Abstract
Хрусталик глаза является прозрачным органом, который преломляет и фокусирует свет, чтобы сформировать четкое изображение на сетчатке. У людей, ресничные мышцы сокращаются, чтобы деформировать линзу, что приводит к увеличению оптической мощности на объективе, чтобы сосредоточиться на близлежащих объектах, процесс, известный как жилье. Возрастные изменения в жесткости линзы были связаны с пресбиопии, уменьшение способности объектива для размещения, и, соответственно, необходимость в очках для чтения. Даже если мышь линзы не учитывают или разрабатывать пресбиопии, мышиные модели может обеспечить неоценимый генетический инструмент для понимания патологии хрусталика, а также ускоренное старение наблюдается у мышей позволяет исследовать возрастных изменений в хрусталике. Этот протокол демонстрирует простой, точный и экономически эффективный метод определения жесткости объектива мыши, используя покровные стекла для применения последовательно увеличивая сжимающие нагрузки на объектив. Типичные данные подтверждают, что мыши линзы становятся более жесткими с возрастом, какчеловеческие линзы. Этот метод хорошо воспроизводим и потенциально могут быть расширены для механического тестирования линзы от более крупных животных.
Protocol
Все процедуры на животных были проведены в соответствии с рекомендациями в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и в соответствии с утвержденным протоколом по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Скриппса научно-исследовательского института.
1. Объектив Вскрытие
- Эвтаназии мышей в соответствии с рекомендациями, содержащимися в Национальных Институтов Здоровья "Руководство по уходу и использованию лабораторных животных", а также утвержденных протоколов использования учреждением животных.
- Вылущивать глаз от мышей с использованием изогнутых щипцов. Выжмите ткань вокруг глаз с щипцами, чтобы принести глаз из розетки, а затем вырви глаз из гнезда с помощью пинцета. Перенести глаза на свежий 1x фосфатным буферным раствором (PBS) в рассечение блюдо.
- Отрезанные зрительного нерва как можно ближе к глазному яблоку, насколько это возможно. Аккуратно и осторожно вставьте тонкие прямые пинцетом в глазное яблоко через отверстие порогае зрительный нерв выходит из заднего.
- Аккуратно надрезать ножницами в глазное яблоко от заднего до края роговицы. Грызун линзы занимают ~ 30% глаз. Сделать тщательно эти надрезы, и не вставляйте пинцет или ножницы слишком глубоко в глаза, чтобы не повредить объектив.
- Разрежьте вдоль стыка между роговицы и склеры, по крайней мере на полпути вокруг глазного яблока.
- Слегка надавите на роговице, чтобы удалить линзу из глаза через отверстие, сделанные в шагах 1.4 и 1.5.
- Используйте тонкий пинцет кончик прямой тщательно удалить все крупные мусора, которые по-прежнему прикреплен к объективу. Визуально осмотрите линзу на наличие повреждений, прежде чем приступить к измерениям жесткости.
2. Жесткость Измерения
- Взвешивание по крайней мере 10 покровные из той же коробки с помощью аналитических весов. Найти средний вес покровные. Для согласованности, используйте ту же коробку покровные для всех экспериментов. Предварительно мокраяПокровные и правый угол зеркало в 1x PBS при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 ч до начала экспериментов.
- Заполните измерительную камеру (см рисунок 1) с 65 - 75 мл 1x PBS. Измерительная камера была изготовлена из плексигласа с камеральной механического цеха, и дерн в камере были сделаны с помощью сверлильного станка на желаемую глубину с соответствующим сверлом. Линзы остаются прозрачными в 1X PBS при комнатной температуре в течение длительности механических испытаний.
Рисунок 1:. Жесткость измерительная камера фотография , где размеры измерительной камеры жесткости выполненного на заказ с различными дерн разной глубины и формы. Круглые дерн, которые являются 200 мкм или 300 мкм глубиной (желтые стрелки) используются для измерений на линзах мыши. Дерн 2 мм в диаметре и 13 ~-. 14 мм от края камеры Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Поместите правый угол зеркало в камеру на постоянном расстоянии от дерн, который будет использоваться для хранения линз. Убедитесь, что зеркало не двигается во время эксперимента.
