Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

doi: 10.3791/53990 Published: October 20, 2016

Abstract

Glioblastoma multiforme (graad IV glioom) is een zeer agressieve kanker bij de mens, met een mediane overleving van 1 jaar na de diagnose. Ondanks de toegenomen kennis van de moleculaire gebeurtenissen die leiden tot glioblastoma ontstaat, kanker nog steeds zeer ongevoelig voor conventionele behandeling. Chirurgische resectie van hooggradige hersentumoren is zelden volledig te wijten aan de sterk infiltrative aard van glioblastoma cellen. Therapeutische benaderingen die glioblastoma cel invasie afzwakken is daarom een ​​aantrekkelijke optie. Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat de tumor-geassocieerde macrofagen en microglia (resident hersenen macrofagen) sterk stimuleren glioblastoma invasie. De in dit document beschreven protocol wordt gebruikt om te modelleren glioblastoma-macrofagen / microglia interactie met behulp van in vitro cultuur assays. Deze benadering kan de ontwikkeling en / of de ontdekking van geneesmiddelen die de communicatie met de macrofagen verstoren dat deze kwaadaardige Behav maakt veel gemakkelijkerIOR. 10-voudig - We hebben twee robuuste co-cultuur invasie assays, waar microglia / macrofagen stimuleren glioom cel invasie van 5 vastgesteld. Glioblastoma cellen gemerkt met een fluorescente merker of constitutief een fluorescerend eiwit tot expressie brengen worden uitgeplaat en zonder macrofagen / microglia on-bedekte matrix polycarbonaat kamer inzetstukken of ingebed in een driedimensionale matrix. Celinvasie wordt bepaald door fluorescentie microscopie aan te tellen alleen invasieve cellen aan de onderkant van het filter. Met behulp van deze assays, meerdere farmacologische remmers (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib en Semapimod), geïdentificeerd die macrofagen blokkeren / microglia gestimuleerd glioblastoma invasie.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glioblastoma multiforme is een agressieve menselijke hersenen kanker met een mediane overleving van ongeveer 12 maanden na de diagnose 1,2. Glioblastoma is een van de meest dodelijke soorten kanker en klinisch uitdagend omdat het ongevoelig is voor standaard chemotherapie en chirurgische resectie. De diffuse aard van glioblastoma stelt tumorcellen verspreid over de normale hersenen die de geavanceerde tumor praktisch onmogelijk operatief resectie volledig. Deze zeer invasieve aspect is een kenmerk kenmerk van glioblastoma en andere geavanceerde astrocytomen. Daarom is de focus van veel onderzoek gedaan naar de moleculaire mechanisme van glioblastoma celinvasie. De glioblastoma tumor micro-omgeving speelt een belangrijke rol bij vaststelling van maligniteit 3-6. Tumor-geassocieerde macrofagen / microglia werden voor de bevordering van glioblastoma invasie 7,8 te zijn. De meeste van deze studies het effect van macrofagen / microglia echter gemeten middelstesten die ze van de glioblastoma cellen fysisch scheiden. Ons laboratorium heeft tot betere analyses die ons in staat om te bestuderen hoe glioblastoma invasie is afhankelijk van macrofagen / microglia in coculturen en stellen ons in staat om het beeld van de fysieke interactie tussen hen tijdens de invasie te genereren uiteengezet.

Classic assays voor het meten van cel invasie onder de "standaard" Boyden kamer chemotaxis en chemoinvasion formaten. Hier de cellen te bestuderen uitgeplaat in een plastic kamer die een polycarbonaat filter aan de achterkant die poriën van een bepaalde grootte (gewoonlijk tussen 0,4 en 8 uM in diameter) heeft bevat. Het proces van invasie omvat een fysieke barrière, gewoonlijk uit extracellulaire matrix eiwitten. In de chemoinvasion assay de voorkeur gebruikte matrix Matrigel (hierna "matrix"), een extracellulaire matrix eiwit mengsel afgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muizen sarcoma-cellen en bestaat grotendeels uit collagen type IV en laminine. De kamers worden dan geplaatst in een weefselkweek die goed celkweekmedia bevat met of zonder groeifactoren waarvan wordt vermoed dat invasie stimuleren. Cellen die een hogere invasiecapaciteit binnenvallen door de extracellulaire matrix bekleed filter met een hogere frequentie en zich aan de onderzijde van het filter hebben. We hebben deze assay gewijzigd om de rol van microglia en macrofagen op tumor geassocieerde glioblastoma celinvasie beoordelen.

