Abstract
Всего монтаж гибридизация (WMISH) представляет собой метод , который позволяет для пространственного разрешения молекул нуклеиновых кислот (часто) в мРНК препарата ткани , '' всей монтировки или стадии развития (такие , как эмбрион или личинку) , представляющие интерес. WMISH является чрезвычайно мощным, поскольку он может внести значительный вклад в функциональной характеристике сложных многоклеточных геномов, вызов, который становится все более узким местом с наводнением последовательности данных следующего поколения. Несмотря на концептуальную простоту методики много времени часто требуется, чтобы оптимизировать различные параметры, присущие WMISH экспериментов для новых модельных систем; тонкие различия в клеточном и биохимических свойствах между типами тканей и стадий развития означает, что один метод WMISH может не подходить для всех ситуаций. Мы разработали множество методов WMISH для вновь возникающие брюхоногих модели Большой Прудовик , которые генерируют последовательный ичеткие сигналы WMISH для ряда генов, и на всех стадиях развития. Эти методы включают в себя назначение личинок неизвестного хронологического возраста к онтогенетического окна, эффективное удаление эмбрионов и личинок из их кубышки, применение соответствующего лечения Протеиназный-K для каждого онтогенетического окна и гибридизацию, пост-гибридизацию и иммунологического шаги. Эти методы обеспечивают основу, из которой результирующий сигнал для данного РНК-транскрипта может быть дополнительно уточнена при помощи зонда конкретных корректировок (в первую очередь исследовать концентрацию и температуру гибридизации).
Introduction
Моллюски являются группой животных, которые удерживают интерес широкого разнообразия научных дисциплин. Несмотря на их морфологическое разнообразие 1, богатство видов (уступает только членистоногих с точки зрения видового числа 2) и отношение к широкому кругу коммерческих 3, 4 медицинских и научных вопросов 5-8, существует относительно небольшое число видов , которые моллюсков могут претендовать быть как хорошо оснащенные научные модели и легко поддерживать в лабораторных условиях. Один моллюск , который используется много дисциплин , таких как нейробиологии 9, экотоксикологии 10 и более недавно эволюционной биологии 11,12, является Большой Прудовик, в первую очередь из - за его широкого распространения и легкость в обслуживании. Несмотря на свою популярность как «модель» организма и его долгую историю использования онтогенетики 13-19, диапазон и мощности молекулярных инструментов , доступных для L. stagnAlis научное сообщество находится далеко отстает от более традиционных моделей животных (Drosophila, мышь, морского ежа, нематоды).
Наше желание развивать Lymnaea как молекулярная модель связана с интересом в молекулярных механизмах , которые направляют формирование оболочки. Это побудило нас уточнить набор методов , которые позволили бы эффективной, последовательной и чувствительной визуализации экспрессии генов в процессе развития Lymnaea 's. Всего монтаж гибридизация (WMISH) широко используется для различных модельных организмов и используется уже в течение более чем 40 лет 20. В своих различных формах, ISH могут быть использованы для пространственно локализовать специфические локусы на хромосомах, рРНК, мРНК и микро-РНК.
Одна из проблем , нам необходимо обратиться до уточнения метода WMISH для L. stagnalis был вопрос мягко и эффективно добывающим эмбрионов и личинок разных стадиях от тон кубышки, в которых они оседают. Это извлечение, или "декапсуляция ', должно быть достигнуто эффективно для того , чтобы собрать материал , достаточного для данного эксперимента на месте, в то же время сохраняя при этом морфологические и клеточную целостность. В то время как другие модели организмы также подвергаются инкапсулированы развитию, в наших руках ни один из методов , представленных за этих видов не может быть успешно применен в L. stagnalis.
Общие цели этого метода являются поэтому: чтобы извлечь L. stagnalis эмбрионов и личинок из их капсул в высокой пропускной способности моды, применять предварительно гибридизационных процедуры , которые оптимизируют сигнал WMISH, для подготовки эмбрионов и личинок с удовлетворительными WMISHsignals для работы с изображениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Следующие шаги описывают наш метод с целью проведения на месте эксперимента на эмбриональных и личиночных стадий L. stagnalis. В случае , если шаг предполагает использование опасных химических веществ это обозначается словом «Внимание» и все соответствующие процедуры безопасности должны быть приняты. Ссылки на репрезентативных MSDS листы для опасных химических веществ содержатся в дополнительном файле 1. Рецепты для всех реагентов представлены в дополнительном файле 2.
1. Сборка декапсуляция аппарата
- Для этого необходимо подключить 20 - мл шприц одноразового для силиконовых труб (с внутренним диаметром 1 мм и наружным диаметром 3 мм) с использованием разреза P1,000 наконечника до соответствующей длины , как показано на рисунке 2А.
- Лента стандартного микроскопа к перевернутой большую чашку Петри. Лента трубки кремния , непосредственно прилегающей к предметное стекло микроскопа , как показано на рисунке60; 2С и 2D.
- Отдых потянул стеклянную иглу на предметное стекло микроскопа и аккуратно вставьте его в трубку кремния , пока кончик иглы не будет выступать примерно на 20% пути через внутренний диаметр трубы (см рис 2С и 2D). После того, как игла находится в положении ленты его вниз к чашке Петри.