- Передача расчлененный линзы в измерительную камеру осторожно с захватывая щипцов или изогнутыми щипцами.
- Возьмите вид сверху картину ненагруженном линзы из прямо над головой. Возьмите мышь фотографий объектив 30X при увеличении с подсветкой от рассечения микроскопа (внизу) и источник волоконно-оптический свет на левой и правой сторон. Установка волоконно-оптический источник питания до 80% от максимальной интенсивности света. Настройте выход источника питания, в зависимости от условий освещения, предпочтений пользователя и качества изображения по мере необходимости.
- Возьмите вид сбоку картину ненагруженном линзы, которые можно увидеть через Р.И.GHT угол зеркала. Если камера не откалиброван, сфотографировать зеркала края в фокусе. Кромка зеркало длиной 5 мм, и это измерение позже может быть использовано для определения пикселов / мм и служат в качестве масштабной линейки в изображениях.
- Поместите линзы в дерн, и убедитесь, что объектив надежно и прямо сидит в дерн. Сфотографируйте объектива перед загрузкой. Объектив должен отдыхать в дерн на его передней или заднем полюсе.
- Поместите 1 покровное мягко на объектив. Подождите 2 мин, чтобы позволить ползать, и взять другой вид сбоку изображение загруженного объектива.
- Продолжайте добавлять покровные, как на стадии 2.8, и принимая вида сбоку снимков после добавления каждого покровного как на шаге 2.8 до в общей сложности 10 покровные не применяются.
- Удалить все покровные. Подождите 2 минуты, и принять вид сбоку изображение объектива (внутри и снаружи дерн) после удаления всех покровные.
Измерение 3. Объектив Nucleus
- Для determине размер ядра хрусталика, переместите объектив в чистую чашку Петри с 1x PBS.
- Аккуратно decapsulate объектив с использованием тонких прямых щипцов.
- Шелушиться клетки коры головного мозга волокна путем прокатки линзы между пальцами в перчатках. Оставшийся ядро линзы будут чувствовать себя как жесткий мрамор. Используйте эту процедуру, чтобы изолировать ядро на взрослых линз, начиная с 1-месячного возраста. Так как изолированное ядро представляет собой твердое тело, дальнейшее механическое испытание ядра хрусталика не может быть выполнена с помощью этого метода, описанного.
- Осторожно промыть ядро линзы в 1x PBS в чашке Петри.
- Поместите ядро линзы обратно в измерительную камеру (не в дерн), и принять образ ядра хрусталика через правый угол зеркала.
Рис . 2: A Линзы мыши сжат покровные (А) Схематическое и (Б) фотография эксментальная установка, показывающая 2-месячным объектив мыши в 200 мкм глубокой дерн в измерительной камере, заполненной 1x PBS. Правый угол зеркало и цифровая камера, установленная на рассечение микроскопа были использованы для сбора изображений объектива во время сжатия по покровные. (C) Фотографии сагиттальной видом 2-месячного дикого типа линзы сжатого путем последовательного увеличения числа покровных при условии, что исходные данные для измерения осевых и экваториальные диаметры и расчета осевых и экваториальные деформаций во время испытаний на сжатие покровного основе. Отражение объектива иногда можно увидеть в покровные (наиболее четко видна в 1 покровного изображения). При проведении измерений, игнорировать отражение и измерить расстояние до вершины линзы. (D) Фотографии сагиттальной видом на 2-месячного дикого типа линз после сжатия и изолированного ядра хрусталика. После сжатия линзы и изолированные ядра сидят за пределами дерн. Шкала баров, 1 мм. Эта цифра изменяется от Gokhв др. PLoS One, 2012 19. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Анализ 4. Изображение
- Мера экваториальные и осевые диаметры линз перед погрузкой и после каждой стадии загрузки с использованием ImageJ или подобное программное обеспечение. Измерьте диаметр каждого ядра хрусталика. Ядро линзы близка к сферической , так измерение при любой ориентации будет достаточно 19,21.