10 voudige 9,10 - Wij hebben kunnen vaststellen middels co-cultuur assays beschreven in dit document dat microglia de invasie van twee glioblastoma cellijnen kunnen stimuleren door 5 geweest. Dit weerspiegelt wat wordt waargenomen in diermodellen van glioblastoma. Verder hebben we een driedimensionaal invasie assay waarbij de wisselwerking tussen glioblastoma cellen en macrofagen / microglia zijn directer onderzocht. De mate van glioblastoma celinvasie gestimuleerd door macrophages / microglia in het 3D assay is vergelijkbaar met wat gezien wordt met de bedekte matrix kamer benadering. Soortgelijke proeven werden eerder ontwikkeld om mammacarcinoom interacties met macrofagen tijdens invasie 11-13. Zowel in dit document beschreven werkwijzen moet de steun in het vermogen om het moleculaire mechanisme (s) van macrofagen / microglia-gestimuleerde invasie van glioblastoma cellen ontleden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fluorescerende Labeling van Cellen

OPMERKING: Label glioblastoma cellijnen en microglia met fluorescerende kleurstoffen 9. Alternatief genereren cellijnen die constitutief fluorescerende eiwitten zoals GFP / RFP expressie zoals beschreven in 14.

  1. 80% confluent op dag van kleuring - plaat cellen op een 6 wells plaat zodanig dat ze 70 zijn. Voor de muizen glioblastoma cellijn GL261 en menselijke glioblastoma cellijn U87, plaat 1 x 10 6 en 1,5 x 10 6 cellen, respectievelijk op een 6 cm schaal 24 uur voor kleuring.
  2. Bereid fluorescerende cel vlek kleurstof oplossing in DMSO en voeg 5 uM kleurstof media, ofwel Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) of macrofaag serumvrij medium (MSFM), vortex goed.
  3. Incubeer cellen met kleurstof gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2.
  4. Verwijderen kleurstof bevattende media en voeg vers medium (RPMI of MSFM) aan de cellen.
  5. Incubeer cellen gedurende 30 min. Opmerking: Cellen nugekleurd en klaar voor gebruik in experimenten.

2. Pre-coated Matrix Kamer Coculture Invasion Assay

  1. Differentiëren THP-1-cellen met behulp forbolmyristaatacetaat (PMA) 15.
    1. Plate 2-3 x 10 5 THP-1 cellen in 1,5 ml RPMI / 10% FBS in een 6 putjes plaat. Direct na plating toevoegen 100 nM PMA en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
      Opmerking: na 48 uur, THP-1-cellen die met succes hebben ondergaan differentiatie hechtende en verspreid naar de bodem van de put die op een ronde morfologie.
    2. Verwijder PMA door eenmaal wassen met 1x PBS en te vervangen door vers RPMI / 10% FBS. Wacht nog 48 uur tot cellen zijn klaar voor gebruik in test.
  2. Evenwicht matrix voorbekleed kamers door ze in een putje met 500 pl medium alleen (zonder serum) en toevoegen van 500 pl medium alleen naar boven. Incubeer kamers voor 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
    tabel of Materials / Equipment.
  3. Om voorzichtig los cellen (fluorescent gelabeld glioblastoma cellijnen en de microglia / macrofagen), verwijder media uit cellen door aspiratie. Was de cellen op schotel met 2 mM EDTA / PBS. Voeg 500 ul van 2 mM EDTA / PBS en incubeer gedurende 5-10 minuten in een cel incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
  4. Resuspendeer cellen in 5 ml medium bevattende 0,3% runderserumalbumine (BSA).
  5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 120 x g.
  6. Aspireren supernatant en resuspendeer pellet in MSFM / 0,3% BSA media (GL261 cellen en microglia) of RPMI / 0,3% BSA (voor U87 en THP-1 cellen) zodat de concentratie van cellen is gelijk aan 1 x 10 6 cellen / ml . Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.
  7. Voeg 500 ul media / 0,3% BSA per putje van de plaat met 24 putjes.
  8. Verwijder media uit kamers die zijn geëquilibreerd gedurende ten minste 2 uur (stap 2,2). plaats chambers in putje met 500 ul media /% BSA 0.3 (stap 2.7).
  9. Als remmers worden gebruikt om hun effect op macrofagen bestuderen / microglia gestimuleerd glioom invasie, voeg de juiste concentratie zowel de onderste en bovenste gedeelten van de kamer.
    LET OP: De concentraties van CSF-1R remmer gebruikt om microglia volledig remmen gestimuleerd GL261 glioblastoma invasie kan worden gevonden in referentie 9.
  10. Afhankelijk van de gebruikte cellijnen, cellen aan de bovenste kamer zoals beschreven in de volgende twee stappen: muis glioblastoom (2.10.1) en humaan glioblastoom (2.10.2).
    1. Mix 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) cellen (150 pi) en 5 x 10 4 muis microglia (50 pl) (zie stap 2.6 voor media-informatie). Breng het volume op 500 pl door toevoeging van 300 ul MSFM / 0,3% BSA. Voeg celmengsel aan de bovenste kamer en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
      LET OP: Muizen microglia zijn geïsoleerd van pasgeboren muizen, zoals beschreven in 1 6.

