameter van 3 mm) met een P1,000 tip gesneden tot een geschikte lengte zoals getoond in figuur 2A.
- Tape een standaard microscoop dia naar een omgekeerde grote petrischaal. Tape de siliconenslang direct naast het microscoopglaasje zie figuur60; 2C en 2D.
- Rusten getrokken glas naald op de microscoop glijbaan en steekt hem voorzichtig in het silicium slang totdat de punt van de naald steekt ongeveer 20% van de weg over de binnendiameter van de buis (zie figuur 2C en 2D). Zodra de naald in positie tape het naar beneden naar de petrischaal.
- Laat het vrije uiteinde van de siliconenslang te rusten in een petrischaal die de decapsulated materiaal verzamelt.
2. Sample Collection, Fixatie en decapsulation
LET OP: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur uitgevoerd, tenzij anders vermeld.
- Verzamel zorgvuldig ei strings van de muren van een aquarium. Om dit te doen, gebruik dan een vlak stuk van flexibele kunststof als een spatel om het ei koord uit de ondergrond te schrapen, en gebruik een plastic theezeefje naar de drijvende ei snaar te vissen uit het water. Fase en het materiaal onder een microscoop met de geleider verschaft in figuur sorteren1.
- Leg het ei koord op een papieren handdoek en maken een longitudinale incisie langs het ei massa met behulp van de vedergewicht tang. Rol het ei capsules uit het ei string en verwijder zoveel mogelijk van de jelly materiaal mogelijk uit elke capsule door ze rond de papieren handdoek met behulp van de vedergewicht tang.
- Met de vedergewicht tang, overdracht van de eikapsels in een petrischaal met 5 ml leidingwater. Doorgaan met-de jellied ei capsules van de gewenste ontwikkelingsstadia verzamelen in dit gerecht. Verzamel genoeg capsules uit alle ontwikkelingsstadia van de geplande WMISH experiment ga dan naar de volgende stap.
- Bij het werken met meer ontwikkelde larven (5 dagen na de eerste splitsing (dpfc) en ouder) verdoven hen voorafgaand aan de fixatie.
OPMERKING: Hiermee wordt voorkomen dat de spieren van de aanbestedende waarvan de interpretatie van in situ kleurpatronen erg moeilijk maakt.- Relax larven (terwijl ze nog in hun capsules) in een 2% w / v oplossing van MgCl2 • 6H 2 O 30 minuten voor fixatie.
- Beoordeel de mate van ontspanning na 30 min door onderdompeling een aantal larven terwijl nog in hun ei capsules in fixerende oplossing en het toezicht op hun reactie onder een microscoop. Onvolledig ontspannen larven in te schuiven in hun schelpen, terwijl volledig ontspannen larven niet zullen reageren. Zodra deze larven zijn versoepeld doorgaan naar de volgende stap.
- Breng de eikapsels met een wijde boring plastic pipet in een afsluitbare buis die 10 maal het volume van eikapsels verschaft (bijv., Zou 1 ml van vaste capsules een 10+ ml tube vereist).
- Aspireren zoveel mogelijk vloeistof uit de buis en vervangen door een volume fixatief oplossing die 10x de hoeveelheid vaste eikapsels. Voorzichtig zwenken de eikapsels in fixeermiddel bij kamertemperatuur gedurende de geschikte tijd voor elke ontwikkelingsfase (zie figuur 1).
- Discontinue rotatie en laat de capsules te zinken en zuig de fixerende oplossing in een geschikte afvalcontainer.
- Was het ei capsules door vervanging van de fixeeroplossing met fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (PBTw) en roteren bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Zuig het PBTw en tweemaal herhalen.
- Verwijderen embryo's en larven van de capsules met de inrichting (zie paragraaf 1 voor details) getoond in figuur 2. Trek de capsules tot in de 20 ml spuit, sluit de buis en verdrijven de capsules door de buis en voorbij de glazen naald uit in de collectie schotel.
OPMERKING: Normaal moet de meerderheid (> 90%) van alle capsules slechts één doorgang door de inrichting nodig. In veel gevallen is de capsule membraan beschadigd maar embryo's en larven blijven in de gescheurde capsule. Opnieuw verwerken van dit materiaal door simpelweg het opstellen ervan in de spuit en opnieuw wegnemen het. - Verzamel de decapsulated embryo's en larven in een 1,5 ml buis met behulp van een microfoonropipette (een P20 voor 0-3 dagen oude larven, en een P200 voor oudere larven met het einde van de tip afgesneden).
