Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Glioblastoma multiforme (graad IV glioom) is een zeer agressieve kanker bij de mens, met een mediane overleving van 1 jaar na de diagnose. Ondanks de toegenomen kennis van de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot glioblastoma ontstaat, kanker nog steeds zeer ongevoelig voor conventionele behandeling. Chirurgische resectie van hooggradige hersentumoren is zelden volledig te wijten aan de sterk infiltrative aard van glioblastoma cellen. Therapeutische benaderingen die glioblastoma cel invasie afzwakken is daarom een aantrekkelijke optie. Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat de tumor-geassocieerde macrofagen en microglia (resident hersenen macrofagen) sterk stimuleren glioblastoma invasie. De in dit document beschreven protocol wordt gebruikt om te modelleren glioblastoma-macrofagen / microglia interactie met behulp van in vitro cultuur assays. Deze benadering kan de ontwikkeling en / of de ontdekking van geneesmiddelen die de communicatie met de macrofagen verstoren dat deze kwaadaardige Behav maakt veel gemakkelijkerIOR. 10-voudig – We hebben twee robuuste co-cultuur invasie assays, waar microglia / macrofagen stimuleren glioom cel invasie van 5 vastgesteld. Glioblastoma cellen gemerkt met een fluorescente merker of constitutief een fluorescerend eiwit tot expressie brengen worden uitgeplaat en zonder macrofagen / microglia on-bedekte matrix polycarbonaat kamer inzetstukken of ingebed in een driedimensionale matrix. Celinvasie wordt bepaald door fluorescentie microscopie aan te tellen alleen invasieve cellen aan de onderkant van het filter. Met behulp van deze assays, meerdere farmacologische remmers (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib en Semapimod), geïdentificeerd die macrofagen blokkeren / microglia gestimuleerd glioblastoma invasie.
Introduction
Glioblastoma multiforme is een agressieve menselijke hersenen kanker met een mediane overleving van ongeveer 12 maanden na de diagnose 1,2. Glioblastoma is een van de meest dodelijke soorten kanker en klinisch uitdagend omdat het ongevoelig is voor standaard chemotherapie en chirurgische resectie. De diffuse aard van glioblastoma stelt tumorcellen verspreid over de normale hersenen die de geavanceerde tumor praktisch onmogelijk operatief resectie volledig. Deze zeer invasieve aspect is een kenmerk kenmerk van glioblastoma en andere geavanceerde astrocytomen. Daarom is de focus van veel onderzoek gedaan naar de moleculaire mechanisme van glioblastoma celinvasie. De glioblastoma tumor micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij vaststelling van maligniteit 3-6. Tumor-geassocieerde macrofagen / microglia werden voor de bevordering van glioblastoma invasie 7,8 te zijn. De meeste van deze studies het effect van macrofagen / microglia echter gemeten middelstesten die ze van de glioblastoma cellen fysisch scheiden. Ons laboratorium heeft tot betere analyses die ons in staat om te bestuderen hoe glioblastoma invasie is afhankelijk van macrofagen / microglia in coculturen en stellen ons in staat om het beeld van de fysieke interactie tussen hen tijdens de invasie te genereren uiteengezet.
Classic assays voor het meten van cel invasie onder de "standaard" Boyden kamer chemotaxis en chemoinvasion formaten. Hier de cellen te bestuderen uitgeplaat in een plastic kamer die een polycarbonaat filter aan de achterkant die poriën van een bepaalde grootte (gewoonlijk tussen 0,4 en 8 uM in diameter) heeft bevat. Het proces van invasie omvat een fysieke barrière, gewoonlijk uit extracellulaire matrix eiwitten. In de chemoinvasion assay de voorkeur gebruikte matrix Matrigel (hierna "matrix"), een extracellulaire matrix eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma-cellen en bestaat grotendeels uit collagen type IV en laminine. De kamers worden dan geplaatst in een weefselkweek die goed celkweekmedia bevat met of zonder groeifactoren waarvan wordt vermoed dat invasie stimuleren. Cellen die een hogere invasiecapaciteit binnenvallen door de extracellulaire matrix bekleed filter met een hogere frequentie en zich aan de onderzijde van het filter hebben. We hebben deze assay gewijzigd om de rol van microglia en macrofagen op tumor geassocieerde glioblastoma celinvasie beoordelen.
10 voudige 9,10 – Wij hebben kunnen vaststellen middels co-cultuur assays beschreven in dit document dat microglia de invasie van twee glioblastoma cellijnen kunnen stimuleren door 5 geweest. Dit weerspiegelt wat wordt waargenomen in diermodellen van glioblastoma. Verder hebben we een driedimensionaal invasie assay waarbij de wisselwerking tussen glioblastoma cellen en macrofagen / microglia zijn directer onderzocht. De mate van glioblastoma celinvasie gestimuleerd door macrophages / microglia in het 3D assay is vergelijkbaar met wat gezien wordt met de bedekte matrix kamer benadering. Soortgelijke proeven werden eerder ontwikkeld om mammacarcinoom interacties met macrofagen tijdens invasie 11-13. Zowel in dit document beschreven werkwijzen moet de steun in het vermogen om het moleculaire mechanisme (s) van macrofagen / microglia-gestimuleerde invasie van glioblastoma cellen ontleden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zeer invasieve aard van hoogwaardige astrocytomen en glioblastoma maken deze hersentumoren zeer dodelijk. Het is daarom van het grootste belang voor de moleculaire en cellulaire mechanismen van glioblastoma invasie begrijpen. Er is al veel geleerd over het proces van glioblastoma invasie al 17. Met behulp van de test formaten beschreven in dit document, heeft ons laboratorium aangetoond in zowel muis en mens modellen die tumor-geassocieerde macrofagen glioma cel invasie kan stimuleren door 5-10 voudig. Dez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