- Разрешить свободный конец трубки кремния отдыхать в другой чашке Петри, которая будет собирать декапсулируются материал.
2. Сбор образцов, Фиксирование и декапсуляция
Примечание: Все этапы выполняются при комнатной температуре, если не указано иное.
- Осторожно собрать яичные строки из стен аквариума. Для этого используйте плоский кусок гибкого пластика, как лопаточкой, чтобы очистить яйцо строку от основы, и использовать пластиковую ситечко для рыбы строку плавающей яйца из воды. Стадия и сортировать материал под микроскопом , используя направляющую представленную на рисунке1.
- Поместите строку яйцо на бумажное полотенце и сделать продольный разрез вдоль яйцемассы с помощью полулегком щипцов. Кидайте кубышки из строки яйца и удалить как можно больше студенистой материала, как можно дальше от каждой капсулы, вставив их вокруг бумажного полотенца, используя полулегком щипцов.
- Используя полулегком щипцов, передать кубышку в чашку Петри, содержащую 5 мл водопроводной воды. Продолжайте собирать де-заливной кубышки желаемых стадий развития в это блюдо. Собрать достаточное количество капсул из всех стадий развития для планируемого эксперимента WMISH затем перейти к следующему шагу.
- При работе с более развитой личинки (5 дней после первого расщепления (dpfc) и старше) Анестезировать их до фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит предотвратить мышцы от заражения , что делает интерпретацию окрашивания образцов на места очень сложных в.- Расслабьтесь личинки (в то время как они все еще находятся в их Capsuле) в 2% вес / об раствора MgCl 2 • 6H 2 O в течение 30 мин до начала фиксации.
- Оценить степень релаксации через 30 мин, погружая несколько личинок в то же время в их кубышки в растворе закрепителя и контроль за их реакцию под микроскопом. Неполностью расслаблены личинки втягиваться в скорлупе, в то время как полностью расслаблен личинки не будет реагировать. После того, как эти личинки были смягчены перейти к следующему шагу.
- Передача кубышку с использованием широкого отверстие пластиковой пипетки в герметичную трубку , которая обеспечивает в 10 раз больше объема кубышки (например., 1 мл осажденных капсулы потребуется мл трубки 10+).
- Отберите столько жидкости, насколько это возможно из трубы и заменить с объемом закрепляющего раствора, который в 10 раз объем оседлых кубышки. Осторожно вращать кубышки в закрепителя при комнатной температуре в течение соответствующего времени для каждой стадии развития (см рисунок 1).
- Discontinвращение у.е и позволяют капсулы погружаться и аспирация Фиксирующий раствор в соответствующий контейнер для отходов.
- Промыть кубышку путем замены Фиксирующий раствор с фосфатным буферным солевым раствором с 0,1% твина-20 (PBTw) и вращение при комнатной температуре в течение 5 мин. Аспирируйте PBTw и повторить дважды.
- Удалить эмбрионов и личинок из их капсул с использованием устройства (смотри раздел 1 для деталей) показано на рисунке 2. Нарисуйте капсулы вверх в 20 мл шприц, присоедините трубку и затем рассеять капсулы через трубку и мимо стеклянной иглы из в коллекция блюдо.
Примечание: Как правило, большинство (> 90%) всех капсул должны только один проход через устройство. Во многих случаях капсула мембрана повреждена, но эмбрионы и личинки остаются внутри разорванной капсулы. Обработать этот материал, просто проводя ее в шприц и рассеивать его снова. - Сбор декапсулируются эмбрионов и личинок в текущем 1,5 мл трубки с помощью микрофонаropipette (а Р20 на 0 - 3-дневного возраста личинок, и Р200 для старшего личинок с концом наконечника отрезан).
Примечание: пауза (до нескольких месяцев) в протоколе можно сделать на данном этапе. Если это требуется, то decapsuled материал должен быть собран в 1,5 мл пробирку для хранения (переходите к следующему шагу). В противном случае немедленно продолжить к Протоколу 3. - Разрешить эмбрионов и личинок опускаться на дно пробирки и аспирата супернатант. Заменить на 33% этилового спирта (этанола) в PBTw и пусть сидят в течение 5 - 10 мин. Повторите с 66% этанола в PBTw и 100% этанола. Промыть личинок дважды в 100% этанола при комнатной температуре. Хранить материал при температуре от -20 & deg; С в 100% EtOH.
- Когда вы будете готовы продолжить, регидрировать образцы путем удаления 100% этанола и замена с 66% этанола в PBTw, пусть сидят в течение 5 - 10 мин. Повторите с 33% этанола в PBTw, пусть сидят в течение 5 - 10 мин. Наконец мыть с 3-кратным 5 мин моет PBTw, чтобы гарантировать, что все этанол удаляется.
