Abstract
Die Augenlinse ist ein transparentes Organ, das Licht bricht und konzentriert sich auf die Netzhaut ein klares Bild zu bilden. Beim Menschen Vertrag Ziliarmuskeln die Linse zu verformen, zu einer Erhöhung führt in der Linse "optische Leistung auf nahe Objekte scharf, ein Verfahren, wie Unterkunft bekannt. Altersbedingte Veränderungen in der Linsensteifigkeit haben Presbyopie in Verbindung gebracht worden, eine Verminderung der Linse die Fähigkeit aufzunehmen, und durch Erweiterung, die Notwendigkeit für eine Lesebrille. Auch wenn die Maus Linsen aufnehmen oder nicht entwickeln Presbyopie, Mausmodelle können einen unschätzbaren genetisches Werkzeug für das Verständnis Objektiv Pathologien bieten, und die beschleunigte Alterung bei Mäusen beobachtet, ermöglicht die Untersuchung von altersbedingten Veränderungen in der Linse. Dieses Protokoll zeigt, eine einfache, präzise und kostengünstiges Verfahren für Maus Linsensteifigkeit Bestimmung unter Verwendung von Glasdeckgläser sequentiell Druckbelastungen auf die Linse Erhöhung anzuwenden. Repräsentative Daten bestätigen, dass die Maus Linsen steifer mit dem Alter, wiemenschliche Linsen. Dieses Verfahren ist sehr gut reproduzierbar und kann potenziell Testlinsen von größeren Tieren zu mechanisch skaliert werden.
Protocol
Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health und im Rahmen einer genehmigten Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee am Scripps Research Institute durchgeführt.
1. Objektiv Dissection
- Euthanize Mäuse gemäß den Empfehlungen in den National Institutes of Health "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" und zugelassene Institution Tier Protokolle verwenden.
- Enucleate das Auge von Mäusen mit einer gebogenen Pinzette. Drücken Sie das Gewebe um das Auge mit der Zange aus der Steckdose, das Auge zu bringen, und dann reiß das Auge aus der Steckdose mit der Zange. Bringen Sie die Augen an die frische 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in Dissektion Gericht.
- Schneiden Sie den Sehnerv so nah an der Augapfel wie möglich. Sanft und vorsichtig einsetzen feinen Pinzette gerade in den Augapfel durch das Loch where der Sehnerv tritt aus dem hinteren.
- machen sorgfältig einen Einschnitt mit einer Schere in den Augapfel vom hinteren zum Rand der Hornhaut. Nagetier Linsen besetzen ~ 30% des Auges. Nehmen Sie diese Einschnitte sorgfältig und nicht einlegen Pinzette oder Schere zu tief in das Auge eine Beschädigung der Linse zu vermeiden.
- Geschnitten entlang der Verbindung zwischen der Hornhaut und Sklera mindestens um die halbe Augapfel.
- Drücken Sie vorsichtig auf der Hornhaut, die Linse aus dem Auge durch die Öffnung in den Schritten 1.4 und 1.5 gemacht zu entfernen.
- Verwenden Sie feine Spitze gerade Pinzette vorsichtig jede große Trümmer zu entfernen, die noch am Objektiv angebracht ist. Eine Sichtprüfung des Objektivs für Schäden vor den Steifigkeitsmessungen fortfahren.
2. Steifigkeitsmessungen
- Wiegen Sie mindestens 10 Deckgläser aus dem gleichen Feld einer Analysenwaage verwenden. Finden Sie das durchschnittliche Gewicht der Deck. Daher sollten Sie das gleiche Feld von Deckgläsern für alle Experimente. VornässenDie Deckgläser und rechten Winkelspiegel bei Raumtemperatur für mindestens 2 h in 1x PBS vor Experimente beginnen.
- Füllen Sie die Messkammer (siehe Abbildung 1) mit 65 bis 75 ml 1x PBS. Die Messkammer wurde aus Plexiglas mit einer hauseigenen Maschinenhalle und Einschläge in der Kammer wurden durch eine Bohrmaschine auf die gewünschte Tiefe mit einem geeigneten Bohrer gemacht. Linsen verbleiben in 1x PBS bei Raumtemperatur für die Dauer der mechanischen Prüfung transparent.
