Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
Glioblastoma multiforme (grad IV gliom) er en meget aggressiv human cancer med en median overlevelse på 1 år efter diagnosen. Trods af den øgede forståelse af de molekylære begivenheder, der giver anledning til glioblastomer, denne kræft stadig yderst refraktære over for konventionel behandling. Kirurgisk resektion af høj kvalitet hjernetumorer er sjældent udført på grund af den meget infiltrativ karakter glioblastomceller. Terapeutiske tilgange, som dæmper glioblastom celleinvasion derfor er en attraktiv mulighed. Vores laboratorium og andre har vist, at tumor associerede makrofager og mikroglia (hjemmehørende hjerne makrofager) kraftigt stimulere glioblastom invasion. Den i dette dokument protokol bruges til at modellere glioblastoma-makrofag / microglia interaktion anvendelse af in vitro kultur assays. Denne tilgang kan i høj grad lette udviklingen og / eller opdagelse af lægemidler, der forstyrrer kommunikationen med makrofager, der giver dette ondartet Behavior. Vi har etableret to robuste cokultur invasion assays, hvor mikroglia / makrofager stimulerer gliom celleinvasion 5 – 10 gange. Glioblastomceller mærket med en fluorescerende markør eller konstitutivt udtrykker et fluorescerende protein udplades uden og med makrofager / mikroglia på matrix-coatede polycarbonat kammer skær eller indlejret i en tredimensional matrix. Celleinvasion vurderes ved hjælp af fluorescensmikroskopi af billedet og tælle kun invasive celler på undersiden af filteret. Under anvendelse af disse assays, adskillige farmakologiske inhibitorer (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib, og Semapimod), er blevet identificeret som blokerer makrofag / microglia stimulerede glioblastoma invasion.
Introduction
Glioblastoma multiforme er en aggressiv menneskelige hjerne kræft med en median overlevelse på ca. 12 måneder fra tidspunktet for diagnosen 1,2. Glioblastoma er en af de mest dødbringende og klinisk udfordrende kræftformer det er refraktære over for standard kemoterapi og kirurgisk resektion. Den diffuse natur af glioblastom muliggør tumorceller at spredes over hele den normale hjerne gør den avancerede tumor praktisk taget umuligt at kirurgisk resecere fuldstændigt. Denne yderst invasive aspekt er kendetegnende træk ved glioblastom og andre avancerede astrocytomer. Derfor har været genstand for megen forskning i molekylære mekanisme af glioblastom celleinvasion. Den glioblastomtumor mikromiljø spiller afgørende roller i etableringen malignitet 3-6. Tumor forbundet makrofager / mikroglia viste sig at være ansvarlig for at fremme glioblastom invasion 7,8. De fleste af disse undersøgelser imidlertid målte virkningen af makrofager / mikroglia under anvendelseanalyser som fysisk adskiller dem fra glioblastom celler. Vores laboratorium har sat sig for at generere forbedrede analyser, der giver os mulighed for at undersøge, hvordan glioblastom invasion afhænger af makrofager / mikroglia i cokultureme og gøre os i stand til at afbilde den fysiske vekselvirkning mellem dem under invasionen.
Klassiske assays til måling af celle invasion omfatter "standard" Boyden kammer kemotaksi og chemoinvasion formater. Her cellerne, der skal undersøges udplades i en plastik kammer, som indeholder et polycarbonat filter på bunden, der har porer af en bestemt størrelse (i almindelighed mellem 0,4 og 8 um i diameter). Processen med celleinvasion involverer en fysisk barriere, der normalt består af ekstracellulær matrix protein. I chemoinvasion assay foretrukne anvendte matrix er Matrigel (i det følgende benævnt "matrix"), et ekstracellulært matrixprotein blanding udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muse sarcomaceller og hovedsageligt består af kollagen type IV og laminin. Kamrene anbringes derefter i en vævskultur brønd, som indeholder cellekulturmedier med eller uden vækstfaktorer, som mistænkes for at stimulere invasion. Celler, der har en højere invasiv kapacitet vil invadere gennem den ekstracellulære matrix coatet filter ved en højere frekvens og klæbe til undersiden af filteret. Vi har modificeret denne assay for at vurdere rollen af mikroglia og tumorassocierede makrofager på glioblastoma celleinvasion.
Vi har været i stand til at bestemme ved hjælp cokultur assays beskrevet i dette dokument, at mikroglia kan stimulere invasionen af to glioblastom cellelinier 5 – 10 gange 9,10. Dette afspejler, hvad der er observeret i dyremodeller af glioblastom. Derudover har vi udviklet et tredimensionelt invasion assay, hvor samspillet mellem glioblastom celler og makrofager / mikroglia kan undersøges mere direkte. Omfanget af glioblastom celleinvasion stimuleret af macrophaGES / mikroglia i 3D-assayet er sammenlignelig med det, der ses ved anvendelse af matrix overtrukket kammer tilgang. Lignende assays blev tidligere udviklet til at studere breast carcinoma interaktioner med makrofager under invasion 11-13. Begge metoder er beskrevet i dette dokument skal hjælpe med evnen til at dissekere den molekylære mekanisme (r) af makrofag / microglia-stimuleret invasion af glioblastomceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den stærkt invasive karakter høje kvalitet astrocytomer og glioblastoma gør disse hjernecancere meget dødbringende. Det er derfor af afgørende betydning for at forstå de molekylære og cellulære mekanismer glioblastom invasion. Meget er blevet lært om processen med glioblastom invasion allerede 17. Brug af assay-formater er beskrevet i dette dokument, har vores laboratorium vist i både murine og humane modeller, tumorassocierede makrofager kan stimulere gliom celleinvasion 5 – 10 gange. Denne cokultu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1., Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