Mix 7,5 x 10 4 U87 (glioblastoma) cellen (75 ui) en 2,5 x 10 4 THP1 (macrofaag) cellen (25 pi). Breng volume 500 pl door toevoeging van 400 pl RPMI / 0,3% BSA. Voeg de cel mengsel aan de bovenste kamer. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur.

  1. Na incubatie verwijderen cellen uit de top van de kamer door behoedzame aspiratie en lossen door het plaatsen van camera's in 3,7% formaldehyde in PBS. Toestaan ​​kamers in fixeermiddel blijft gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (of overnacht bij 4 ° C). Verwijder fixatief door zachte aspiratie en te vervangen door 500 ul 1x PBS. Ga verder naar hoofdstuk 4 voor beeldanalyse.
    LET OP: Experiment kunnen worden gepauzeerd op dit moment en opgeslagen voor beeldvorming in 1x PBS. Fluorescerende kleurstof signalen kunnen worden gedetecteerd tot 2 weken na fixatie.

3. Invasion Assay "3D" -embedding glioom en macrofagen / microglia in Matrix

  1. Dooi matrix mix bij 4 ° C gedurende de nacht. Voer alle verdere manipulaties met behulp van matrix op het ijs in de kap.
  2. Bereid 10 mg / ml concentratie van matrix media (MSFM of RPMI) met 0,3% BSA op ijs.
    Opmerking: De concentratie van matrix kenmerkend ongeveer 15 mg / ml.
  3. Om cellen (gelabeld in stap 1) tot schorsing bereiden in matrix, verwijder media uit cellen door aspiratie. Was de cellen op schotel met 2 mM EDTA / PBS. Voeg 500 ul van 2 mM EDTA / PBS cellen en incubeer gedurende 5-10 minuten in de broedstoof bij 37 ° C en 5% CO2.
  4. Resuspendeer cellen in 5 ml medium bevattende 0,3% BSA.
  5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 120 x g.
  6. Aspireren supernatant van pellet. Resuspendeer pellet in media / 0,3% BSA zodat de concentratie van cellen is gelijk aan 1 x 10 6 cellen / ml. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.
  7. Voeg 1,5 x 10 5 GL261 cellen (in 150 pl) + 5 x 10 4 microglia cellen (in 50 ui) in een 1,5 ml microfugebuis.Voeg 2 x 10 5 GL261 cellen (200 ui) in een afzonderlijke 1,5 ml microfugebuis.
    OPMERKING: GL261 cellen alleen zonder microglia dient als controle.
  8. Spin cellen in microfuge gedurende 5 minuten bij 120 x g.
  9. Resuspendeer cellen in 200 ul koude matrix op ijs.
  10. Plaat 50 ul (50.000 cellen) op het midden van het bovenste compartiment van 8 uM poriegrootte kamer insert.
  11. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min bij polymerisatie optreedt.
  12. Voeg 200 ul serumvrij medium aan de bovenste kamer en 700 pl serum bevattend celkweekmedium de onderste put.
  13. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 48 uur.
  14. Na incubatie verwijderen cellen uit de top van de kamer door behoedzame aspiratie en lossen door het plaatsen van camera's in 3,7% formaldehyde in PBS. Toestaan ​​kamers in fixeermiddel blijft gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (of overnacht bij 4 ° C). Verwijder fixatief door zachte aspiratie en te vervangen door 500 ul 1x PBS. Ga naar deel 4 foimage r analyse.

