Abstract
眼透镜是透明的器官，折射和光聚焦，以形成在视网膜上的清晰图像。在人类中，睫状肌收缩变形的透镜，从而增加在透镜“光功率集中于附近的物体，被称为住宿的方法。在镜头的刚度与年龄相关的变化都与老花眼，在适应镜头的能力降低，以及由此延伸，需要老花镜。尽管鼠标镜头不适合或开发老花眼，小鼠模型可以为理解镜头病症的宝贵基因工具，并在小鼠中观察到加速老化能够在镜头年龄相关的变化研究。这个协议表明用于确定鼠标透镜刚度，用玻璃盖玻片依次施加压缩负荷增大到透镜的简单，精确和成本效益的方法。有代表性的数据证实，鼠标透镜随着年龄的增长变得更硬，像人类的镜头。这种方法是高度可重复的，并且可以潜在地扩大到从较大的动物机械地测试镜片。
Protocol
所有动物的程序均按照建议的指南中照顾和实验动物使用由卫生和批准议定书下国家研究院的机构动物护理和使用委员会在斯克里普斯研究所进行。
1.解剖镜
- 根据健康“指南实验动物的护理和使用”的国家机构和认可机构使用动物的协议安乐死的建议只。
- 去核的使用弯钳小鼠眼球。按压围绕与镊子眼组织带来的眼睛从插座中，然后从与镊子插座摘去眼。在解剖盘传送眼睛到新鲜的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
- 切断视神经接近眼球越好。轻轻地，小心地穿过孔插入wher细直镊子进入眼球E中的视神经退出的后路。
- 小心使用剪刀切开成从后角膜边缘的眼球。啮齿动物的透镜占据的眼睛的〜30％。请仔细这些切口，不插入镊子或剪刀太深进入眼内，以免损坏镜头。
- 沿角膜和巩膜在围绕眼球至少一半的方式之间的接合处切割。
- 轻轻地推在角膜上通过在步骤1.4和1.5所取得的开口以除去从眼睛的晶状体。
- 使用精尖镊子直小心删除仍然连在镜头任何大的杂物。目视检查是否有损坏镜头在进行硬度测量之前。
2.测量刚度
- 从使用分析天平同一框体重至少10盖玻片。查找的平均重量的盖玻片。为了保持一致性，使用盖玻片所有实验的同一个盒子。预湿盖玻片和直角镜在1×PBS中在室温下至少2小时开始实验之前。
- 填测量室（参见图1）与65 - 75毫升1×PBS中。测量室由一个内部的机械车间做出来有机玻璃，并在该室草皮被钻床设置为所需的深度与适当的钻头制成。透镜在1×PBS中保持透明，在室温下机械测试的持续时间。
图1：刚度测量室示出了各种不同的深度和形状的草皮层的定做刚度测量室的尺寸的照片。圆形凹坑是200微米或300微米深（黄色箭头）被用于对小鼠透镜的测量结果。草皮是2毫米直径和〜13-从腔边缘14毫米请点击此处查看该图的放大版本。
- 放置直角镜进入室在从将被用于保持透镜的草皮层的恒定距离。确保镜在实验过程中不动。
- 转移解剖镜头测量室仔细抓住钳或弯钳。
- 取卸载透镜的顶视图图片从直接开销。取小鼠透镜照片在30X放大倍数下通过从解剖显微镜（底部），在左，右两侧光纤光源照明。设置光纤电源到最大光强度的80％。根据需要调整基于环境照明，用户偏好和画质电源输出。
- 取卸载透镜的侧视图的图片，这可以通过里可以看到GHT角度的镜子。如果相机未校准，采取在聚焦镜边缘的图片。镜边缘为5mm长，并且该测量可以在以后被用来确定像素/毫米，并作为图像中的比例尺。
- 镜头放置到草皮，并确认镜头在草皮安全，直就位。取装载前透镜的图象。该镜头应在其前或后极部草皮静养。
- 轻轻地放在1盖玻片上的镜头。等待2分钟，以允许蠕变，并采取装载镜头的另一侧查看图片。
- 继续加入盖玻片如在步骤2.8和服用侧视图图片加入每个盖玻片的如在步骤2.8之后，直到总共10盖玻片被应用。
- 删除所有盖玻片。等待2分钟，并除去所有盖玻片后取透镜（内部和外部的草皮的）的侧视图图片。
3.晶状体核测量
- 要determ的INE晶状体核大小，移动镜头到一个干净的培养皿中充满了1X PBS。
- 用细镊子直轻轻解封镜头。