OPMERKING: Een pauze (tot enkele maanden) het protocol kan in dit stadium. Indien dit vereist is, dient de decapsuled materiaal worden verzameld in een 1,5 ml buis voor opslag (verder met de volgende stap). Anders onmiddellijk blijven Protocol 3. - Toestaan embryo's en larven zinken naar de bodem van de buis en zuig de supernatant. Vervang met 33% ethanol (EtOH) in PBTw en laat zitten voor 5-10 min. Herhaal dit met 66% EtOH in PBTw en 100% EtOH. Wassen larven tweemaal in 100% EtOH bij kamertemperatuur. Bewaar het materiaal bij -20 ° C in 100% EtOH.
- Als u klaar bent om verder te gaan, opnieuw te hydrateren de monsters door het verwijderen van de 100% EtOH en te vervangen door 66% EtOH in PBTw, laat zitten voor 5-10 min. Herhaal dit met 33% EtOH in PBTw, laat zitten voor 5-10 min. Tot slot was met 3x 5 minuten wassen van PBTw te zorgen dat alle EtOH wordt verwijderd.
3. Proteinase-K, TEA en Post-fixation
LET OP: Wij vinden het uitvoeren van de volgende stappen in kleine manden met een maaswijdte vloer de meest efficiënte en zachte methode voor het snel uitwisselen van tijdkritische oplossingen. Hoewel deze woning kan worden gemaakt, maken we gebruik van manden (middelgroot) die compatibel zijn met de Intavis InSituPro -Vsi vloeistof handlingrobot (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc) zijn. Dergelijke korven kunnen snel en gemakkelijk worden verplaatst tussen de putjes van een 12 putjes weefselkweekplaat (TCD), teneinde de uitwisseling oplossingen of de oplossing kan worden weggezogen uit de put met een pipet. Als alternatief kunnen alle oplossing beurzen worden uitgevoerd zonder deze manden door simpelweg de bovenstaande vloeistof uit de larven opzuigen. In dit geval zal een zachte draaibeweging alle embryo's en larven geconcentreerd naar het midden van de schaal waardoor de bovenstaande vloeistof van de rand van de put te verwijderen. De volgende gaat uit van de gebruiker is het gebruik van manden voor oplossing uitwisselingen.
- Met behulp van een pipet, Overdracht van embryo's en larven in een mandje zitten in een 12 goed TCD met 2 ml PBTw.
Opmerking. Het aantal embryo's en / of larven die kan worden toegevoegd is afhankelijk van het ontwikkelingsstadium onderzocht, maar een algemene vuistregel is ten minste 25% van het vloeroppervlak zonder embryo / larven (dwz handhaven, niet overladen het mandje). - Bereid een aangrenzend goed met 2 ml van het geschikte proteïnase-K-oplossing (zie figuur 1) en een 2 wells met 2 ml 0,2% Glycine elk. Beweeg elke mand in de put met de juiste concentratie van Proteïnase-K en meteen beginnen met timing.
- Na 10 min bewegen elk mandje in een putje met 0,2% glycine en incubeer gedurende 5 min. Ga dan elke mand in de tweede put met 0,2% Glycine en incubeer gedurende 5 min. Spoel de Glycine met 3x 5 min uitwisseling van 3 ml PBTw.
- Verwijder de PBTw oplossing en eenmaal de behandeling van de monsters met vers bereide Triethanolamine (TEA) solution gedurende 5 minuten LET OP! Niet schudden. Vervangen door 3 ml vers bereide TEA-oplossing gedurende 5 min. Niet schudden. Zuig het merendeel van de TEA-oplossing uit de monsters. Voeg de vers bereide Triethanolamine met azijnzuuranhydride (TEAAA) oplossing en incubeer gedurende 5 min. LET OP! Niet schudden.
- OPTIE - Terwijl de bovenstaande stap incubatie, bereiden een verse partij van TEAAA oplossing en herhaal de bovenstaande stap.
LET OP: Deze tweede behandeling met TEAAA is optioneel, maar kan helpen om alle achtergrond met sondes gevoelig zijn voor het genereren van de achtergrond volledig te elimineren. - Verwijder de TEAAA oplossing opzuigen uit de put en vervangen door 3 ml PBTw. Niet schudden. Verwijder de PBTw en 3 ml 3,7% formaldehyde toepassing PBTw. Zwenk af en toe tijdens een 30 minuten incubatie.