4. Imaging Testen

  1. Verwijder Chambers van 3,7% formaldehyde en was in goed met vers 500 ul 1x PBS.
    LET OP: Sta niet toe dat de kamers te drogen.
  2. Met een wattenstaafje, reinig de niet-invasieve cellen uit het bovenste gedeelte van het filter (zijde naar de binnenzijde van de kamer) schrapen het filteroppervlak. Begin voorzichtig en geleidelijk te verhogen druk. Doe dit minstens 3 keer per kamer.
  3. Plaats kamers in ofwel een glazen bodem schaal of laat het in een 24 wells plaat.
  4. Plaats monster op het podium van een epifluorescerende of laser confocale fluorescentiemicroscoop uitgerust met camera en image capture software 9,10.
  5. Haal een paar 10X of 20X beelden van representatieve velden.
  6. Met een beeldanalyse software zoals ImageJ Tel het aantal glioblastoma cellen die het filter zijn overgestoken naar de onderzijde 9,10.
  7. Wanneer beeldvorming van de "3D. "Invasie assay (beschreven in hoofdstuk 3), het genereren van een Z-stack-serie met behulp van een fluorescerende laser confocale microscoop 5-6 Om het beeld van de invasieve cel bevolking aan de onderkant van het filter, volg het protocol stappen 4,2-4,6 hierboven beschreven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Met de hier beschreven werkwijzen, hebben we aangetoond dat microglia en macrofagen aanzienlijk kunnen stimuleren glioblastoom celinvasie. Twee verschillende invasie assays worden toegepast en worden weergegeven in figuur 1. In figuur 2, werden GL261 cellen die constitutief het fluorescerende eiwit tot expressie mCherry uitgeplaat op vooraf beklede kamers met en zonder microglia voor 48 uur. GL261 cellen werden minimaal invasieve op zichzelf echter indien gekweekt met microglia de invasiecapaciteit ongeveer 10-voudig verhoogd.

We nemen een vergelijkbaar effect met menselijke cellijnen. In figuur 3, U87 cellen (gekleurd met 5-chloromethylfluorescein diacetaat (CMFDA) groen) geeft 5-6 maal hoger invasie wanneer gekweekt samen met gedifferentieerde THP-1-cellen. THP-1 is een humane monocytische cellijn (afgeleid van een acute monocytische leukemie patiënt) die zijn differentiated in een macrofaag-achtige toestand met behulp van forbolmyristaatacetaat (PMA) 15. Gedifferentieerde THP-1-cellen vertonen veel van de kenmerken van de menselijke macrofagen zoals cytokine afscheiding en de mogelijkheid om fagocytose uitvoeren.

Alternatief kan celinvasie worden gemeten door deze in te sluiten in matrixvorm en plating dit direct op het filter in een kamer inzetstuk. Laser confocale microscopie kan worden gebruikt om een ​​reeks beelden die een driedimensionale representatie (Z-stack) produceert produceren. Vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in de matrix beklede kamer assay (getoond in figuren 2-3), de co-cultuur van microglia (gekleurd met CMPTX rode) stimuleert GL261 cellen (CMFDA groen) te vallen zoals gemeten door het aantal cellen die gekruist aan de onderzijde van het filter (figuur 4). Dit formaat heeft als bijkomend voordeel dat mogelijke cel-cel interacties tussen glio visualiserenblastoom cellen en microglia tijdens invasie. Inderdaad, microglia lijken nauwer bij de glioma cellen gesuspendeerd in 3D matrix (Figuur 5). Als slechts eindpuntanalyse vereist en een confocale laser is niet beschikbaar voor gebruik, kan celkamers worden gereinigd zoals beschreven voor de matrix beklede kamers. Dan is het aantal resterende (invasieve) cellen kan worden bepaald door het tellen behulp beelden verkregen uit een standaard epifluorescerende microscoop. Film 1 toont de driedimensionale samenstel van een dergelijke test.