- Откорректируйте линзы осевого диаметра, добавляя глубину дерн, используемой. В камере измерения, дерн затемняется 200 мкм (2-месячным линзы мыши) или 300 мкм (4-месячным и 8-месячным линзы мыши) осевого толщины линзы.
- Вычислить осевые и экваториальные штаммы из измерений диаметра линзы с использованием уравнения, ε = (d - d 0) / d 0, где ε является деформация, d является осевая или еquatorial диаметр при заданной нагрузке, а d 0 представляет собой соответствующий аксиальном или экваториальном диаметра при нулевой нагрузке.
- Постройте осевую и экваториальных деформаций как функции приложенной нагрузки (в мг).
- Участок осевой, экваториальной и ядерных диаметров. Рассчитать и построить соотношение сторон объектива путем деления осевого диаметра от экваториального диаметра.
- Рассчитать и построить объем объектива , используя уравнение, объем = 4/3 × π × Г × E 2 R A, где г Е экваториальный радиус и г А осевой радиус измеряется от изображения , снятого на шаге 2.6. Это уравнение предполагает , что линза представляет собой сплюснутый сфероид (эллипсоид) 1,22.
- Рассчитать и построить ядерный объем с помощью уравнения, объем = 4/3 × × П г N 3, где г N является радиус ядра хрусталика, измеренная от фотографии , сделанной на шаге 3.5. Это уравнение предполагает I ядро линзыса сфера 19,21.
- Подсчитано и представлено графически ядерную фракцию как отношение объема ядра к объему линзы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Измеряли жесткость и размеры 2-, 4- и 8-месячных линз мыши. Мыши были у всех животных дикого типа на чистом фоне C57BL6 штамма, полученного из Питомника TSRI животных, и каждая линза была загружена с 1 до 10 покровные. Осевые и экваториальные штаммы были рассчитаны в зависимости от приложенной нагрузки путем измерения осевого и экваториального диаметра линзы после добавления каждого покровное, а затем нормализации каждого изменения диаметра к соответствующему ненагруженном диаметра. Восемь линзы от каждого возраста были протестированы, и результаты выражены как среднее ± стандартная ошибка. Как было показано ранее 19, осевая деформация является логарифмической функцией приложенной нагрузки (рис 3А). Был статистически значимое зависимое от возраста снижение осевых и экваториальных деформаций при максимальной приложенной к нему нагрузки (рисунок 3), что указывает , что объектив мыши застывает с возрастом. улицаИзмерения дождя были очень воспроизводимые через объективы одного и того же возраста, что подтверждается небольшими стандартными ошибками.
Данные изображения , собранные в ходе этого эксперимента были также использованы для определения нескольких других морфологических характеристик линз (рисунок 4). Как и ожидалось, осевого и экваториального диаметра и объема линзы увеличивается с возрастом (рис 4А, 4В и 4D). Соотношение сторон указывает на то, что линза имеет несколько больший диаметр , чем экваториальный осевого диаметра, и этот показатель не меняется с возрастом (фиг.4С). Диаметр, объем и доля ядра хрусталика увеличивается с возрастом (рис 4Е, 4F и 4G). Эти результаты свидетельствуют о том, что ядро линзы реконструирует увеличения относительного размера по мере старения хрусталика.
Эти данные показывают, что мышиные линзы увеличение жесткости с возрастом, похоже на изменения вПеренять человеческие линзы 9,15. Эти данные также согласуются с предыдущими наблюдениями , сделанными с использованием аналогичного метода 18 и Бриллюэна оптической микроскопии 23 , что мышь линзы увеличения жесткости с возрастом. Два других исследования использовали описанный способ , чтобы показать , что тропомодулина-1, актин остроконечн-блокирующее конец белка, CP49, бисерного промежуточный нити белка, и аквапорин 0 необходимы для поддержания линзы жесткость 19,20. С помощью этого метода, то множество мышиных моделей для объектива патологии и ускоренного старения мышей могут быть использованы для выявления изменений жесткости линзы из-за генетических изменений и / или старением. Этот метод также может быть адаптирован для линз из других видов. Размеры камеры, используемой для этих экспериментов оптимизированы для линз мыши, но могут быть легко расширены для линз от более крупных видов. В будущем, было бы интересно, чтобы определить, является ли весы размер линзы с линзой жесткости между видами.