3. протеиназы-К, TEA и пост-Fixation
Примечание: Мы находим, выполнив следующие действия в маленьких корзинках с полом сетки наиболее эффективный и щадящий метод для быстрого обмена критичных по времени решения. Хотя это может быть домашний, мы используем корзины (среднего размера), которые совместимы с Intavis InSituPro -Vsi обработки жидкого робота (www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc~~HEAD=pobj). Такие корзины могут быть быстро и легко перемещаться между лунки 12-луночных блюдо культуры ткани (ТКД) с целью обмена решений, или раствор может быть отсасывают из скважины с помощью пипетки. В качестве альтернативы, все обмены решение может быть выполнено без этих корзин просто аспирационных супернатант из личинок. В этом случае пологий вихревое движение сконцентрируется все эмбрионы и личинки в центр чашки, позволяя супернатант быть удалены от края колодца. Далее предполагается, что пользователь применяет корзины для обмена решений.
- С помощью пипеткиЭмбрионы передачи и личинки в корзине сидит в TCD 12 а с 2 мл PBTw.
Примечание:. Число эмбрионов и / или личинок , которые могут быть добавлены зависит от стадии развития расследуется, однако общее правило заключается в том , чтобы поддерживать , по крайней мере 25% от площади свободного эмбрионов / личинки (то есть, не загромождать корзины). - Готовят смежный хорошо с 2 мл соответствующего раствора протеиназы-К (см рисунок 1), а еще 2 скважины с 2 мл 0,2% глицин каждого. Перемещение каждой корзины в лунку, содержащую соответствующую концентрацию протеиназы-К и сразу же начинают отсчет времени.
- Через 10 мин перемещения каждой корзины в лунку, содержащую 0,2% глицин и инкубировать в течение 5 мин. Затем переместить каждую корзинку во вторую скважину с 0,2% глицин и инкубировать в течение 5 мин. Промойте глицина с 3-кратным 5 мин обмена 3 мл PBTw.
- Удалите раствор PBTw и обработать образцы один раз со свежеприготовленным триэтаноламина (TEA) золь5 социологическое загрязнение в течение мин ВНИМАНИЕ! Не перемешивать. Заменить 3 мл свежеприготовленного раствора ТЭА в течение 5 мин. Не перемешивать. Аспирируйте большинство TEA раствора из образцов. Добавляют свежеприготовленный раствор триэтаноламина с уксусным ангидридом (TEAAA) и инкубируют в течение 5 мин. ОСТОРОЖНО! Не перемешивать.
- ДОПОЛНИТЕЛЬНО - Хотя в приведенном выше стадию инкубации, подготовить другой свежую порцию TEAAA раствора и повторите описанные выше действия.
Примечание: Эта вторая обработка TEAAA не является обязательным, но может помочь, чтобы полностью устранить все фон с зондами, склонных к генерации фона. - Удалите раствор TEAAA аспирационных его из колодца и заменить с 3 мл PBTw. Не перемешивать. Удалите PBTw и нанесите 3 мл 3,7% формальдегида в PBTw. Аккуратно водоворот иногда в течение 30 мин инкубации.
- Удалите закрепитель аспирационных его из колодца и заменить с 3 мл PBTw. Передача материала в 1,5 мл пробирку. рeplace в PBTw с гибридизационного буфера и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре - ВНИМАНИЕ.
- Место труб в горячем блоке при комнатной температуре, и установить температуру до желаемой температуры гибридизации.
Примечание: Температура гибридизации зонда конкретны и должны быть эмпирически оптимизированы, однако мы находим 55 ° C, чтобы быть хорошей температуры на начальном этапе судебного разбирательства. Разрешить блок прийти к температуре гибридизации, и позволяют образцы предварительно гибридизуются в течение примерно 15 мин (т.е. время, необходимое для подготовки рибозонды, больше не надо). Подготовка необходимых объемов (обычно 100 мкл) разбавленного рибонуклеотидными зондами. Как правило, мы пробные концентрации зондовые 100 и 500 нг / мл в качестве первоначального диапазона. Мы готовим рибозонды согласно 12. - Удалить буфер гибридизации из образцов и добавить зонд в буфере для гибридизации с образцами. Накладка с 100 мкл (или достаточного объема с образованием фазы над гибридизацией Buffeг) минерального масла.
ПРИМЕЧАНИЕ: минеральное масло предотвращает обширное образование конденсата, который образуется в течение длительного стадии гибридизации. Обширные конденсация существенно изменить как химический состав раствора гибридизации и концентрацию зонда. - Денатурации зонд и РНК-мишени путем нагрева образцов до 75 ° С в течение 10 мин, затем уменьшить нагрев до требуемой температуры гибридизации. Разрешить гибридизацию проводили в течение минимум 12 ч (O / N) или более (24 - 48 ч).
- Во время гибридизации удалить одну трубку из теплового блока, поверните его быстро между большим и указательным пальцами, чтобы приостановить личинки, не нарушая масляной фазы, и заменить его в тепловом блоке. Повторите этот раз каждые 6 - 12 ч или около того.
4. Горячие промывает и иммунологического
Примечание: В то время как мы используем жидкую обработку робота для следующих шагов, они могут также легко быть сделано вручную. В этом случае, эмбрионы и личинки ShoULD храниться в 1,5 мл пробирки они были гибридизированных. Все последующие обмены раствор отсасывают и добавляют с P1,000 пипеткой. Когда выполняется вручную каждого из следующих шагов следует применять по 1 мл каждого раствора.
- Тепло адекватные объемы (3 мл каждый для каждого образца) от 4x, 2x и 1x промывные растворы до температуры гибридизации.