Figuur 1
Figuur 1:. Schema van twee verschillende protocollen voor het testen van Microglia / macrofaag-gestimuleerde Glioblastoma Cell Invasion Top panel illustreert pre-coated matrix kamer invasie assay (deel 2). Onderste paneel toont 3D-matrix invasie assay (hoofdstuk 3). Figuur aangepast van9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Microglia (MG) Verbeter GL261 Glioblastoma Cell Invasion. (A) Representatieve beelden van binnenvallende GL261 cellen (uitdrukken mCherry) in de afwezigheid (linker paneel; GL261 alleen) of de aanwezigheid van microglia (rechter paneel; GL261 + MG) werden gecombineerd en uitgeplaat op-matrix gecoate kamers, gevolgd door incubatie gedurende 48 hr en evaluatie van het aantal cellen die het filter hebben gekruist. Beelden gemaakt met behulp van 10X objectief. Schaal bar = 400 pm. (B) Kwantificering van assay tellen alleen invasieve GL261 cellen (rood). De getoonde gegevens zijn gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten. (C) Kwantificering van microglia-gestimuleerde GL261 invasie in de Presence van farmacologische remmers gefitinib (5 uM), JNJ-28312141 (10 uM), PLX3397 (1 uM), PLX5562 (1 uM). De getoonde gegevens zijn gemiddelden ± SEM van zes onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. THP1 macrofagen Verbeter U87 Glioblastoma Cell Invasion. (A) Representatieve beelden van binnenvallende U87 cellen gekleurd met CMFDA groene uitgeplaat op-bedekte matrix kamers alleen (linkerpaneel, U87) of gedifferentieerde THP1 macrofagen (rechter paneel; U87 + THP1), gevolgd door incubatie gedurende 24 uur en daarna evaluatie het aantal cellen die het filter hebben gekruist. Foto's genomen met behulp van een 10X objectief. Schaal bar = 400 pm. (B) Kwantificering van de test alleen telleninvasieve U87 cellen (groen). De getoonde gegevens zijn gemiddelden ± SEM van tien onafhankelijke experimenten.

figuur 4
. Figuur 4. 3D Invasion Assay van GL261 en Microgliale Coculture (A) getoonde afbeeldingen zijn projecties van een Z-reeks beelden van GL261 cellen (gekleurd met CMFDA groen) ingebed in matrix alleen (linker paneel, GL261), of met muizen microglia ( gelabeld met CMPTX rood, rechter paneel; GL261 + MG). De Z-projecties zijn van de bodem 4 van de plakken afbeeldingsstapel die de bodem van de kamer filter omvat en vormt derhalve invasieve cellen. Schaal bar = 200 uM. (B) Kwantificering van GL261 cellen (groen) bepaald op de onderzijde van het filter, zoals hierboven beschreven. Het totale aantal binnendringende GL261 cellen bepaald en genormaliseerd tot die van GL261 cellen in monocultuur. De getoonde gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM van 3 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in tweevoud (figuur aangepast van 10). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Afbeelding van een Plak binnen de 3D-Stapel GL261 (groen) en microglia (rood) Coculture Ingebed in Matrix. GL261 en microglia cel interacties zijn gemarkeerd met witte pijlen. Schaal bar = 100 uM.

Figuur 1
Film 1:. Glioblastoma en Microglia Interaction in 3D rotatie rond de X-as van een 3D-projectie van het gehele Z-serie beelden uit GL261 (groen) en microglia (rood) co-cultuur ingebed in matrix. Slices zijn in 5 uM stappen. Klik hier om deze video te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De zeer invasieve aard van hoogwaardige astrocytomen en glioblastoma maken deze hersentumoren zeer dodelijk. Het is daarom van het grootste belang voor de moleculaire en cellulaire mechanismen van glioblastoma invasie begrijpen. Er is al veel geleerd over het proces van glioblastoma invasie al 17. Met behulp van de test formaten beschreven in dit document, heeft ons laboratorium aangetoond in zowel muis en mens modellen die tumor-geassocieerde macrofagen glioma cel invasie kan stimuleren door 5-10 voudig. Deze co-cultuur model repliceert getrouw het vermogen van glioblastoma cellen fysieke interactie met macrofagen / microglia hetgeen het mogelijk paracriene en juxtacrine interacties (via ligand-receptor systemen zoals Notch-Delta en efrine-Ephs) die mogelijk betrokken zijn bij bidirectionele communicatie tussen de tumorcellen en macrofagen. Andere testvormen die trachten het effect van macrofagen op glioom celinvasie ontdekken meestal de cellenfysiek gescheiden als macrofagen uitgeplaat op de bodem van de put en de glioblastomacellen op de kamer 3,4. Derhalve zijn deze studies tonen een bescheiden toename in macrofaag invasie gestimuleerde glioom (2 maal). Deze co-cultuur test verbetert dit effect (5-10 maal) waarschijnlijk gewezen op het belang van juxtacrine interacties tijdens macrofagen / microglia gestimuleerd glioblastoma invasie.