- 脱落的皮质纤维细胞通过滚动手套的手指之间的镜头。剩下的晶状体核会感觉像一个硬的大理石。使用此过程来隔离成人镜头细胞核起1个月的年龄。因为分离的核是一个刚体，不能用此描述的方法进行晶状体核的进一步的机械测试。
- 轻轻漂洗在培养皿在1×PBS中的晶状体核。
- 放置晶状体核放回测量室（未在草皮），并采取晶状体核的图像通过直角反射镜。
图2：恩小鼠镜头由盖玻片压缩 （一）示意图和（B）的照片perimental设置表示在填充用1×PBS测量室200微米深草皮一个2个月大的小鼠透镜。直角反射镜和安装在解剖显微镜的数字照相机中使用由盖玻片压缩过程中收集透镜的图像。 （C）的通过连续增加盖玻片的数字压缩的2个月大的野生型透镜的矢状次照片用于测量轴向和赤道直径和基于盖玻片压缩测试期间计算轴向和赤道菌株提供的原始数据。透镜的反射有时可以在盖玻片（最清晰可见的1盖玻片图像中的）中看到。当进行测量时，忽略该反射并测量到透镜的顶点。 （D）的2个月大的野生型镜头后的压缩和隔离晶状体核矢状美景照片。该压缩后的镜头和孤立的核正坐在草皮之外。比例尺1毫米。这个数字是从Gokh修改在， 等 公共科学图书馆·之一 ，2012 19。 请点击此处查看该图的放大版本。
4.图像分析
- 装货前和使用ImageJ或类似软件的每一装载步骤后测量镜头赤道和轴向的直径。测量每个晶状体核的直径。晶状体核是近球形所以在任何方向的测量就足够了19,21。
- 通过增加使用的草皮的深度修正镜头直径轴。在测量室中，草皮层遮蔽了透镜的轴向厚度为200微米（2个月大的小鼠透镜）或300微米（4月龄和8个月大的小鼠镜头）。
- 使用方程，ε=（D - D 0）计算从透镜直径测量的轴向和赤道菌株/天0，其中ε为应变，d为轴向或电子邮件quatorial直径在给定的负载，而d 0是在零负载的相应的轴向或赤道直径。
- 画出轴向和赤道株作为施加的负荷（毫克）的功能。
- 绘制轴，赤道和核直径。计算并通过由赤道直径除以轴径绘制透镜纵横比。
- 计算和使用等式绘制透镜体积，体积= 4/3×π×R e 2 的 ×R A，其中R e为赤道半径和R a是从在步骤2.6拍摄的照片测量的轴向半径。这个公式假定镜头是一个扁球体（椭球）1.22。
- 计算并用公式，体积= 4/3×π×R N 3，其中R N是透镜核的半径为从在步骤3.5拍摄的照片测量绘制核体积。这个公式假定晶状体核我SA球19,21。
- 计算并绘制细胞核部分作为核体积与透镜体积的比值。
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Representative Results
刚度和2-，4-和8个月大的小鼠的镜片的尺寸进行了测量。小鼠从TSRI动物育种设施获得的纯C57BL6菌株背景所有野生型动物，并且每一个透镜装载有1至10个盖玻片。轴向和赤道株计算为通过测量透镜的轴向和赤道直径在加入每个盖玻片的后，再归一直径为相应的卸载每个直径变化的施加载荷的功能。从每个年龄八个透镜进行了测试，结果表示为平均值±标准误差。如图先前19，轴向应变是施加的载荷（ 图3A）的对数函数。有一个在最大施加载荷（ 图3）下轴向和赤道菌株具有统计学显著年龄依赖性降低，表明该鼠透镜随年龄变硬。圣雨测量结果在相同年龄的透镜高度重现，由小标准误差所证明。
该实验中收集的图像数据也被用来确定几个其他透镜的形态特征（ 图4）。正如预期的，轴向和赤道直径和透镜体积与年龄（ 图4A，4B和4D）增加。纵横比表示该透镜具有稍大赤道直径大于轴径，并且此参数不与年龄（ 图4C）变化。晶状体核的直径，体积和分数随着年龄的增加（ 图4E，4F和4G）。这些结果表明，晶状体核重塑在相对大小为随着透镜年龄。