Abb . 1: Steifigkeitsmesskammer ein Foto , um die Abmessungen der maßgeschneiderte Steifigkeitsmesskammer mit einer Vielzahl von Einschläge von verschiedenen Tiefen und Formen zeigt. Die runden Einschläge, die 200 & mgr; m oder 300 & mgr; m tief (gelbe Pfeile) werden für die Messungen an der Maus Linsen verwendet werden. Divots sind 2 mm im Durchmesser und ~ 13-. 14 mm vom Rand der Kammer Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Platzieren Sie rechts Winkelspiegel in die Kammer mit einem konstanten Abstand von der Divot, die verwendet werden, wird die Linse zu halten. Stellen Sie sicher, dass der Spiegel nicht während des Experiments nicht bewegt.
- Transfer seziert Linsen Messkammer sorgfältig mit Greifzange oder einer gebogenen Pinzette.
- Nehmen Sie eine Draufsicht Bild des unbelasteten Linse direkt von oben. Nehmen Maus Objektiv Fotos bei 30-facher Vergrößerung mit Beleuchtung von Binokular (unten) und eine Faseroptik-Lichtquelle auf der linken und rechten Seite. Stellen Sie die faseroptische Stromversorgung zu 80% der maximalen Lichtintensität. Stellen Sie die Stromversorgung Ausgabe basierend auf Umgebungsbeleuchtung, Benutzereinstellung und Bildqualität nach Bedarf.
- Nehmen Sie eine Seitenansicht Bild des unbelasteten Linse, die durch die ri zu sehen istght Winkelspiegel. Wenn die Kamera nicht kalibriert ist, nehmen Sie ein Bild von der Spiegelrand im Fokus. Der Spiegelrand ist 5 mm lang, und diese Messung später verwendet werden, können die Pixel / mm und dienen als Maßstab in den Bildern zu bestimmen.
- Platz Linse in das Divot, und bestätigen, dass die Linse fest sitzt und gerade in der Divot. Nehmen Sie ein Bild von der Linse vor dem Laden. Die Linse sollte in der Divot an der vorderen oder hinteren Pol ruhen.
- Platz 1 Deckglas vorsichtig auf die Linse. Warten Sie 2 min Kriechen zu ermöglichen, und nehmen Sie eine andere Seitenansicht Bild der geladenen Linse.
- Weiterhin Zugabe von Deckgläsern, wie in Schritt 2.8 und unter Seitenansicht Bilder nach der Zugabe von jedem Deckglas, wie in Schritt 2,8 bis insgesamt 10 Deckgläser aufgebracht.
- Entfernen Sie alle Deckgläser. Warten Sie 2 Minuten, und nehmen Sie eine Seitenansicht Bild der Linse (innerhalb und außerhalb des Divot), nachdem Sie alle Deckgläser zu entfernen.
3. Objektiv Nucleus Mess
- Um bestimine Linsenkerngröße, bewegen Sie die Linse auf eine saubere Petrischale mit 1x PBS gefüllt.
- Sanft decapsulate die Linse fein gerade Pinzette.
- Slough die kortikale Faserzellen aus, indem die Linse zwischen behandschuhten Fingern rollen. Der verbleibende Linsenkern wird wie eine harte Marmor fühlen. Verwenden Sie dieses Verfahren, um den Kern auf die Erwachsenen Linsen zu isolieren, um Alter von 1 Monat beginnen. Da der isolierte Kern ein starrer Körper ist, weitere mechanische Prüfung des Linsenkerns ist, kann nicht unter Verwendung dieses beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.
- Spülen Sie vorsichtig den Linsenkern in 1x PBS in der Petrischale.
- Setzen Sie den Linsenkern zurück in die Messkammer (nicht in der Divot), und nehmen Sie ein Bild des Linsenkerns durch den rechten Winkelspiegel.
Abbildung 2: a . Durch Deckgläser Druck Maus Objektive (A) Schematische und (B) Fotografie des experimental Setup einen 2 Monate alten Maus-Objektiv in einem 200 & mgr; m tief Divot in der Messkammer gefüllt mit 1x PBS zeigt. Ein rechter Winkelspiegel und eine Digitalkamera auf einem Präpariermikroskop angebracht wurden verwendet, um Bilder der Linse während der Kompression durch Deckgläser zu sammeln. (C) Fotos von sagittalen Ansichten eines 2 Monate alten Wildtyp-Linse komprimiert, indem nacheinander Anzahl von Deck Erhöhung vorgesehen, um die Rohdaten zur Messung von axialen und äquatorialen Durchmesser und Berechnung axialen und äquatorialen Sorten während Deck-basierten Druckprüfung. Eine Reflexion der Linse kann manchmal in den Deckgläsern zu sehen (am deutlichsten sichtbar in der 1 Deckbild). Bei Messungen, ignorieren zu dem Scheitelpunkt der Linse, um die Reflexion und zu messen. (D) Fotos von sagittalen Blick auf die 2-Monate alten Wildtyp-Objektiv Nachverdichtung und der isolierten Linsenkern. Die Nachverdichtung Linse und isolierte Kern außerhalb des Divot sitzen. Maßstabsbalken, 1 mm. Diese Zahl wird geändert von Gokhin, et al. PLoS One, 2012 19. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Bildanalyse
- Messen Sie äquatorialen und axialen Durchmesser der Linsen vor dem Laden und nach jedem Ladeschritt mit ImageJ oder ähnliche Software. Messen der Durchmesser jedes Linsenkern. Der Linsenkern ist nahezu kugelförmige so eine Messung bei jeder Ausrichtung 19,21 ausreichen.
- Korrigieren Sie die Linse axialen Durchmesser von verwendet, um die Tiefe des Divot Zugabe. In der Messkammer, verdeckt das Divot 200 um (2 Monate alten Maus-Linsen) oder 300 um (4 Monate alte und 8 Monate alten Maus-Linsen) der axialen Dicke der Linse.
- Berechnen der axialen und äquatorialen Stämme aus der Linsendurchmesser - Messungen unter Verwendung der Gleichung, ε = (d - d 0) / d 0 ist , wobei ε - Stamm ist, d der axiale oder eQuatorial Durchmesser bei einer gegebenen Last ist , und d 0 der entsprechenden axialen oder äquatorialen Durchmesser bei Nullast.
- Zeichnen Sie die axialen und äquatorialen Sorten als Funktionen der auferlegten Last (in mg).
- Zeichnen Sie die axial, äquatorialen und Kerndurchmesser. Berechnen und zeichnen Sie das Objektiv Seitenverhältnis durch die axiale Durchmesser durch den äquatorialen Durchmesser geteilt wird.
- Berechnen und zeichnen Sie das Objektiv Volumen unter Verwendung der Gleichung, Volumen = 4/3 × π × r E 2 × r A, wobei r E ist der äquatoriale Radius und r A die axiale Radius aus dem Bild in Schritt 2.6 genommen , gemessen. Diese Gleichung nimmt die Linse ist eine Oblate Sphäroid (Ellipsoid) 1,22.
- Berechnen und zeichnen Sie die Kernvolumen unter Verwendung der Gleichung, Volumen = 4/3 × π × r N 3, wobei r N der Radius des Linsenkerns ist , wie aus dem Bild in Schritt 3.5 genommen gemessen. Diese Gleichung nimmt den Linsenkern isa Kugel 19,21.
- Berechnen und Plotten der nukleären Fraktion als das Verhältnis des Kernvolumens zum Objektiv Volumen.
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Representative Results
Die Steifigkeit und die Abmessungen der 2-, 4- und 8-Monate alten Maus Linsen wurden gemessen. Die Mäuse wurden alle Wildtyp-Tiere auf einem reinen Hintergrund C57BL6 Stamm aus der Zuchtanlage TSRI Tier erhalten, und jede Linse wurde mit 1 bis 10 Deckgläser geladen. Die axialen und äquatorialen Stämme wurden als Funktion der aufgebrachten Last berechnet, indem die axialen und äquatorialen Durchmesser der Linse nach der Zugabe von jedem Deckglas zu messen und dann jede Änderung des Durchmessers zu dem entsprechenden unbelasteten Durchmesser normalisieren. Acht Linsen aus jeder Alters wurden getestet, und die Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Wie zuvor 19 gezeigt ist Axialdehnung eine logarithmische Funktion der angelegten Last (3A). Es wurde eine statistisch signifikante altersabhängige Abnahme der axialen und äquatorialen Stämmen unter der maximalen aufgebrachten Last (Abbildung 3), was darauf hinweist , dass die Maus - Linse mit dem Alter versteift. Stregen Messungen waren über Linsen im gleichen Alter in hohem Maße reproduzierbar, wie durch die kleinen Standardfehler unter Beweis gestellt.