- Промыть образцы три раза в 4х промывочного буфера в течение 15 минут каждый при температуре гибридизации. Промыть образцы три раза в 2Х буфера для промывки в течение 15 мин при каждой температуре гибридизации. Промыть образцы три раза в 1X буфера для промывки в течение 15 мин при каждой температуре гибридизации.
- Промыть все образцы один раз с 1x Хлорид натрия цитрата натрия буфере + 0,1% твин (SSC + 0,1% Tween) при температуре гибридизации. Разрешить образцы для охлаждения до комнатной температуры.
- Вымойте все образцы дважды в 1x SSC + 0,1% твина в течение 15 мин Заменить этот 1x SSC раствор с малеиновой кислотой буфера (МАБ) и оставьте на 10 мин Повторите МАВ жпепел. Заменить МАВ с блоком раствора и инкубируют в течение 1,5 ч.
- Заменить блок решение для раствора антител (1: 10000 разбавления антитела в блочной растворе) и инкубируют в течение 12 ч (O / N) при комнатной температуре и при легком помешивании.
5. Цвет развития и монтажа
- Аспирируйте раствора антител и мыть в 15 раз с PBTw в течение 10 минут каждый. Заменить PBTw с 1x щелочной фосфатазы буфера (AP) и инкубировать в течение 10 мин.
- Хотя приведенные выше инкубации шаг продолжается, готовят раствор для окрашивания AP (см Дополнительный файл 2) - ВНИМАНИЕ. Передача материала в TCD хорошо и заменить 1x раствор AP с AP окрашивания раствором. Обратите внимание, время таким образом, чтобы продолжительность времени реакции цвет имеет место для может быть записан. Контроль за развитием рисунка окрашивания до тех пор, соотношение сигнал фона не является оптимальным.
- Для того, чтобы остановить развитие цвета, удалить окрашивание раствора 1x AP (утилизирует в соответствующем Wastе контейнера), и применять 2 мл PBTw и обратите внимание на время. Промыть два раза больше с PBTw в течение 5 минут каждый. Используйте один из этих полосканий для передачи материала в 1,5 мл пробирку.
- Удалите PBTw и нанесите 1 мл 3,7% формальдегида в PBTw и агитировать или вращаться в течение не менее 30 мин при комнатной температуре (это также может быть сделано O / N).
- Промойте закрепитель с 3-мя промывками PBT (бросайте закрепитель отходов в соответствующий контейнер отходов). Вымойте образцы 3 раза при 50 ° C в деионизированной воде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти смывки устраняют осаждение солей, которые могут стать заметными в процессе очистки и этапы визуализации. - Определите, нужно ли образцы должны быть установлены в бензилбензоат бензиловый спирт (BB: BA, также известный как ясно Мюррей) или глицерин.
Примечание: Мы предпочитаем более мощный осветлитель BB: BA , как L. stagnalis эмбрионы несколько непрозрачным. Образцы должны быть установлены в BB: BA сначала должны быть обезвожены через серии этанола. Образцы, которые будут установлены в 60%глицерин может быть немедленно установлен. - Передача образцов в монтажный раствор (ВВ: ВА или 60% глицерина) с использованием пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При установке в BB: BA это должно быть сделано в стакане скважины (BB: BA будет плавиться поликарбонатный пластик). - Разрешить образцы для очистки в течение 5 - 10 мин, а затем смонтировать их на слайд, используя соответствующее количество сложенных покровных в качестве разделителей (1 покровное для образцов <1 dpfc, 2 покровные для образцов> 1 dpfc).
Примечание: тотальных теперь могут быть визуализируют с помощью сложного микроскопа с DIC оптики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Окрашивание образцы представитель WMISH , показанные на рисунке 3 , были получены с использованием методики , описанной выше, и отражают разнообразие картины пространственной экспрессии генов , участвующих в диапазоне молекулярных процессов , начиная от формирования оболочки (новый ген 1, 2, 3 и 4), для передачи сигналов межклеточной (ДПП) в регуляции транскрипции (Brachyury) через целый ряд стадий развития. В то время как мы не количественно уровни экспрессии этих генов мы ожидаем, что они также будут значительно отличаться, указывая, что наш метод может быть применен в отношении широкого разнообразия продуктов генов, выраженных во всех стадиях развития на различных уровнях. Только один из генов , представленных здесь (ДПП) были ранее описаны в L. stagnalis 21,22. Результаты, которые мы представляем здесь, в основном в соответствии с этими предыдущих докладах, но со значительно более высоким пространственным РЕСО люция. Пространственная картина экспрессии Brachyury было описано в ушко 23 и лимфы улитки 24 и в обоих случаях также был обнаружен в мантийных клеток , как мы видим , для L. stagnalis (рис 3F). Мы выделили новые гены 1 - 4 (из протеомического экрана , предназначенная для идентификации продуктов генов , непосредственно участвующих в формировании оболочки, и поэтому их пространственные паттерны экспрессии , связанные с железой оболочки (рис 3А и В) или поле оболочки (рис 3C и D) являются полностью совпадают с образующие оболочку функций. Эти результаты указывают на то, что высокая техника пропускной способности мы разработали для удаления эмбрионов и личинок из кубышек, а последующие стадиеспецифический лечения пермеабилизирующего, генерируют целые образцы монтирование , что будет давать высокое качество окрашивания на месте в шаблоны для широкого спектра генов для всех стадий эмбрионального и личиночного развития.