- Verwijder het fixeermiddel door opzuigen uit de put en vervangen door 3 ml PBTw. Breng het materiaal in een 1,5 ml buis. RVervang het PBTw de hybridisatie buffer en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur - Pas.
- Plaats de buizen in een heet blok bij kamertemperatuur en de temperatuur op de gewenste hybridisatietemperatuur.
OPMERKING: De hybridisatietemperatuur is probe specifiek en moet empirisch worden geoptimaliseerd, maar vinden we 55 ° C een goede temperatuur initieel proces zijn. Laat het blok naar de hybridisatietemperatuur komen en laat de monsters vooraf hybridiseren gedurende ongeveer 15 minuten (dat wil zeggen, de tijd die nodig is om de riboprobes bereiden, langer is niet nodig). Bereid voldoende volumes (normaal 100 pl) van de verdunde riboprobes. Wij doorgaans proef probe concentraties van 100 en 500 ng / ml als een eerste reeks. We bereiden riboprobes volgens 12. - Verwijder de hybridisatiebuffer uit de monsters en voeg de probe in hybridisatiebuffer aan de monsters. Overlay met 100 ui (of een voldoende volume om een fase boven de hybridisatie buffe vormenr) minerale olie.
OPMERKING: De minerale olie voorkomt uitgebreide condenswater dat tijdens de langdurige hybridisatiestap vormen. Uitgebreide condensatie aanzienlijk veranderen zowel de chemie van de hybridisatie oplossing en de concentratie van de probe. - Denatureren de probe en het doel-RNA door het verwarmen van de monsters tot 75 ° C gedurende 10 minuten, dan het vuur de gewenste hybridisatietemperatuur. Sta hybridisatie doorgaan gedurende minimaal 12 uur (O / N) of meer (24-48 uur).
- Tijdens hybridisatie verwijderen van een enkele buis van de hitte blok, draai het snel tussen duim en wijsvinger aan de larven te schorten zonder de oliefase te verstoren, en te vervangen in de hitte blok. Herhaal dit eenmaal per 6-12 uur of zo.
4. Hot wast en Immunodetectie
LET OP: Terwijl we een vloeistof handlingrobot gebruiken voor de volgende stappen, kunnen deze ook gemakkelijk met de hand worden gedaan. In dit geval, embryo's en larven shoULD in 1,5 ml buisjes ze werden gehybridiseerd in bewaard. Alle volgende oplossing uitwisselingen worden opgezogen en toegevoegd met een pipet P1,000. Bij het handmatig uitgevoerd elk van de volgende stappen 1 ml van elke oplossing moet gebruiken.
- Warmte adequate volumina (3 ml elk per monster) van de 4x, 2x en 1x wasoplossingen de hybridisatietemperatuur.
- Was alle monsters driemaal 4x wasbuffer gedurende 15 min elk bij de hybridisatietemperatuur. Was alle monsters driemaal 2x wasbuffer gedurende 15 min elk bij de hybridisatietemperatuur. Was alle monsters driemaal in 1 x wasbuffer gedurende 15 min elk bij de hybridisatietemperatuur.
- Was alle monsters één keer met 1x natriumchloride Natriumcitraat buffer + 0,1% Tween (SSC + 0,1% Tween) aan de hybridisatie temperatuur. Sta monsters afkoelen tot kamertemperatuur.
- Was alle monsters tweemaal in 1x SSC + 0,1% Tween gedurende 15 min Vervang dit 1x SSC oplossing met maleïnezuur Buffer (MAB) en laat zitten voor 10 min Herhaal de MAB was. Vervang MAB met blok-oplossing en incubeer gedurende 1,5 uur.
- Wisselen het blok oplossing antilichaamoplossing (1: 10.000 verdunning van antilichaam in blokkeeroplossing) en incubeer 12 uur (O / N) bij kamertemperatuur onder zacht schudden.
5. Kleur Ontwikkeling en Montage
- Zuig het antilichaamoplossing en was 15 maal met PBTw gedurende 10 minuten elk. Vervang PBTw met 1x alkalisch fosfatase Buffer (AP) en incubeer gedurende 10 min.
- Terwijl de bovenstaande incubatie stap verloopt, de voorbereiding van de AP kleuroplossing (zie aanvullende File 2) - LET OP. Transfer van het materiaal in een TCD goed en vervang de 1x AP oplossing AP kleuroplossing. Noteer de tijd zodat de tijd dat de kleurreactie plaats te kunnen worden opgenomen. Bewaken van de ontwikkeling van het kleurpatroon tot de signaal achtergrond verhouding optimaal.