Рис . 3: Упорно и экваториальные деформационных кривых нагрузки для 2-, 4- и 8-месячным (2М, 4М и 8M) мыши дикого типа линз (A) Осевая деформация сжатия график в зависимости от приложенной нагрузки ( мг). (B) Экваториальная компressive штамм график в зависимости от приложенной нагрузки (мг). Четырех- и 8-месячные линзы выставлены меньше напряжения, чем 2-месячных линз при эквивалентных максимальных нагрузках, что свидетельствует об увеличении жесткости линзы с возрастом. **, Р <0,01. Обратите внимание , что Y-ось отличается от (А) и (В). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: морфологическая характеристика 2-, 4- и 8-месячным (2М, 4М и 8M) мыши дикого типа линз (A) диаметр Осевая и (В) экваториальный диаметр прогрессивно увеличивается с возрастом. Отношение линзы аспект (С) показывает, что мышиные линзы немного шире на экваторе объектива. Объем объектива (D), ядерный диаметр (Е), ядерный объем (F), и ядерная фракция (G), постепенно увеличиваются с возрастом. **, Р <0,01. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько ключевых соображений при использовании этого метода для измерения жесткости объектива. Во-первых, покровные применяются к линзе при слегка косо (8 - 8,5 °) по отношению к нижней части камеры (Q). Это будет применяться очень небольшой составляющей нагрузки экваториально, а не в осевом направлении. Тем не менее, эта экваториальная нагрузка считается пренебрежимо малым , поскольку грех θ ≈ 0,1 19. Если этот способ приспособлен для больших объективов, угол покровные к нижней части камеры должны были бы быть измерено, чтобы определить, следует ли учитываться в расчетах деформации экваториальный нагрузки. Во-вторых, важно, чтобы объектив уравновешиваться после добавления каждого покровное. Период ожидания 2 минуты позволяет зависящих от времени деформации (т.е.., Ползучести) происходит таким образом, что снимки сделаны только тогда , когда линза находится в равновесной форме 19. В-третьих, этот протокол оптимизирован для измерения деформации сжатия на мУз линзы в широком динамическом диапазоне нагрузок. В экспериментальных исследованиях, приложенной нагрузке 1293 мг (то есть, десять 18 х 18 мм покровные) Сжатый линзы мыши до максимальной деформации, за которой повышенные нагрузки не вызывают заметных дальнейшей деформации. Это связано с наличием твердого ядра хрусталика , который не деформируется заметно при сжатии 19. В-четвертых, этот протокол позволяет избежать повреждения необратимого тканей. В ранее опубликованных экспериментах, не наблюдалось никаких изменений механических свойств линз мыши при повторной загрузке, предполагая , что этот метод не повредить объектив 19. Когда механически испытания линз разного вида или мутантных линз, пилотные испытания должны быть сделаны, чтобы определить максимальную нагрузку, необходимую для достижения максимальной деформации, повторяя шаги 2.8 - 2.10 и сравнение кривых деформации нагрузки, диаметр объектива и объемы линз между первой и второй погрузка. И, наконец, этот метод дает эмпирическое измерение жесткости O F всей линзы и не может дифференцировать вклад различных типов клеток (эпителиальные клетки, кортикальные волокна, ядерные волокна) и капсулы хрусталика в целом объективами механические свойства.
Осевые и экваториальные штаммы приведены здесь в качестве функции приложенной нагрузки. Предыдущие исследования количественно линзы мыши жесткость 19,21, упругость 21 или изменение диаметра 18 при приложенной нагрузке. Штамм является безразмерной величиной, которая позволяет прямое сравнение между линзами разных размеров. Обратите внимание , что экваториальная расширение (положительное напряжение) происходит одновременно с прикладной осевого сжатия (отрицательного напряжения) из - за сохранения объема линзы (т.е. Пуассона эффект). Тем не менее, наблюдаемые экваториальные штаммы были значительно меньше по абсолютной величине, чем осевых деформаций, что свидетельствует о том, что этот метод имеет меньшее разрешение, чтобы обнаружить небольшие изменения в экваториальной деформации по сравнению с осевой деформации.