ove_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 ">
Рисунок 1. Обобщенная Онтогения Большой Прудовик и Соответствуя Фиксирование и протеиназы-К лечение. Типичные изображения эмбрионов и личинок из первых 7 дней развития иллюстрируют значительное увеличение размера (строка 1) и морфологической сложности (строки 2 и 3) , Эти изменения развития переводят на большие различия в соответствующее время фиксации и концентрации протеиназы-К, которые генерируют оптимальные сигналы WMISH. Для WMISH все этапы должны быть зафиксированы в 3,7% формальдегида в PBS при комнатной температуре при осторожном перемешивании в их кубышки. Все этапы должны быть затем обработаны с соответствующей концентрации протеиназы-К в течение 10 мин. Обратите внимание, что мы наблюдаем существенное между пакетное изменение в активности протеиназы-К от нашего поставщика. Это изменение должно быть объяснено performiнг раунд "калибрующие" WMISH экспериментов, в которых активность нового протеиназы-K определяется эмпирически. Поэтому концентрации протеиназы-K , указанные на рисунке следует рассматривать в качестве первоначального руководства, однако относительных концентраций между стадиями развития (например , 2 - дневных эмбрионов требуют концентрации протеиназы-K 3 раза выше , чем 1 -й день эмбрионы) установлены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Устройство , используемое для Decapsule L. stagnalis эмбрионы. (A) обзор устройства , который может эффективно удалить L. stagnalis эмбрионов и личинок из их капсул. (В) увеличенный виджелтый коробочный область в (A). Резкое стекло игла помещается на предметное стекло микроскопа и вставляется в трубку кремния (внутренний диаметр 1 мм, внешний диаметр 3 мм) таким образом, что кончик высовывается примерно 20% пути в полость трубки. Стеклянная игла затем также приклеенный к предметное стекло микроскопа и чашки Петри. (С) схематический вид "план" желтого коробочного сечения в A. кубышек , содержащих фиксированные эмбрионы и личинки сначала собранное с помощью 20 мл шприц. Затем шприц прикреплен к трубке кремния и капсулы исключенный через трубку и мимо иглы. Яйцо капсулы мембраны разрываются иглой и освобожденный эмбриональных и личиночной материал может быть собран из коллекции чашки с помощью микропипетки. (D) Схематическое 'сечение' вид желтой секции коробочной в А. микроскопа гарантирует , что игла входит в трубку кремния на нужной высоте.
Рисунок 3. Представитель Изображения WMISH паттернов экспрессии против различных генов из диапазона L. . stagnalis Стадии развития Произведенные методом , описанным здесь Все стадии развития были обработаны , как описано в указанном выше способе и были смонтированы и отображается в BB: BA (ясно , Мюррей). Приблизительный возраст указаны в кр право каждой панели и ориентации указывается в нижнем правом углу. Джин Ортология (если они известны), указывается в левом нижнем углу каждой панели. Сокращения: оболочки железы (Sg); поле оболочки (SF); мантии (т); футов (фут); Decapentaplegic (ДПП); dpfc (дней после первого деления дробления). Все масштабные линейки 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод позволяет эффективно визуализации РНК - транскриптов с предположительно различными уровнями экспрессии в пределах всех стадиях развития Большой Прудовик. Для удаления эмбрионов и личинок из их капсул мы опробовали различные химические, осмотического шока и физических методов лечения сообщалось для других encapsulated- развития модельных организмов. Тем не менее, в наших руках метод, который мы описываем здесь единственный метод с высокой пропускной способностью, которая удаляет жесткую оболочку капсулы без повреждения эмбрионов и личинок. После декапсуляции, материал либо могут быть сохранены, или обрабатывают стадии конкретного режима протеиназы-К, а затем гибридизировали с рибозонд. Необходимы дополнительные усилия эмпирические оптимизации (как правило, сосредоточены на концентрации зонда и температуры гибридизации) может потребоваться для каждого зонда / мишени. Эти параметры (в дополнение к режиму фиксации и лечения протеиназы-К), как правило, наиболее влиятельные параметрылюбого на месте эксперимента (при условии , что качество неподвижного материала и РНК зондов высокого стандарта).
Важность соответствующего лечения Протеиназный-K до конечной результат в эксперименте на месте имеет первостепенное значение для L. stagnalis. Это находит свое отражение в широком диапазоне концентраций протеиназы-К, предписанный отчетливыми стадии развития (в пределах от 0 мкг / мл до 500 мкг / мл). Поэтому важно, чтобы иметь возможность присвоить данную строку яйца к онтогенетического окна. С этой целью руководство , что мы предлагаем на рисунке 1 позволяет для постановки материала развития неизвестных возрастов (а версия для печати этой фигуры доступна в дополнительном файле 3 , которые пользователи могут найти полезным иметь в микроскоп при постановке материала) , Отметим, что для других видов брюхоногих протеиназы-К лечения WMISH может либо оставаться постоянной для широкого диапазона Developmental этапы 8,25,26, или может быть полностью опущен 27. Это резко контрастирует с ситуацией в L. stagnalis. Кроме того, в то время как другие исследовательские группы, ранее сообщалось WMISH паттерны экспрессии нескольких генов в L. личинки stagnalis (см 22,28,29) метод , который мы описываем здесь дает модели значительно более высоким пространственным разрешением. И, наконец, мы наблюдали значительное между пакетное изменение в активности протеиназы-К от нашего поставщика. Это изменение должно быть учтено путем проведения раунда "калибрующие" WMISH экспериментов, в которых активность нового протеиназы-K определяется эмпирически. Все последующие эксперименты с аликвот протеиназы-K из этой партии может быть затем свободно выполняться.