Het protocol beschreven in dit document omvat verschillende stappen die zorgvuldig moet worden uitgevoerd om goede resultaten te bereiken. Indien het experiment wordt uitgevoerd zoals beschreven en niet binnendringende cellen worden gezien, kan de fluorescerende kleurstof verlopen die zal leiden tot zeer zwak of niet aanwezig kleuring. Voor de invasie assays met de pre-coated kamers, is het essentieel om nieuwe invasie cellen die niet voorbij de vervaldatum en werden ingevroren bewaard de hele tijd tot het uitvoeren van het experiment gebruikt. Chambers die werden achtergelatenbij kamertemperatuur gedurende meer dan 12 uur werden onbevredigend doordat de matrix barrière niet meer intact en cellen vielen op een veel hogere frequentie dan normaal. Voor de 3D assay is van doorslaggevend belang voor alle pipetten en buizen op ijs bewaren. Indien bij kamertemperatuur gedurende een langere tijd, zal de matrix polymeriseren en kan niet worden gebruikt om de cellen te resuspenderen in. Aanbevolen wordt een bakje gevuld met ijs wordt gebruikt in de kap op alle materialen die in contact met de matrix komen houden. Het protocol kan worden aangepast om een ​​hogere celdichtheid omvatten, maar dit kan de tijd die nodig is om het optimale effect op glioom invasie zien krijgt. Het zou interessant zijn om te zien of andere celtypes in de co-cultuur test kan worden toegevoegd en wat mogelijke effecten die ze kunnen hebben op de invasie. Tenslotte erkennen wij dat de hersenen micro uniek en moeilijk te repliceren in vitro. Een beperking van dit protocol is dat de invasie chAmbers hier gebruikt niet de typische elementen van de normale hersenen die glioblastoma cellen zullen tegenkomen tijdens de invasie (dat wil zeggen, dicht op elkaar gepakte neuronen en astrocyten). Hoewel daarmee voorbehoud, het stimulerende effect van macrofagen / microglia van de assay is consistent met wat is waargenomen in vivo en kan worden gebruikt om te voorspellen welke remmers en / of eiwitten kunnen dit proces verstoren.

Nabootsen van de tumor micro-omgeving in kweek is een moeilijke taak gezien hoe veel verschillende celtypen en matrixeiwitten aanwezig in tumoren in verschillende stadia van maligniteit zijn. Nog redelijk nauwkeurig in vitro modellen van tumor interactie met componenten van de micro-omgeving zou zeer de ontdekking van nieuwe therapeutische middelen te vergemakkelijken. Het is nu duidelijk zijn dat cellen zoals macrofagen een belangrijke rol spelen in verschillende aspecten in verband met de progressie naar maligniteit, waaronder angiogenese, invasie, immuun ontduiking en resistentie tegen geneesmiddelen. de cocultuur invasie assay beschreven gebruikt de verhouding van tumorcellen macrofagen die wordt waargenomen bij patiënten met een hoge graad glioblastomas (ongeveer 3: 1, 5). Het is aangetoond dat het vermogen van macrofagen / microglia aan glioblastoma invasie stimuleren afhangt van CSF-1R en EGFR signalering farmacologische remming van deze processen gebruik JNJ-28.312.141, PLX3397 (CSF-1R) en gefitinib (EGFR) remt sterk de verhoging in invasie 9. Verder met de geïntegreerde matrix assay werd aangetoond dat Semapimod, een klein molecuul bekend macrofagen en microglia targeten, kunnen ook microglia blokkeren gestimuleerd glioblastoom invasie 10. De resultaten van deze co-cultuur experimenten op voorwaarde dat de impuls aan deze verbindingen met behulp van in vivo modellen te valideren. Consistent met gegevens van de in vitro testen beschreven in dit document, blokkade van CSF-1R met de remmer PLX3397 (die de bloedhersenbarrière passeert) grotendeels blokkeerde devermogen van GL261 glioma cellen binnen te vallen in de hersenen van C57BL / 6 muizen 9. Ook Semapimod afgeleverd in de hersenen werd aangetoond dat de invasie te remmen en synergie met de standaard behandeling straling in sterk verlenging van de overleving van muizen die GL261 tumoren 10. Beide benaderingen kunnen effectief in de kliniek te bewijzen.