нт "> В целом, этот простой метод с легко собранного устройства для измерения жесткости объектива мыши могут быть применены в целом и широко в исследованиях линзы, чтобы лучше понять, как мутации в белков, патологии и / или старения влияют на жесткость объектива. В то время как мыши линзы не приспособить этот метод до сих пор может пролить свет на белки и модификации, связанные с возрастом, которые способствуют увеличению жесткости линзы, и потенциально способствуют новые знания в разработке новых методов лечения дальнозоркости.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
- Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the ocular lens. , Cambridge University Press. (2004).
- Piatigorsky, J. Lens differentiation in vertebrates. A review of cellular and molecular features. Differentiation. 19 (3), 134-153 (1981).
- Glasser, A. Restoration of accommodation: surgical options for correction of presbyopia. Clin Exp Optom. 91 (3), 279-295 (2008).
- Keeney, A. H., Hagman, R. E., Fratello, C. J. Dictionary of ophthalmic optics. , Butterworth-Heinemann. (1995).
- Millodot, M. Dictionary of optometry and visual science. 7, Elsevier/Butterworth-Heinemann. (2009).
- Heys, K. R., Cram, S. L., Truscott, R. J. Massive increase in the stiffness of the human lens nucleus with age: the basis for presbyopia. Mol Vis. 10, 956-963 (2004).
- Heys, K. R., Friedrich, M. G., Truscott, R. J. Presbyopia and heat: changes associated with aging of the human lens suggest a functional role for the small heat shock protein, alpha-crystallin, in maintaining lens flexibility. Aging Cell. 6 (6), 807-815 (2007).
- Pierscionek, B. K. Age-related response of human lenses to stretching forces. Exp Eye Res. 60 (3), 325-332 (1995).
- Glasser, A., Biometric Campbell, M. C. optical and physical changes in the isolated human crystalline lens with age in relation to presbyopia. Vision Res. 39 (11), 1991-2015 (1999).
- Weeber, H. A., van der Heijde, R. G. On the relationship between lens stiffness and accommodative amplitude. Exp Eye Res. 85 (5), 602-607 (2007).
- Weeber, H. A., et al. Dynamic mechanical properties of human lenses. Exp Eye Res. 80 (3), 425-434 (2005).
- Fisher, R. F.
- Krueger, R. R., Sun, X. K., Stroh, J., Myers, R. Experimental increase in accommodative potential after neodymium: yttrium-aluminum-garnet laser photodisruption of paired cadaver lenses. Ophthalmology. 108 (11), 2122-2129 (2001).
- Burd, H. J., Wilde, G. S., Judge, S. J. An improved spinning lens test to determine the stiffness of the human lens. Exp Eye Res. 92 (1), 28-39 (2011).
- Glasser, A., Campbell, M. C. Presbyopia and the optical changes in the human crystalline lens with age. Vision Res. 38 (2), 209-229 (1998).
- Pau, H., Kranz, J. The increasing sclerosis of the human lens with age and its relevance to accommodation and presbyopia. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 229 (3), 294-296 (1991).
- Hollman, K. W., O'Donnell, M., Erpelding, T. N. Mapping elasticity in human lenses using bubble-based acoustic radiation force. Exp Eye Res. 85 (6), 890-893 (2007).
- Baradia, H., Nikahd, N., Glasser, A.
- Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734 (2012).
- Sindhu Kumari, S., et al.
- Fudge, D. S., et al. Intermediate filaments regulate tissue size and stiffness in the murine lens. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (6), 3860-3867 (2011).
- Kuszak, J. R., Mazurkiewicz, M., Zoltoski, R. Computer modeling of secondary fiber development and growth: I. Nonprimate lenses. Mol Vis. 12, 251-270 (2006).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy. Biophys J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
