Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Glioblastoma multiforme (grado IV glioma) è un tumore umano molto aggressivo, con una sopravvivenza mediana di 1 anno dopo la diagnosi. Nonostante la maggiore comprensione degli eventi molecolari che danno origine a glioblastomi, questo tipo di tumore rimane ancora molto refrattario al trattamento convenzionale. La resezione chirurgica dei tumori cerebrali di alto grado è raramente completa a causa della natura altamente infiltrante di cellule di glioblastoma. approcci terapeutici che attenuano l'invasione delle cellule di glioblastoma è quindi un'opzione attraente. Il nostro laboratorio e altri hanno dimostrato che i macrofagi e microglia tumore (macrofagi cerebrali residenti) fortemente stimolare glioblastoma invasione associati. Il protocollo descritto in questo documento viene utilizzato per modellare glioblastoma-macrofagi / microglia interazione mediante saggi in vitro di cultura. Questo approccio può facilitare notevolmente lo sviluppo e / o la scoperta di farmaci che interrompono la comunicazione con i macrofagi che permette a questo behav malignaior. Abbiamo stabilito due robusti saggi co-coltura di invasione dove microglia / macrofagi stimolano l'invasione delle cellule di glioma da 5 – 10 volte. cellule di glioblastoma marcate con un marcatore fluorescente o esprimono costitutivamente una proteina fluorescente sono placcati senza e con macrofagi / microglia su inserti camera policarbonato matrice rivestite o incorporati in una matrice tridimensionale. invasione cellulare viene valutata mediante microscopia a fluorescenza ad immagine e contare le cellule invasive solo sulla parte inferiore del filtro. L'utilizzo di questi test, diversi inibitori farmacologici (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib, e Semapimod), sono stati identificati che bloccano macrofagi / microglia stimolata glioblastoma invasione.
Introduction
Glioblastoma multiforme è un cancro aggressivo cervello umano con una sopravvivenza media di circa 12 mesi dal momento della diagnosi 1,2. Glioblastoma è uno dei tumori più letali e clinicamente impegnativi in quanto è refrattario alla chemioterapia standard e la resezione chirurgica. La natura diffusa del glioblastoma permette alle cellule tumorali di diffondersi in tutto il cervello normale rendendo il tumore avanzato praticamente impossibile chirurgicamente resecare completamente. Questo aspetto altamente invasiva è una caratteristica segno distintivo di glioblastoma e altri astrocitomi avanzate. Pertanto, l'attenzione di molte ricerche è stato sul meccanismo molecolare di invasione delle cellule di glioblastoma. Il microambiente tumorale glioblastoma gioca un ruolo fondamentale nella creazione di malignità 3-6. Tumore associato macrofagi / microglia hanno dimostrato di essere responsabile della promozione di glioblastoma invasione 7,8. La maggior parte di questi studi tuttavia misurato l'effetto di macrofagi / microglia usandosaggi che fisicamente li separano dalle cellule di glioblastoma. Il nostro laboratorio ha stabilito per generare saggi miglioramento che ci permettono di studiare come glioblastoma invasione dipende macrofagi / microglia in co-colture e ci consentono di immagine l'interazione fisica tra di loro durante l'invasione.
saggi classici per misurare l'invasione delle cellule includono i chemiotassi camera di Boyden "standard" e formati chemioinvasione. Qui le cellule da studiare sono placcati in una camera di plastica che contiene un filtro di policarbonato sul fondo che ha pori di una dimensione specificata (in genere tra 0,4 e 8 micron di diametro). Il processo di invasione delle cellule comporta una barriera fisica, generalmente composto da proteine della matrice extracellulare. Nel saggio chemioinvasione, la matrice preferito utilizzato è Matrigel (di seguito denominato "matrice"), una miscela di proteine della matrice extracellulare secreta dalle Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), le cellule del mouse sarcoma ed è costituito in gran parte di collagen tipo IV e laminina. Le camere vengono poi poste in un pozzo di coltura tissutale, che contiene mezzi di coltura cellulare, con o senza fattori di crescita che sono sospettati di stimolare l'invasione. Le cellule che hanno una maggiore capacità invasiva invaderanno attraverso il filtro rivestito matrice extracellulare ad una frequenza superiore e aderire alla parte inferiore del filtro. Abbiamo modificato questo test al fine di valutare il ruolo della microglia e macrofagi tumore associati su invasione delle cellule di glioblastoma.
Siamo stati in grado di determinare con saggi co-coltura descritti in questo documento che la microglia possono stimolare l'invasione di due linee cellulari di glioblastoma da 5 – 10 volte 9,10. Questo riflette ciò che viene osservato in modelli animali di glioblastoma. Inoltre, abbiamo sviluppato un saggio a tre invasione tridimensionale in cui le interazioni tra cellule di glioblastoma e macrofagi / microglia possono essere esaminate in modo più diretto. L'entità della invasione delle cellule di glioblastoma stimolato da macrophaGes / microglia nel dosaggio 3D è paragonabile a quello che si vede usando l'approccio camera di matrice rivestita. Test simili sono stati precedentemente sviluppato per studiare le interazioni di carcinoma della mammella con macrofagi durante l'invasione 11-13. Entrambi i metodi descritti in questo documento dovrebbe aiutare nella capacità di sezionare il meccanismo molecolare (s) di macrofagi / microglia stimolata invasione delle cellule di glioblastoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
La natura altamente invasiva di astrocitoma alto grado e glioblastoma rendono questi tumori cerebrali molto mortale. E 'quindi di fondamentale importanza per comprendere i meccanismi molecolari e cellulari di glioblastoma invasione. Molto è stato imparato a conoscere il processo di glioblastoma invasione già 17. Utilizzando i formati di test descritti in questo documento, il nostro laboratorio ha dimostrato sia in mouse e modelli umani che di tumore associato macrofagi possono stimolare l'invasione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
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