Ранее мы описали альтернативный метод WMISH для L. stagnalis эмбрионов и личинок в других местах 12. Этот метод подробно использование mucolytIC агент N-ацетил-L-цистеина (NAC), восстанавливающий агент, такой как дитиотрейтол (DTT) и обработки перед гибридизацией с додецилсульфата натрия (SDS). Мы нашли эти процедуры окрашивания повысили образцы некоторых генов для некоторых стадий развития. Стратегия фиксации , что недавно мы разработали и описать здесь (фиксация личинок в пределах их капсул) упрощает и ускоряет шаги , необходимые для подготовки материалов для эксперимента на месте в, и , видимо , сводит на нет необходимость опытным путем определения дополнительных оптимальных методов лечения предварительной гибридизации с НСС, DTT или SDS. Будущие уточнения к способу , о котором здесь может включать визуализацию микроРНК (следующие модификации стандартных протоколов WMISH сообщалось ранее 30), двойной или тройной маркировки мРНК с таргетингом 31 и флуоресцентный визуализации WMISH сигналов 32. Возможно, самым большим ограничением методики является общая продолжительность времени, которое требуется, чтобы перейти от коллектинг материал, в цифровое изображение, которое представляет заданному образцу экспрессии генов. В связи с характером биохимических и биофизических событий , которые должны произойти во время такого процесса это является неотъемлемой чертой большинства протоколов гибридизация.
Lymnaea занимает позицию в многоклеточных , что крайне недостаточно представлены в терминах модельных организмов. В качестве иллюстративного Spiralian, Lymnaea может принести понимание эволюции различных морфологических признаков , таких как формирование оболочки 12 и тела рукости 33-35 и также является ценным нейроэтология 36 и нейрофизиологии модель 9,37. Мощные методы , такие , как способность эффективно визуализировать паттерны экспрессии генов на месте повышает функциональность Lymnaea в качестве модельного организма, и расширяет спектр вопросов , на которые он может быть использован для решения. В то время, когда поколение большой последовательности DATasets (полный Транскриптом и даже геномы) является относительно рутинные, такие методы станут более актуальными для исследователей, желающих интерпретировать поток данных о последовательности из таких моделей. В то время как Lymnaea является относительно производным брюхоногих 38, и обладает тем, что будет считаться большой геном по сравнению с другими модельных организмов (1.22 Gb) 39, он имеет много практических и интересных особенностей , которые делают ее привлекательной моделью системы. Методы , которые мы описываем здесь расширить набор инструментов доступных для Lymnaea и могут быть использованы для других видов , которые подвергаются инкапсулированных развитию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование для проекта DJJ через DFG # JA2108 / 2-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Featherweight forceps | Ehlert & Partner | #4181119 | |
| Silicon tubing | Glasgerätebau OCHS GmbH | 760070 | |
| Glass capillaries | Hilgenberg | 1403547 | |
| 12 well tissue culture dishes | Carl Roth | CE55.1 | |
| 37% Formaldehyde | Carl Roth | P733.1 | CAUTION - May cause cancer. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Toxic: danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | Carl Roth | CN06.3 | CAUTION - CAUSES EYE IRRITATION. MAY CAUSE RESPIRATORY TRACT AND SKIN IRRITATION. Avoid breathing dust. Avoid contact with eyes, skin and clothing. Use only with adequate ventilation |
| Magnesium Chloride | Carl Roth | 2189.1 | |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium Chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ficoll type 400 | Carl Roth | CN90.1 | |
| polyvinylpyrrolidone K30 (MW 40) | Carl Roth | 4607.1 | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Nuclease freeBovine Serum Albumin | Carl Roth | 8895.1 | |
| Salmon sperm | Carl Roth | 5434.2 | |
| Heparin | Carl Roth | 7692.1 | CAUTION - ADVERSE EFFECTS INCLUDE HEMORRHAGE, LOCAL IRRITATION. POSSIBLE ALLERGIC REACTION IF INHALED, INGESTED/CONTACTED. EYES/SKIN/RESPIRATORY TRACT IRRITANT. POSSIBLE HYPERSENSITIZATION. DURING PREGNANCY HAS BEEN REPORTED TO INCREASE RISK OF STILLBIRTH |
| Proteinase-K | Carl Roth | 7528.1 | |
| Glycine | Carl Roth | 3790.2 | |
| Deionised formamide | Carl Roth | P040.1 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Standard formamide | Carl Roth | 6749.3 | CAUTION - Irritating to eyes and skin. May be harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. May cause harm to the unborn child. Hygroscopic. |
| Triethanolamine | Carl Roth | 6300.1 | CAUTION - Avoid breathing vapor or mist. Avoid contact with eyes. Avoid prolonged or repeated contact with skin. Wash thoroughly after handling. |