Het is nu wel duidelijk zijn dat de macrofaag systeem is heel belangrijk voor progressie van verschillende kankers kwaadaardigheid 3-6, 11-13. Er is duidelijk vastgesteld borstkanker en hersenkanker modellen die tumor-geassocieerde macrofagen cruciaal zijn voor tumorcel invasie en metastase. Bovendien, macrofagen waarschijnlijk erg belangrijk voor het mediëren immune escape macrofagen (en cellen van verwante cellijn, zoals dendritische cellen) fungeren als professionele antigeenpresenterende cellen die orkestreren adaptieve immuniteit in reactie op infectie 18 te zijn. Het is nu duidelijk dat één van de normale physiological functies van het adaptieve immuunsysteem ongecontroleerde proliferatie te voorkomen door afwijkende cellen vernietigen. Immuniteit naar de tumorcellen is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat de sterk mutagene aard van de kankercel genereert neo-antigenen die als vreemd worden herkend door het adaptieve immuunsysteem. Inderdaad het proces van "immuun fraude" wordt gepostuleerd dat een belangrijk deel van maligniteit kankercellen moet het immuunsysteem (met name cytotoxische lymfocyten, natuurlijke killercellen en inflammatoire macrofagen) verhinderen de tumor te vernietigen. Gehoopt wordt het beschreven in dit document zal de studie van glioblastoma interactie met macrofagen vergemakkelijkt en mogelijk toestaan dat de uitbreiding van de soorten vragen die we kunnen pakken over kwaadaardige kanker met behulp van in vitro cultuur assays assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix Corning/Fisher Scientific Cat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) Life Technologies 12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye Life Technologies/Molecular Probes C34552
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies/Molecular Probes C2925
GL261 cell line National Cancer Institute (NCI)
U87 cell line American Tissue Type Culture Collection HTB-14
THP-1 cell line American Tissue Type Culture Collection ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml) Life Technologies/Gibco 11875-093
Formaldehyde solution Sigma Aldrich F1635
Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. Corning CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear Trevigen 3445-005-01
Fetal Calf Serum (FBS) Life Technologies Cat: 10500064
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisherscientific BP1600-100
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific 15575-020
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma Aldrich P8139-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82, (10), 1271-1286 (2007).
  2. Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21, (21), 2683-2710 (2007).
  3. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, (3), 502-514 (2012).
  4. Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14, (8), 958-978 (2012).
  5. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81, (3), 447-455 (2005).
  6. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, (3), 472-485 (2011).
  7. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103, (4), 351-355 (2002).
  8. Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27, (7), 918-930 (2008).
  9. Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
  10. Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9, (5), (2014).
  11. Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65, (12), 5278-5283 (2005).
  12. House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50, (32), 6920-6932 (2011).
  13. Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173, (3), 395-404 (2006).
  14. Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13, (1), 34-37 (2003).
  15. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26, (2), 171-176 (1980).
  16. Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16, (3), 320-344 (1998).
  17. Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32, (7-8), 372-380 (2013).
  18. See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123, (3), 405-412 (2015).
Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coniglio, S., Miller, I., Symons, M., Segall, J. E. Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion. J. Vis. Exp. (116), e53990, doi:10.3791/53990 (2016).More

Coniglio, S., Miller, I., Symons, M., Segall, J. E. Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion. J. Vis. Exp. (116), e53990, doi:10.3791/53990 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter