Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Le glioblastome multiforme (grade IV gliome) est un cancer très agressif humain avec une survie médiane de diagnostic 1 an après. En dépit de la meilleure compréhension des événements moléculaires qui donnent lieu à des glioblastomes, ce cancer reste encore très réfractaire au traitement conventionnel. La résection chirurgicale des tumeurs cérébrales de haut grade est rarement complète en raison de la nature hautement infiltrant des cellules de glioblastome. Les approches thérapeutiques qui atténuent l'invasion des cellules de glioblastome est donc une option intéressante. Notre laboratoire et d'autres ont montré que la tumeur des macrophages et des cellules microgliales (macrophages résidents du cerveau) stimulent fortement l'invasion de glioblastome sont associés. Le protocole décrit dans le présent document est utilisé pour modéliser le glioblastome-macrophage / microglie interaction en utilisant des tests de culture in vitro. Cette approche peut grandement faciliter le développement et / ou la découverte de médicaments qui perturbent la communication avec les macrophages qui permet à cette behav maligneIOR. Nous avons établi deux essais d'invasion de coculture robustes où microglie / macrophages stimulent l'invasion des cellules de gliome par 5-10 fois. les cellules de glioblastome marquées avec un marqueur fluorescent ou exprimant constitutivement une protéine fluorescente sont plaquées sans et avec les macrophages / microglie en polycarbonate inserts de chambre de matrice revêtue ou enrobée dans une matrice à trois dimensions. L'invasion cellulaire est évaluée en utilisant la microscopie de fluorescence à l'image et compter uniquement les cellules invasives sur le côté inférieur du filtre. L'utilisation de ces essais, plusieurs inhibiteurs pharmacologiques (JNJ-28312141, PLX3397, géfitinib et Semapimod), ont été identifiés qui bloquent les macrophages / microglie stimulé l'invasion de glioblastome.
Introduction
Le glioblastome multiforme est un cancer du cerveau humain agressif avec une survie médiane d'environ 12 mois à partir du moment du diagnostic 1,2. Glioblastome est l'un des cancers les plus mortels et cliniquement difficile car il est réfractaire à une chimiothérapie standard et la résection chirurgicale. Le caractère diffus de glioblastome permet aux cellules tumorales de se propager dans le cerveau normal rendant la tumeur avancée pratiquement impossible de chirurgicalement réséquer complètement. Cet aspect très invasive est une caractéristique marque de glioblastome et d'autres astrocytomes avancées. Par conséquent, l'objet de beaucoup de recherches a été mis sur le mécanisme moléculaire de l'invasion des cellules de glioblastome. Le microenvironnement glioblastome tumorale joue un rôle essentiel dans l' établissement d'une tumeur maligne 3-6. Tumeur associée macrophages / microglie se sont révélés être responsable de la promotion glioblastome invasion 7,8. La plupart de ces études ont cependant mesuré l'effet des macrophages / microglie utilisantdes essais qui les séparent physiquement à partir des cellules de glioblastome. Notre laboratoire a défini pour générer des tests améliorés qui nous permettent d'étudier la façon dont l'invasion de glioblastome dépend de macrophages / microglie dans cocultures et nous permettent à l'image de l'interaction physique entre eux lors de l'invasion.
tests classiques pour mesurer l'invasion des cellules comprennent les Boyden chimiotaxie "standard" de la chambre et les formats de chemoinvasion. Ici, les cellules à étudier sont plaquées dans une chambre en matière plastique qui contient un filtre en polycarbonate sur le fond qui comporte des pores d'une taille donnée (généralement comprise entre 0,4 et 8 um de diamètre). Le processus d'invasion cellulaire implique une barrière physique, habituellement composé de protéines de la matrice extracellulaire. Dans l'essai de chemoinvasion, la matrice utilisée est préférée Matrigel (ci-après dénommée «matrice»), un mélange de protéines de la matrice extracellulaire sécrétée par Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) des cellules de sarcome de souris et se compose essentiellement de colType lagen IV et la laminine. Les chambres sont ensuite placées dans une culture bien de tissu qui contient des milieux de culture de cellules avec ou sans facteurs de croissance qui sont soupçonnés de stimuler l'invasion. Les cellules qui ont une capacité d'invasion ultérieure va envahir à travers la matrice extracellulaire filtre revêtu à une fréquence supérieure et adhèrent à la face inférieure du filtre. Nous avons modifié cet essai afin d'évaluer le rôle de la microglie et des macrophages associés à une tumeur sur l'invasion des cellules de glioblastome.
Nous avons été en mesure de déterminer en utilisant des tests de coculture décrits dans le présent document que les microglies peuvent stimuler l'invasion de deux lignées de cellules de glioblastome par 5-10 fois 9,10. Cela reflète ce que l'on observe dans les modèles animaux de glioblastome. En outre, nous avons développé un essai de trois invasion dimensions où les interactions entre les cellules de glioblastome et les macrophages / microglie peuvent être examinés plus directement. L'étendue de l'invasion des cellules stimulées par le glioblastome macrophaGes / microglie dans le test 3D est comparable à ce qui est vu en utilisant l'approche de la chambre de matrice recouverte. Des essais similaires ont déjà été mis au point pour étudier les interactions de carcinome du sein avec les macrophages lors de l' invasion 11-13. Les deux procédés décrits dans le présent document devraient contribuer à la capacité à disséquer les mécanismes moléculaires (s) de macrophages / microglies invasion stimulée par des cellules de glioblastome.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nature hautement invasive des astrocytomes de haut grade et glioblastome rendre ces cancers du cerveau très meurtrière. Il est donc d'une importance primordiale pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de l'invasion de glioblastome. On a beaucoup appris sur le processus de glioblastome invasion déjà 17. En utilisant les formats d'analyse détaillés dans ce document, notre laboratoire a montré à la fois la souris et des modèles humains que les macrophages associés au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
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