- Om kleur ontwikkeling te stoppen, verwijder de 1x AP kleuroplossing (afvoeren in de daarvoor bestemde waste container), en pas 2 ml PBTw en noteer de tijd. Spoel tweemaal met PBTw gedurende 5 minuten elk. Een van deze spoelingen om het materiaal in een 1,5 ml buis.
- Verwijder de PBTw en 1 ml 3,7% formaldehyde toepassing PBTw en schudden of roteren gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (dit kan ook O / N).
- Spoel het fixeermiddel met 3 wasbeurten van PBT (gooi het afval fixeermiddel in een geschikte afvalcontainer). Was de monsters 3 keer bij 50 ° C in gedeïoniseerd water.
LET OP: Deze wasbeurten elimineren het neerslaan van zouten die tijdens het opruimen en visualisatie stappen zichtbaar kunnen worden. - Beslis of de monsters in benzylbenzoaat worden gemonteerd Benzylalcohol (BB: BA, ook bekend als Murray wissen) of glycerol.
LET OP: Wij verkiezen de meer krachtige clearing-agent BB: BA als L. stagnalis embryo's zijn enigszins ondoorzichtig. Monsters in BB worden gemonteerd: BA zal eerst moeten worden ontwaterd door middel van een ethanol-serie. Monsters 60% te monterenglycerol kunnen direct worden gemonteerd. - Breng de monsters in de bevestigingsoplossing (BB: BA of 60% glycerol) met een pipet.
LET OP: Bij montage in BB: BA dit moet gebeuren in een glazen goed (BB: BA zal polycarbonaat plastic smelten). - Laat de monsters vrij te maken voor 5-10 min, en vervolgens zet ze op een dia met behulp van een geschikt aantal gestapelde dekglaasjes als afstandhouders (1 dekglaasje voor monsters <1 dpfc, 2 dekglaasjes voor monsters> 1 dpfc).
LET OP: Whole mounts kan nu worden afgebeeld met behulp van een samengestelde microscoop met DIC optiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve WMISH kleurpatronen figuur 3 werden gegenereerd met behulp van de hierboven beschreven techniek, en geven verschillende ruimtelijke expressiepatronen van genen betrokken bij diverse moleculaire processen gaande van shell formatie (nieuw gen 1, 2, 3 en 4), tot cel-cell signaling (Dpp) om transcriptie regulatie (Brachyury) in een heel scala van ontwikkelingsstadia. Hoewel we niet de expressieniveaus van deze genen verwachten we dat ze zou ook gekwantificeerde variëren sterk, wat aangeeft dat onze werkwijze kan worden toegepast op een grote verscheidenheid aan genproducten tot expressie gebracht in alle ontwikkelingsstadia op verschillende niveaus. Slechts één van de hier gepresenteerde genen (Dpp) is eerder beschreven in L. stagnalis 21,22. De resultaten die we hier presenteren zijn grotendeels in overeenstemming met deze eerdere rapporten, maar met aanzienlijk hogere ruimtelijke reso lutie. De ruimtelijke expressiepatroon van Brachyury is beschreven in abalone 23 en limpet 24 en in beide gevallen werd ook gedetecteerd in cellen mantel zoals we voor L. stagnalis (figuur 3F). We isoleerden nieuwe genen 1-4 (van proteoom scherm ontworpen om genproducten die rechtstreeks bij shell vorming identificeren, en zo hun ruimtelijke expressiepatronen geassocieerd met de shell klier (figuur 3A en B) of shell veld (figuur 3C en D) zijn volledig congruent met omhulselvormende functies. Deze resultaten geven aan dat de high throughput techniek die we hebben ontwikkeld voor het verwijderen van embryo's en larven uit het ei capsule, en de volgende trap specifieke permeabilisatie behandelingen genereren ganse berg monsters die hoge kwaliteit oplevert in situ kleuring patronen voor een grote verscheidenheid van genen voor alle fasen van de embryonale en larvale ontwikkeling.