此数据显示，鼠标镜片增加刚度随着年龄，类似于改变一晋人的镜头9,15。这些数据也同意采用类似的方法制成18以前的意见和布里渊光学显微镜23鼠标透镜刚度随着年龄的增长。另外两项研究使用上述方法表明tropomodulin-1，肌动蛋白指出，封端的蛋白质，CP49，串珠中间丝蛋白，水通道蛋白0都需要保持镜头刚度19,20。用这种方法，小鼠模型透镜病状和小鼠的加速老化的过多可用于理解由于遗传变异和/或老化透镜刚度变化。此方法也可以适用于来自其它物种的镜片。用于这些实验的腔室的尺寸为鼠标透镜优化，但可以很容易地按比例放大用于从较大的品种镜片。在未来，这将是有趣的，以确定镜片大小是否与跨物种镜片硬度成正比。
图3：为2,4和8个月大的（2M，4M和8M）野生型小鼠镜头轴向和赤道应变负荷曲线 （A）轴向压缩应变描绘成施加载荷的功能（毫克）。 （B）赤道补偿ressive应变绘制为所施加的负荷（毫克）的功能。四和8个月大的镜头表现出了比2个月大的镜头相当于在最大负荷较少的菌株，这表明随着年龄的增加镜头刚度。 **，P <0.01。需要注意的是Y轴（A）和（B）之间的不同。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：2,4和8个月大的（2M，4M和8M）野生型小鼠镜头的形态特征 （A）轴径和（B）赤道直径逐渐随着年龄的增长。透镜纵横比（C）示出了小鼠透镜在透镜赤道稍宽。透镜体积（D）中，核直径（E），核体积（F）和核级分（G）的与年龄逐渐增大。 **，P <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
使用这种方法来衡量镜片硬度时，有几个关键因素。 （ - 8.5°8）相对于所述腔室（θ）的底部第一，盖玻片在略微倾斜的角度施加到透镜。这将适用于负载的非常小的组分平展，而不是轴向。然而，这种赤道负载可以忽略不计，因为罪θ≈0.1 19。如果此方法适于大透镜，盖玻片到腔室的底部的角将需要被测量以确定赤道负载是否应计入应变计算。其次，它是重要的，以允许透镜到加法每个盖玻片的后平衡。为2分钟的等待期间允许取决于时间的变形（ 即 ，蠕变）发生，使得当透镜处于一种平衡状19的图片仅服用。第三，该协议是用于测量M上压应变优化乌斯横跨负荷的宽动态范围的透镜。在试点研究中，1293毫克（ 即十18×18mm的盖玻片）施加的载荷压缩鼠标透镜到最大应变，超过此负载增加不会引起明显的进一步变形。这是由于刚性晶状体核不压缩下19略微变形的存在。四，本协议避免了不可逆的组织损伤。在先前公布的实验中，在重复加载观察到的小鼠镜片的机械性能没有变化，这表明该方法不会损坏镜头19。当机械地测试不同的物种或突变体透镜镜片，中试应做通过重复步骤2.8确定所需的最大应变的最大载荷 - 2.10和比较第一和第二之间的应变负荷曲线，透镜直径和透镜卷加载。最后，这种方法提供的刚度邻的经验测量 F中的整个透镜并不能区分不同类型的细胞的贡献（上皮细胞，皮质纤维，核纤维）和晶状体囊到整个透镜的机械性能。
轴向和赤道菌株这里描绘成施加负载的功能。以前的研究已经量化鼠标透镜刚度19,21，21的弹性或在施加载荷，直径18的变化。应变是一个无量纲的量，允许不同尺寸的透镜之间直接比较。需要注意的是赤道扩展（阳性菌株）与施加的轴向压缩（负株）同时出现，由于保护镜头体积（ 即泊松效应）。然而，观察到赤道菌株在绝对值比轴向应变小得多，这说明相比，轴向应变，该方法具有分辨率较低，检测赤道应变的微小变化。
NT“>综上所述，随着测量鼠标透镜刚度容易组装的装置这种简单的方法一般可以广泛应用于镜片研究，以更好地了解如何突变的蛋白质，病理和/或老化影响镜片的刚度。虽然鼠标镜头不容纳，这种方法仍可以阐明有助于增加透镜刚度蛋白质和年龄相关的修改，并且新的知识，以开发用于老花眼新疗法的潜在贡献。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