Die Bilddaten , die während dieses Experiments gesammelt wurden auch mehrere andere Linse zu bestimmen morphologischen Eigenschaften (Abbildung 4) verwendet. Wie erwartet, axialen und äquatorialen Durchmesser und Linsenvolumen mit dem Alter zunimmt (Abbildung 4A, 4B und 4D). Das Seitenverhältnis gibt an, dass die Linse einen etwas größeren Durchmesser als äquatorialen axialen Durchmesser aufweist, und dieser Parameter nicht mit dem Alter (4C) ändern. Der Durchmesser, das Volumen und Bruchteil des Linsenkerns mit dem Alter zunimmt (4E, 4F und 4G). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Linsenkern in relativen Größe wie die Linse Alter zu erhöhen umbaut.
Diese Daten zeigen, dass die Maus Linsen Erhöhung der Steifigkeit mit dem Alter, ähnlich wie bei Änderungen in einemGing menschlichen Linsen 9,15. Diese Daten stimmen auch mit früheren Beobachtungen unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens 18 und durch Brillouin - optische Mikroskopie 23 , die Maus Linsen in der Steifigkeit mit dem Alter zunehmen. Zwei weitere Studien , die die beschriebenen Verfahren haben gezeigt, dass Tropomodulin-1 zu zeigen, ein Aktin spitz-End - Capping Protein, CP49, eine wulstige Intermediärfilament Protein und Aquaporin 0 nötig sind , um Linse 19,20 Steifheit beizubehalten. Mit diesem Verfahren wird die Vielzahl von Mausmodellen für die Linsen Pathologien und der beschleunigten Alterung der Mäuse können verwendet werden, Linsensteifigkeitsänderungen aufgrund genetischer Variation und / oder Alterung, zu verstehen. Dieses Verfahren kann auch für Linsen aus anderen Arten angepasst werden. Die Abmessungen der Kammer für diese Experimente verwendet werden, für Maus Linsen optimiert, aber leicht für Objektive von größeren Arten skaliert werden kann. In Zukunft wäre es interessant, zu bestimmen, ob mit Linsensteifigkeit über Artgrenzen Linsengröße skaliert.
Abb . 3: Axial und Äquatorial - Dehnungsbelastungskurven für 2-, 4- und 8-Monate alten (2M, 4M und 8M) Wildtyp - Maus - Objektive (A) Axial aufgetragen Druckspannung in Abhängigkeit von der angelegten Last ( mg). (B) Äquatorial-compressive Stamm aufgetragen als Funktion der angelegten Last (mg). Vier- und 8 Monate alte Linsen zeigten eine geringere Belastung als 2 Monate alten Linsen bei äquivalenten maximalen Belastungen, eine Erhöhung der Linsensteifigkeit mit dem Alter angibt. **, P <0,01. Beachten Sie, dass die Y-Achse ist der Unterschied zwischen (A) und (B). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Morphologische Merkmale von 2-, 4- und 8-Monate alten (2M, 4M und 8M) Wildtyp - Maus - Objektive (A) Axial Durchmesser und (B) äquatorialen Durchmesser progressiv mit dem Alter zunehmen. Die Linse Seitenverhältnis (C) zeigt, dass Maus Linsen am Linsenäquator etwas breiter sind. Linsenvolumen (D), Kerndurchmesser (E), die Kernvolumen (F) und Kernfraktion (G) mit zunehmendem Alter erhöhen. **, P <0,01. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt mehrere wichtige Überlegungen bei der Verwendung dieser Methode Linse Steifigkeit zu messen. Zuerst werden die Deckgläser auf die Linse bei einem leicht schrägen Winkel aufgetragen (8-8,5 °) in Bezug auf den Boden der Kammer (θ). Dies wird eine sehr kleine Komponente der Last anwenden aquatorial anstatt axial. Allerdings ist diese äquatorialen Last als vernachlässigbar , da sin θ ≈ 0,1 19. Wenn dieses Verfahren für größere Linsen angepasst ist, müsste der Winkel der Deckgläser auf den Boden der Kammer gemessen werden, um zu bestimmen, ob äquatorialen Last in Dehnungsberechnungen berücksichtigt werden. Zweitens ist es wichtig, die Linse zu ermöglichen, nach der Zugabe von jedem Deckglas zu äquilibrieren. Die Wartezeit von 2 Minuten ermöglicht zeitabhängige Verformung (dh., Kriechen) auftreten, so daß nur Bilder aufgenommen werden , wenn