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figuur 1. Samengevat ontogenie van poelslak en overeenkomstige fixatie en Proteïnase-K behandelingen. Representatieve beelden van embryo's en larven van de eerste 7 dagen van ontwikkeling tonen een aanzienlijke toename in grootte (rij 1) en morfologische complexiteit (rijen 2 en 3) . Deze ontwikkelingsveranderingen vertalen in grote verschillen in de juiste fixatie tijd en Proteïnase-K concentraties die optimale WMISH genereren. Voor WMISH alle stadia van 3,7% formaldehyde in PBS moet worden vastgesteld bij kamertemperatuur onder zacht schudden in hun ei capsules. Alle fasen moet dan worden behandeld met het geschikte proteïnase K-concentratie 10 min. Merk op dat we aanzienlijke inter-batch variatie waarnemen in de activiteit van Proteïnase-K van onze leverancier. Deze variatie moet rekening worden gehouden door Performing een rondje "kalibreren" WMISH experimenten waarbij de activiteit van het nieuwe Proteïnase-K empirisch bepaald. Het proteïnase-K concentraties van de figuur moet daarom worden beschouwd als een eerste lijst, maar de relatieve concentraties van ontwikkelingsstadia (bijvoorbeeld 2 dagen oude embryo's vereisen een proteïnase-K concentratie 3 keer hoger dan dag 1 embryo's) worden ingesteld. Zoom klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De apparatuur voor Decapsule L. stagnalis Embryo's. (A) Een overzicht van de apparatuur die efficiënt L. kan verwijderen stagnalis embryo's en larven van de capsules. (B) een vergrote weergave vande gele doos gebied (A). Een scherpe glazen naald wordt op het microscoopglaasje en ingebracht in de siliconenslang (inwendige diameter 1 mm, uitwendige diameter 3 mm) zodat het uiteinde uitsteekt ongeveer 20% van de weg in de holte van de buis. De glazen naald wordt dan ook vastgebonden aan de microscoop glijbaan en de petrischaal. (C) Een schematische "plan" weergave van de gele boxed sectie in A. Egg capsules met vaste embryo's en larven worden eerst verzameld met behulp van de injectiespuit 20 ml. De spuit wordt dan aan de siliconenslang en capsules uitgedreven door de buis en voorbij de naald. Egg capsule membranen worden verscheurd door de naald en de bevrijde embryonale en larvale materiaal kan worden verzameld uit de collectie schotel met behulp van een micropipet. (D) Een schematische 'dwarsdoorsnede' aanzicht van de gele boxed sectie in A. De microscoop dia zorgt ervoor dat de naald in het silicium slangen op de juiste hoogte.
Figuur 3. Vertegenwoordiger Beelden van WMISH Expression Patterns tegen een verscheidenheid van genen van een Range van L. . stagnalis ontwikkelingsstadia die door de hier beschreven methode alle ontwikkelingsstadia werd verwerkt zoals beschreven voor de bovenstaande werkwijze en werden gemonteerd en afgebeeld in BB: BA (Murray clear). Geschatte leeftijd zijn aangegeven in dep recht van elk paneel en de oriëntatie wordt aangegeven in de rechter benedenhoek. Gene orthologie (indien bekend) wordt aangegeven in de linkerbenedenhoek van elk paneel. Afkortingen: shell klier (sg); shell veld (sf); mantel (mt); voet (ft); Decapentaplegic (Dpp); dpfc (dagen na de eerste splitsing). Alle schaal bars zijn 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode maakt de efficiënte visualisatie van RNA transcripten met vermoedelijk variërende expressieniveaus in alle ontwikkelingsstadia van poelslak. Embryo's en larven van de capsules te verwijderen we uitgetest diverse chemicaliën, osmotische shock en fysische behandelingen gerapporteerd voor andere encapsulated- het ontwikkelen van model organismen. In onze handen de hier beschreven werkwijze is het enige high-throughput techniek die de taaie capsulaire membraan verwijderd zonder beschadiging van de embryo's en larven. Na decapsulation kan het materiaal ofwel worden opgeslagen, of behandeld met een verdieping specifieke behandeling met proteïnase-K en gehybridiseerd met een riboprobe. Aanvullende empirische optimalisatie inspanningen (meestal gericht op probeconcentratie en hybridisatietemperatuur) kan voor elke probe / doel. Deze parameters (naast de fixatie regime en Proteïnase-K behandelingen) zijn meestal de meest invloedrijke parametersvan elke experiment in situ (in de veronderstelling dat de kwaliteit van het vaste materiaal en de RNA probe van een hoog niveau).