| Acetic anhydride | Carl Roth | 4483.1 | CAUTION - CAUSES SEVERE SKIN AND EYE BURNS. REACTS VIOLENTLY WITH WATER. HARMFUL IF SWALLOWED. VAPOR IRRITATING TO THE EYES AND RESPIRATORY TRACT |
| Maleic acid | Carl Roth | K304.2 | CAUTION - Very hazardous in case of eye contact (irritant), of ingestion, . Hazardous in case of skin contact (irritant), of inhalation (lung irritant). Slightly hazardous in case of skin contact (permeator). Corrosive to eyes and skin. |
| Benzyl benzoate | Sigma | B6630-250ML | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. Harmful if swallowed. |
| Benzyl alcohol | Sigma | 10,800-6 | CAUTION - Harmful if swallowed. Harmful if inhaled. Causes serious eye irritation. |
| Glycerol | Carl Roth | 3783.1 | |
| Blocking powder | Roche | 11096176001 | |
| Anti DIG Fab fragments AP conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Tris-HCl | Carl Roth | 9090.3 | |
| 4-Nitro blue tetrazolium chloride in dimethylformamide | Carl Roth | 4421.3 | CAUTION - May cause harm to the unborn child. Harmful by inhalation and in contact with skin. Irritating to eyes. |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate | Carl Roth | A155.3 | CAUTION - Potentially harmful if ingested. Do not get on skin, in eyes, or on clothing. Potential skin and eye irritant. |
| N-acetyl cysteine | Carl Roth | 4126.1 | |
| Dithiothreitol | Carl Roth | 6908.1 | CAUTION - May cause eye and skin irritation. May cause respiratory and digestive tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Tergitol | Sigma | NP40S | CAUTION - May be harmful if inhaled. May cause respiratory tract irritation. May be harmful if absorbed through skin. May cause skin irritation. May cause eye irritation. May be harmful if swallowed. |
| Sodium dodecyl sulphate | Carl Roth | CN30.3 | CAUTION - Harmful if swallowed. Toxic in contact with skin. Causes skin irritation. Causes serious eye damage. May cause respiratory irritation. |
| Potassium Chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4•2H2O) | Carl Roth | 4984.1 | |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.1 | |
| Tri sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7•2H2O) | Carl Roth | 3580.1 | CAUTION - May cause eye, skin, and respiratory tract irritation. The toxicological properties of this material have not been fully investigated. |
| Mineral oil | Carl Roth | HP50.2 | |
| InSituPro-Vsi | Intavis | www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc |
References
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Brusca, R. C., Brusca, G. J. Invertebrates. , Sinauer. Sunderland. (2002).
- Food and Agriculture Organisation of the United Nations. Global Aquaculture Production 1950-2013. , Available from: http://www.fao.org/fishery/statistics/global-aquaculture-production/query/en (2013).
- World Health Organization. Schistosomiasis: number of people treated in 2011. Week. Epi. Rec. 88, 81-88 (2013).
- Henry, J. Q., Collin, R., Perry, K. J. The slipper snail, Crepidula.: an emerging lophotrochozoan model system. Biol. Bull. 218 (3), 211-229 (2010).
- Perry, K. J., Henry, J. Q. CRISPR/Cas9-mediated genome modification in the mollusc, Crepidula fornicata. Genesis. 53 (2), 237-244 (2015).
- Kandel, E. R. The molecular biology of memory storage: a dialog between genes and synapses. Bio. Rep. 24, 475-522 (2004).
- Jackson, D. J., Ellemor, N., Degnan, B. M. Correlating gene expression with larval competence, and the effect of age and parentage on metamorphosis in the tropical abalone Haliotis asinina. Mar. Biol. 147, 681-697 (2005).
- Carter, C. J., Farrar, N., Carlone, R. L., Spencer, G. E. Developmental expression of a molluscan RXR and evidence for its novel, nongenomic role in growth cone guidance. Dev. Biol. 343 (1-2), 124-137 (2010).
- Rittschof, D., McClellan-Green, P. Molluscs as multidisciplinary models in environment toxicology. Mar. Pollut. Bull. 50 (4), 369-373 (2005).
- Liu, M. M., Davey, J. W., Jackson, D. J., Blaxter, M. L., Davison, A. A conserved set of maternal genes? Insights from a molluscan transcriptome. Int. J. Dev. Biol. 58 (6-8), 501-511 (2014).
- Hohagen, J., Herlitze, I., Jackson, D. J. An optimised whole mount in situ. hybridisation protocol for the mollusc Lymnaea stagnalis. BMC Dev. Biol. 15 (1), 19 (2015).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea stagnalis. L. from oviposition till first cleavage. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 91-121 (1946).
- Raven, C. P. The development of the egg of Limnaea Stagnalis. L. from the first cleavage till the troghophore stage, with special reference to its' chemical embryology. Arch. Neth. J. Zool. 1 (4), 353-434 (1946).
- Raven, C. P. Morphogenesis in Limnaea stagnalis. and its disturbance by lithium. J. Exp. Zool. 121 (1), 1-77 (1952).
- Raven, C. P. The nature and origin of the cortical morphogenetic field in Limnaea. Dev. Biol. 7, 130-143 (1963).
- Morrill, J. B., Blair, C. A., Larsen, W. J. Regulative development in the pulmonate gastropod, Lymnaea palustris., as determined by blastomere deletion experiments. J Exp Zool. 183 (1), (1973).
- Van Den Biggelaar, J. A. M. Timing of the phases of the cell cycle during the period of asynchronous division up to the 49-cell stage in Lymnaea. J. Emb. Exp. Morph. 26 (3), 367-391 (1971).
- Verdonk, N. H. Gene expression in early development of Lymnaea stagnalis. Dev. Biol. 35 (1), 29 (1973).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and Detection of Rna-Dna Hybrid Molecules in Cytological Preparations. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 63 (2), 378-383 (1969).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Sarashina, I., Kagi, H., Endo, K. Possible functions of Dpp in gastropod shell formation and shell coiling. Dev Genes Evol. 221 (2), 59-68 (2011).
- Koop, D., Richards, G. S., Wanninger, A., Gunter, H. M., Degnan, B. M. D. The role of MAPK signaling in patterning and establishing axial symmetry in the gastropod Haliotis asinina. Dev. Biol. 311 (1), 200-212 (2007).
- Lartillot, N., Lespinet, O., Vervoort, M., Adoutte, A. Expression pattern of Brachyury in the mollusc Patella vulgata suggests a conserved role in the establishment of the AP axis in Bilateria. Development. 129 (6), 1411-1421 (2002).
- Jackson, D. J., Wörheide, G., Degnan, B. M. Dynamic expression of ancient and novel molluscan shell genes during ecological transitions. BMC Evol. Biol. 7 (1), 160 (2007).
- Jackson, D. J., Meyer, N. P., Seaver, E., Pang, K., McDougall, C., et al. Developmental expression of COE. across the Metazoa supports a conserved role in neuronal cell-type specification and mesodermal development. Dev Genes Evol. 220, 221-234 (2010).
- Perry, K. J., Lyons, D. C., Truchado-Garcia, M., Fischer, A. H. L., Helfrich, L. W., et al. Deployment of regulatory genes during gastrulation and germ layer specification in a model spiralian mollusc. Dev. Dyn. , (2015).
- Iijima, M., Takeuchi, T., Sarashina, I., Endo, K. Expression patterns of engrailed and dpp in the gastropod Lymnaea stagnalis. Dev Genes Evol. 218 (5), 237-251 (2008).
- Shimizu, K., Iijima, M., Setiamarga, D. H. E., Sarashina, I., Kudoh, T., et al. Left-right asymmetric expression of dpp in the mantle of gastropods correlates with asymmetric shell coiling. EvoDevo. 4 (1), 15 (2013).
- Christodoulou, F., Raible, F., Tomer, R., Simakov, O., Trachana, K., et al. Ancient animal microRNAs and the evolution of tissue identity. Nature. 463, (2010).
- Koga, M., Kudoh, T., Hamada, Y., Watanabe, M., Kageura, H. A new triple staining method for double in situ hybridization in combination with cell lineage tracing in whole-mount Xenopus embryos. Dev Growth Differ. 49 (8), 635-645 (2007).
- Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev. Biol. 11 (1), 43 (2011).
- Davison, A., Frend, H. T., Moray, C., Wheatley, H., Searle, L. J., Eichhorn, M. P. Mating behaviour in Lymnaea stagnalis. pond snails is a maternally inherited, lateralized trait. Biol. Lett. 5 (1), 20-22 (2009).
- Kuroda, R., Endo, B., Abe, M., Shimizu, M. Chiral blastomere arrangement dictates zygotic left-right asymmetry pathway in snails. Nature. 462 (7274), 790-794 (2009).
- Shibazaki, Y., Shimizu, M., Kuroda, R. Body handedness is directed by genetically determined cytoskeletal dynamics in the early embryo. Curr. Biol. 14 (16), 1462-1467 (2004).
- Lu, T. Z., Feng, Z. P. A sodium leak current regulates pacemaker activity of adult central pattern generator neurons in Lymnaea stagnalis. PLoS One. 6 (4), e18745 (2011).
- Dawson, T. F., Boone, A. N., Senatore, A., Piticaru, J., Thiyagalingam, S., et al. Gene Splicing of an Invertebrate Beta Subunit (LCav-beta) in the N-Terminal and HOOK Domains and Its Regulation of LCav1 and LCav2 Calcium Channels. PLoS ONE. 9 (4), e92941 (2014).
- Smith, S. A., Wilson, N. G., Goetz, F. E., Feehery, C., Andrade, S. C. S., et al. Resolving the evolutionary relationships of molluscs with phylogenomic tools. Nature. 480 (7377), 364-367 (2011).
- Gregory, T. R., Nicol, J. A., Tamm, H., Kullman, B., Kullman, K., et al. Eukaryotic genome size databases. Nuc. Acids. Res. 35 (Database issue), D332-D338 (2007).
