Coculture Assays अध्ययन करने के लिए ग्लयोब्लास्टोमा आक्रमण की बृहतभक्षककोशिका और Microglia उत्तेजना
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
ग्लयोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (ग्रेड चतुर्थ glioma) 1 साल के बाद निदान के एक औसत अस्तित्व के साथ एक बहुत आक्रामक मानव कैंसर है। आणविक घटनाओं है कि glioblastomas को जन्म दे की वृद्धि की समझ के बावजूद, इस कैंसर अभी भी अत्यधिक पारंपरिक इलाज करने के लिए आग रोक बनी हुई है। उच्च ग्रेड ब्रेन ट्यूमर की शल्य लकीर glioblastoma कोशिकाओं की अत्यधिक infiltrative प्रकृति के कारण शायद ही कभी पूरा हो गया है। चिकित्सकीय दृष्टिकोण जो ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण attenuate इसलिए एक आकर्षक विकल्प है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों है कि ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज और microglia (निवासी मस्तिष्क मैक्रोफेज) दृढ़ता ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रोत्साहित दिखाया है। प्रोटोकॉल इस पत्र में वर्णित ग्लियोब्लास्टोमा-बृहतभक्षककोशिका / microglia बातचीत में इन विट्रो संस्कृति assays का उपयोग करने के लिए मॉडल का इस्तेमाल किया जाता है। यह दृष्टिकोण बहुत विकास और / या दवाओं है कि मैक्रोफेज के साथ संचार को बाधित की खोज की है कि इस घातक बिहेव सक्षम बनाता सुविधा कर सकते हैंआईओआर। 10 गुना – हम दो मजबूत coculture आक्रमण assays जहां microglia / मैक्रोफेज द्वारा 5 glioma सेल आक्रमण को प्रोत्साहित स्थापना की है। ग्लयोब्लास्टोमा कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट मार्कर या अनिवार्यता से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त के साथ लेबल मैट्रिक्स लेपित पॉली कार्बोनेट चैम्बर सम्मिलित करता है पर बिना और साथ मैक्रोफेज / microglia चढ़ाया या एक तीन आयामी मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं। सेल आक्रमण फिल्टर के नीचे पर छवि के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग और केवल आक्रामक कोशिकाओं की गिनती द्वारा मूल्यांकन किया है। इन assays का प्रयोग, कई औषधीय inhibitors (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, और Semapimod), पहचान की गई है जो बृहतभक्षककोशिका ब्लॉक / microglia ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण को प्रेरित किया।
Introduction
ग्लयोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी निदान 1,2 के समय से लगभग 12 महीने के एक औसत अस्तित्व के साथ एक आक्रामक मानव मस्तिष्क कैंसर है। ग्लयोब्लास्टोमा सबसे घातक और नैदानिक चुनौतीपूर्ण कैंसर में से एक यह मानक रसायन चिकित्सा और शल्य लकीर को आग रोक के रूप में है। ग्लियोब्लास्टोमा के फैलाना प्रकृति ट्यूमर कोशिकाओं को उन्नत ट्यूमर व्यावहारिक रूप से शल्य चिकित्सा पूरी तरह से बांटना असंभव बना सामान्य मस्तिष्क भर में प्रसार करने के लिए सक्षम बनाता है। यह बेहद आक्रामक पहलू ग्लियोब्लास्टोमा और अन्य उन्नत astrocytomas की एक बानगी सुविधा है। इसलिए, अधिक से अधिक शोध का ध्यान केंद्रित ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण की आणविक तंत्र पर किया गया है। ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर microenvironment द्रोह 3-6 स्थापित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज / microglia ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण 7.8 बढ़ावा देने के लिए जिम्मेदार होने के लिए दिखाया गया है। इन अध्ययनों से ज्यादातर लेकिन का उपयोग कर मैक्रोफेज / microglia के प्रभाव को मापाassays जो शारीरिक रूप से उन्हें glioblastoma कोशिकाओं से अलग। हमारी प्रयोगशाला बाहर स्थापित किया है सुधार assays जो हमें अध्ययन कैसे ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण पर cocultures में मैक्रोफेज / microglia निर्भर है और आक्रमण के दौरान उन दोनों के बीच शारीरिक संपर्क की छवि के लिए हमें सक्षम करने की अनुमति उत्पन्न करते हैं।
क्लासिक assays को मापने के लिए सेल आक्रमण 'मानक' Boyden कक्ष chemotaxis और chemoinvasion प्रारूपों में शामिल हैं। यहाँ कोशिकाओं का अध्ययन किया जा करने के लिए एक प्लास्टिक चैम्बर जो नीचे है कि एक निर्दिष्ट आकार (व्यास में 0.4 और 8 के बीच आम तौर माइक्रोन) के के छिद्रों पर एक पॉली कार्बोनेट फिल्टर होता है में चढ़ाया जाता है। सेल आक्रमण करने की प्रक्रिया एक शारीरिक बाधा है, आमतौर पर बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन से बना शामिल है। chemoinvasion परख में, वरीय इस्तेमाल किया मैट्रिक्स Matrigel (इसके बाद के रूप में "मैट्रिक्स" कहा जाता है), एक बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन मिश्रण Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) द्वारा स्रावित माउस सार्कोमा कोशिकाओं और कर्नल के बड़े पैमाने पर होते हैंlagen प्रकार चतुर्थ और laminin। कक्षों तो एक अच्छी तरह से टिशू कल्चर के साथ जो या वृद्धि कारक है कि आक्रमण को प्रोत्साहित करने के संदेह कर रहे हैं बिना सेल संस्कृति मीडिया में शामिल है में रखा जाता है। कोशिकाओं जो एक उच्च आक्रामक क्षमता एक उच्च आवृत्ति पर बाह्य मैट्रिक्स लेपित फिल्टर के माध्यम से आक्रमण और फिल्टर के नीचे का पालन करना होगा है। हम आदेश ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण पर microglia और ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज की भूमिका का आकलन करने के लिए इस परख संशोधित किया है।
10 गुना 9,10 – हम इस कागज कि microglia द्वारा 5 दो ग्लियोब्लास्टोमा सेल लाइनों के आक्रमण को प्रोत्साहित कर सकते भीतर वर्णित coculture assays का उपयोग निर्धारित करने के लिए सक्षम किया गया है। यह दर्शाता है जो ग्लियोब्लास्टोमा के पशु मॉडल में मनाया जाता है। इसके अलावा, हम एक तीन आयामी आक्रमण परख जहां glioblastoma कोशिकाओं और मैक्रोफेज के बीच बातचीत / microglia अधिक सीधे जांच की जा सकती विकसित की है। ग्लियोब्लास्टोमा सेल आक्रमण की हद macropha से प्रेरितGES / 3D परख में microglia क्या मैट्रिक्स लेपित चैम्बर दृष्टिकोण का उपयोग कर देखा जाता है के बराबर है। इसी assays के पहले आक्रमण 11-13 दौरान मैक्रोफेज के साथ स्तन कार्सिनोमा बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किए गए। दोनों ही तरीकों से इस पत्र में वर्णित glioblastoma कोशिकाओं के बृहतभक्षककोशिका / microglia उत्तेजित आक्रमण की आणविक तंत्र (s) काटना करने की क्षमता में सहायता करनी चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च ग्रेड astrocytomas और glioblastoma के अत्यधिक आक्रामक प्रकृति इन मस्तिष्क के कैंसर बहुत घातक हैं। सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण इसलिए यह ग्लियोब्लास्टोमा आक्रमण की आणविक और सेलुलर तंत्र को समझने की है। ज्यादातर ग्लि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
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