Het belang van een adequate proteïnase K-behandeling om het uiteindelijke resultaat van een experiment in situ grootste belang is voor L. stagnalis. Dit blijkt uit het grote aantal Proteïnase-K concentraties vereist verschillende ontwikkelingsstadia (van 0 pg / ml tot 500 ug / ml). Het is daarom belangrijk om in staat zijn een bepaalde tekenreeks ei toewijzen aan een ontogenetisch venster. Te dien einde, de richtlijn die wij in figuur 1 zorgt voor de enscenering van ontwikkelings materiaal van onbekende leeftijd (een print vriendelijke versie van dit bedrag is beschikbaar in aanvullende File 3 die gebruikers nuttig kunnen vinden om te hebben bij de microscoop wanneer staging materiaal) . Wij merken op dat voor andere soorten van buikpotigen Proteïnase-K behandelingen voor WMISH kan ofwel worden constant voor een breed scala van develo gehoudenpmental ensceneert 8,25,26, of kan geheel 27 worden weggelaten. Dit staat in schril contrast met de situatie in L. stagnalis. Bovendien, terwijl andere onderzoeksgroepen eerder hebben gemeld WMISH expressie patronen voor verschillende genen in L. stagnalis larven (zie 22,28,29) de methode die we hier beschrijven levert patronen van aanzienlijk hogere ruimtelijke resolutie. Tot slot hebben we aanzienlijke inter-batch variatie waargenomen in de activiteit van het proteïnase-K van onze leverancier. Deze variatie worden verklaard door het uitvoeren van een ronde van "kalibreren" WMISH experimenten waarbij de activiteit van het nieuwe Proteïnase-K empirisch bepaald. Alle daaropvolgende experimenten met monsters van Proteïnase-K van die partij kan dan vrij worden uitgevoerd.
We eerder beschreven alternatieve werkwijze voor WMISH L. stagnalis embryo's en larven elders 12. Deze methode beschreven het gebruik van de mucolytic middel N-acetyl-L-cysteïne (NAC), een reducerend middel zoals dithiothreitol (DTT) en een pre-hybridisatie behandeling met natriumdodecylsulfaat (SDS). We vonden de behandelingen verbeterd de kleurpatronen van sommige genen voor bepaalde ontwikkelingsstadia. De fixatie strategie die we recent ontwikkelde en beschrijf hier (vaststelling van larven in hun capsules) vereenvoudigt en versnelt de stappen die nodig zijn om materiaal te bereiden op een in situ experiment, en blijkbaar ontkent de noodzaak van empirisch bepalen van extra optimale pre-hybridisatie behandelingen met NAC, DTT of SDS. Toekomstige verfijningen aan de hier vermelde techniek kan onder meer de visualisatie van microRNAs (volgende wijzigingen aan de norm WMISH protocollen eerder gemeld 30), dubbele of drievoudige etikettering van mRNA richt 31, en TL-visualisatie van WMISH signalen 32. Misschien wel de grootste beperking van de techniek is de totale lengte van de tijd die het kost om van collecting materiaal, een digitaal beeld dat een bepaald gen expressiepatroon vertegenwoordigt. Vanwege de aard van de biochemische en biofysische gebeurtenissen die moeten plaatsvinden tijdens een dergelijke werkwijze is dat een inherent kenmerk van de meeste in situ hybridisatie protocollen.
Lymnaea neemt een positie binnen de Metazoa dat zeer ondervertegenwoordigd in termen van model organismen. Als vertegenwoordiger Spiralian, kan Lymnaea brengen inzicht in de evolutie van de verschillende morfologische kenmerken zoals shell vorming 12 en lichaam zelfverheffing 33-35 en is ook een waardevolle neuroethology 36 en neurofysiologie model 9,37. Krachtige technieken zoals de mogelijkheid om efficiënt visualiseren genexpressie patronen in situ verhoogt de functionaliteit van Lymnaea als modelorganisme, en vergroot het aantal vragen dat het kan worden gebruikt om aan te pakken. In een tijd waarin het genereren van grote opeenvolging DATasets (complete transcriptoom en zelfs genoom) relatief routinematige dergelijke werkwijzen zal relevanter voor onderzoekers die de stroom van sequentiegegevens uit dergelijke modellen worden geïnterpreteerd. Lymnaea terwijl een relatief afgeleide gastropode 38 en bezit wat beschouwd een groot genoom in vergelijking met andere modelorganismen (1,22 Gb 39), heeft veel praktische en interessante eigenschappen die het een aantrekkelijk model systeem. De methoden die we hier beschrijven uitbreiden van de toolbox beschikbaar voor Lymnaea en van nut kan zijn voor andere soorten die ondergaan ingekapseld ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de financiering aan DJJ door de DFG-project # JA2108 / 2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