die Linse bei einer Gleichgewichtsform 19 ist. Drittens wird dieses Protokoll zur Messung der Druckspannung auf m optimiertOuse Linsen über einen großen Dynamikbereich von Lasten. In Pilotstudien unter einer Last von 1293 mg (dh zehn 18 x 18 mm Deckgläser) komprimiert , um die Maus Linse auf eine maximale Dehnung, jenseits derer Lasten verursachen keine nennenswerte weitere Verformung erhöht. Dies ist aufgrund des Vorhandenseins der starren Linsenkern , die nicht wesentlich unter 19 Komprimierung zu verformen. Viertens vermeidet dieses Protokoll irreversible Gewebeschäden. In früher veröffentlichten Experimente wurden auf repeat Laden keine Änderungen in den mechanischen Eigenschaften von Maus Linsen beobachtet, was darauf hindeutet , dass dieses Verfahren nicht die Linse 19 nicht beschädigt. Bei der mechanischen Linsen einer anderen Spezies oder mutierten Linsen Testen, Pilottests sollten durch Wiederholen der Schritte für eine maximale Belastung benötigt, um die maximale Belastung zu bestimmen, erfolgen 2,8-2,10 und den Vergleich der Dehnungsbelastungskurven, Linsendurchmesser und Linsenvolumen zwischen dem ersten und dem zweiten Laden. Schließlich bietet dieses Verfahren eine empirische Messung der Steifigkeit o f die gesamte Linse und die Beiträge der verschiedenen Zelltypen unterscheiden kann (Epithelzellen, kortikale Fasern, Kernfasern) und die Linsenkapsel zu Ganzlinsen mechanischen Eigenschaften.
Die axialen und äquatorialen Sorten werden hier als Funktionen der auferlegten Last aufgetragen. Frühere Studien haben 19,21, Maus Linse Steifigkeit quantifiziert Belastbarkeit 21 oder die Änderung im Durchmesser 18 bei aufgebrachten Last. Der Stamm ist eine dimensionslose Größe, die zwischen den Linsen unterschiedlicher Größe direkten Vergleich ermöglicht. Beachten Sie, dass äquatorialen Verlängerung (positive Stamm) tritt gleichzeitig mit der angelegten axiale Kompression (negative Dehnung) aufgrund Erhaltung der Linsenvolumen (dh Poisson - Effekt). Allerdings waren die beobachteten äquatorialen Sorten viel kleiner in der absoluten Größe als die axiale Stämme, was darauf hinweist, dass diese Methode weniger Auflösung kleine Änderungen in der äquatorialen Stamm zu erkennen ist als axiale Belastung verglichen.
nt "> Zusammenfassend diese einfache Methode mit einem leicht zusammengebauten Vorrichtung für Maus Objektiv Steifigkeit Messung kann im allgemeinen und weit verbreitet in der Linse Forschung angewendet werden, um besser zu verstehen, wie Mutationen in Proteinen, Pathologien und / oder Alterungslinsensteifigkeit beeinflussen. Während Maus Linsen nicht aufnehmen kann diese Methode noch die Proteine und altersbedingte Änderungen erläutern, die zu einer erhöhten Steifigkeit Linse beitragen und möglicherweise neue Erkenntnisse beitragen neuartige Medikamente zur Behandlung der Alterssichtigkeit zu entwickeln.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine tip straight forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | |
| Microdissection scissors, straight edge | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Curved forceps | Fine Scientific Tools | 11272-40 | |
| Seizing forceps | Hammacher | HSC 702-93 | Optional |
| Dissection dish | Fisher Scientific | 12565154 | |
| 60 mm Petri dish | Fisher Scientific | 0875713A | |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14190 | |
| 18 x 18 mm glass coverslips | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Measurement chamber with divots to hold lenses | Custom-made (see Figure 1) | ||
| Right-angle mirror | Edmund Optics | 45-591 | |
| Light source | Schott/Fostec | 8375 | |
| Illuminated dissecting microscope | Olympus | SZX-ILLD100 | With SZ-PT phototube |
| Digital camera | Nikon | Coolpix 990 |
References
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